BR112014021521B1 - Método para aumentar a resistência à infecção por phakopsora em uma planta de soja transgênica, método para a produção de uma planta de soja transgênica, método para a produção de um produto e método para criar uma planta transgênica resistente a fungos - Google Patents

Abstract

MÉTODO PARA AUMENTAR A RESISTÊNCIA FÚNGICA EM UMA PLANTA, ÁCIDO NUCLEICO RECOMBINANTE, PROTEÍNA DE FUSÃO HIDROFOBINA, CONSTRUÇÃO DE VETOR RECOMBINANTE, MÉTODO PARA A PRODUÇÃO DE UMA PLANTA TRANSGÊNICA, USO, PRODUTO DERIVADO A PARTIR DE UMA PLANTA, MÉTODO PARA A PRODUÇÃO DE UM PRODUTO, MÉTODO PARA CRIAR UMA PLANTA RESISTENTE A FUNGOS, MÉTODO PARA APLICAR UMA PROTEÍNA HIDROFOBINA E USO DE UMA PROTEÍNA HIDROFOBINA. A presente invenção refere-se a um método para aumentar a resistência contra patógenos fúngicos da Família de plantas Phacopsoraceae e/ou células vegetais. Isto é alcançado, por exemplo, por aumento da expressão de uma proteína hidrofobina ou fragmento da mesma em uma planta, parte da planta e/ou célula vegetal, em comparação a plantas tipo selvagem, partes da planta tipo selvagem e/ou células vegetais tipo selvagem. Nas plantas transgênicas, a hidrofobina pode ser expressa como uma proteína de fusão para facilitar e/ou aumentar a expressão. Além disso, a proteína hidrofobina pode ser expressa incluindo uma sequência sinal de secreção que medeia a secreção da proteína no apoplasto e/ou na cutícula.

Description

[001] Este pedido reivindica prioridade dos pedidos com número de patente EP 12163267.3, depositado em 5 de abril de 2012 e patente US 61/620454, depositado em 5 de abril de 2012, todos integralmente incorporados ao presente pedido como referência.

DESCRIÇÃO RESUMIDA DA INVENÇÃO

[002] A presente invenção refere-se a um método para aumentar a resistência contra patógenos fúngicos, em particular, patógenos da Família Phacopsoraceae, por exemplo, ferrugem da soja, em plantas, partes da planta e/ou células vegetais. Isto é alcançado por aumento da expressão e/ou atividade de uma proteína hidrofobina em uma planta, parte da planta e/ou célula vegetal em comparação com plantas tipo selvagem, partes da planta tipo selvagem e/ou células vegetais tipo selvagem ou por aplicação de uma formulação ou solução contendo uma proteína hidrofobina.

[003] Além disso, a invenção refere-se a plantas transgênicas, partes da planta e/ou células vegetais que têm uma resistência aumentada contra patógenos fúngicos, em particular, patógenos da Família Phacopsoraceae, por exemplo, ferrugem da soja, e a vetores de expressão recombinantes que compreendem uma sequência que é idêntica ou homóloga a uma sequência que codifica uma proteína hidrofobina.

[004] Além disso, a invenção refere-se à formulação e aplicação de proteínas hidrofobina para plantas, partes da planta e/ou células vegetais modificar a superfície de uma maneira que leve à infecção reduzida de patógeno.

ANTECEDENTES DA INVENÇÃO

[005] O cultivo de plantas de cultura agrícolas serve principalmente para a produção de gêneros alimentícios para humanos e animais. Monoculturas em particular, que são a regra hoje em dia, são altamente suscetíveis a uma dispersão de doenças similar à epidemia. O resultado é produção acentuadamente reduzida. Até hoje, os organismos patogênicos foram controlados principalmente com o uso de pesticidas. Hoje em dia, a possibilidade de modificar diretamente a disposição genética de uma planta ou patógeno também está aberta ao homem.

[006] A resistência geralmente descreve a capacidade de uma planta prevenir, ou pelo menos abreviar a infestação e colonização por um patógeno nocivo. Mecanismos diferentes podem ser diferenciados na resistência que ocorre naturalmente, com os quais as plantas se defendem da colonização por organismos fitopatogênicos. Essas interações específicas entre o patógeno e o hospedeiro determinam o curso da infecção (Schopfer e Brennicke (1999) Pflanzenphysiologie, Springer Verlag, Berlin-Heidelberg, Alemanha).

[007] Com referência à resistência específica de raça, também chamada resistência do hospedeiro, uma diferenciação é feita entre interações compatíveis e incompatíveis. Na interação compatível, uma interação ocorre entre um patógeno virulento e uma planta suscetível. O patógeno sobrevive, e pode acumular estruturas de reprodução, enquanto o hospedeiro na maioria das vezes morre. Por outro lado, ocorre uma interação incompatível quando o patógeno infecta a planta, mas é inibido em seu crescimento antes ou depois de um desenvolvimento fraco de sintomas. No último caso, a planta é resistente ao respectivo patógeno (Schopfer e Brennicke, consulte acima). No entanto, esse tipo de resistência é específico para uma determinada linhagem ou patógeno.

[008] Em ambas as interações, compatíveis e incompatíveis, ocorre uma reação defensiva e específica do hospedeiro ao patógeno. Na natureza, no entanto, essa resistência é com frequência superada devido ao rápido desenvolvimento evolutivo de novas raças virulentas dos patógenos (Neu et al. (2003) American Cytopathol. Society, MPMI 16 no 7: 626-633).

[009] A maioria dos patógenos é específico para espécies de plantas. Isso significa que um patógeno pode induzir uma doença em uma determinada espécie de planta, mas não em outra espécie de planta (Heath (2002) Can. J. Plant Pathol. 24: 259-264). A resistência contra um patógeno em certas espécies de planta é chamada de resistência de não hospedeiro. A resistência de não hospedeiro oferece proteção forte, ampla e permanente de fitopatógenos. Os genes que fornecem resistência de não hospedeiro fornecem a oportunidade de uma proteção forte, ampla e permanente contra certas doenças em plantas não hospedeiras. Em particular, essa resistência trabalha para diferentes linhagens do patógeno.

[010] Os fungos são distribuídos mundialmente. Aproximadamente 100.000 espécies diferentes de fungos são conhecidas até hoje. Destas, as ferrugens são de grande importância. Elas podem ter um ciclo de desenvolvimento complicado com até cinco etapas diferentes de esporo (espermatium, aecidiospore, uredósporo, teleutósporo e basidiósporo).

[011] Durante a infecção de plantas por fungos patogênicos, diferentes fases são geralmente observadas. As primeiras fases da interação entre fungos fitopatogênicos e suas plantas hospedeiras potenciais são decisivas para a colonização da planta pelo fungo. Durante o primeiro estágio da infecção, os esporos tornam-se fixados à superfície das plantas, germinam e o fungo penetra na planta. As propriedades químicas da superfície (por exemplo, cutícula) são uma importante determinante para o reconhecimento da planta como um potencial hospedeiro (para revisão consulte Tucker e Talbot (2001) Surface attachment and pre-penetration stage development by plant pathogenic fungi, Annual Review of Phytopathology Vol. 39: 385-417). Os fungos podem penetrar na planta através de portas existentes como estômatos, lenticelas, hidátodos ou ferimentos, ou então eles penetram na epiderme da planta diretamente como o resultado da força mecânica e com a ajuda de enzimas que digerem a parede celular. Estruturas específicas de infecção são desenvolvidas para penetração da planta. A ferrugem da soja Phakopsora pachyrhizi penetra diretamente na epiderme da planta. Depois de atravessar a célula da epiderme, os fungos alcançam o espaço intercelular do mesófilo, onde o fungo começa a se espalhar através das folhas. Para adquirir nutrientes, o fungo penetra nas células do mesófilo e desenvolve haustório dentro da célula do mesófilo. Durante o processo de penetração, a membrana plasmática da célula do mesófilo penetrada permanece intacta. Portanto, o fungo da ferrugem da soja estabelece uma interação biotrópica com a soja.

[012] Os fungos fitopatogênicos biotrópicos, como muitas ferrugens, dependem no metabolismo de células vivas das plantas para sua nutrição. Este tipo de fungo pertence ao grupo de fungos biotrópicos, como outros fungos da ferrugem, fungos de oídio poeirentos ou oomicetos patógenos como o gênero Phytophthora ou Peronospora. Os fungos fitopatogênicos necrotróficos dependem de células mortas das plantas para sua nutrição, por exemplo, espécied do gênero Fusarium, Rhizoctonia ou Mycospaerella. A ferrugem da soja ocupou uma posição intermediária, visto que penetra na epiderme diretamente, como consequência a célula penetrada torna-se necrótica. Após a penetração, o fungo muda para um estilo de vida biotrópico obrigatório. O subgrupo dos patógenos fúngicos biotrópicos que segue essencialmente como uma estratégia de infecção é heminecrotrófico. Ao contrário de um patógeno heminecrotrófico, um patógeno hemibiotrófico vive por um período curto de tempo de uma maneira biotrófica e subsequentemente inicia a morte da célula hospedeira e/ou do organismo hospedeiro, isto é, muda o resto de seu ciclo vital para um estilo de vida necrotrófico.

[013] Os estágios iniciais de pré-penetração, isto é, fixação do esporo, germinação do esporo, crescimento da hifa e o desenvolvimento da estrutura de infecção (apressório) são cruciais para o sucesso da infecção. Infelizmente os mecanismos moleculares subjacentes são ainda desconhecidos. Todavia, há algumas indicações de que a expressão de hidrofobinas pelos fungos é necessária para o desenvolvimento das hifas e do apressório. Para uma revisão abrangente sobre o estágio de pré-penetração nas interações planta-patógeno e no envolvimento de hidrofobinas consulte Tucker e Talbot, “Surfacec attachment and pre-penetration stage development by plant pathogeneic fungi (Annu. Rev. Phytopathol 2001, 39:385ff).

[014] Hidrofobinas são uma classe de proteínas pequenas ricas em cisteína com um comprimento de cerca de 100 a 150 aminoácidos que ocorre na natureza apenas em fungos filamentosos. Elas são anfifílicas e podem formar uma camada na superfície de um objeto. Suas funções naturais incluem, entre outras, o revestimento dos esporos do fungo, de modo que estes não grudem um no outro, o revestimento das hifas aéreas para reduzir a tensão superficial da água e assim facilitar a absorção de água, e talvez a transmissão de sinal entre um fungo e seu ambiente (Whiteford. J. F. Spanu, P. D. (2001), Fungal Genet. Biol. 32 (3): 159-168; Wosten et al. (1999) Current Biol. 19: 1985-88; Bell et al. (1992), Genes Dev. 6: 2382-2394).

[015] Hidrofobinas geralmente têm oito unidades de cisteína. Elas podem ser isoladas a partir de fontes naturais, mas também podem ser obtidas por meios de métodos de engenharia genética, conforme descrito, por exemplo, nos documentos WO 2006/082251 e WO 2006/131564.

[016] O primeiro isolamento e purificação de hidrofobina foi realizado a partir de Schizophyllum commune em 1999. Nesse meio tempo, os genes da hidrofobina foram identificados em Ascomicetos, Deuteromicetos e Basiodiomicetos. Alguns fungos compreendem mais de um gene da hidrofobina, por exemplo, Schizophyllum commune, Coprinus cinereus e Aspergillus nidulans. Com base nas diferenças em relação à hidropatia e às propriedades biofísicas das hidrofobinas, estas foram divididas em duas categorias: classe I e classe II. Os experimentos de complementação mostraram que as hidrofobinas da classe I são capazes de substituir hidrofobinas de outra classe até certo ponto, visto que a função está relacionada. Hidrofobinas diferentes parecem estar envolvidas em diferentes estágios de desenvolvimento dos fungos e realizar diferentes funções nestes (van Wetter et al. (2000) Mol. Microbiol. 36:201-210; Kershaw et al. (1998) Fungal Genet. Biol. 23:18- 33).

[017] A ferrugem da soja tornou-se cada vez mais importante em tempos recentes. A doença pode ser causada pela ferrugem biotrópica Phakopsora pachyrhizi (Sydow) e Phakopsora meibomiae (Arthur). Eles pertencem à Classe Basidiomycota, Ordem Uredinales, Família Phakopsoraceae. Ambas as ferrugens infectam um amplo espectro de plantas hospedeiras leguminosas. P. pachyrhizi, também conhecida como ferrugem asiática, é o patógeno mais agressivo na soja (Glycine max) e é, portanto, pelo menos no momento, de grande importância para a agricultura. P. pachyrhizi pode ser encontrado em quase todas as sojas de regiões tropicais e subtropicais do mundo. P. pachyrhizi é capaz de infectar 31 espécies de 17 famílias de leguminosas, sob condições naturais, e é capaz de crescer em mais de 60 espécies sob condições controladas (Sinclair et al. (eds.), Proceedings of the rust workshop (1995), National SoyaResearch Laboratory, Publicação no 1 (1996); Rytter J.L. et al., Plant Dis. 87, 818 (1984)). P. meibomiae foi descoberto na Bacia do Caribe e em Porto Rico, e não causou dano substancial até agora.

[018] P. pachyrhizi atualmente pode ser controlado no campo só por meios de fungicidas. Plantas de soja com resistência ao espectro inteiro dos isolados não está disponível. Ao procurar plantas resistentes, seis genes dominantes Rpp1-5 e Rpp?(Hyuuga) que medeiam resistência da soja a P. pachyrhizi, foram descobertos. A resistência foi perdida rapidamente, visto que P. pychyrhizi desenvolve novas raças virulentas.

[019] Nos anos recentes, doenças fúngicas, por exemplo, ferrugem da soja, ganharam importância como peste na produção agrícola. Havia, portanto, uma demanda na técnica anterior para desenvolver métodos para controlar fungos e fornecer plantas resistentes a fungos.

[020] Muita pesquisa foi realizada no campo de oídio e míldio que infectam a camada epidérmica das plantas. No entanto, o problema para lidar com a ferrugem da soja que infeta o mesófilo permanece não solucionado.

DESCRIÇÃO RESUMIDA DA INVENÇÃO

[021] O objetivo da presente invenção é, entre outros, fornecer um método de resistência crescente contra patógenos fúngicos, preferencialmente patógenos da ferrugem (isto é, patógenos fúngicos da Ordem Pucciniales), preferencialmente contra patógenos fúngicos da Família Phacopsoraceae, mais preferencialmente contra patógenos fúngicos do Gênero Phacopsora, mais preferencialmente contra Phakopsora pachyrhizi (Sydow) e Phakopsora meibomiae (Arthur), também conhecidos como ferrugem da soja.

[022] De maneira surpreendente, nós descobrimos que patógenos fúngicos, em particular patógenos da ferrugem (isto é, patógenos fúngicos da Ordem Pucciniales), preferencialmente patógenos fúngicos da Família Phacopsoraceae, por exemplo, ferrugem da soja, podem ser controlados pela superexpressão de uma proteína hidrofobina. Dessa forma, sem se limitar pela teoria, nós descobrimos que a resistência fúngica pode ser realizada por expressão de hidrofobina e, portanto, alterando as propriedades físico-químicas da cutícula, da parede celular ou da membrana plasmática da célula vegetal que expressa a hidrofobina de uma maneira que o fungo não reconheça seu hospedeiro ou seja inibido pela presença da hidrofobina. O mesmo efeito pode ser obtido por aplicação à planta de uma solução de proteína hidrofobina pura ou formulada.

[023] A presente invenção, portanto, fornece um método para aumentar a resistência contra patógenos fúngicos, preferencialmente contra patógenos da ferrugem (isto é, patógenos fúngicos da Ordem Pucciniales), preferencialmente contra patógenos fúngicos da Família Phacopsoraceae, mais preferencialmente contra patógenos fúngicos do Gênero Phacopsora, com a máxima preferência contra patógenos fúngicos Phakopsora pachyrhizi (Sydow) e Phakopsora meibomiae (Arthur), também conhecidos como ferrugem da soja, em plantas transgênicas, partes de plantas transgênicas ou células vegetais transgênicas, pela superexpressão de um ou mais ácidos nucleicos de hidrofobina.

[024] Em uma realização específica, a hidrofobina é expressa como uma proteína de fusão que compreende um ou mais dos elementos selecionados a partir do grupo que consiste em sequência sinal, polipeptídeo parceiro de fusão, sequência ligante e sequência de purificação.

[025] Em uma realização preferencial, a proteína hidrofobina é fundida a uma sequência sinal de secreção, leva à secreção da proteína, por exemplo, no apoplasto e/ou na cutícula. A fusão da proteína hidrofobina a uma sequência sinal de secreção foi escolhida com base na teoria de que uma alteração na hidrofobicidade da superfície da folha (ou do apoplasto) talvez iniba o crescimento das hifas ou apressórios do fungo. Por outro lado, também é possível que a alteração de propriedades físico-químicas da membrana plasmática das células que expressam hidrofobina levaria a uma resistência aumentada. Além disso, é possível que a alteração de propriedades físico- químicas do citoplasma cause o grau de resistência. No último caso, uma secreção da proteína não seria necessária.

[026] Um objetivo adicional é fornecer plantas transgênicas resistentes a patógenos fúngicos, preferencialmente patógenos da ferrugem (isto é, patógenos fúngicos da Ordem Pucciniales), preferencialmente contra patógenos fúngicos da Família Phacopsoraceae, mais preferencialmente contra patógenos fúngicos do Gênero Phacopsora, com a máxima preferência contra Phakopsora pachyrhizi (Sydow) e Phakopsora meibomiae (Arthur), também conhecidos como ferrugem da soja, um método para produzir essas plantas, bem como uma construção de vetor para os métodos acima.

[027] Portanto, a presente invenção também se refere a uma construção de vetor recombinante e uma planta transgênica, parte de planta transgênica ou célula vegetal transgênica que compreende um ácido nucleico de hidrofobina. Além disso, é reivindicado um método para a produção de uma planta transgênica, parte de planta transgênica ou célula vegetal transgênica com o uso do ácido nucleico da presente invenção. Além disso, é reivindicado o uso de um ácido nucleico ou do vetor recombinante da presente invenção para a transformação de uma planta, parte de planta ou célula vegetal.

[028] Os objetivos da presente invenção, como descritos acima, são alcançados pela matéria sujeito das principais reivindicações. Realizações preferenciais da invenção são definidas pela matéria sujeito das reivindicações dependentes.

BREVE DESCRIÇÃO DAS VÁRIAS VISTAS DOS DESENHOS

[029] A Figura 1 mostra a ilustração esquemática de uma proteína de fusão hidrofobina que compreende uma sequência de purificação (por exemplo, uma Histidina (His)-tag), um polipeptídeo parceiro de fusão (por exemplo, parte da subunidade Pdx1da sintase), uma sequência ligante (por exemplo, um sítio de reconhecimento da protease fator Xa) e uma sequência sinal de secreção.

[030] A Figura 2 mostra o sistema de escore usado para determinar o nível de área de folha doente de plantas de soja tipo selvagem e transgênica contra o fungo da ferrugem P. pachyrhizi.

[031] A Figura 3 mostra a sequência codificadora de uma proteína de fusão hidrofobina que compreende uma sequência sinal de secreção, uma parte da subunidade Pdx1 da sintase (Yaad) de Bacillus subtilis, um sítio de reconhecimento da protease fator Xa, hidrofobina de Aspergillus nidulans, e uma His-tag (SEQ ID NO: 29).

[032] A Figura 4 mostra a sequência de aminoácidos de uma proteína de fusão hidrofobina que compreende uma sequência sinal de secreção, uma parte da subunidade Pdx1 da sintase (Yaad) de Bacillus subtilis, um sítio de reconhecimento da protease fator Xa, hidrofobina de Aspergillus nidulans, e uma His-tag (SEQ ID NO: 30).

[033] A Figura 5 mostra a sequência codificadora de uma proteína de fusão hidrofobina que compreende uma sequência sinal de secreção, uma parte da subunidade Pdx1 da sintase (Yaad) de Bacillus subtilis, um sítio de reconhecimento da protease fator Xa e hidrofobina de Aspergillus nidulans sem His-tag (SEQ ID NO: 27).

[034] A Figura 6 mostra a sequência de aminoácidos de uma proteína de fusão hidrofobina que compreende uma sequência sinal de secreção, uma parte da subunidade Pdx1 da sintase (Yaad) de Bacillus subtilis, um sítio de reconhecimento da protease fator Xa e hidrofobina de Aspergillus nidulans sem His-tag (SEQ ID NO: 28).

[035] A Figura 7 mostra o resultado da superexpressão de hidrofobina em plantas de soja, que foram infectadas com ferrugem asiática da soja. O resultado do escore de 25 plantas de soja transgênica que expressam a construção de vetor de superexpressão de hidrofobina é mostrado. Plantas de soja T0 que expressam a proteína hidrofobina foram inoculadas com esporos de Phakopsora pachyrhizi. A avaliação da área de folha doente em todas as folhas foi realizada 14 dias após inoculação. A média da porcentagem da área de folha mostrando colônias fúngicas ou amarelamento/acastanhado forte em todas as folhas foi considerada como área de folha doente. Todas as 25 plantas de soja T0 que expressam hidrofobina (expressão verificada por RT-PCR) foram avaliadas em paralelo com plantas de controle não transgênicas. A média da área de folha doente é mostrada na Figura 7. A superexpressão de hidrofobina reduz significativamente (*: p < 0,05) a área de folha doente em comparação com plantas de controle não transgênicas, em 26%.

[036] A Figura 8 mostra um alinhamento de várias proteínas hidrofobina (inclusive seus parceiros de fusão) (Hidrofobina_Gm: SEQ ID NO: 42, HFBII versão 1: SEQ ID NO: 45, HFBII 2 versão 2 (que compreende resíduos de aminoácidos adicionais para proteína direcionada a corpos de inclusão quando expressa em E. coli): SEQ ID NO: 46, Hidrofobina_SC3 versão 1: SEQ ID NO: 43, Hidrofobina_SC3 versão 2 (que compreende resíduos de aminoácidos adicionais para proteína direcionada a corpos de inclusão quando expressa em E. coli): SEQ ID NO: 44, yaaD_TT1: SEQ ID NO: 52, yaaD_HFPI: SEQ ID NO: 50, yaaD_HFBII: SEQ ID NO: 48, yaad: SEQ ID NO: 18).

[037] A Figura 9 mostra o resultado de escore da doença de ferrugem da soja pulverizadas com variedades de hidrofobina diferentes (10 plantas para cada uma, Hidrophbin_SC3: SEQ ID NO: 43, yaaD_HFPI: SEQ ID NO: 50, HFBII: SEQ ID NO: 45) e das plantas não tratados como controle. As plantas foram inoculadas com esporos de Phakopsora pachyrhizi 24 horas após tratamento com a respectiva solução de proteína Hidrofobina. A avaliação da área de folha doente em todas as folhas foi realizada 14 dias após inoculação. A média da porcentagem da área de folha mostrando colônias fúngicas ou amarelamento/acastanhado forte em todas as folhas foi considerada como área de folha doente. Todas as 10 plantas de soja de cada uma foram pulverizadas com a respectiva hidrofobina e avaliadas em paralelo a plantas de controle não tratadas. A média da área de folha doente é mostrada na Figura 9.

[038] A figura 10 contém uma breve descrição das sequências da lista de sequências.

DESCRIÇÃO DETALHADA DA INVENÇÃO

[039] A presente invenção pode ser mais facilmente compreendida por referência à descrição detalhada das realizações a seguir das realizações preferenciais da invenção e dos Exemplos incluídos no presente pedido.

DEFINIÇÕES

[040] Salvo indicação em contrário, os termos usados no presente pedido são para serem entendidos de acordo com uso convencional pelos técnicos no assunto. Além disso as definições de termos fornecidos no presente pedido, definições de termos comuns em biologia molecular também podem ser encontradas em Rieger et al., 1991 Glossary of genetics: classical and molecular, 5a Ed., Berlin: Springer-Verlag; e em Current Protocols in Molecular Biology, F.M. Ausubel et al., Eds., Current Protocols, uma joint venture entre Greene Publishing Associates, Inc. e John Wiley & Sons, Inc., (1998 Suplemento).

[041] Entende-se que, como usado no relatório descritivo e nas reivindicações, “um” ou “uma” pode significar um ou mais, dependendo do contexto em que é usado. Dessa forma, por exemplo, referência a “uma célula” pode significar que pelo menos uma célula pode ser utilizada. Entende-se que a terminologia usada no presente pedido tem a intenção de descrever somente realizações específicas descritas, e não tem a intenção de ser limitante.

[042] Ao longo deste pedido, são referenciadas várias publicações. As divulgações de todas essas publicações e essas referências citadas dentro dessas publicações são integralmente incorporadas ao presente pedido como referência neste pedido psrs descrever mais completamente do estado da técnica ao qual esta invenção pertence. Técnicas padrão para clonagem, isolamento de DNA, amplificação e purificação, para reações enzimáticas envolvendo DNA ligase, DNA polimerase, endonucleases de restrição e similares, e várias técnicas de separação são as conhecidas na técnica e comumente empregadas pelos técnicos no assunto. Várias técnicas padrão são descritas em Sambrook et al., 1989 Molecular Cloning, Segunda Edição, Cold Spring Harbor Laboratory, Plainview, N.Y.; Maniatis et al., 1982 Molecular Cloning, Cold Spring Harbor Laboratory, Plainview, N.Y.; Wu (Ed.) 1993 Meth. Enzymol. 218, Part I; Wu (Ed.) 1979 Meth Enzymol. 68; Wu et al., (Eds.) 1983 Meth. Enzymol. 100 e 101; Grossman e Moldave (Eds.) 1980 Meth. Enzymol. 65; Miller (Ed.) 1972 Experiments in Molecular Genetics, Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor, N.Y.; Old e Primrose, 1981 Principles of Gene Manipulation, University of California Press, Berkeley; Schleif and Wensink, 1982 Practical Methods in Molecular Biology; Glover (Ed.) 1985 DNA Cloning Vol. I and II, IRL Press, Oxford, Reino Unido; Hames e Higgins (Eds.) 1985 Nucleic Acid Hybridization, IRL Press, Oxford, Reino Unido; e Setlow e Hollaender 1979 Genetic Engineering: Principles and Methods, Vols. 1 a 4, Plenum Press, Nova York. As abreviações e a nomenclatura, quando empregadas, são consideradas padrão na área e geralmente usadas em revistas profissionais conforme citadas no presente pedido.

[043] “Homólogos” de uma proteína englobam peptídeos, oligopeptídeos, polipeptídeos, proteínas e/ou enzimas que têm substituições, deleções e/ou inserções de aminoácidos em relação à proteína não modificada em questão, e que têm atividade funcional similar à da proteína não modificada a partir da qual eles são derivados.

[044] “Homólogos” de um ácido nucleico que engloba nucleotídeos e/ou polinucleotídeos que têm substituições, deleções e/ou inserções de ácidos nucleicos em relação ao ácido nucleico não modificado em questão, em que a proteína codificada por esses ácidos nucleicos tem atividade funcional similar ou mais alta que a proteína codificada não modificada pelo ácido nucleico não modificado a partir do qual eles são derivados. Em particular, homólogos de um ácido nucleico podem englobar substituições com base no código de aminoácidos degenerativos.

[045] Uma “deleção” refere-se à remoção de um ou mais aminoácidos a partir de uma proteína ou à remoção de um ou mais ácidos nucleicos a partir de DNA, ssRNA e/ou dsRNA.

[046] Uma “inserção” refere-se a um ou mais resíduos de aminoácidos ou resíduos de ácidos nucleicos a serem introduzidos em um local predeterminado em uma proteína ou do ácido nucleico.

[047] Uma “substituição” refere-se à substituição de aminoácidos da proteína por outros aminoácidos que têm propriedades similares (como hidrofobicidade similar, hidrofilicidade, antigenicidade, propensão para formar ou quebrar estruturas α-helicoidais ou estruturas folha beta).

[048] Ao nível de ácido nucleico, uma substituição refere-se a uma substituição de ácido nucleico por outros ácidos nucleicos, em que a proteína codificada pelo ácido nucleico modificado tem uma função similar. Em particular, homólogos de um ácido nucleico englobam substituições com base no código de aminoácidos degenerativos.

[049] As substituições de aminoácidos são tipicamente de resíduos únicos, mas podem ser agrupadas dependendo das restrições funcionais colocadas na proteína e podem variar de 1 a 10 aminoácidos; inserções ou deleções serão usualmente na ordem de cerca de 1 a 10 resíduos de aminoácidos. As substituições de aminoácidos são preferencialmente substituições de aminoácidos conservativas. Tabelas de substituições conservativas são bem conhecidas na técnica (consulte, por exemplo, Creighton (1984) Proteins. W.H. Freeman e Company (Eds) e Tabela 1 abaixo ou Taylor W.R. (1986) The classification of amino acid conservation, J Theor Biol., 119:205-18). TABELA 1 EXEMPLOS DE SUBSTITUIÇÕES DE AMINOÁCIDOS CONSERVADOS

[050] As substituições, deleções e/ou inserções de aminoácidos podem ser facilmente produzidas com o uso de técnicas de peptídeos sintéticos bem conhecidas na técnica, como síntese peptídica em fase sólida e similares, ou por manipulação de DNA recombinante.

[051] Os métodos para a manipulação de sequências de DNA para produzir substituição, inserção ou deleção de variantes de uma proteína são bem conhecidos na técnica. Por exemplo, técnicas para produzir mutações de substituição em locais predeterminados no DNA são bem conhecidas pelos técnicos no assunto e incluem a mutagênese M13, mutagênese do Gene T7 in vitro (USB, Cleveland, OH), mutagênese sítio-dirigida QuickChange (Stratagene, San Diego, CA), PCR mediada por mutagênese sítio-dirigida ou outros protocolos de mutagênese sítio-dirigida.

[052] Ortólogos e parálogos englobam conceitos evolutivos usados para descrever as relações ancestrais dos genes. Parálogos são genes da mesma espécie que foram originadas através de duplicação de um gene ancestral, ortólogos são genes de organismos diferentes que foram originados através de especiação, e também são derivados a partir de um gene ancestral comum.

[053] O termo “domínio” refere-se a um conjunto de aminoácidos conservados nas posições específicas ao longo de um alinhamento de sequências de proteínas relacionadas evolutivamente. Embora aminoácidos em outras posições possam variar entre homólogos, aminoácidos que são altamente conservados nas posições específicas indicam aminoácidos que provavelmente são essenciais na estrutura, estabilidade ou função de uma proteína.

[054] Existem bancos de dados especializados na identificação de domínios, por exemplo, SMART (Schultz et al. (1998) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 95, 5857-5864; Letunic et al. (2002) Nucleic Acids Res 30, 242-244), InterPro (Mulder et al., (2003) Nucl. Acids. Res. 31, 315-318), Prosite (Bucher e Bairoch (1994), A generalized profile syntax for biomolecular sequences motifs and its function in automatic sequence interpretation. (In) ISMB-94; Proceedings 2a International Conference on Intelligent Systems for Molecular Biology. Altman R., Brutlag D., Karp P., Lathrop R., Searls D., Eds., páginas 53-61, AAAI Press, Menlo Park; Hulo et al., Nucl. Acids. Res. 32:D134-D137, (2004)), ou Pfam (Bateman et al., Nucleic Acids Research 30(1): 276-280 (2002)). Está disponível um conjunto de ferramentas para análise de sequências de proteínas in silico no servidor proteômico ExPASy (Swiss Institute of Bioinformatics (Gasteiger et al., ExPASy: the proteomics server for in-depth protein knowledge and analysis, Nucleic Acids Res. 31:3784-3788(2003)). Domínios ou motivos também podem ser identificados com o uso de técnicas de rotina, como por alinhamento de sequência.

[055] Métodos para o alinhamento de sequências para comparação são bem conhecidos na técnica, esses métodos incluem GAP, BESTFIT, BLAST, FASTA e TFASTA. GAP usa o algoritmo de Needleman e Wunsch ((1970) J Mol Biol 48: 443-453) para encontrar o alinhamento global (isto é, que abrange as sequências completas) de duas sequências, que maximiza o número de correspondências e minimiza o número de gaps. O algoritmo BLAST (Altschul et al. (1990) J Mol Biol 215: 403-10) calcula o percentual de identidade, similaridade ou homologia de sequência e realiza uma análise estatística da identidade, similaridade ou homologia entre as duas sequências. O programa de computação para realização da análise BLAST está disponível publicamente junto ao National Centre for Biotechnology Information (NCBI). Homólogos podem ser facilmente identificados com o uso, por exemplo, do algoritmo de alinhamento de múltiplas sequências ClustalW (versão 1.83), com os parâmetros padrão de alinhamento em pares, e um método de escore em porcentagem. As porcentagens globais de similaridade/homologia/identidade também podem ser determinadas com o uso de um dos métodos disponíveis no pacote do programa de computação MatGAT (Campanella et al., BMC Bioinformatics. 10 de julho de 2003; 4:29. MatGAT: um aplicativo que gera matrizes de similaridade/homologia/identidade com o uso de sequências de proteínas ou de DNA). A edição manual secundária pode ser realizada para otimizar o alinhamento entre motivos conservados, como seria evidente para um técnico no assunto. Além disso, ao invés de usar sequências inteiras para a identificação de homólogos, domínios específicos podem também ser usados. Os valores de identidade de sequência podem ser determinados ao longo do ácido nucleico completo, da sequência de aminoácidos ou ao longo dos domínios selecionados ou motivo(s) conservado(s), com o uso dos programas acima mencionados acima com o uso dos parâmetros padrão. Para alinhamentos locais, o algoritmo de Smith-Waterman é particularmente útil (Smith TF, Waterman MS (1981) J. Mol. Biol 147(1);195-7).

[056] Uma “sequência sinal” é um peptídeo curto (3 a 60 aminoácidos de comprimento) que direciona o transporte de uma proteína, preferencialmente para outras organelas dentro da célula ou para certas localizações subcelulares ou para a secreção de uma proteína. As sequências sinal também podem ser chamadas peptídeo de trânsito, sequência de trânsito, peptídeo sinal, sinal de direcionamento ou sinal de localização.

[057] Uma “sequência sinal de secreção” é um tipo particular de sequência sinal, que dirige o transporte de uma proteína para o exterior do protoplasto ou simplasto.

[058] O “protoplasto” ou “simplasto” de uma planta ou de uma célula vegetal, como entendido no presente pedido, é o espaço interno cercado pela membrana celular. Dessa forma, “protoplasto” ou “simplasto” não inclui a membrana celular.

[059] O “apoplasto” de uma planta é o espaço fora da membrana celular.

[060] A “cutícula” de uma célula vegetal ou órgão de planta, como folha ou caule, é um protetor hidrofóbico, cobertura cerosa produzida pelas células da epiderme.

[061] Como usado no presente pedido, os termos “resistência fúngica”, “resistente a um fungo” e/ou “resistente a fungos’" significa reduzir, prevenir ou retardar uma infecção por fungos. O termo “resistência” refere-se à resistência fúngica. Resistência não implica que a planta necessariamente tenha 100% de resistência à infecção. Em realizações preferenciais, melhorar ou aumentar a resistência fúngica significa que a resistência em uma planta resistente é maior que 10%, maior que 20%, maior que 30%, maior que 40%, maior que 50%, maior que 60%, maior que 70%, maior que 80%, maior que 90% ou maior que 95%, em comparação a uma planta tipo selvagem.

[062] Como usado no presente pedido, os termos “resistência à ferrugem da soja”, “resistente a uma ferrugem da soja”, “resistente à ferrugem da soja”, “resistência à ferrugem”, “resistente a uma ferrugem” ou “resistente à ferrugem” significa reduzir, prevenir ou retardar uma infecção de uma planta, parte da planta ou célula vegetal por Phacopsoracea, em particular Phakopsora pachyrhizi (Sydow) e Phakopsora meibomiae (Arthur) - também conhecida como ferrugem da soja ou ferrugem asiática da soja (ASR), em comparação a uma planta tipo selvagem, parte da planta tipo selvagem ou célula vegetal tipo selvagem. Resistência não implica que a planta necessariamente tenha 100% de resistência à infecção. Em realizações preferenciais, melhorar ou aumentar a resistência à ferrugem significa que a resistência à ferrugem em uma planta resistente é maior que 10%, maior que 20%, maior que 30%, maior que 40%, maior que 50%, maior que 60%, maior que 70%, maior que 80%, maior que 90% ou maior que 95%, em comparação a uma planta tipo selvagem que não é resistente à ferrugem da soja. Preferencialmente a planta tipo selvagem é uma planta de um genótipo similar, mais preferencialmente idêntica à planta que tem resistência aumentada à ferrugem da soja, mas não compreende um ácido nucleico exógeno de hidrofobina, fragmentos funcionais do mesmo e/ou um ácido nucleico exógeno capaz de hibridizar com um ácido nucleico de hidrofobina.

[063] O nível de resistência fúngica de uma planta pode ser determinado de várias maneiras, por exemplo, por pontuação/medição da área de folha infectada em relação à área de folha total. Outra possibilidade para determinar o nível de resistência é contar o número de colônias de ferrugem da soja sobre a planta ou medir a quantidade de esporos produzidos por essas colônias. Outra maneira de resolver o grau de infestação fúngica é medir especificamente a quantidade de DNA da ferrugem por PCR quantitativo (q). Sondas específicas e sequências de primer para a maioria dos patógenos fúngicos estão disponíveis na literatura (Frederick RD, Snyder CL, Peterson GL, et al. 2002 Polymerase chain reaction assays for the detection and discrimination of the rust pathogens Phakopsora pachyrhizi and P. meibomiae, Phytopathology 92(2) 217-227).

[064] O termo “hibridização” como usado no presente pedido inclui “qualquer processo pelo qual uma fita de molécula de ácido nucleico se une a uma fita complementar através de pareamento de base” (J. Coombs (1994) Dictionary of Biotechnology, Stockton Press, Nova York). A hibridização e a força de hibridização (isto é, a força da associação entre as moléculas de ácido nucleico) são afetadas por esses fatores como o grau de complementaridade entre as moléculas de ácido nucleico, estringência das condições envolvidas, a Tm do híbrido formado, e a razão G:C dentro das moléculas de ácido nucleico.

[065] Como usado no presente pedido, o termo “Tm” é usado em referência à “temperatura de fusão”. A temperatura de fusão é a temperatura em que uma população de moléculas de ácido nucleico de fita dupla torna-se metade dissociada em fitas simples. A equação para calcular a Tm de moléculas de ácido nucleico é bem conhecida na técnica. Conforme indicado por referências padrão, uma estimativa simples do valor de Tm pode ser calculada pela equação: Tm=81,5+0,41(% G+C), quando uma molécula de ácido nucleico está em solução aquosa em NaCl 1 M (consulte, por exemplo, Anderson e Young, Quantitative Filter Hybridization, in Nucleic Acid Hybridization (1985)]. Outras referências incluem cálculos mais sofisticados, que levam em conta características estruturais bem como de sequência para o cálculo de Tm. Condições estringentes, são conhecidas pelos técnicos no assunto e podem ser encontradas em Current Protocols in Molecular Biology, John Wiley & Sons, N.Y. (1989), 6.3.16.3.6.

[066] Em particular, o termo condições de estringência refere-se a condições, em que 100 nucleotídeos contíguos ou mais, 150 nucleotídeos contíguos ou mais, 200 nucleotídeos contíguos ou mais ou 250 nucleotídeos contíguos ou mais que são um fragmento ou idêntico à molécula de ácido nucleico complementar (DNA, RNA, ssDNA ou ssRNA) hibridiza sob condições equivalentes a hibridização em dodecil sulfato de sódio 7% (SDS), NaPO4 0,5 M, EDTA 1 mM a 50°C com lavagem em SSC 2X, SDS 0,1% a 50°C ou 65°C, preferencialmente a 65°C, com uma molécula de ácido nucleico específica (DNA; RNA, ssDNA ou ssRNA). Preferencialmente, as condições de hibridização são equivalentes a hibridização em dodecil sulfato de sódio (SDS) 7%, NaPO4 0,5 M, EDTA 1 mM a 50°C com lavagem em SSC 1X, SDS 0,1% a 50°C ou 65°C, preferencialmente 65°C, mais preferencialmente as condições de hibridização são equivalentes a hibridização em dodecil sulfato de sódio (SDS) 7%, NaPO4 0,5 M, EDTA 1 mM a 50°C com lavagem em SSC 0,1X, SDS 0,1% a 50°C ou 65°C, preferencialmente 65°C. Preferencialmente, os nucleotídeos complementares hibridizam com um fragmento ou com os ácidos nucleicos inteiros de hidrofobina. Preferencialmente, o polinucleotídeo complementar hibridiza com partes dos ácidos nucleicos de hidrofobina capazes de fornecer resistência à ferrugem da soja por superexpressão ou infrarregulação, respectivamente.

[067] Por exemplo, as condições típicas de hibridização de alta estringência para híbridos de DNA maiores que 50 nucleotídeos englobam hibridização a 65°C em SSC 1x, ou a 42°C em SSC 1x e formamida 50%, seguido de lavagem a 65°C em SSC 0,3x. Exemplos de condições de hibridização de estringência média para híbridos de DNA maiores que 50 nucleotídeos englobam hibridização a 50°C em SSC 4x ou a 40°C em SSC 6x e formamida a 50%, seguido de lavagem a 50°C em SSC 2x.

[068] “Identidade” ou “homologia” ou “similaridade” entre duas sequências de ácidos nucleicos ou sequências de aminoácidos refere-se em cada caso ao longo de todo o comprimento das sequências de ácidos nucleicos de hidrofobina ou sequências de aminoácidos de hidrofobina. Os termos “identidade”, “homologia” e “similaridade” são usados no presente pedido de forma intercambiável.

[069] Por exemplo, a identidade pode ser calculada por meios do programa Vector NTI Suite 7.1 da companhia Informax (EUA) que emprega o Método Clustal (Higgins DG, Sharp PM. Fast and sensitive multiple sequence alignments on a microcomputer. Comput Appl. Biosci. abril de 1989; 5(2):151-1) com as seguintes configurações: Parâmetro de alinhamento múltiplo: Penalidade de abertura de gap 10 Penalidade de extensão de gap 10 Faixa de penalidade de separação de gap 8 Penalidade de separação de gap desligado % de identidade para atraso de alinhamento 40 Gaps de resíduo específico desligado Gap de resíduo hidrofílico desligado Pesagem de transição 0 Parâmetro de alinhamento de pareamento: Algoritmo FAST ligado Tamanho de k-tupla 1 Penalidade de gap 3 Tamanho da janela 5 Número de melhores diagonais 5

[070] De maneira alternativa a identidade pode ser determinada de acordo com Chenna, Ramu, Sugawara, Hideaki, Koike, Tadashi, Lopez, Rodrigo, Gibson, Toby J, Higgins, Desmond G, Thompson, Julie D. Multiple sequence alignment with the Clustal series of programs. (2003) Nucleic Acids Res 31 (13):3497-500, a página web: http://www.ebi.ac.uk/Tools/clustalw/index.html# e as seguintes configurações Penalidade de Abertura de Gap de DNA 15.0 Penalidade de Extensão de Gap de DNA 6.66 Matriz de DNA Identidade Penalidade de Abertura de Gap de Proteína 10.0 Penalidade de Extensão de Gap de Proteína 0.2 Matriz de proteína Gonnet Proteína/DNA ENDGAP -1 Proteína/DNA GAPDIST 4.

[071] Todas as sequências de ácido nucleico mencionadas no presente pedido (sequências de DNA e RNA de fita simples e fita dupla, por exemplo, cDNA e mRNA) podem ser produzidas de uma maneira conhecida por síntese química a partir dos blocos de construção de nucleotídeos, por exemplo, por condensação de fragmento de sobreposição individual, blocos de construção de ácido nucleico complementar da dupla hélice. A síntese química de oligonucleotídeos pode, por exemplo, ser realizada de uma maneira conhecida, pelo método de fosfoamidita (Voet, Voet, 2a edição, Wiley Press, Nova York, páginas 896-897). O acúmulo de oligonucleotídeos sintéticos e preenchimento de gaps por meio do fragmento de Klenow da DNA polimerase e reações de ligação bem como técnicas de clonagem geral são descritas em Sambrook et al. (1989), consulte abaixo.

[072] A identidade de sequência entre o ácido nucleico ou proteína útil de acordo com a presente invenção e os ácidos nucleicos de hidrofobina ou proteínas de hidrofobina podem ser otimizados por comparação de sequência e algoritmos de alinhamento conhecidos na técnica (consulte Gribskov e Devereux, Sequence Analysis Primer, Stockton Press, 1991, e referências citadas a esse respeito) e calculando a diferença de percentual entre as sequências de nucleotídeos ou proteínas, por exemplo, por algoritmo de Smith-Waterman conforme implementado no programa de computação BESTFIT com o uso de parâmetros padrão (por exemplo, University of Wisconsin Genetic Computing Group).

[073] O termo “planta” tem a intenção de englobar plantas em qualquer estágio de maturidade ou desenvolvimento, bem como quaisquer tecidos ou órgãos (partes de planta) pegos ou derivados de qualquer uma dessas plantas a menos que claramente indicado de outra forma por contexto. As partes de planta incluem, mas não se limitam a células vegetais, caules, raízes, flores, óvulos, estames, sementes, folhas, embriões, regiões meristemáticas, tecido de calo, culturas de antera, gametófitos, esporófitos, pólen, microesporos, protoplastos, culturas de raízes cabeludas e/ou similares. A presente invenção também inclui sementes produzidas pelas plantas da presente invenção. Preferencialmente, as sementes compreendem os ácidos nucleicos de hidrofobina exógenos. Em uma realização, as sementes podem se desenvolver em plantas com resistência aumentada à infecção fúngica em comparação a uma variedade tipo selvagem da semente da planta. Como usado no presente pedido, uma “célula vegetal” inclui, mas não se limita a, um protoplasto, gameta produzindo célula e uma célula que regenera em uma planta inteira. A cultura de tecido de vários tecidos de plantas e regeneração de plantas deste ponto em diante é bem conhecida na técnica e é amplamente publicada.

[074] A referência no presente pedido a um ácido nucleico e/ou proteína “endógena” da invenção refere-se ao ácido nucleico e/ou proteína em questão conforme encontrado em uma planta em sua forma natural (isto é, sem que haja qualquer intervenção humana).

[075] O termo ácido nucleico “exógeno” refere-se a um ácido nucleico que foi introduzido em uma planta por meio de genetecnologia. Um ácido nucleico “exógeno” pode tanto não ocorrer em uma planta em sua forma natural, ser diferente do ácido nucleico em questão conforme encontrado em uma planta em sua forma natural, como pode ser idêntico a um ácido nucleico encontrado em uma planta em sua forma natural, mas não integrado dentro de seu ambiente genético natural. O significado correspondente de “exógeno” é aplicado no contexto de expressão de proteína. Por exemplo, uma planta transgênica que contém um transgene, isto é, um ácido nucleico exógeno, pode, quando comparada à expressão do gene endógeno, encontrar um aumento substancial da expressão do respectivo gene ou proteína no total. Uma planta transgênica, de acordo com a presente invenção, inclui um ácido nucleico de hidrofobina exógeno integrado em qualquer loci genético e opcionalmente a planta também pode incluir o gene endógeno dentro do antecedente genético natural.

[076] Para os propósitos da invenção, meios “recombinantes” em relação a, por exemplo, uma sequência de ácido nucleico, uma molécula de ácido nucleico, um cassete de expressão ou uma construção de vetor que compreende qualquer um ou mais dos ácidos nucleicos de hidrofobina, todas essas construções produzidas pelo homem por métodos de tecnologia genética em que tanto: (a) as sequências dos ácidos nucleicos de hidrofobina ou uma parte das mesmas, ou (b) a(s) sequência(s) de controle genético que são ligadas de maneira funcional à sequência de ácido nucleico de hidrofobina de acordo com a invenção, por exemplo, um promotor, ou (c) a) e b).

[077] não são localizadas em seu ambiente genético natural nem foram modificadas pelo homem por métodos de tecnologia genética. A modificação pode assumir a forma de, por exemplo, uma substituição, adição, deleção, inversão ou inserção de um ou mais resíduos de nucleotídeo. O ambiente genético natural é entendido como significando o locus gênico ou cromossômico natural na planta original, ou a presença em uma biblioteca genômica ou a combinação com o promotor natural.

[078] Um ácido nucleico recombinante também pode se referir a um ácido nucleico em uma forma isolada. Um ácido nucleico recombinante, cassete de expressão ou construção de vetor preferencialmente compreende um gene natural e um promotor natural, um gene natural e um promotor não natural, um gene não natural e um promotor natural, ou um gene não natural e um promotor não natural.

[079] No caso de uma biblioteca genômica, o ambiente genético natural da sequência de ácido nucleico é preferencialmente mantido, pelo menos em parte. O ambiente flanqueia a sequência de ácido nucleico em pelo menos um lado e tem um comprimento de sequência de pelo menos 50 bp, preferencialmente pelo menos 500 bp, especialmente preferencialmente pelo menos 1000 bp, com a máxima preferência pelo menos 5000 bp.

[080] Um cassete de expressão que ocorre naturalmente, por exemplo, a combinação de ocorrência natural do promotor natural das sequências de ácido nucleico com a sequência de ácido nucleico correspondente que codifica uma proteína útil nos métodos da presente invenção, conforme descrito acima, torna-se um cassete de expressão recombinante quando esse cassete de expressão é modificado pelo homem por métodos não naturais, sintéticos (“artificiais”) como, por exemplo, tratamento mutagênico. Métodos adequados são descritos, por exemplo, na patente US 5.565.350, documento WO 00/15815 ou patente US 200405323. Além disso, um cassete de expressão que ocorre naturalmente, por exemplo, a combinação de ocorrência natural do promotor natural das sequências de ácido nucleico com a sequência de ácido nucleico correspondente que codifica uma proteína útil nos métodos da presente invenção, conforme descrito acima, torna-se um cassete de expressão recombinante quando esse cassete de expressão não está integrado no meio genético natural, mas em um meio genético diferente.

[081] Deve-se notar ainda que, no contexto da presente invenção, o termo “ácido nucleico isolado” ou “proteína isolada” pode, em alguns casos, ser considerado como um sinônimo de um “ácido nucleico recombinante” ou uma “proteína recombinante”, respectivamente e refere-se a um ácido nucleico ou uma proteína que não está localizada em seu ambiente genético natural e/ou que foi modificada por métodos de tecnologia genética. O gene isolado pode ser isolado a partir de um organismo, ou pode ser fabricado artificialmente, por exemplo, por síntese química.

[082] Como usado no presente pedido, o termo “transgênico” refere-se a um organismo, por exemplo, uma planta, célula vegetal, calo, tecido vegetal ou parte de planta que contém de modo exógeno, o ácido nucleico, construção recombinante, vetor ou cassete de expressão descritos no presente pedido, ou uma parte dos mesmos, que é preferencialmente introduzido por processos biológicos não essenciais, preferencialmente, por transformação de Agrobacteria. A construção recombinante ou uma parte do mesmo é integrado de maneira estável em um cromossomo, de modo que é passado para gerações sucessivas por propagação clonal, propagação vegetativa ou propagação sexual. Gerações sucessivas preferenciais também são transgênicas. Os processos essencialmente biológicos podem ser cruzamento de plantas e/ou recombinação natural.

[083] Uma planta transgênica, células vegetais ou tecidos para os propósitos da invenção são assim entendidos como significando que um ácido nucleico de hidrofobina exógeno, construção recombinante, vetor ou cassete de expressão incluindo um ou mais ácidos nucleicos de hidrofobina são integrados no genoma por meios de genetecnologia.

[084] Preferencialmente, construções, vetores ou cassetes de expressão não estão presentes no genoma da planta original ou estão presentes no genoma da planta transgênica sem seu locus natural do genoma da planta original.

[085] Uma planta “tipo selvagem”, parte de planta “tipo selvagem” ou célula vegetal “tipo selvagem” que a dita planta, parte de planta ou célula vegetal não expressam ácido nucleico de hidrofobina exógeno ou proteína hidrofobina exógena.

[086] Locus natural significa a localização em um cromossomo específico, preferencialmente a localização entre certos genes, mais preferencialmente a mesma sequência antecedente como na planta original que é transformada.

[087] Preferencialmente, a planta transgênica, célula vegetal ou tecido da mesma expressam os ácidos nucleicos de hidrofobina, construções de hidrofobina ou cassetes de expressão de hidrofobina descritos no presente pedido.

[088] O termo “expressão” ou “expressão gênica” significa a transcrição de um gene específico, genes específicos ou construção de vetor genético específico. O termo “expressão” ou “expressão gênica”, em particular, significa a transcrição de um gene ou genes, ou construção de vetor genético dentro do RNA estrutural (rRNA, tRNA) ou mRNA, com ou sem subsequente tradução deste último dentro de uma proteína. O processo inclui a transcrição de DNA e processamento do produto de RNA resultante. O termo “expressão” ou “expressão gênica” também pode incluir a tradução do mRNA e com isso a síntese da proteína codificada, isto é, expressão de proteína.

[089] O termo “expressão aumentada”, “expressão melhorada”, “superexpressão” ou “aumento de conteúdo” como usado no presente pedido, significa qualquer forma de expressão que é adicional ao nível de expressão tipo selvagem original. Para os propósitos desta invenção, o nível de expressão tipo selvagem original também pode ser zero (ausência de expressão). A ausência de expressão na planta tipo selvagem ou de controle talvez seja devido à ausência da respectiva sequência codificadora.

[090] Métodos para aumentar a expressão de genes ou produtos de genes são bem documentados na técnica e incluem, por exemplo, a superexpressão direcionada pelos promotores apropriados, o uso de enhancers de transcrição ou enhancers de tradução. Ácidos nucleicos isolados que servem como promotores ou elementos enhancer podem ser introduzidos na posição apropriada (tipicamente a montante) de uma forma não heteróloga de um polinucleotídeo de modo a suprarregular a expressão de um ácido nucleico que codifica a proteína de interesse. Por exemplo, os promotores endógenos podem ser alterados in vivo por mutação, deleção e/ou substituição (consulte, Kmiec, patente US 5.565.350; Zarling et al, documento WO 9322443), ou promotores isolados podem ser introduzidos em uma célula vegetal na orientação e distância apropriada a partir de um gene da presente invenção, de modo a controlar a expressão do gene.

[091] Se a expressão da proteína é desejada, é geralmente desejável incluir uma região de poliadenilação na extremidade 3’ de uma região codificadora de polinucleotídeo. A região de poliadenilação pode ser derivada do gene natural, a partir de uma variedade de genes de outras plantas, ou a partir do T-DNA. A sequência da extremidade 3’ a ser adicionada pode ser derivada, por exemplo, dos genes da nopalina sintase ou octopina sintase, ou alternativamente de outro gene de planta, ou menos preferencialmente de qualquer outro gene eucariótico.

[092] Uma sequência de íntron pode ser adicionada à região 5’ não traduzida (UTR) e/ou à sequência codificadora da sequência codificadora parcial para aumentar a quantidade de mensagem madura que se acumula no citosol. A inclusão de um íntron de junção na unidade de transcrição tanto nos construções para expressão em vegetais como em animais mostraram aumentar a expressão gênica em ambos, mRNA e proteínas, em níveis de até 1000 vezes (Buchman e Berg (1988) Mol. Cell Biol. 8: 4395-4405; Callis et al. (1987) Genes Dev 1:11831200). Esse aumento de íntron da expressão gênica é tipicamente maior quando colocado perto da extremidade 5’ da unidade de transcrição. O uso de íntrons do milho Adh1-S íntron 1, 2 e 6, e do íntron Bronze-1 são conhecidos na técnica. Para informações gerais consulte: The Maize Handbook, Capítulo 116, Freeling e Walbot, Eds., Springer, N.Y. (1994).

[093] O termo “fragmento funcional” refere-se a qualquer ácido nucleico ou proteína que meramente compreende uma parte do ácido nucleico inteiro ou proteína inteira, respectivamente, mas ainda fornece a mesma função, por exemplo, resistência fúngica, quando expresso ou reprimido em uma planta, respectivamente. Preferencialmente, o fragmento compreende pelo menos 50%, pelo menos 60%, pelo menos 70%, pelo menos 80%, pelo menos 90% pelo menos 95%, pelo menos 98%, pelo menos 99% da sequência original. Preferencialmente, o fragmento funcional compreende ácidos nucleicos ou aminoácidos contíguos como no ácido nucleico original ou proteína original, respectivamente. Em uma realização, os fragmentos de quaisquer ácidos nucleicos de hidrofobina têm uma identidade conforme definido acima ao longo de um comprimento de pelo menos 20%, pelo menos 30%, pelo menos 50%, pelo menos 75%, pelo menos 90% dos nucleotídeos do respectivo ácido nucleico de hidrofobina.

[094] Nos casos em que é desejado superexpressão de ácido nucleico, o termo “atividade funcional similar” ou “função similar” significa que qualquer homólogo e/ou fragmento fornece resistência fúngica quando expresso em uma planta. Preferencialmente, atividade funcional similar significa que pelo menos 50%, pelo menos 60%, pelo menos 70%, pelo menos 80%, pelo menos 90%, pelo menos 95%, pelo menos 98%, pelo menos 99% ou 100% ou resistência fúngica mais alta em comparação com a atividade funcional fornecida pela expressão exógena da sequência de nucleotídeo de hidrofobina conforme definido pela SEQ ID NO: 1 ou a sequência de proteína hidrofobina conforme definido pela SEQ ID NO: 2.

[095] O termo “atividade aumentada” ou “atividade melhorada”, como usado no presente pedido significa qualquer proteína que tem atividade aumentada e que fornece uma resistência fúngica aumentada em comparação a planta tipo selvagem que expressa somente o respectivo ácido nucleico de hidrofobina endógeno. No que se refere à superexpressão, para os propósitos desta invenção, o nível de expressão tipo selvagem original também pode ser zero (ausência de expressão).

[096] Em relação a uma construção de vetor e/ou moléculas de ácidos nucleicos recombinantes, o termo “ligado de maneira funcional” entende- se significar que o ácido nucleico a ser expresso é ligado à sequência reguladora, incluindo promotores, terminadores, enhancers e/ou outros elementos de controle de expressão (por exemplo, sinais de poliadenilação), de uma maneira que permita expressão do ácido nucleico (por exemplo, em uma célula vegetal hospedeira quando o vetor é introduzido na célula vegetal hospedeira). Essas sequências reguladoras são descritas, por exemplo, em Goeddel, Gene Expression Technology: Methods in Enzymology 185, Academic Press, San Diego, CA (1990) e Gruber e Crosby, em: Methods in Plant Molecular Biology and Biotechnology, Eds. Glick e Thompson, Cápitulo 7, 89-108, CRC Press: Boca Raton, Flórida, incluindo as referências a esse respeito. Sequências reguladoras incluem as que direcionam expressão constitutiva de uma sequência de nucleotídeos em muitos tipos de células hospedeiras e as que direcionam expressão direta da sequência de nucleotídeos somente em certas células hospedeiras ou sob certas condições. Será apreciado pelo técnico no assunto que o projeto do vetor pode depender desses fatores como a escolha da célula hospedeira a ser transformada, o nível de expressão de ácido nucleico desejado, e similares.

[097] O termo “introdução” ou “transformação”, conforme mencionado no presente pedido, engloba a transferência de um polinucleotídeo exógeno em uma célula hospedeira, independentemente do método usado para a transferência. O tecido vegetal capaz de propagação clonal subsequente, tanto por organogênese como por embriogênese, pode ser transformado por uma construção de vetor da presente invenção e regenerar uma planta inteira a partir dele. O tecido específico escolhido varia de acordo com os sistemas de propagação clonal disponíveis e mais adequados à espécie particular sendo transformada. Tecido exemplares alvos incluem discos foliais, pólen, embriões, cotilédones, hipocótilos, megagametófitos, tecido caloso, tecido merismático existente (por exemplo, meristema apical, gemas axilares e meristemas de raiz), e tecido de meristema induzido (por exemplo, meristema de cotilédone e meristema de hipocótilo). O polinucleotídeo pode ser introduzido de maneira transitória pu estável em uma célula hospedeira e pode ser mantido não integrado, por exemplo, como um plasmídeo. De maneira alternativa, ele pode ser integrado no genoma hospedeiro. O genoma hospedeiro inclui o ácido nucleico contido no núcleo bem como o ácido nucleico contido nos plastídeos, por exemplo, cloroplastos e/ou mitocôndria. A célula vegetal transformada resultante pode então ser usada para regenerar uma planta transformada de uma maneira conhecida por técnicos no assunto.

[098] O termo “terminador” engloba uma sequência de controle que é uma sequência de DNA no final de uma unidade de transcrição que sinaliza o processamento 3’ e poliadenilação de um transcrito primário e terminação da transcrição. O terminador pode ser derivado do gene natural, a partir e uma variedade de outros genes de plantas, ou a partir do T-DNA. O terminador a ser adicionado pode ser derivado, por exemplo, dos genes da nopalina sintase ou octopina sintase, ou alternativamente de outro gene de planta, ou menos preferencialmente de qualquer outro gene de eucarionte.

DESCRIÇÃO DETALHADA DA INVENÇÃO

[099] A presente invenção mostra que aumentar expressão em uma planta de um ácido nucleico de hidrofobina que codifica um polipeptídeo de hidrofobina fornece plantas com resistência fúngica melhorada em relação a plantas de controle.

ÁCIDOS NUCLEICOS DE HIDROFOBINA

[100] Dessa forma, um ácido nucleico de hidrofobina que codifica uma proteína hidrofobina é uma realização da presente invenção.

[101] Em uma realização da presente invenção, o ácido nucleico de hidrofobina codifica uma hidrofobina classe I ou classe II, preferencialmente, uma hidrofobina selecionada a partir do grupo que consiste em uma hidrofobina de Aspergillus nidulans (por exemplo, dewA; sequência de ácido nucleico conforme mostrado na SEQ ID NO: 1), rodA (sequência de ácido nucleico conforme mostrado na SEQ ID NO: 3), hypA (sequência de ácido nucleico conforme mostrado na SEQ ID NO: 5), hypB (sequência de ácido nucleico conforme mostrado na SEQ ID NO: 7), sc3 (sequência de ácido nucleico conforme mostrado na SEQ ID NO: 9), basf1 (sequência de ácido nucleico conforme mostrado na SEQ ID NO: 11), basf2 (sequência de ácido nucleico conforme mostrado na SEQ ID NO: 13), hidrofobina SC3 (sequência de ácido nucleico conforme mostrado na SEQ ID NO: 43 ou 44), hidrofobina HFBII (sequência de ácido nucleico que codifica uma sequência de aminoácidos conforme mostrada na SEQ ID NO: 45 ou 46), hidrofobina Gm (sequência de ácido nucleico conforme mostrado na SEQ ID NO: 41), hidrofobina TT1 (sequência de ácido nucleico conforme mostrado na SEQ ID NO: 89), e hidrofobina HFPI (sequência de aminoácidos conforme mostrada na SEQ ID NO: 90), ou um fragmento funcional, derivado, ortólogo ou parálogo do mesmo.

[102] Preferencialmente, o ácido nucleico de hidrofobina é uma molécula de ácido nucleico isolada que compreende um ácido nucleico selecionado a partir do grupo que consiste em: (i) um ácido nucleico que tem, em ordem crescente, de preferência pelo menos 60%, pelo menos 61%, pelo menos 62%, pelo menos 63%, pelo menos 64%, pelo menos 65%, pelo menos 66%, pelo menos 67%, pelo menos 68%, pelo menos 69%, pelo menos 70%, pelo menos 71%, pelo menos 72%, pelo menos 73%, pelo menos 74%, pelo menos 75%, pelo menos 76%, pelo menos 77%, pelo menos 78%, pelo menos 79%, pelo menos 80%, pelo menos 81%, pelo menos 82%, pelo menos 83%, pelo menos 84%, pelo menos 85%, pelo menos 86%, pelo menos 87%, pelo menos 88%, pelo menos 89%, pelo menos 90%, pelo menos 91%, pelo menos 92%, pelo menos 93%, pelo menos 94%, pelo menos 95%, pelo menos 96%, pelo menos 97%, pelo menos 98%, pelo menos 99% ou 100% de identidade de sequência à sequência de ácido nucleico representada pela SEQ ID NO: 1, 3, 5, 7, 9, 11, 13, 39, 41, 55 a 62, 89 ou 90, ou um fragmento funcional, derivado, ortólogo ou parálogo do mesmo; (ii) a sequência complementar de qualquer um dos ácidos nucleicos de (i); (iii) um ácido nucleico que codifica uma proteína hidrofobina que tem, em ordem crescente, de preferência pelo menos 60%, pelo menos 61%, pelo menos 62%, pelo menos 63%, pelo menos 64%, pelo menos 65%, pelo menos 66%, pelo menos 67%, pelo menos 68%, pelo menos 69%, pelo menos 70%, pelo menos 71%, pelo menos 72%, pelo menos 73%, pelo menos 74%, pelo menos 75%, pelo menos 76%, pelo menos 77%, pelo menos 78%, pelo menos 79%, pelo menos 80%, pelo menos 81%, pelo menos 82%, pelo menos 83%, pelo menos 84%, pelo menos 85%, pelo menos 86%, pelo menos 87%, pelo menos 88%, pelo menos 89%, pelo menos 90%, pelo menos 91%, pelo menos 92%, pelo menos 93%, pelo menos 94%, pelo menos 95%, pelo menos 96%, pelo menos 97%, pelo menos 98%, pelo menos 99% ou 100% de identidade de sequência à sequência de aminoácidos representada pela SEQ ID NO: 2, 4, 6, 8, 10, 12, 14, 40, 42, 43, 44, 45, 46, 87 ou 88, ou um fragmento funcional, derivado, ortólogo ou parálogo do mesmo; preferencialmente o polipeptídeo hidrofobina confere resistência fúngica melhorada em relação às plantas de controle; (iv) uma molécula de ácido nucleico que hibridiza com uma molécula de ácido nucleico de (i) a (iii) sob condições de hibridização de alta estringência, e que preferencialmente codifica uma proteína hidrofobina que tem essencialmente a mesma atividade biológica que uma proteína hidrofobina codificada pela SEQ ID NO: 2, 4, 6, 8, 10, 12, 14, 40, 42, 43, 44, 45, 46, 87 ou 88; preferencialmente a proteína hidrofobina codificada confere resistência fúngica melhorada em relação às plantas de controle; e (v) um ácido nucleico que codifica a mesma proteína hidrofobina que os ácidos nucleicos de (i) a (iv) acima, mas que difere dos ácidos nucleicos de (i) a (iv) acima devido à degeneração do código genético.

[103] Mais preferencialmente, o ácido nucleico de hidrofobina isolado que compreende um ácido nucleico selecionado a partir do grupo que consiste em: (i) um ácido nucleico que tem em ordem crescente de preferência pelo menos 90%, pelo menos 91%, pelo menos 92%, pelo menos 93%, pelo menos 94%, pelo menos 95%, pelo menos 96%, pelo menos 97%, pelo menos 98%, pelo menos 99% ou pelo menos 100% de identidade de sequência à sequência de ácido nucleico representada pela SEQ ID NO: 1, 3, 5, 7, 9, 11, 13, 39, 41, 55 a 62, 89 ou 90; (ii) a sequência complementar de qualquer um dos ácidos nucleicos de (i); (iii) um ácido nucleico que codifica uma proteína hidrofobina que tem em ordem crescente de preferência pelo menos 90%, pelo menos 91%, pelo menos 92%, pelo menos 93%, pelo menos 94%, pelo menos 95%, pelo menos 96%, pelo menos 97%, pelo menos 98%, pelo menos 99% ou pelo menos 100% de identidade de sequência à sequência de aminoácidos representada pela SEQ ID NO: 2, 4, 6, 8, 10, 12, 14, 40, 42, 43, 44, 45, 46, 87 ou 88; preferencialmente o polipeptídeo hidrofobina confere resistência fúngica melhorada em relação às plantas de controle; (iv) uma molécula de ácido nucleico que hibridiza com uma molécula de ácido nucleico de (i) a (iii) sob condições de hibridização de alta estringência, e que preferencialmente codifica uma proteína hidrofobina que tem essencialmente a mesma atividade biológica que uma proteína hidrofobina codificada pela SEQ ID NO: 2, 4, 6, 8, 10, 12, 14, 40, 42, 43, 44, 45, 46, 87 ou 88; preferencialmente a proteína hidrofobina codificada confere resistência fúngica melhorada em relação às plantas de controle; e (v) um ácido nucleico que codifica a mesma proteína hidrofobina que os ácidos nucleicos de (i) a (iv) acima, mas que difere dos ácidos nucleicos de (i) a (iv) acima devido à degeneração do código genético.

[104] Mais preferencialmente, o ácido nucleico de hidrofobina é uma molécula de ácido nucleico isolada que compreende um ácido nucleico selecionado a partir do grupo que consiste em: (i) um ácido nucleico que tem, em ordem crescente, de preferência pelo menos 60%, pelo menos 61%, pelo menos 62%, pelo menos 63%, pelo menos 64%, pelo menos 65%, pelo menos 66%, pelo menos 67%, pelo menos 68%, pelo menos 69%, pelo menos 70%, pelo menos 71%, pelo menos 72%, pelo menos 73%, pelo menos 74%, pelo menos 75%, pelo menos 76%, pelo menos 77%, pelo menos 78%, pelo menos 79%, pelo menos 80%, pelo menos 81%, pelo menos 82%, pelo menos 83%, pelo menos 84%, pelo menos 85%, pelo menos 86%, pelo menos 87%, pelo menos 88%, pelo menos 89%, pelo menos 90%, pelo menos 91%, pelo menos 92%, pelo menos 93%, pelo menos 94%, pelo menos 95%, pelo menos 96%, pelo menos 97%, pelo menos 98%, pelo menos 99% ou 100% de identidade de sequência à sequência de ácido nucleico representada pela SEQ ID NO: 1), ou um fragmento funcional, derivado, ortólogo ou parálogo do mesmo. (ii) a sequência complementar de qualquer um dos ácidos nucleicos de (i); (iii) um ácido nucleico que codifica uma proteína hidrofobina que tem, em ordem crescente, de preferência pelo menos 60%, pelo menos 61%, pelo menos 62%, pelo menos 63%, pelo menos 64%, pelo menos 65%, pelo menos 66%, pelo menos 67%, pelo menos 68%, pelo menos 69%, pelo menos 70%, pelo menos 71%, pelo menos 72%, pelo menos 73%, pelo menos 74%, pelo menos 75%, pelo menos 76%, pelo menos 77%, pelo menos 78%, pelo menos 79%, pelo menos 80%, pelo menos 81%, pelo menos 82%, pelo menos 83%, pelo menos 84%, pelo menos 85%, pelo menos 86%, pelo menos 87%, pelo menos 88%, pelo menos 89%, pelo menos 90%, pelo menos 91%, pelo menos 92%, pelo menos 93%, pelo menos 94%, pelo menos 95%, pelo menos 96%, pelo menos 97%, pelo menos 98%, pelo menos 99% ou 100% de identidade de sequência à sequência de aminoácidos representada pela SEQ ID NO: 2, ou um fragmento funcional, derivado, ortólogo ou parálogo do mesmo; preferencialmente o polipeptídeo hidrofobina confere resistência fúngica melhorada em relação às plantas de controle; (iv) uma molécula de ácido nucleico que hibridiza com uma molécula de ácido nucleico de (i) a (iii) sob condições de hibridização de alta estringência, e que preferencialmente codifica uma proteína hidrofobina que tem essencialmente a mesma atividade biológica que uma proteína hidrofobina codificada pela SEQ ID NO: 2; preferencialmente a proteína hidrofobina codificada confere resistência fúngica melhorada para plantas de controle; e (v) um ácido nucleico que codifica a mesma proteína hidrofobina que os ácidos nucleicos de (i) a (iv) acima, mas que difere dos ácidos nucleicos de (i) a (iv) acima devido à degeneração do código genético.

[105] Mais preferencialmente, o ácido nucleico de hidrofobina isolado que compreende um ácido nucleico selecionado a partir do grupo que consiste em: (i) um ácido nucleico que tem em ordem crescente de preferência pelo menos 90%, pelo menos 91%, pelo menos 92%, pelo menos 93%, pelo menos 94%, pelo menos 95%, pelo menos 96%, pelo menos 97%, pelo menos 98%, pelo menos 99% ou pelo menos 100% de identidade de sequência à sequência de ácido nucleico representada pela SEQ ID NO: 1; (ii) a sequência complementar de qualquer um dos ácidos nucleicos de (i); (iii) um ácido nucleico que codifica uma proteína hidrofobina que tem em ordem crescente de preferência pelo menos 90%, pelo menos 91%, pelo menos 92%, pelo menos 93%, pelo menos 94%, pelo menos 95%, pelo menos 96%, pelo menos 97%, pelo menos 98%, pelo menos 99% ou pelo menos 100% de identidade de sequência à sequência de aminoácidos representada pela SEQ ID NO: 2; preferencialmente o polipeptídeo hidrofobina confere resistência fúngica melhorada para plantas de controle; (iv) uma molécula de ácido nucleico que hibridiza com uma molécula de ácido nucleico de (i) a (iii) sob condições de hibridização de alta estringência, e que preferencialmente codifica uma proteína hidrofobina que tem essencialmente a mesma atividade biológica que uma proteína hidrofobina codificada pela SEQ ID NO: 2; preferencialmente a proteína hidrofobina codificada confere resistência fúngica melhorada para plantas de controle; e (v) um ácido nucleico que codifica a mesma proteína hidrofobina que os ácidos nucleicos de (i) a (iv) acima, mas que difere dos ácidos nucleicos de (i) a (iv) acima devido à degeneração do código genético.

[106] As porcentagens de identidade de um ácido nucleico são indicadas com referência à região inteira de nucleotídeo fornecida em uma sequência especificamente divulgada no presente pedido.

[107] Preferencialmente, o ácido nucleico de hidrofobina compreende pelo menos cerca de 250, pelo menos cerca de 275, pelo menos cerca de 300, pelo menos cerca de 350, pelo menos cerca de 375, pelo menos cerca de 380, pelo menos cerca de 390, pelo menos cerca de 400, pelo menos cerca de 410, pelo menos cerca de 420, pelo menos cerca de 430, pelo menos cerca de 440, pelo menos cerca de 450 nucleotídeos, pelo menos cerca de 460, pelo menos cerca de 470 nucleotídeos, preferencialmente nucleotídeos contínuos, preferencialmente contados a partir das extremidades 5’ ou 3’ do ácido nucleico, ou até o comprimento total da sequência de ácido nucleico especificada na SEQ ID NO: 1, 3, 5, 7, 9, 11, 13, 39, 41, 55 a 62, 89 ou 90, preferencialmente da sequência de ácido nucleico especificada na SEQ ID NO: 1. Preferencialmente, um fragmento de ácido nucleico de hidrofobina tem substancialmente a mesma atividade biológica que a sequência de ácido nucleico dada na SEQ ID NO: 1, 3, 5, 7, 9, 11, 13, 39, 41, 55 a 62, 89 ou 90, preferencialmente, como SEQ ID NO: 1.

[108] Preferencialmente, o ácido nucleico de hidrofobina isolado compreende ou consiste em uma sequência conforme representada na SEQ ID NO: 1, 3, 5, 7, 9, 11, 13, 39, 41, 55 a 62, 89 ou 90, um complemento do mesmo, um ácido nucleico que codifica uma proteína hidrofobina com SEQ ID NO: 2, 4, 6, 8, 10, 12, 14, 40, 42, 43, 44, 45, 46, 87 ou 88, ou uma molécula de ácido nucleico que hibridiza com qualquer uma dessas moléculas de ácido nucleico ou uma sequência complementar (complemento) do mesmo sob condições de hibridização de alta estringência.

[109] Com a máxima preferência, o ácido nucleico de hidrofobina isolado compreende ou consiste em uma sequência conforme representada na SEQ ID NO: 1, um complemento do mesmo, um ácido nucleico que codifica uma proteína hidrofobina com SEQ ID NO: 2, ou uma molécula de ácido nucleico que hibridiza com qualquer uma dessas moléculas de ácido nucleico ou uma sequência complementar (complemento) do mesmo sob condições de hibridização de alta estringência.

PROTEÍNAS HIDROFOBINA

[110] Outra realização da presente invenção é uma proteína hidrofobina.

[111] Em uma realização da presente invenção, a proteína hidrofobina é uma hidrofobina classe I ou classe II, preferencialmente, uma proteína hidrofobina selecionada a partir do grupo que consiste em uma hidrofobina de Aspergillus nidulans (por exemplo, dewA; sequência de aminoácidos conforme mostrada na SEQ ID NO: 2), rodA (sequência de aminoácidos conforme mostrada na SEQ ID NO: 4), hypA (sequência de aminoácidos conforme mostrada na SEQ ID NO: 6), hypB (sequência de aminoácidos conforme mostrada na SEQ ID NO: 8), sc3 (sequência de aminoácidos conforme mostrada na SEQ ID NO: 10), basf1 (sequência de aminoácidos conforme mostrada na SEQ ID NO: 12), basf2 (sequência de aminoácidos conforme mostrada na SEQ ID NO: 14), hidrofobina SC3 (sequência de aminoácidos conforme mostrada na SEQ ID NO: 43 ou 44), hidrofobina HFBII (sequência de aminoácidos conforme mostrada na SEQ ID NO: 45 ou 46), hidrofobina Gm (sequência de aminoácidos conforme mostrada na SEQ ID NO: 42), hidrofobina TT1 (sequência de aminoácidos conforme mostrada na SEQ ID NO: 87), e hidrofobina HFPI (sequência de aminoácidos conforme mostrada na SEQ ID NO: 88), ou um fragmento funcional, derivado, ortólogo ou parálogo do mesmo.

[112] Preferencialmente, a proteína hidrofobina é uma proteína que compreende uma sequência de aminoácidos selecionada a partir do grupo que consiste em: (i) uma sequência de aminoácidos que tem, em ordem crescente, de preferência pelo menos 60%, pelo menos 61%, pelo menos 62%, pelo menos 63%, pelo menos 64%, pelo menos 65%, pelo menos 66%, pelo menos 67%, pelo menos 68%, pelo menos 69%, pelo menos 70%, pelo menos 71%, pelo menos 72%, pelo menos 73%, pelo menos 74%, pelo menos 75%, pelo menos 76%, pelo menos 77%, pelo menos 78%, pelo menos 79%, pelo menos 80%, pelo menos 81%, pelo menos 82%, pelo menos 83%, pelo menos 84%, pelo menos 85%, pelo menos 86%, pelo menos 87%, pelo menos 88%, pelo menos 89%, pelo menos 90%, pelo menos 91%, pelo menos 92%, pelo menos 93%, pelo menos 94%, pelo menos 95%, pelo menos 96%, pelo menos 97%, pelo menos 98%, pelo menos 99% ou 100% de identidade de sequência à sequência de aminoácidos representada pela SEQ ID NO: 2, 4, 6, 8, 10, 12, 14, 40, 42, 43, 44, 45, 46, 87 ou 88, ou um fragmento funcional, derivado, ortólogo ou parálogo do mesmo; preferencialmente a proteína hidrofobina confere resistência fúngica melhorada em relação às plantas de controle. (ii) uma sequência de aminoácidos codificada por um ácido nucleico que tem, em ordem crescente, de preferência pelo menos 60%, pelo menos 61%, pelo menos 62%, pelo menos 63%, pelo menos 64%, pelo menos 65%, pelo menos 66%, pelo menos 67%, pelo menos 68%, pelo menos 69%, pelo menos 70%, pelo menos 71%, pelo menos 72%, pelo menos 73%, pelo menos 74%, pelo menos 75%, pelo menos 76%, pelo menos 77%, pelo menos 78%, pelo menos 79%, pelo menos 80%, pelo menos 81%, pelo menos 82%, pelo menos 83%, pelo menos 84%, pelo menos 85%, pelo menos 86%, pelo menos 87%, pelo menos 88%, pelo menos 89%, pelo menos 90%, pelo menos 91%, pelo menos 92%, pelo menos 93%, pelo menos 94%, pelo menos 95%, pelo menos 96%, pelo menos 97%, pelo menos 98%, pelo menos 99% ou 100% de identidade de sequência à sequência de ácido nucleico representada pela SEQ ID NO: 1, 3, 5, 7, 9, 11, 13, 39, 41, 55 a 62, 89 ou 90, ou um fragmento funcional, derivado, ortólogo ou parálogo do mesmo; preferencialmente a proteína hidrofobina confere resistência fúngica melhorada em relação às plantas de controle.

[113] Preferencialmente, a proteína hidrofobina da presente invenção é caracterizada por sua propriedade de aumentar à temperatura ambiente o ângulo de contato de uma gota de água em uma superfície de vidro revestida com a proteína hidrofobina para pelo menos 20°, preferencialmente pelo menos 25°, mais preferencialmente pelo menos 30°, em comparação ao ângulo de contato da gota de água na superfície de vidro não revestida com a proteína hidrofobina.

[114] Preferencialmente, a proteína hidrofobina é uma proteína que compreende uma sequência de aminoácidos selecionada a partir do grupo que consiste em: (i) uma sequência de aminoácidos que tem, em ordem crescente, de preferência pelo menos 90%, pelo menos 91%, pelo menos 92%, pelo menos 93%, pelo menos 94%, pelo menos 95%, pelo menos 96%, pelo menos 97%, pelo menos 98%, pelo menos 99% ou pelo menos 100% de identidade de sequência à sequência de aminoácidos representada pela SEQ ID NO: 2, 4, 6, 8, 10, 12, 14, 40, 42, 43, 44, 45, 46, 87 ou 88, ou um fragmento funcional, derivado, ortólogo ou parálogo do mesmo; preferencialmente a proteína hidrofobina confere resistência fúngica melhorada em relação às plantas de controle. (ii) sequência de aminoácidos codificada por um ácido nucleico que tem, em ordem crescente, de preferência pelo menos 90%, pelo menos 91%, pelo menos 92%, pelo menos 93%, pelo menos 94%, pelo menos 95%, pelo menos 96%, pelo menos 97%, pelo menos 98%, pelo menos 99% ou pelo menos 100% de identidade de sequência à sequência de ácido nucleico representada pela SEQ ID NO: 1, 3, 5, 7, 9, 11, 13, 39, 41, 55 a 62, 89 ou 90, ou um fragmento funcional, derivado, ortólogo ou parálogo do mesmo; preferencialmente a proteína hidrofobina confere resistência fúngica melhorada em relação às plantas de controle.

[115] Preferencialmente, a proteína hidrofobina é uma proteína que compreende uma sequência de aminoácidos selecionada a partir do grupo que consiste em: (i) uma sequência de aminoácidos que tem em ordem crescente, de preferência, pelo menos 60%, 61%, 62%, 63%, 64%, 65%, 66%, 67%, 68%, 69%, 70%, 71%, 72%, 73%, 74%, 75%, 76%, 77%, 78%, 79%, 80%, 81%, 82%, 83%, 84%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% ou 100% de identidade de sequência à sequência de aminoácidos representada pela SEQ ID NO: 2, ou um fragmento funcional, derivado, ortólogo ou parálogo do mesmo; preferencialmente a proteína hidrofobina confere resistência fúngica melhorada em relação às plantas de controle; ou (ii) uma sequência de aminoácidos codificada por um ácido nucleico que tem, em ordem crescente, de preferência pelo menos 60%, 61%, 62%, 63%, 64%, 65%, 66%, 67%, 68%, 69%, 70%, 71%, 72%, 73%, 74%, 75%, 76%, 77%, 78%, 79%, 80%, 81%, 82%, 83%, 84%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% ou 100% de identidade de sequência à sequência de ácidos nucleicos representada pela SEQ ID NO: 1, ou um fragmento funcional, derivado, ortólogo ou parálogo do mesmo; preferencialmente a proteína hidrofobina confere resistência fúngica melhorada em relação às plantas de controle.

[116] Preferencialmente, a proteína hidrofobina é uma proteína que compreende uma sequência de aminoácidos selecionada a partir do grupo que consiste em: (i) uma sequência de aminoácidos que tem, em ordem crescente, de preferência pelo menos 90%, pelo menos 91%, pelo menos 92%, pelo menos 93%, pelo menos 94%, pelo menos 95%, pelo menos 96%, pelo menos 97%, pelo menos 98%, pelo menos 99% ou pelo menos 100% de identidade de sequência à sequência de aminoácidos representada pela SEQ ID NO: 2, ou um fragmento funcional, derivado, ortólogo ou parálogo do mesmo; preferencialmente a proteína hidrofobina confere resistência fúngica melhorada em relação às plantas de controle; ou (ii) sequência de aminoácidos codificada por um ácido nucleico que tem, em ordem crescente, de preferência pelo menos 90%, pelo menos 91%, pelo menos 92%, pelo menos 93%, pelo menos 94%, pelo menos 95%, pelo menos 96%, pelo menos 97%, pelo menos 98%, pelo menos 99% ou pelo menos 100% de identidade de sequência à sequência de ácido nucleico representada pela SEQ ID NO: 1, ou um fragmento funcional, derivado, ortólogo ou parálogo do mesmo; preferencialmente a proteína hidrofobina confere resistência fúngica aumentada em relação às plantas de controle.

[117] As porcentagens de identidade de uma sequência de aminoácidos ou proteína são indicadas com referência à sequência inteira de aminoácidos especificamente divulgada no presente pedido.

[118] Preferencialmente, a proteína hidrofobina compreende pelo menos cerca de 50, pelo menos cerca de 60, pelo menos cerca de 70, pelo menos cerca de 80, pelo menos cerca de 90, pelo menos cerca de 100, pelo menos cerca de 110, pelo menos cerca de 120, pelo menos cerca de 125, pelo menos cerca de 130, pelo menos cerca de 135, pelo menos cerca de 140, pelo menos cerca de 145, pelo menos cerca de 150, pelo menos cerca de 155 resíduos de aminoácidos, preferencialmente resíduos de aminoácidos contínuos, preferencialmente contados a partir da terminação N ou da terminação C da sequência de aminoácidos, ou até o comprimento total da sequência de aminoácidos especificada na SEQ ID NO: 2, 4, 6, 8, 10, 12, 14, 40, 42, 43, 44, 45, 46, 87 ou 88, preferencialmente da sequência de aminoácidos especificada na SEQ ID NO: 2. Preferencialmente, um fragmento de proteína hidrofobina tem substancialmente a mesma atividade biológica que a sequência de aminoácidos dada na SEQ ID NO: 2, 4, 6, 8, 10, 12, 14, 40, 42, 43, 44, 45, 46, 87 ou 88, preferencialmente, como SEQ ID NO: 2.

[119] Preferencialmente, a proteína hidrofobina isolada compreende ou consiste em uma sequência de aminoácidos conforme representada na SEQ ID NO: 2, 4, 6, 8, 10, 12, 14, 40, 42, 43, 44, 45, 46, 87 ou 88, ou é codificada por um ácido nucleico com uma sequência conforme mostrado na SEQ ID NO: 1, 3, 5, 7, 9, 11, 13, 39, 41, 55 a 62, 89 ou 90.

[120] Preferencialmente, a proteína hidrofobina isolada compreende ou consiste em uma sequência de aminoácidos conforme representada na SEQ ID NO: 2, ou é codificada por um ácido nucleico com uma sequência conforme mostrada na SEQ ID NO: 1.

ÁCIDOS NUCLEICOS QUE CODIFICAM UMA PROTEÍNA DE FUSÃO HIDROFOBINA E PROTEÍNAS DE FUSÃO HIDROFOBINA

[121] Outra realização da presente invenção é um ácido nucleico que codifica uma proteína de fusão hidrofobina, isto é, um ácido nucleico de proteína de fusão hidrofobina. Uma realização adicional da presente invenção também é uma proteína de fusão hidrofobina.

[122] Uma proteína de fusão hidrofobina pode compreender um ou mais dos seguintes elementos: a) sequência sinal, b) polipeptídeo parceiro de fusão, c) proteína hidrofobina, d) sequências ligantes, e e) sequência de purificação. Preferencialmente, a proteína de fusão compreende um ou mais (1, 2, 3, 4 ou 5) do elemento selecionado, por exemplo, dois polipeptídeos parceiros de fusão.

[123] Dessa forma, a proteína hidrofobina pode ser compreendida em uma proteína de fusão hidrofobina juntamente com um ou mais dos seguintes elementos: a) sequência sinal, b) polipeptídeo parceiro de fusão, c) sequências ligantes, e d) sequência de purificação.

[124] Em uma realização, a proteína de fusão hidrofobina compreende um parceiro de fusão e uma proteína hidrofobina. Opcionalmente, a proteína de fusão hidrofobina ainda compreende uma sequência sinal, preferencialmente uma sequência sinal de secreção, e opcionalmente uma sequência ligante e opcionalmente uma sequência de purificação.

[125] Em uma realização, a proteína de fusão hidrofobina compreende uma sequência sinal de secreção e uma proteína hidrofobina. Opcionalmente, a proteína de fusão hidrofobina ainda compreende um parceiro de fusão e opcionalmente uma sequência ligante e opcionalmente uma sequência de purificação.

[126] Preferencialmente, a proteína de fusão hidrofobina compreende uma sequência sinal de secreção, um parceiro de fusão, e uma proteína hidrofobina. Opcionalmente, a proteína de fusão hidrofobina ainda compreende uma sequência ligante e opcionalmente uma sequência de purificação.

[127] Preferencialmente, a proteína de fusão hidrofobina compreende uma sequência sinal de secreção, um parceiro de fusão, uma sequência ligante e uma proteína hidrofobina. Opcionalmente, a proteína de fusão hidrofobina compreende uma sequência de purificação.

SEQUÊNCIA SINAL

[128] Preferencialmente, a proteína de fusão compreende uma sequência sinal. Uma sequência sinal é um peptídeo curto (3 a 60 aminoácidos de comprimento) que direciona o transporte de uma proteína, preferencialmente para outras organelas dentro da célula ou para certas localizações subcelulares ou para a secreção de uma proteína.

[129] A sequência sinal codificada pelo ácido nucleico de sequência sinal é preferencialmente cerca de 5, 10, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35, 36, 37, 38, 39, 40, 41, 42, 43, 44, 45, 46, 47, 48, 49, 50, 51, 52, 53, 54 ou mais aminoácidos de comprimento. Preferencialmente a sequência sinal é clivada do resto da proteína de fusão, preferencialmente por uma peptidase sinal, depois que a proteína é transportada. Em outra realização, a sequência sinal não é clivada do resto da proteína de fusão depois que a proteína é transportada.

[130] Preferencialmente, a sequência sinal direciona o transporte da proteína a outras organelas dentro da célula. Preferencialmente, a sequência sinal direciona o peptídeo hidrofobina ao núcleo, mitocôndria, matriz mitocondrial, retículo endoplasmático, plastídeo, cloroplasto, apicoplasto, cromoplasto, cianela, tilacoide, amiloplasto, peroxissoma, glioxissoma e/ou hidrogenossoma. Preferencialmente, a sequência sinal direciona o transporte da proteína para os corpos de inclusão de uma célula procarionte como E. coli.

[131] Com a máxima preferência, a sequência sinal é uma sequência sinal de secreção. Preferencialmente, a sequência sinal de secreção direciona o transporte de uma proteína hidrofobina ou proteína de fusão hidrofobina ao exterior do protoplasto ou simplasto. Mais preferencialmente, a sequência sinal de secreção direciona o transporte de uma proteína hidrofobina no apoplasto, preferencialmente até o interior ou sobre a parede celular. Em uma realização, a sequência sinal de secreção direciona o transporte de uma proteína hidrofobina até o interior ou sobre a membrana celular. Em outra realização, a sequência sinal de secreção direciona o transporte de uma proteína hidrofobina à superfície celular, preferencialmente a superfície externa da membrana celular. Com a máxima preferência, a sequência sinal de secreção direciona o transporte de uma proteína hidrofobina à superfície da folha ou do caule, preferencialmente até o interior ou sobre a cutícula.

[132] Preferencialmente, a sequência sinal de secreção compreende uma sequência de aminoácidos selecionada a partir do grupo que consiste em: (i) uma sequência de aminoácidos que tem, em ordem crescente, de preferência pelo menos 60%, pelo menos 70%, pelo menos 80%, pelo menos 85%, pelo menos 90%, pelo menos 91%, pelo menos 92%, pelo menos 93%, pelo menos 94%, pelo menos 95%, pelo menos 96%, pelo menos 97%, pelo menos 98%, pelo menos 99% ou pelo menos 100% de identidade de sequência à sequência de aminoácidos representada pela SEQ ID NO: 24, ou um fragmento funcional, derivado, ortólogo ou parálogo da mesma; preferencialmente a sequência sinal de secreção direciona transporte da proteína hidrofobina fora do protoplasto ou simplasto; ou (ii) sequência de aminoácidos codificada por um ácido nucleico que tem, em ordem crescente, de preferência pelo menos 60%, pelo menos 70%, pelo menos 80%, pelo menos 85%, pelo menos 90%, pelo menos 91%, pelo menos 92%, pelo menos 93%, pelo menos 94%, pelo menos 95%, pelo menos 96%, pelo menos 97%, pelo menos 98%, pelo menos 99% ou pelo menos 100% de identidade de sequência à sequência de ácido nucleico representada pela SEQ ID NO: 23, ou um fragmento funcional, derivado, ortólogo ou parálogo da mesma; preferencialmente a sequência sinal de secreção direciona transporte da proteína hidrofobina fora do protoplasto ou simplasto.

[133] Preferencialmente, a proteína hidrofobina compreende pelo menos cerca de 10, pelo menos cerca de 11, pelo menos cerca de 12, pelo menos cerca de 13, pelo menos cerca de 14, pelo menos cerca de 15, pelo menos cerca de 16, pelo menos cerca de 17, pelo menos cerca de 18, pelo menos cerca de 19 resíduos de aminoácidos, preferencialmente resíduos de aminoácidos contínuos, preferencialmente contados a partir da terminação N ou da terminação C da sequência de aminoácidos, ou até o comprimento total da sequência de aminoácidos especificada na SEQ ID NO: 24. Preferencialmente, um fragmento de sequência sinal de secreção tem substancialmente a mesma atividade biológica que a sequência de aminoácidos dada na SEQ ID NO: 24.

[134] Preferencialmente, a sequência sinal de secreção compreende ou consiste em uma sequência de aminoácidos conforme representada na SEQ ID NO: 24.

[135] Preferencialmente, um ácido nucleico que codifica uma sequência sinal de secreção é um ácido nucleico selecionado a partir do grupo que consiste em: (i) um ácido nucleico que tem em ordem crescente de preferência pelo menos 60%, pelo menos 70%, pelo menos 80%, pelo menos 90%, pelo menos 91%, pelo menos 92%, pelo menos 93%, pelo menos 94%, pelo menos 95%, pelo menos 96%, pelo menos 97%, pelo menos 98%, pelo menos 99% ou pelo menos 100% de identidade de sequência à sequência de ácido nucleico representada pela SEQ ID NO: 23, (ii) a sequência complementar de qualquer um dos ácidos nucleicos de (i); (iii) um ácido nucleico que codifica uma proteína de fusão hidrofobina que tem em ordem crescente de preferência pelo menos 60%, pelo menos 70%, pelo menos 80%, pelo menos 90%, pelo menos 91%, pelo menos 92%, pelo menos 93%, pelo menos 94%, pelo menos 95%, pelo menos 96%, pelo menos 97%, pelo menos 98%, pelo menos 99% ou pelo menos 100% de identidade de sequência à sequência de aminoácidos representada pela SEQ ID NO: 24, preferencialmente a sequência sinal de secreção direciona transporte da proteína hidrofobina fora do protoplasto ou simplasto; (iv) uma molécula de ácido nucleico que hibridiza com uma molécula de ácido nucleico de (i) a (iii) sob condições de hibridização de alta estringência; e (v) um ácido nucleico que codifica a mesma sequência sinal de secreção que os ácidos nucleicos de (i) a (iv) acima, mas que difere dos ácidos nucleicos de (i) a (iv) acima devido à degeneração do código genético.

[136] Preferencialmente, o ácido nucleico que codifica uma sequência sinal de secreção compreende pelo menos cerca de 20, pelo menos cerca de 30, pelo menos cerca de 40, pelo menos cerca de 50, pelo menos cerca de 55, nucleotídeos, preferencialmente nucleotídeos contínuos, preferencialmente contados a partir da extremidade 5’ ou 3’ do ácido nucleico ou até o comprimento inteiro da sequência de ácido nucleico especificada na SEQ ID NO: 23. Preferencialmente, o fragmento de um ácido nucleico que codifica uma sequência sinal de secreção tem substancialmente a mesma atividade biológica que a sequência de ácido nucleico dada na SEQ ID NO: 23.

[137] Preferencialmente, o ácido nucleico que codifica uma sequência sinal de secreção compreende ou consiste em uma sequência conforme representada na SEQ ID NO: 23.

[138] Preferencialmente, a sequência sinal compreende uma sequência de aminoácidos conforme exibida pelos resíduos de aminoácidos adicionais de versão 2 de HFBII ou SC3 conforme mostrado na Figura 8 (em comparação à versão 1 da respectiva sequência de aminoácidos).

[139] Sequências sinais adequadas alternativas são conhecidas pelos técnicos no assunto e podem ser encontradas, por exemplo, em Khar Heng Choo, Tin Wee Tan e Shoba Ranganathan (2005) SPdb - a signal peptide database.BMC, Bioinformatics 2005, 6:249 doi:10.1186/1471-2105-6-249 e http://proline.bic.nus.edu.sg/spdb/.

POLIPEPTÍDEOS PARCEIROS DE FUSÃO

[140] Preferencialmente, a proteína hidrofobina da proteína de fusão hidrofobina é ligada a uma sequência de polipeptídeos com pelo menos 10, pelo menos 20, pelo menos 50, pelo menos 60, pelo menos 70, pelo menos 80, pelo menos 90, pelo menos 100, pelo menos 150, pelo menos 200, pelo menos 250, pelo menos 300 resíduos de aminoácidos que não ocorrem naturalmente ligados à proteína hidrofobina (no presente pedido chamado de “polipeptídeo parceiro de fusão”).

[141] Preferencialmente, o polipeptídeo parceiro de fusão é ligado à terminação C e/ou a terminação N da proteína hidrofobina, preferencialmente, à terminação N. A ligação do parceiro de fusão à hidrofobina pode ser diretamente através de uma ponte peptídica ou através de uma sequência ligante, preferencialmente um peptídeo ligante. Preferencialmente, a proteína de fusão compreende um ou mais, preferencialmente 1, 2, 3, 4 ou 5 polipeptídeos parceiros de fusão.

[142] Polipeptídeos parceiros de fusão preferenciais compreendido na proteína de fusão hidrofobina são selecionados a partir do grupo da subunidade Pdx1 da sintase (yaad) de sintase Plp de Bacillus subitilis (que codifica a sequência de ácido nucleico: SEQ ID NO: 17 e sequência de aminoácidos: 18), yaae (que codifica a sequência de ácido nucleico: SEQ ID NO: 19 e sequência de aminoácidos: 20), tioredoxina, preferencialmente tioredoxina de Escherichia coli (que codifica a sequência de ácidos nucleicos: SEQ ID NO: 21 e sequência de aminoácidos: 22) ou Homo sapiens (cf. SEQ ID NO: 54), e ubiquitina (por exemplo, Homo sapiens conforme especificado na SEQ ID NO: 53), ou um fragmento, derivado, ortólogo ou parálogo dos mesmos.

[143] Preferencialmente, os ácidos nucleicos de proteína de fusão hidrofobina codificam uma proteína hidrofobina, preferencialmente uma hidrofobina classe I, mais preferencialmente, uma hidrofobina selecionada a partir do grupo que consiste em dewA (SEQ ID NO: 2), rodA (SEQ ID NO: 4), hypA (SEQ ID NO: 6), hypB (SEQ ID NO: 8), sc3 (SEQ ID NO: 10), basf1 (SEQ ID NO: 12), basf2 (SEQ ID NO: 14), hidrofobina SC3 (SEQ ID NO: 43 ou 44), hidrofobina HFBII (SEQ ID NO: 45 ou 46), hidrofobina Gm (SEQ ID NO: 42), hidrofobina TT1 (SEQ ID NO: 87), e hidrofobina HFPI (SEQ ID NO: 88) ou um fragmento funcional, derivado, ortólogo ou parálogo do mesmo, fundido a um polipeptídeo parceiro de fusão selecionado a partir do grupo que consiste em yaad (SEQ ID NO: 18), yaae (SEQ ID NO: 20), tioredoxina, preferencialmente tioredoxina de Escherichia coli (SEQ ID NO: 22) ou Homo sapiens (SEQ ID NO: 54), e ubiquitina (SEQ ID NO: 53) ou um fragmento, derivado, ortólogo ou parálogo do mesmo. De preferência é uma proteína de fusão hidrofobina que compreende uma hidrofobina de Aspergillus nidulans (por exemplo, dewA, SEQ ID NO: 2) e um polipeptídeo parceiro de fusão selecionado a partir do grupo que consiste em yaad (SEQ ID NO: 18), yaae (SEQ ID NO: 20), tioredoxina, preferencialmente tioredoxina de Escherichia coli (SEQ ID NO: 22) ou Homo sapiens (SEQ ID NO: 54), e ubiquitina (SEQ ID NO: 53), ou um fragmento, derivado, ortólogo ou parálogo do mesmo, preferencialmente uma proteína de fusão hidrofobina que compreende dewA (SEQ ID NO: 2) e yaad (SEQ ID NO: 18), ou um fragmento, derivado, ortólogo ou parálogo do mesmo. Fragmentos preferenciais de yaad são os primeiros 10 a 15, 15 a 20, 20 a 25, 25 a 30, 30 a 35, 35 a 40 ou 40 a 45 aminoácidos N-terminais de SEQ ID NO: 18. Da máxima preferência é um fragmento de yaad conforme representado pela SEQ ID NO: 16.

[144] Preferencialmente, o polipeptídeo parceiro de fusão é codificado por um ácido nucleico selecionado a partir do grupo que consiste em: (i) um ácido nucleico que tem em ordem crescente de preferência pelo menos 60%, pelo menos 70%, pelo menos 80%, pelo menos 90%, pelo menos 91%, pelo menos 92%, pelo menos 93%, pelo menos 94%, pelo menos 95%, pelo menos 96%, pelo menos 97%, pelo menos 98%, pelo menos 99% ou pelo menos 100% de identidade de sequência à sequência de ácido nucleico representada pela SEQ ID NO: 15, 17, 19 ou 21; (ii) a sequência complementar de qualquer um dos ácidos nucleicos de (i); (iii) um ácido nucleico que codifica um polipeptídeo parceiro de fusão que tem em ordem crescente de preferência pelo menos 60%, pelo menos 70%, pelo menos 80%, pelo menos 90%, pelo menos 91%, pelo menos 92%, pelo menos 93%, pelo menos 94%, pelo menos 95%, pelo menos 96%, pelo menos 97%, pelo menos 98%, pelo menos 99% ou pelo menos 100% de identidade de sequência à sequência de aminoácidos representada pela SEQ ID NO: 16, 18, 20, 22, 53 ou 54; (iv) uma molécula de ácido nucleico que hibridiza com uma molécula de ácido nucleico de (i) a (iii) sob condições de hibridização de alta estringência; e (v) um ácido nucleico que codifica o mesmo polipeptídeo parceiro de fusão que os ácidos nucleicos de (i) a (iv) acima, mas que difere dos ácidos nucleicos de (i) a (iv) acima devido à degeneração do código genético.

[145] Preferencialmente, o polipeptídeo parceiro de fusão é codificado por um ácido nucleico selecionado a partir do grupo que consiste em: (i) um ácido nucleico que tem em ordem crescente de preferência pelo menos 60%, pelo menos 70%, pelo menos 80%, pelo menos 90%, pelo menos 91%, pelo menos 92%, pelo menos 93%, pelo menos 94%, pelo menos 95%, pelo menos 96%, pelo menos 97%, pelo menos 98%, pelo menos 99% ou pelo menos 100% de identidade de sequência à sequência de ácido nucleico representada pela SEQ ID NO: 17; (ii) a sequência complementar de qualquer um dos ácidos nucleicos de (i); (iii) um ácido nucleico que codifica um polipeptídeo parceiro de fusão que tem em ordem crescente de preferência pelo menos 60%, pelo menos 70%, pelo menos 80%, pelo menos 90%, pelo menos 91%, pelo menos 92%, pelo menos 93%, pelo menos 94%, pelo menos 95%, pelo menos 96%, pelo menos 97%, pelo menos 98%, pelo menos 99% ou pelo menos 100% de identidade de sequência à sequência de aminoácidos representada pela SEQ ID NO: 18; e (iv) uma molécula de ácido nucleico que hibridiza com uma molécula de ácido nucleico de (i) a (iii) sob condições de hibridização de alta estringência.

[146] Preferencialmente, o polipeptídeo parceiro de fusão é codificado por um ácido nucleico selecionado a partir do grupo que consiste em: (i) um ácido nucleico que tem em ordem crescente de preferência pelo menos 60%, pelo menos 70%, pelo menos 80%, pelo menos 90%, pelo menos 91%, pelo menos 92%, pelo menos 93%, pelo menos 94%, pelo menos 95%, pelo menos 96%, pelo menos 97%, pelo menos 98%, pelo menos 99% ou pelo menos 100% de identidade de sequência à sequência de ácido nucleico representada pela SEQ ID NO: 15; (ii) a sequência complementar de qualquer um dos ácidos nucleicos de (i); (iii) um ácido nucleico que codifica um polipeptídeo parceiro de fusão que tem em ordem crescente de preferência pelo menos 60%, pelo menos 70%, pelo menos 80%, pelo menos 90%, pelo menos 91%, pelo menos 92%, pelo menos 93%, pelo menos 94%, pelo menos 95%, pelo menos 96%, pelo menos 97%, pelo menos 98%, pelo menos 99% ou pelo menos 100% de identidade de sequência à sequência de aminoácidos representada pela SEQ ID NO: 16; e (iv) uma molécula de ácido nucleico que hibridiza com uma molécula de ácido nucleico de (i) a (iii) sob condições de hibridização de alta estringência; e (v) um ácido nucleico que codifica o mesmo polipeptídeo parceiro de fusão que os ácidos nucleicos de (i) a (iv) acima, mas que difere dos ácidos nucleicos de (i) a (iv) acima devido à degeneração do código genético.

[147] Preferencialmente, o polipeptídeo parceiro de fusão é codificado por um ácido nucleico selecionado a partir do grupo que consiste em: (i) um ácido nucleico que tem em ordem crescente de preferência pelo menos 90%, pelo menos 91%, pelo menos 92%, pelo menos 93%, pelo menos 94%, pelo menos 95%, pelo menos 96%, pelo menos 97%, pelo menos 98%, pelo menos 99% ou pelo menos 100% de identidade de sequência à sequência de ácido nucleico representada pela SEQ ID NO: 15, 17, 19 ou 21; (ii) a sequência complementar de qualquer um dos ácidos nucleicos de (i); (iii) um ácido nucleico que codifica um polipeptídeo parceiro de fusão que tem em ordem crescente de preferência pelo menos 90%, pelo menos 91%, pelo menos 92%, pelo menos 93%, pelo menos 94%, pelo menos 95%, pelo menos 96%, pelo menos 97%, pelo menos 98%, pelo menos 99% ou pelo menos 100% de identidade de sequência à sequência de aminoácidos representada pela SEQ ID NO: 16, 18, 20, 22, 53 ou 54; (iv) uma molécula de ácido nucleico que hibridiza com uma molécula de ácido nucleico de (i) a (iii) sob condições de hibridização de alta estringência; e (v) um ácido nucleico que codifica o mesmo polipeptídeo parceiro de fusão que os ácidos nucleicos de (i) a (iv) acima, mas que difere dos ácidos nucleicos de (i) a (iv) acima devido à degeneração do código genético.

[148] Preferencialmente, o polipeptídeo parceiro de fusão é codificado por um ácido nucleico selecionado a partir do grupo que consiste em: (i) um ácido nucleico que tem em ordem crescente de preferência pelo menos 90%, pelo menos 91%, pelo menos 92%, pelo menos 93%, pelo menos 94%, pelo menos 95%, pelo menos 96%, pelo menos 97%, pelo menos 98%, pelo menos 99% ou pelo menos 100% de identidade de sequência à sequência de ácido nucleico representada pela SEQ ID NO: 15; (ii) a sequência complementar de qualquer um dos ácidos nucleicos de (i); (iii) um ácido nucleico que codifica um polipeptídeo parceiro de fusão que tem em ordem crescente de preferência pelo menos 90%, pelo menos 91%, pelo menos 92%, pelo menos 93%, pelo menos 94%, pelo menos 95%, pelo menos 96%, pelo menos 97%, pelo menos 98%, pelo menos 99% ou pelo menos 100% de identidade de sequência à sequência de aminoácidos representada pela SEQ ID NO: 16; (iv) uma molécula de ácido nucleico que hibridiza com uma molécula de ácido nucleico de (i) a (iii) sob condições de hibridização de alta estringência; e (v) um ácido nucleico que codifica o mesmo polipeptídeo parceiro de fusão que os ácidos nucleicos de (i) a (iv) acima, mas que difere dos ácidos nucleicos de (i) a (iv) acima devido à degeneração do código genético.

[149] Fragmentos preferenciais do polipeptídeo parceiro de fusão, preferencialmente de yaad, yaae, tioredoxina ou tioredoxina, têm pelo menos 10, pelo menos 20, pelo menos 30, pelo menos 40, pelo menos 50, pelo menos 60 ou pelo menos 70 dos primeiros aminoácidos N-terminal ou dos últimos aminoácidos C-terminal. De preferência são os primeiros 20, 30, 40, 50, 60, 70, 80, 90, 100, 110, 120, 130, 140, 150, 160, 170, 180, 190, 200, 210, 220, 230, 240, 250, 260, 270, 280, 290, 300, 310 ou 320 aminoácidos N-terminal ou os últimos aminoácidos C-terminal 20, 30, 40, 50, 60, 70, 80, 90, 100, 110, 120, 130, 140, 150, 160, 170, 180, 190, 200, 210, 220, 230, 240, 250, 260, 270, 280, 290, 300, 310 ou 320 de yaad, yaae, tioredoxina ou ubiquitina. Fragmentos preferenciais de yaad, yaae, tioredoxina ou ubiquitina são os primeiros aminoácidos N- terminais ou os últimos C-terminais 10 a 15, 15 a 20, 20 a 25, 25 a 30, 30 a 35, 35 a 40, 40 a 45, 45 a 50, 50 a 55, 55 a 60, 60 a 65, 65 a 70, 70 a 75, 75 a 80, 80 a 85, 85 a 90, 90 a 95, ou 95 a 100 de yaad, yaae, tioredoxina ou ubiquitina.

[150] Fragmentos preferenciais do polipeptídeo parceiro de fusão são pelo menos 10, pelo menos 15, pelo menos 20, pelo menos 25, pelo menos 30, pelo menos 35 ou pelo menos 40 dos primeiros aminoácidos N- terminal ou os primeiros 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17. 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 19, 30, 31, 32, 33, 34, 35, 36, 37, 38, 39 ou 40 aminoácidos N- terminal de de yaad, yaae ou tioredoxina. Fragmentos preferenciais de yaad, yaae, tioredoxina ou ubiquitina são os primeiros 10 a 15, 15 a 20, 20 a 25, 25 a 30, 30 a 35, 35 a 40 ou 40 a 45 aminoácidos N-terminais de yaad, yaae, tioredoxina ou ubiquitina.

[151] Fragmentos preferenciais do polipeptídeo parceiro de fusão são pelo menos 10, pelo menos 15, pelo menos 20, pelo menos 25, pelo menos 30, pelo menos 35 ou pelo menos 40 dos primeiros aminoácidos N- terminal ou os primeiros 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17. 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 19, 30, 31, 32, 33, 34, 35, 36, 37, 38, 39 ou 40 aminoácidos N- terminal de yaad. Fragmentos preferenciais de yaad são os primeiros 10 a 15, 15 a 20, 20 a 25, 25 a 30, 30 a 35, 35 a 40 ou 40 a 45 aminoácidos N-terminais de yaad.

[152] Um polipeptídeo parceiro de fusão preferencial é yaad (SEQ ID NO: 18). Fragmentos preferenciais de SEQ ID NO: 18 são pelo menos 10, pelo menos 15, pelo menos 20, pelo menos 25, pelo menos 30, pelo menos 35 ou pelo menos 40 dos primeiros aminoácidos N-terminal ou os primeiros 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17. 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 19, 30, 31, 32, 33, 34, 35, 36, 37, 38, 39 ou 40 aminoácidos N-terminal da SEQ ID NO: 18. Fragmentos preferenciais de yaad são os primeiros 10 a 15, 15 a 20, 20 a 25, 25 a 30, 30 a 35, 35 a 40 ou 40 a 45 aminoácidos N-terminais de SEQ ID NO: 18. Da máxima preferência são os primeiros 39 aminoácidos da subunidade Pdx1 da sintase (yaad) de Bacillus subitilis conforme representado pela SEQ ID NO: 16.

[153] Outra realização da presente invenção é a sequência codificadora correspondente de um dos fragmentos preferenciais mencionados acima dos polipeptídeos parceiros de fusão.

SEQUÊNCIA LIGANTE

[154] Os elementos diferentes da proteína de fusão hidrofobina podem ser diretamente ligados através de uma ponte peptídica ou podem ser ligados através de uma sequência ligante. Dessa forma, a proteína de fusão hidrofobina, preferencialmente compreende uma ou mais sequências ligantes. A sequência ligante é preferencialmente um peptídeo de um ou mais, de preferência, 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19 ou 20 aminoácidos. A sequência ligante liga dois elementos de polipeptídeos da proteína de fusão hidrofobina através de uma ponte peptídica em sua terminação C e sua terminação N. Preferencialmente, a sequência ligante é ligada através de pontes peptídicas entre a proteína hidrofobina e a sequência sinal e/ou entre o parceiro de fusão e a proteína hidrofobina. Preferencialmente, a sequência ligante é um sítio de clivagem de protease. Preferencialmente, a sequência ligante é o sítio de reconhecimento para protease fator Xa. Preferencialmente, o sítio de reconhecimento para protease fator Xa tem a sequência de aminoácidos de isoleucina, ácido glutâmico, glicina, arginina (dada em código de uma letra: IEGR).

[155] Preferencialmente, o parceiro de fusão é ligado à terminação C ou terminação N da proteína hidrofobina, preferencialmente, a terminação N, através de uma sequência ligante, preferencialmente com a sequência ligante sendo o sítio de reconhecimento para protease fator Xa, preferencialmente, que tem a sequência de aminoácidos IEGR.

SEQUÊNCIA DE PURIFICAÇÃO

[156] Preferencialmente, a proteína de fusão compreende uma sequência de purificação. A sequência de purificação é preferencialmente um peptídeo de um ou mais, de preferência, 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19 ou 20 aminoácidos, e facilita a purificação da proteína de fusão hidrofobina de seu contexto celular. Várias sequências de purificação são conhecidas na técnica e podem ter, por exemplo, um marcador de histidina (His), um marcador de glutationa-S-transferase (GST), um marcador de estreptavidina (estreptococo), um marcador de tioredoxina, um marcador de proteína de ligação de maltose (MBP), marcador de HA ou um marcador de FLAG. Preferencialmente, a sequência de purificação é um marcador de His, de preferência o marcador de His tem a sequência GSHHHHHH (cf. SEQ ID NO: 26 e a sequência codificadora SEQ ID NO: 27).

ÁCIDOS NUCLEICOS DE PROTEÍNA DE FUSÃO HIDROFOBINA

[157] Uma realização preferencial da presente invenção é um ácido nucleico de proteína de fusão hidrofobina, que codifica uma proteína de fusão hidrofobina.

[158] Preferencialmente, o ácido nucleico de proteína de fusão hidrofobina que codifica uma proteína de fusão hidrofobina é uma molécula de ácido nucleico isolada que compreende um ácido nucleico selecionado a partir do grupo que consiste em: (i) um ácido nucleico que tem, em ordem crescente, de preferência pelo menos 60%, pelo menos 61%, pelo menos 62%, pelo menos 63%, pelo menos 64%, pelo menos 65%, pelo menos 66%, pelo menos 67%, pelo menos 68%, pelo menos 69%, pelo menos 70%, pelo menos 71%, pelo menos 72%, pelo menos 73%, pelo menos 74%, pelo menos 75%, pelo menos 76%, pelo menos 77%, pelo menos 78%, pelo menos 79%, pelo menos 80%, pelo menos 81%, pelo menos 82%, pelo menos 83%, pelo menos 84%, pelo menos 85%, pelo menos 86%, pelo menos 87%, pelo menos 88%, pelo menos 89%, pelo menos 90%, pelo menos 91%, pelo menos 92%, pelo menos 93%, pelo menos 94%, pelo menos 95%, pelo menos 96%, pelo menos 97%, pelo menos 98%, pelo menos 99% ou 100% de identidade de sequência à sequência de ácido nucleico representada pela SEQ ID NO: 47, 49, 51, 27, 29, 31, 33, 35, 47, 49, 51, 63 a 70, 71, 73, 75, 77, 79, 81, 83 ou 85, ou um fragmento funcional, derivado, ortólogo ou parálogo do mesmo; (ii) a sequência complementar de qualquer um dos ácidos nucleicos de (i); (iii) um ácido nucleico que codifica uma proteína de fusão hidrofobina que tem, em ordem crescente, de preferência pelo menos 60%, pelo menos 61%, pelo menos 62%, pelo menos 63%, pelo menos 64%, pelo menos 65%, pelo menos 66%, pelo menos 67%, pelo menos 68%, pelo menos 69%, pelo menos 70%, pelo menos 71%, pelo menos 72%, pelo menos 73%, pelo menos 74%, pelo menos 75%, pelo menos 76%, pelo menos 77%, pelo menos 78%, pelo menos 79%, pelo menos 80%, pelo menos 81%, pelo menos 82%, pelo menos 83%, pelo menos 84%, pelo menos 85%, pelo menos 86%, pelo menos 87%, pelo menos 88%, pelo menos 89%, pelo menos 90%, pelo menos 91%, pelo menos 92%, pelo menos 93%, pelo menos 94%, pelo menos 95%, pelo menos 96%, pelo menos 97%, pelo menos 98%, pelo menos 99% ou 100% de identidade de sequência à sequência de aminoácidos representada pela SEQ ID NO: 48, 50, 52, 28, 30, 32, 34, 36, 48, 50, 52, 72, 74, 76, 78, 80, 82, 84 ou 86, ou um fragmento funcional, derivado, ortólogo ou parálogo do mesmo; preferencialmente a proteína de fusão hidrofobina confere resistência fúngica melhorada em relação às plantas de controle. (iv) uma molécula de ácido nucleico que hibridiza com uma molécula de ácido nucleico de (i) a (iii) sob condições de hibridização de alta estringência; e (v) um ácido nucleico que codifica a mesma proteína de fusão hidrofobina que os ácidos nucleicos de (i) a (iv) acima, mas que difere dos ácidos nucleicos de (i) a (iv) acima devido à degeneração do código genético.

[159] Preferencialmente, o ácido nucleico de hidrofobina que codifica uma proteína de fusão hidrofobina é uma molécula de ácido nucleico isolada que compreende um ácido nucleico selecionado a partir do grupo que consiste em: (i) um ácido nucleico que tem, em ordem crescente, de preferência pelo menos 60%, pelo menos 61%, pelo menos 62%, pelo menos 63%, pelo menos 64%, pelo menos 65%, pelo menos 66%, pelo menos 67%, pelo menos 68%, pelo menos 69%, pelo menos 70%, pelo menos 71%, pelo menos 72%, pelo menos 73%, pelo menos 74%, pelo menos 75%, pelo menos 76%, pelo menos 77%, pelo menos 78%, pelo menos 79%, pelo menos 80%, pelo menos 81%, pelo menos 82%, pelo menos 83%, pelo menos 84%, pelo menos 85%, pelo menos 86%, pelo menos 87%, pelo menos 88%, pelo menos 89%, pelo menos 90%, pelo menos 91%, pelo menos 92%, pelo menos 93%, pelo menos 94%, pelo menos 95%, pelo menos 96%, pelo menos 97%, pelo menos 98%, pelo menos 99% ou 100% de identidade de sequência à sequência de ácido nucleico representada pela SEQ ID NO: 27), ou um fragmento funcional, derivado, ortólogo ou parálogo do mesmo. (ii) a sequência complementar de qualquer um dos ácidos nucleicos de (i); (iii) um ácido nucleico que codifica uma proteína de fusão hidrofobina que tem, em ordem crescente, de preferência pelo menos 60%, pelo menos 61%, pelo menos 62%, pelo menos 63%, pelo menos 64%, pelo menos 65%, pelo menos 66%, pelo menos 67%, pelo menos 68%, pelo menos 69%, pelo menos 70%, pelo menos 71%, pelo menos 72%, pelo menos 73%, pelo menos 74%, pelo menos 75%, pelo menos 76%, pelo menos 77%, pelo menos 78%, pelo menos 79%, pelo menos 80%, pelo menos 81%, pelo menos 82%, pelo menos 83%, pelo menos 84%, pelo menos 85%, pelo menos 86%, pelo menos 87%, pelo menos 88%, pelo menos 89%, pelo menos 90%, pelo menos 91%, pelo menos 92%, pelo menos 93%, pelo menos 94%, pelo menos 95%, pelo menos 96%, pelo menos 97%, pelo menos 98%, pelo menos 99% ou 100% de identidade de sequência à sequência de aminoácidos representada pela SEQ ID NO: 28, ou um fragmento funcional, derivado, ortólogo ou parálogo do mesmo; preferencialmente a proteína de fusão hidrofobina confere resistência fúngica melhorada em relação às plantas de controle; (iv) uma molécula de ácido nucleico que hibridiza com uma molécula de ácido nucleico de (i) a (iii) sob condições de hibridização de alta estringência; e (v) um ácido nucleico que codifica a mesma proteína de fusão hidrofobina que os ácidos nucleicos de (i) a (iv) acima, mas que difere dos ácidos nucleicos de (i) a (iv) acima devido à degeneração do código genético.

[160] Preferencialmente, o ácido nucleico de hidrofobina que codifica uma proteína de fusão hidrofobina é uma molécula de ácido nucleico isolada que compreende um ácido nucleico selecionado a partir do grupo que consiste em: (i) um ácido nucleico que tem, em ordem crescente, de preferência pelo menos 60%, pelo menos 61%, pelo menos 62%, pelo menos 63%, pelo menos 64%, pelo menos 65%, pelo menos 66%, pelo menos 67%, pelo menos 68%, pelo menos 69%, pelo menos 70%, pelo menos 71%, pelo menos 72%, pelo menos 73%, pelo menos 74%, pelo menos 75%, pelo menos 76%, pelo menos 77%, pelo menos 78%, pelo menos 79%, pelo menos 80%, pelo menos 81%, pelo menos 82%, pelo menos 83%, pelo menos 84%, pelo menos 85%, pelo menos 86%, pelo menos 87%, pelo menos 88%, pelo menos 89%, pelo menos 90%, pelo menos 91%, pelo menos 92%, pelo menos 93%, pelo menos 94%, pelo menos 95%, pelo menos 96%, pelo menos 97%, pelo menos 98%, pelo menos 99% ou 100% de identidade de sequência à sequência de ácido nucleico representada pela SEQ ID NO: 29), ou um fragmento funcional, derivado, ortólogo ou parálogo do mesmo. (ii) a sequência complementar de qualquer um dos ácidos nucleicos de (i); (iii) um ácido nucleico que codifica uma proteína de fusão hidrofobina que tem, em ordem crescente, de preferência pelo menos 60%, pelo menos 61%, pelo menos 62%, pelo menos 63%, pelo menos 64%, pelo menos 65%, pelo menos 66%, pelo menos 67%, pelo menos 68%, pelo menos 69%, pelo menos 70%, pelo menos 71%, pelo menos 72%, pelo menos 73%, pelo menos 74%, pelo menos 75%, pelo menos 76%, pelo menos 77%, pelo menos 78%, pelo menos 79%, pelo menos 80%, pelo menos 81%, pelo menos 82%, pelo menos 83%, pelo menos 84%, pelo menos 85%, pelo menos 86%, pelo menos 87%, pelo menos 88%, pelo menos 89%, pelo menos 90%, pelo menos 91%, pelo menos 92%, pelo menos 93%, pelo menos 94%, pelo menos 95%, pelo menos 96%, pelo menos 97%, pelo menos 98%, pelo menos 99% ou 100% de identidade de sequência à sequência de aminoácidos representada pela SEQ ID NO: 30, ou um fragmento funcional, derivado, ortólogo ou parálogo do mesmo; preferencialmente a proteína de fusão hidrofobina confere resistência fúngica melhorada em relação às plantas de controle; (iv) uma molécula de ácido nucleico que hibridiza com uma molécula de ácido nucleico de (i) a (iii) sob condições de hibridização de alta estringência; e (v) um ácido nucleico que codifica a mesmo proteína de fusão hidrofobina que os ácidos nucleicos de (i) a (iv) acima, mas que difere dos ácidos nucleicos de (i) a (iv) acima devido à degeneração do código genético.

[161] Mais preferencialmente, o ácido nucleico de proteína de fusão hidrofobina isolada que codifica uma proteína de fusão hidrofobina é uma molécula de ácido nucleico isolada que compreende um ácido nucleico selecionado a partir do grupo que consiste em: (i) um ácido nucleico que tem em ordem crescente de preferência pelo menos 60%, pelo menos 70%, pelo menos 80%, pelo menos 90%, pelo menos 91%, pelo menos 92%, pelo menos 93%, pelo menos 94%, pelo menos 95%, pelo menos 96%, pelo menos 97%, pelo menos 98%, pelo menos 99% ou pelo menos 100% de identidade de sequência à sequência de ácido nucleico representada pela SEQ ID NO: 47, 49, 51, 27, 29, 31, 33, 35, 63 a 70, 71, 73, 75, 77, 79, 81, 83 ou 85, (ii) a sequência complementar de qualquer um dos ácidos nucleicos de (i); (iii) um ácido nucleico que codifica uma proteína de fusão de hidrofobina que tem em ordem crescente de preferência pelo menos 60%, pelo menos 70%, pelo menos 80%, pelo menos 90%, pelo menos 91%, pelo menos 92%, pelo menos 93%, pelo menos 94%, pelo menos 95%, pelo menos 96%, pelo menos 97%, pelo menos 98%, pelo menos 99% ou pelo menos 100% de identidade de sequência à sequência de aminoácidos representada pela SEQ ID NO: 48, 50, 52, 28, 30, 32, 34, 36, 72, 74, 76, 78, 80, 82, 84 ou 86, preferencialmente a proteína de fusão hidrofobina confere resistência fúngica melhorada em relação às plantas de controle; (iv) uma molécula de ácido nucleico que hibridiza com uma molécula de ácido nucleico de (i) a (iii) sob condições de hibridização de alta estringência; e (v) um ácido nucleico que codifica a mesmo proteína de fusão hidrofobina que os ácidos nucleicos de (i) a (iv) acima, mas que difere dos ácidos nucleicos de (i) a (iv) acima devido à degeneração do código genético.

[162] Mais preferencialmente, o ácido nucleico de proteína de fusão hidrofobina isolada que codifica uma proteína de fusão hidrofobina é uma molécula de ácido nucleico isolada que compreende um ácido nucleico selecionado a partir do grupo que consiste em: (i) um ácido nucleico que tem em ordem crescente de preferência pelo menos 90%, pelo menos 91%, pelo menos 92%, pelo menos 93%, pelo menos 94%, pelo menos 95%, pelo menos 96%, pelo menos 97%, pelo menos 98%, pelo menos 99% ou pelo menos 100% de identidade de sequência à sequência de ácido nucleico representada pela SEQ ID NO: 27, (ii) a sequência complementar de qualquer um dos ácidos nucleicos de (i); (iii) um ácido nucleico que codifica uma proteína de fusão hidrofobina que tem em ordem crescente de preferência pelo menos 90%, pelo menos 91%, pelo menos 92%, pelo menos 93%, pelo menos 94%, pelo menos 95%, pelo menos 96%, pelo menos 97%, pelo menos 98%, pelo menos 99% ou pelo menos 100% de identidade de sequência a sequência de aminoácidos representada pela SEQ ID NO: 28; preferencialmente a proteína de fusão hidrofobina confere resistência fúngica melhorada para plantas de controle; (iv) uma molécula de ácido nucleico que hibridiza com uma molécula de ácido nucleico de (i) a (iii) sob condições de hibridização de alta estringência; e (v) um ácido nucleico que codifica a mesma proteína de fusão hidrofobina que os ácidos nucleicos de (i) a (iv) acima, mas que difere dos ácidos nucleicos de (i) a (iv) acima devido à degeneração do código genético.

[163] Mais preferencialmente, o ácido nucleico de proteína de fusão hidrofobina isolada que codifica uma proteína de fusão hidrofobina é uma molécula de ácido nucleico isolada que compreende um ácido nucleico selecionado a partir do grupo que consiste em: (i) um ácido nucleico que tem em ordem crescente de preferência pelo menos 90%, pelo menos 91%, pelo menos 92%, pelo menos 93%, pelo menos 94%, pelo menos 95%, pelo menos 96%, pelo menos 97%, pelo menos 98%, pelo menos 99% ou pelo menos 100% de identidade de sequência à sequência de ácido nucleico representada pela SEQ ID NO: 29, (ii) a sequência complementar de qualquer um dos ácidos nucleicos de (i); (iii) um ácido nucleico que codifica uma proteína de fusão hidrofobina que tem em ordem crescente de preferência pelo menos 90%, pelo menos 91%, pelo menos 92%, pelo menos 93%, pelo menos 94%, pelo menos 95%, pelo menos 96%, pelo menos 97%, pelo menos 98%, pelo menos 99% ou pelo menos 100% de identidade de sequência à sequência de aminoácidos representada pela SEQ ID NO: 30; preferencialmente a proteína de fusão hidrofobina confere resistência fúngica melhorada para plantas de controle; (iv) uma molécula de ácido nucleico que hibridiza com uma molécula de ácido nucleico de (i) a (iii) sob condições de hibridização de alta estringência; e (v) um ácido nucleico que codifica a mesma proteína de fusão hidrofobina que os ácidos nucleicos de (i) a (iv) acima, mas que difere dos ácidos nucleicos de (i) a (iv) acima devido à degeneração do código genético.

[164] Preferencialmente, o ácido nucleico da proteína de fusão hidrofobina compreende pelo menos cerca de 400, pelo menos cerca de 450, pelo menos cerca de 500, pelo menos cerca de 550, pelo menos cerca de 600, pelo menos cerca de 650, pelo menos cerca de 700, pelo menos cerca de 750, pelo menos cerca de 800, pelo menos cerca de 850, pelo menos cerca de 900, pelo menos cerca de 950, pelo menos cerca de 1000 nucleotides, preferencialmente nucleotídeos contínuos, preferencialmente contados a partir das extremidades 5’ ou 3’ do ácido nucleico, ou até o comprimento total da sequência de ácido nucleico especificada na SEQ ID NO: 47, 49, 51, 27, 29, 31, 33, 35, 63 a 70, 71, 73, 75, 77, 79, 81, 83 ou 85, preferencialmente da sequência de ácido nucleico especificada na SEQ ID NO: 27 ou 29. Preferencialmente, um fragmento de ácido nucleico de hidrofobina tem substancialmente a mesma atividade biológica que a sequência de ácido nucleico dada na SEQ ID NO: 47, 49, 51, 27, 29, 31, 33, 35, 63 a 70, 71, 73, 75, 77, 79, 81, 83 ou 85, preferencialmente, como SEQ ID NO: 27 ou 29.

[165] Preferencialmente, o ácido nucleico da proteína de fusão hidrofobina isolado compreende ou consiste em uma sequência conforme representada na SEQ ID NO: 47, 49, 51, 27, 29, 31, 33, 35, 63 a 70, 71, 73, 75, 77, 79, 81, 83 ou 85, um complemento do mesmo, um ácido nucleico que codifica uma proteína de fusão hidrofobina com SEQ ID NO: 48, 50, 52, 28, 30, 32, 34, 36, 72, 74, 76, 78, 80, 82, 84 ou 86, ou uma molécula de ácido nucleico que hibridiza com qualquer uma dessas moléculas de ácido nucleico ou uma sequência complementar (complemento) do mesmo sob condições de hibridização de alta estringência.

[166] Com a máxima preferência, o ácido nucleico da proteína de fusão hidrofobina isolado compreende ou consiste em uma sequência conforme representada na SEQ ID NO: 27, um complemento do mesmo, um ácido nucleico que codifica uma proteína hidrofobina com SEQ ID NO: 28, ou uma molécula de ácido nucleico que hibridiza com qualquer uma dessas moléculas de ácido nucleico ou uma sequência complementar (complemento) do mesmo sob condições de hibridização de alta estringência.

[167] Com a máxima preferência, o ácido nucleico da proteína de fusão hidrofobina isolado compreende ou consiste em uma sequência conforme representada na SEQ ID NO: 29, um complemento do mesmo, um ácido nucleico que codifica uma proteína hidrofobina com SEQ ID NO: 30, ou uma molécula de ácido nucleico que hibridiza com qualquer uma dessas moléculas de ácido nucleico ou uma sequência complementar (complemento) do mesmo sob condições de hibridização de alta estringência.

PROTEÍNAS DE FUSÃO HIDROFOBINA

[168] Preferencialmente, a proteína de fusão hidrofobina é uma proteína que compreende uma sequência de aminoácidos selecionada a partir do grupo que consiste em: (i) uma sequência de aminoácidos que tem, em ordem crescente, de preferência pelo menos 60%, pelo menos 61%, pelo menos 62%, pelo menos 63%, pelo menos 64%, pelo menos 65%, pelo menos 66%, pelo menos 67%, pelo menos 68%, pelo menos 69%, pelo menos 70%, pelo menos 71%, pelo menos 72%, pelo menos 73%, pelo menos 74%, pelo menos 75%, pelo menos 76%, pelo menos 77%, pelo menos 78%, pelo menos 79%, pelo menos 80%, pelo menos 81%, pelo menos 82%, pelo menos 83%, pelo menos 84%, pelo menos 85%, pelo menos 86%, pelo menos 87%, pelo menos 88%, pelo menos 89%, pelo menos 90%, pelo menos 91%, pelo menos 92%, pelo menos 93%, pelo menos 94%, pelo menos 95%, pelo menos 96%, pelo menos 97%, pelo menos 98%, pelo menos 99% ou 100% de identidade de sequência com a sequência de aminoácidos representada pela SEQ ID NO: 48, 50, 52, 28, 30, 32, 34, 36, 72, 74, 76, 78, 80, 82, 84 ou 86, ou um fragmento funcional, derivado, ortólogo ou parálogo do mesmo; preferencialmente a proteína de fusão hidrofobina confere resistência fúngica melhorada em relação às plantas de controle; ou (ii) uma sequência de aminoácidos codificada por um ácido nucleico que tem, em ordem crescente, de preferência pelo menos 60%, pelo menos 61%, pelo menos 62%, pelo menos 63%, pelo menos 64%, pelo menos 65%, pelo menos 66%, pelo menos 67%, pelo menos 68%, pelo menos 69%, pelo menos 70%, pelo menos 71%, pelo menos 72%, pelo menos 73%, pelo menos 74%, pelo menos 75%, pelo menos 76%, pelo menos 77%, pelo menos 78%, pelo menos 79%, pelo menos 80%, pelo menos 81%, pelo menos 82%, pelo menos 83%, pelo menos 84%, pelo menos 85%, pelo menos 86%, pelo menos 87%, pelo menos 88%, pelo menos 89%, pelo menos 90%, pelo menos 91%, pelo menos 92%, pelo menos 93%, pelo menos 94%, pelo menos 95%, pelo menos 96%, pelo menos 97%, pelo menos 98%, pelo menos 99% ou 100% de identidade de sequência à sequência de ácido nucleico representada pela SEQ ID NO: 47, 49, 51, 27, 29, 31, 33, 35, 63 a 70, 71, 73, 75, 77, 79, 81, 83, ou 85, ou um fragmento funcional, derivado, ortólogo ou parálogo do mesmo; preferencialmente a proteína de fusão hidrofobina confere resistência fúngica melhorada em relação às plantas de controle.

[169] Outra realização da presente invenção é uma proteína de fusão hidrofobina. Preferencialmente, a proteína de fusão hidrofobina é uma proteína que compreende uma sequência de aminoácidos selecionada a partir do grupo que consiste em: (i) uma sequência de aminoácidos que tem, em ordem crescente, de preferência pelo menos 60%, pelo menos 61%, pelo menos 62%, pelo menos 63%, pelo menos 64%, pelo menos 65%, pelo menos 66%, pelo menos 67%, pelo menos 68%, pelo menos 69%, pelo menos 70%, pelo menos 71%, pelo menos 72%, pelo menos 73%, pelo menos 74%, pelo menos 75%, pelo menos 76%, pelo menos 77%, pelo menos 78%, pelo menos 79%, pelo menos 80%, pelo menos 81%, pelo menos 82%, pelo menos 83%, pelo menos 84%, pelo menos 85%, pelo menos 86%, pelo menos 87%, pelo menos 88%, pelo menos 89%, pelo menos 90%, pelo menos 91%, pelo menos 92%, pelo menos 93%, pelo menos 94%, pelo menos 95%, pelo menos 96%, pelo menos 97%, pelo menos 98%, pelo menos 99% ou 100% de identidade de sequência à sequência de aminoácidos representada pela SEQ ID NO: 28, ou um fragmento funcional, derivado, ortólogo ou parálogo do mesmo; preferencialmente a proteína de fusão hidrofobina confere resistência fúngica melhorada em relação às plantas de controle; ou (ii) uma sequência de aminoácidos codificada por um ácido nucleico que tem, em ordem crescente, de preferência pelo menos 60%, pelo menos 61%, pelo menos 62%, pelo menos 63%, pelo menos 64%, pelo menos 65%, pelo menos 66%, pelo menos 67%, pelo menos 68%, pelo menos 69%, pelo menos 70%, pelo menos 71%, pelo menos 72%, pelo menos 73%, pelo menos 74%, pelo menos 75%, pelo menos 76%, pelo menos 77%, pelo menos 78%, pelo menos 79%, pelo menos 80%, pelo menos 81%, pelo menos 82%, pelo menos 83%, pelo menos 84%, pelo menos 85%, pelo menos 86%, pelo menos 87%, pelo menos 88%, pelo menos 89%, pelo menos 90%, pelo menos 91%, pelo menos 92%, pelo menos 93%, pelo menos 94%, pelo menos 95%, pelo menos 96%, pelo menos 97%, pelo menos 98%, pelo menos 99% ou 100% de identidade de sequência à sequência de ácido nucleico representada pela SEQ ID NO: 27, ou um fragmento funcional, derivado, ortólogo ou parálogo do mesmo; preferencialmente a proteína de fusão hidrofobina confere resistência fúngica melhorada em relação às plantas de controle.

[170] Outra realização da presente invenção é uma proteína de fusão hidrofobina. Preferencialmente, a proteína de fusão hidrofobina é uma proteína que compreende uma sequência de aminoácidos selecionada a partir do grupo que consiste em: (i) uma sequência de aminoácidos que tem, em ordem crescente, de preferência pelo menos 60%, pelo menos 61%, pelo menos 62%, pelo menos 63%, pelo menos 64%, pelo menos 65%, pelo menos 66%, pelo menos 67%, pelo menos 68%, pelo menos 69%, pelo menos 70%, pelo menos 71%, pelo menos 72%, pelo menos 73%, pelo menos 74%, pelo menos 75%, pelo menos 76%, pelo menos 77%, pelo menos 78%, pelo menos 79%, pelo menos 80%, pelo menos 81%, pelo menos 82%, pelo menos 83%, pelo menos 84%, pelo menos 85%, pelo menos 86%, pelo menos 87%, pelo menos 88%, pelo menos 89%, pelo menos 90%, pelo menos 91%, pelo menos 92%, pelo menos 93%, pelo menos 94%, pelo menos 95%, pelo menos 96%, pelo menos 97%, pelo menos 98%, pelo menos 99% ou 100% de identidade de sequência à sequência de aminoácidos representada pela SEQ ID NO: 30, ou um fragmento funcional, derivado, ortólogo ou parálogo do mesmo; preferencialmente a proteína de fusão hidrofobina confere resistência fúngica melhorada em relação às plantas de controle; ou (ii) uma sequência de aminoácidos codificada por um ácido nucleico que tem, em ordem crescente, de preferência pelo menos 60%, pelo menos 61%, pelo menos 62%, pelo menos 63%, pelo menos 64%, pelo menos 65%, pelo menos 66%, pelo menos 67%, pelo menos 68%, pelo menos 69%, pelo menos 70%, pelo menos 71%, pelo menos 72%, pelo menos 73%, pelo menos 74%, pelo menos 75%, pelo menos 76%, pelo menos 77%, pelo menos 78%, pelo menos 79%, pelo menos 80%, pelo menos 81%, pelo menos 82%, pelo menos 83%, pelo menos 84%, pelo menos 85%, pelo menos 86%, pelo menos 87%, pelo menos 88%, pelo menos 89%, pelo menos 90%, pelo menos 91%, pelo menos 92%, pelo menos 93%, pelo menos 94%, pelo menos 95%, pelo menos 96%, pelo menos 97%, pelo menos 98%, pelo menos 99% ou 100% de identidade de sequência à sequência de ácido nucleico representada pela SEQ ID NO: 29, ou um fragmento funcional, derivado, ortólogo ou parálogo do mesmo; preferencialmente a proteína de fusão hidrofobina confere resistência fúngica melhorada em relação às plantas de controle.

[171] Preferencialmente, a proteína de fusão hidrofobina é uma proteína que compreende uma sequência de aminoácidos selecionada a partir do grupo que consiste em: (i) uma sequência de aminoácidos que tem, em ordem crescente, de preferência pelo menos 90%, pelo menos 91%, pelo menos 92%, pelo menos 93%, pelo menos 94%, pelo menos 95%, pelo menos 96%, pelo menos 97%, pelo menos 98%, pelo menos 99% ou pelo menos 100% de identidade de sequência à sequência de aminoácidos representada pela SEQ ID NO: 48, 50, 52, 28, 30, 32, 34, 36, 72, 74, 76, 78, 80, 82, 84 ou 86, ou um fragmento funcional, derivado, ortólogo ou parálogo do mesmo; preferencialmente a proteína de fusão hidrofobina confere resistência fúngica melhorada em relação às plantas de controle; ou (ii) sequência de aminoácidos codificada por um ácido nucleico que tem, em ordem crescente, de preferência pelo menos 90%, pelo menos 91%, pelo menos 92%, pelo menos 93%, pelo menos 94%, pelo menos 95%, pelo menos 96%, pelo menos 97%, pelo menos 98%, pelo menos 99% ou pelo menos 100% de identidade de sequência à sequência de ácido nucleico representada pela SEQ ID NO: 47, 49, 51, 27, 29, 31, 33, 35, 63 a 70, 71, 73, 75, 77, 79, 81, 83, ou 85, ou um fragmento funcional, derivado, ortólogo ou parálogo do mesmo; preferencialmente a proteína de fusão hidrofobina confere resistência fúngica melhorada em relação às plantas de controle.

[172] Preferencialmente, a proteína de fusão hidrofobina é uma proteína que compreende uma sequência de aminoácidos selecionada a partir do grupo que consiste em: (i) uma sequência de aminoácidos que tem, em ordem crescente, de preferência pelo menos 90%, pelo menos 91%, pelo menos 92%, pelo menos 93%, pelo menos 94%, pelo menos 95%, pelo menos 96%, pelo menos 97%, pelo menos 98%, pelo menos 99% ou pelo menos 100% de identidade de sequência à sequência de aminoácidos representada pela SEQ ID NO: 28, ou um fragmento funcional, derivado, ortólogo ou parálogo do mesmo; preferencialmente a proteína de fusão hidrofobina confere resistência fúngica melhorada em relação às plantas de controle; ou (ii) sequência de aminoácidos codificada por um ácido nucleico que tem, em ordem crescente, de preferência pelo menos 90%, pelo menos 91%, pelo menos 92%, pelo menos 93%, pelo menos 94%, pelo menos 95%, pelo menos 96%, pelo menos 97%, pelo menos 98%, pelo menos 99% ou pelo menos 100% de identidade de sequência à sequência de ácido nucleico representada pela SEQ ID NO: 27, ou um fragmento funcional, derivado, ortólogo ou parálogo do mesmo; preferencialmente a proteína de fusão hidrofobina confere resistência fúngica melhorada em relação às plantas de controle.

[173] Preferencialmente, a proteína de fusão hidrofobina é uma proteína que compreende uma sequência de aminoácidos selecionada a partir do grupo que consiste em: (i) uma sequência de aminoácidos que tem, em ordem crescente, de preferência pelo menos 90%, pelo menos 91%, pelo menos 92%, pelo menos 93%, pelo menos 94%, pelo menos 95%, pelo menos 96%, pelo menos 97%, pelo menos 98%, pelo menos 99% ou pelo menos 100% de identidade de sequência à sequência de aminoácidos representada pela SEQ ID NO: 30, ou um fragmento funcional, derivado, ortólogo ou parálogo do mesmo; preferencialmente a proteína de fusão hidrofobina confere resistência fúngica melhorada em relação às plantas de controle; ou (ii) sequência de aminoácidos codificada por um ácido nucleico que tem, em ordem crescente, de preferência pelo menos 90%, pelo menos 91%, pelo menos 92%, pelo menos 93%, pelo menos 94%, pelo menos 95%, pelo menos 96%, pelo menos 97%, pelo menos 98%, pelo menos 99% ou pelo menos 100% de identidade de sequência à sequência de ácido nucleico representada pela SEQ ID NO: 29, ou um fragmento funcional, derivado, ortólogo ou parálogo do mesmo; preferencialmente a proteína de fusão hidrofobina confere resistência fúngica melhorada em relação às plantas de controle.

[174] Preferencialmente, a proteína de fusão hidrofobina compreende pelo menos cerca de 100, pelo menos cerca de 150, pelo menos cerca de 175, pelo menos cerca de 200, pelo menos cerca de 250, pelo menos cerca de 300, pelo menos cerca de 350, pelo menos cerca de 400, pelo menos cerca de 450, pelo menos cerca de 500, pelo menos cerca de 550, pelo menos cerca de 600 resíduos de aminoácidos, preferencialmente resíduos de aminoácidos contínuos, preferencialmente contados a partir da terminação N ou da terminação C da sequência de aminoácidos, ou até o comprimento total da sequência de aminoácidos especificada na SEQ ID NO: 48, 50, 52, 28, 30, 32, 34, 36, 72, 74, 76, 78, 80, 82, 84 ou 86, preferencialmente da sequência de aminoácidos especificada na SEQ ID NO: 28 ou 30. Preferencialmente, um fragmento de proteína hidrofobina tem substancialmente a mesma atividade biológica que a sequência de aminoácidos dada na SEQ ID NO: 48, 50, 52, 28, 30, 32, 34, 36, 72, 74, 76, 78, 80, 82, 84 ou 86, preferencialmente, como SEQ ID NO: 28 ou 30.

[175] Preferencialmente, a proteína de fusão hidrofobina isolada compreende ou consiste em uma sequência de aminoácidos conforme representada na SEQ ID NO: 48, 50, 52, 28, 30, 32, 34, 36, 72, 74, 76, 78, 80, 82, 84 ou 86, ou é codificada por um ácido nucleico com uma sequência conforme mostrado na SEQ ID NO: 48, 50, 52, 27, 29, 31, 33, 35, 63 a 70, 71, 73, 75, 77, 79, 81, 83 ou 85.

[176] Preferencialmente, a proteína de fusão hidrofobina isolada compreende ou consiste em uma sequência de aminoácidos conforme representada na SEQ ID NO: 28, ou é codificada por um ácido nucleico com uma sequência conforme mostrado na SEQ ID NO: 27.

[177] Preferencialmente, a proteína de fusão hidrofobina isolada compreende ou consiste em uma sequência de aminoácidos conforme representada na SEQ ID NO: 30, ou é codificada por um ácido nucleico com uma sequência conforme mostrado na SEQ ID NO: 29.

CONSTRUÇÕES DE EXPRESSÃO E CONSTRUÇÕES DE VETOR

[178] A invenção também fornece construções genéticas, como construções de expressão ou cassetes de expressão, ou construções de vetor, que compreendem um ácido nucleico de hidrofobina ou um ácido nucleico de proteína de fusão hidrofobina. Preferencialmente, essas construções genéticas são adequadas para a introdução e/ou expressão em plantas, partes de planta ou células vegetais de ácidos nucleicos que codificam proteínas hidrofobina ou proteínas de fusão hidrofobina. As construções de expressão podem ser inseridas nos vetores, que podem estar comercialmente disponíveis, adequados para transformação em plantas ou células hospedeiras e adequados para expressão do gene de interesse nas células transformadas. A invenção também fornece o uso de uma construção genética, conforme definida no presente pedido, nos métodos da invenção. Dessa forma, outra realização da presente invenção é uma construção de expressão ou cassete de expressão que compreende um ácido nucleico de hidrofobina ou um ácido nucleico da proteína de fusão hidrofobina.

[179] As construções genéticas da invenção podem estar compreendidas em uma célula hospedeira, célula vegetal, semente, produto agrícola, planta ou parte de plantas. As plantas ou células hospedeiras são transformadas com uma construção genética, como uma construção de vetor ou uma construção de expressão que compreende qualquer um dos ácidos nucleicos de hidrofobina ou ácidos nucleicos da proteína de fusão hidrofobina descritos acima.

[180] Em uma realização, a construção genética da invenção confere resistência fúngica aumentada para uma planta, depois de ter sido introduzido na dita planta, cuja planta expressa o ácido nucleico que codifica a proteína hidrofobina compreendida na construção genética. Em outra realização, a construção genética da invenção confere resistência fúngica aumentada para uma planta que compreende células vegetais na qual a construção foi introduzida, cujas células vegetais expressam o ácido nucleico que codifica a proteína hidrofobina ou proteína de fusão hidrofobina compreendida na construção genética.

[181] O técnico no assunto é bem consciente dos elementos genéticos que devem estar presentes na construção genética a fim de transformar, selecionar e propagar com sucesso as células hospedeiras que contêm a sequência de interesse.

[182] Mais especificamente, a presente invenção fornece uma construção de expressão que compreende: (a) um ácido nucleico de hidrofobina que codifica uma proteína hidrofobina ou uma proteína de fusão hidrofobina conforme descrito acima; (b) uma ou mais sequências de controle capazes de direcionar a expressão da sequência de ácido nucleico de (a), em que a sequência controle é preferencialmente uma sequência promotora; e opcionalmente (c) uma sequência de terminação da transcrição.

[183] Preferencialmente, a presente invenção fornece uma construção de expressão que compreende: (a) um ácido nucleico da proteína de fusão hidrofobina que codifica uma proteína de fusão hidrofobina, em que a proteína de fusão hidrofobina compreende um ou mais elementos selecionados a partir do grupo que consiste em sequência sinal, parceiro de fusão, proteína hidrofobina, sequência ligante e sequência de purificação, todos conforme descrito acima; (b) uma ou mais sequências de controle capazes de direcionar a expressão da sequência de ácido nucleico de (a), em que a sequência controle é preferencialmente uma sequência promotora; e opcionalmente (c) uma sequência de terminação da transcrição.

[184] Preferencialmente, o ácido nucleico de hidrofobina ou o ácido nucleico da proteína de fusão hidrofobina da construção de expressão compreende um ácido nucleico selecionado a partir do grupo que consiste em: - um ácido nucleico que tem em ordem crescente, de preferência pelo menos 80%, pelo menos 85%, pelo menos 90%, pelo menos 93%, pelo menos 94%, pelo menos 95%, pelo menos 96%, pelo menos 97%, pelo menos 98%, pelo menos 99% ou pelo menos 100% de identidade de sequência à sequência de ácido nucleico representada pela SEQ ID NO: 1, 3, 5, 7, 9, 11, 13, 39, 41, 55 a 62, 89, 90, 47, 49, 51, 27, 29, 31, 33, 35, 63 a 70, 71, 73, 75, 77, 79, 81, 83 ou 85; - a sequência complementar de qualquer um dos ácidos nucleicos de (i); - um ácido nucleico que codifica uma proteína hidrofobina ou proteína de fusão hidrofobina que tem em ordem crescente, de preferência pelo menos 80%, pelo menos 85%, pelo menos 90%, pelo menos 93%, pelo menos 94%, pelo menos 95%, pelo menos 96%, pelo menos 97%, pelo menos 98%, pelo menos 99% ou pelo menos 100% de identidade de sequência à sequência de aminoácidos representada pela SEQ ID NO: 2, 4, 6, 8, 10, 12, 14, 40, 42, 43, 44, 45, 46, 87, 88, 48, 50, 52, 28, 30, 32, 34, 36, 72, 74, 76, 78, 80, 82, 84 ou 86, preferencialmente a proteína hidrofobina ou proteína de fusão hidrofobina confere resistência fúngica melhorada em relação às plantas de controle; - uma molécula de ácido nucleico que hibridiza com uma molécula de ácido nucleico de (i) a (iii) sob condições de hibridização de alta estringência; e - um ácido nucleico que codifica a mesma proteína que os ácidos nucleicos de (i) a (iv) acima, mas difere dos ácidos nucleicos de (i) a (iv) acima devido à degeneração do código genético.

[185] Com a máxima preferência, o ácido nucleico de hidrofobina ou ácido nucleico da proteína de fusão hidrofobina da construção de expressão tem SEQ ID NO: 1, 3, 27 ou 29, um complemento do mesmo, um ácido nucleico que codifica uma proteína hidrofobina ou proteína de fusão hidrofobina com SEQ ID NO: 2, 4, 28, 30 ou uma molécula de ácido nucleico que hibridiza com qualquer uma dessas moléculas de ácido nucleico sob condições de hibridização de alta estringência.

[186] Uma construção de vetor recombinante que compreende: (a) um cassete de expressão, conforme descrito acima, que compreende um ácido nucleico de hidrofobina ou um ácido nucleico da proteína de fusão hidrofobina, conforme descrito acima, ligado de maneira funcional com (b) um promotor e (c) uma sequência de terminação da transcrição é uma realização adicional da invenção.

[187] Preferencialmente, a construção do vetor recombinante compreende: (a) (i) um ácido nucleico que tem pelo menos 60% de identidade, preferencialmente pelo menos 70% de identidade de sequência, pelo menos 80%, pelo menos 90%, pelo menos 95%, pelo menos 98%, pelo menos 99% de identidade de sequência, ou até 100% de identidade de sequência com a SEQ ID NO: 1, 3, 5, 7, 9, 11, 13, 39, 41, 55 a 62, 89, 90, 47, 49, 51, 27, 29, 31, 33, 35, 63 a 70, 71, 73, 75, 77, 79, 81, 83 ou 85 ou um fragmento funcional do mesmo, ou um ortólogo ou um parálogo do mesmo; (ii) um ácido nucleico que codifica uma proteína que tem pelo menos 60% de identidade, preferencialmente pelo menos 70% de identidade de sequência, pelo menos 80%, pelo menos 90%, pelo menos 95%, pelo menos 98%, pelo menos 99% de identidade de sequência, ou até 100% de identidade de sequência com a SEQ ID NO: 2, 4, 6, 8, 10, 12, 14, 40, 42, 43, 44, 45, 46, 87, 88, 48, 50, 52, 28, 30, 32, 34, 36, 72, 74, 76, 78, 80, 82, 84 ou 86 ou um fragmento funcional do mesmo, ou um ortólogo ou um parálogo do mesmo; (iii) um ácido nucleico capaz de hibridizar, sob condições estringentes, com qualquer um dos ácidos nucleicos de acordo com (i) ou (ii) ou um complemento do mesmo; e/ou. (iv) um ácido nucleico que codifica a mesma proteína que os ácidos nucleicos de (i) a (iii) acima, mas difere dos ácidos nucleicos de (i) a (iii) acima devido à degeneração do código genético; ligado de maneira funcional com (b) um promotor e (c) uma sequência de terminação da transcrição.

[188] Além disso, é fornecido uma construção do vetor recombinante que compreende: (a) (i) um ácido nucleico que tem pelo menos 90%, pelo menos 95%, pelo menos 98%, pelo menos 99% de identidade de sequência, ou até 100% de identidade de sequência com a SEQ ID NO: 1, 3, 27 ou 29; (ii) um ácido nucleico que codifica uma proteína que tem pelo menos 90%, pelo menos 95%, pelo menos 98%, pelo menos 99% de identidade de sequência, ou até 100% de identidade de sequência com a SEQ ID NO: 2, 4, 28 ou 30; e/ou (iii) um ácido nucleico capaz de hibridizar, sob condições estringentes, com qualquer um dos ácidos nucleicos de acordo com (i) ou (ii) ou um complemento do mesmo; e/ou. (iv) um ácido nucleico que codifica a mesma proteína que os ácidos nucleicos de (i) a (iii) acima, mas difere dos ácidos nucleicos de (i) a (iii) acima devido à degeneração do código genético; ligado de maneira funcional com (b) um promotor e (c) uma sequência de terminação da transcrição é uma realização adicional da invenção.

[189] Preferencialmente, a sequência de terminação da transcrição é o terminador do gene inibidor de catepsina D (CATHD) de Solanum tuberosum (batata) de (SEQ ID NO: 38). Preferencialmente, a sequência de terminação da transcrição compreende um ácido nucleico que tem pelo menos 70%, pelo menos 80%, pelo menos 90%, pelo menos 95%, pelo menos 98%, pelo menos 99% de identidade de sequência ou até 100% de identidade de sequência com a SEQ ID NO: 38 ou um fragmento funcional do mesmo, ou um ortólogo ou um parálogo do mesmo.

[190] Os promotores de acordo com a presente invenção podem ser constitutivos, induzíveis, em particular patógeno-induzível, desenvolvimento de estágio-preferencial, célula tipo-preferencial, tecido-preferencial ou órgão- preferencial. Os promotores constitutivos são ativos sob a maioria das condições. Exemplos não limitantes de promotores constitutivos incluem os promotores CaMV 19S e 35S (Odell et al., 1985, Nature 313:810-812), o promotor sX CaMV 35S (Kay et al., 1987, Science 236:1299-1302), o promotor Sep1, o promotor de actina de arroz (McElroy et al., 1990, Plant Cell 2:163-171), o promotor de actina de Arabidopsis, o promotor de ubiquitina (Christensen et al., 1989, Plant Molec. Biol. 18:675-689); pEmu (Last et al., 1991, Theor. Appl. Genet. 81:581-588), o promotor 35S de vírus do mosaico da escrofulária, o promotor Smas (Velten et al., 1984, EMBO J. 3:2723-2730), o promotor GRP1-8, o promotor de álcool de cinamila desidrogenase (patente US 5.683.439), promotores do T-DNA de Agrobacterium, como manopina sintase, nopalina sintase e octopina sintase, o promotor da subunidade pequena de bifosfato ribulose carboxilase (ssuRUBISCO), e/ou similares.

[191] Preferencialmente, o vetor de expressão da invenção compreende um promotor constitutivo, promotor mesófilo-específico, promotor epiderme-específico, promotor raíz-específico, um promotor induzível de patógeno ou um promotor induzível fúngico. Um promotor é induzível, se sua atividade, medida na quantidade de RNA produzido sob controle do promotor, é pelo menos 30%, pelo menos 40%, pelo menos 50% preferencialmente pelo menos 60%, pelo menos 70%, pelo menos 80%, pelo menos 90%, mais preferencialmente pelo menos 100%, pelo menos 200%, pelo menos 300% mais alto em seu estado induzido, que em seu estado não induzido. Um promotor é célula-, tecido- ou órgão-específico, se sua atividade, medida na quantidade de RNA produzido sob controle do promotor, é pelo menos 30%, pelo menos 40%, pelo menos 50% preferencialmente pelo menos 60%, pelo menos 70%, pelo menos 80%, pelo menos 90%, mais preferencialmente pelo menos 100%, pelo menos 200%, pelo menos 300% mais alto em um tipo de célula, tecido ou órgão específico, então em outros tipos de células ou tecidos da mesma planta, preferencialmente os outros tipos de células ou tecidos são tipos de células ou tecidos do mesmo órgão da planta, por exemplo, uma raiz. No caso de promotores órgão específicos, a atividade de promotor tem que ser comparada à atividade de promotor em outros órgãos da planta, por exemplo, folhas, caules, flores ou sementes. Preferencialmente, o promotor é um promotor constitutivo, promotor mesófilo-específico ou promotor epiderme-específico.

[192] Preferencialmente, o promotor é um promotor epiderme- específico, com a máxima preferência é o promotor Glyma02g47670 (SEQ ID NO: 37). Preferencialmente, a sequência promotora compreende um ácido nucleico que tem pelo menos 70%, pelo menos 80%, pelo menos 90%, pelo menos 95%, pelo menos 98%, pelo menos 99% de identidade de sequência ou até 100% de identidade de sequência com a SEQ ID NO: 37 ou um fragmento funcional do mesmo, ou um ortólogo ou um parálogo do mesmo.

[193] Em realizações preferenciais, o aumento na quantidade e/ou atividade de proteína da proteína hidrofobina ocorre de uma maneira constitutiva ou tecido-específica. Em realizações especialmente preferenciais, um aumento essencialmente induzido por patógeno na quantidade e/ou atividade de proteína ocorre, por exemplo, por expressão recombinante do ácido nucleico de hidrofobina sob o controle de um promotor fúngico-induzível. Em particular, a expressão do ácido nucleico de hidrofobina ocorre em locais infectados por fungos, onde, no entanto, preferencialmente a expressão do ácido nucleico de hidrofobina permanece essencialmente inalterado em tecidos não infectados por fungos.

[194] Promotores preferenciais de estágio de desenvolvimento são preferencialmente expressos em certos estágios de desenvolvimento. Os promotores tecido e órgão preferenciais incluem os que são preferencialmente expressos em certos tecidos ou órgãos, como folhas, raízes, sementes ou xilema. Exemplos de promotores de tecidos preferenciais e órgãos preferenciais incluem, mas não se limitam a promotores de fruta-preferencial, óvulo-preferencial, tecido- preferencial masculino, semente-preferencial, tegumento-preferencial, tubérculo- preferencial, talo-preferencial, pericarpo-preferencial, folha-preferencial, estigma- preferencial, pólen-preferencial, antera-preferencial, uma pétala-preferencial, sépala-preferencial, pedicelo-preferencial, síliqua-preferencial, haste-preferencial e/ou raiz-preferencial e/ou similares. Promotores preferenciais de sementes são preferencialmente expressos durante o desenvolvimento da semente e/ou germinação. Por exemplo, promotores de sementes preferenciais podem ser embrião-preferencial, endosperma preferencial e tegumento-preferencial. Consulte Thompson et al., 1989, BioEssays 10:108. Exemplos de promotores preferenciais de sementes incluem, mas não se limitam a celulose sintase (celA), Cim1, gama-zeína, globulina-1, zeína 19 kD de milho (cZ19B1) e/ou similares.

[195] Outros tecidos preferenciais adequados ou promotores órgão-preferencial incluem, mas não se limitam ao promotor do gene napin de colza (U.S. Patent No. 5,608,152), o promotor USP de Vicia faba (Baeumlein et al., 1991, Mol Gen Genet. 225(3):459-67), o promotor de oleosina de Arabidopsis (pedido PCT documento WO 98/45461), o promotor de faseolina de Phaseolus vulgaris (patente US 5.504.200), o promotor de Bce4 de Brassica (pedido PCT documento WO 91/13980), ou o promotor de B4 de legumina (LeB4; Baeumlein et al., 1992, Plant Journal, 2(2):233-9), bem como promotores que conferem expressão específica de semente em plantas monocotiledônias como milho, cevada, trigo, centeio, arroz, etc. Promotores adequados para serem observados são os promotores de gene lpt2 ou lpt1 de cevadas (pedido PCT documento WO 95/15389 e pedido PCT documento WO 95/23230) ou os descritos no pedido PCT documento WO 99/16890 (promotores do gene de hordeína de cevada, gene de glutelina de arroz, gene de orizina de arroz, gene de prolamina de arroz, gene de gliadina de trigo, gene de glutelina de trigo, gene de glutelina de aveia, gene de kasirina de sorgo e/ou gene de secalina de centeio).

[196] Promotores úteis de acordo com a invenção incluem, mas não se limitam a, serem o principal promotor de proteína de ligação de a/b de clorofila, promotores de histona, o promotor de Ap3, o promotor de β-conglicina, o promotor de napina, o promotor de lecitina de soja, o promotor de zeína 15kD de milho, o promotor de zeína 22kD, o promotor de zeína 27kD, o promotor de g- zeína, o ceroso, contraído 1, contraído 2, promotores de bronze, o promotor de Zm13 (patente US 5.086.169), os promotores de poligalacturonase (PG) de milho (patentes US 5.412.085 e 5.545.546), o promotor de SGB6 (patente US 5.470.359), bem como promotores sintéticos ou outros naturais.

[197] Promotores epiderme-específicos podem ser selecionados a partir do grupo que consiste em: WIR5 (=GstA1); acc. X56012; Dudler & Schweizer, GLP4, acc. AJ310534; Wei Y., Zhang Z., Andersen C.H., Schmelzer E., Gregersen P.L., Collinge D.B., Smedegaard-Petersen V. e Thordal- Christensen H., Plant Molecular Biology 36, 101 (1998), GLP2a, acc. AJ237942, Schweizer P., Christoffel A. e Dudler R., Plant J. 20, 541 (1999); Prx7, acc. AJ003141, Kristensen B.K., Ammitzboll H., Rasmussen S.K. e Nielsen K.A., Molecular Plant Pathology, 2(6), 311 (2001); GerA, acc. AF250933; Wu S., Druka A., Horvath H., Kleinhofs A., Kannangara G. e von Wettstein D., Plant Phys Biochem 38, 685 (2000); OsROC1, acc. AP004656 RTBV, acc. AAV62708, AAV62707; Kloti A., Henrich C., Bieri S., He X., Chen G., Burkhardt P.K., Wünn J., Lucca P., Hohn T., Potrykus I. e Fütterer J., PMB 40, 249 (1999); Chitinase ChtC2-Promoter from potato (Ancillo et al., Planta. 217(4), 566, (2003)); AtProT3 Promoter (Grallath et al., Plant Physiology. 137(1), 117 (2005)); SHN-Promoters from Arabidopsis (AP2/EREBP transcription factors involved in cutin and wax production) (Aarón et al., Plant Cell. 16(9), 2463 (2004)); e/ou GSTA1 from wheat (Dudler et al., WP2005306368 e Altpeter et al., Plant Molecular Biology. 57(2), 271 (2005)).

[198] Promotores mesófilo-específicos podem ser selecionados a partir do grupo que consiste em: PPCZm1 (=PEPC); Kausch A.P., Owen T.P., Zachwieja S.J., Flynn A.R. e Sheen J., Plant Mol. Biol. 45, 1 (2001); OsrbcS, Kyozuka et al., PlaNT Phys 102, 991 (1993); Kyozuka J., McElroy D., Hayakawa T., Xie Y., Wu R. e Shimamoto K., Plant Phys. 102, 991 (1993); OsPPDK, acc. AC099041; TaGF-2.8, acc. M63223; Schweizer P., Christoffel A. e Dudler R., Plant J. 20, 541 (1999); TaFBPase, acc. X53957; TaWIS1, acc. AF467542; patente US 200220115849; HvBIS1, acc. AF467539; patente US 200220115849; ZmMIS1, acc. AF467514; patente US 200220115849; HvPR1a, acc. X74939; Bryngelsson et al., Mol. Plant Microbe Interacti. 7 (2), 267 (1994); HvPR1b, acc. X74940; Bryngelsson et al., Mol. Plant Microbe Interact. 7(2), 267 (1994); HvB1,3gluc; acc. AF479647; HvPrx8, acc. AJ276227; Kristensen et al., Molecular Plant Pathology, 2(6), 311 (2001); e/ou HvPAL, acc. X97313; Wei Y., Zhang Z., Andersen C.H., Schmelzer E., Gregersen P.L., Collinge D.B., Smedegaard- Petersen V. e Thordal-Christensen H. Plant Molecular Biology 36, 101 (1998).

[199] Promotores constitutivos podem ser selecionados a partir do grupo que consiste em: PcUbi promoter from parsley (documento WO 03/102198) CaMV 35S promoter: Cauliflower Mosaic Virus 35S promoter (Benfey et al. 1989 EMBO J. 8(8): 2195-2202), STPT promoter: Arabidopsis thaliana Short Triose phosphat translocator promoter (Acesso NM_123979) - Act1 promoter: - Oryza sativa actin 1 gene promoter (McElroy et al. 1990 PLANT CELL 2(2) 163-171 a) e/ou EF1A2 promoter: Glycine max translation elongation factor EF1 alpha (patente US 20090133159).

[200] Um tipo de construção de vetor é um “plasmídeo”, que se refere a uma alça de DNA de fita dupla circular na qual segmentos de DNA adicionais podem ser ligados. Outro tipo de vetor é um vetor viral, em que segmentos de DNA adicionais podem ser ligados ao genoma viral. Certas construções de vetor são capazes de replicação autônoma em uma célula vegetal hospedeira em que eles são introduzidos. Outras construções de vetores são integradas no genoma de uma célula vegetal hospedeira mediante introdução em uma célula hospedeira, e assim são replicados junto com o genoma hospedeiro. Em particular a construção de vetor é capaz de direcionar a expressão de gene para o qual os vetores são ligados de maneira funcional. No entanto, a invenção tem a intenção de incluir essas outras formas de expressão de construções de vetores, como vetores virais (por exemplo, potato vírus X tabaco rattle vírus, e/ou Gemini vírus), que serve funções equivalentes.

[201] As construções e vetores de expressão de hidrofobina descritos no presente pedido são úteis nos métodos, plantas, partes coletáveis e produtos da invenção.

[202] Em realizações preferenciais, o aumento na quantidade ou função de proteína da proteína hidrofobina ocorre de uma maneira constitutiva ou tecido-específica. Em realizações especialmente preferenciais, um aumento essencialmente induzido por patógeno na quantidade de proteína ou função de proteína ocorre, por exemplo, por expressão exógena do ácido nucleico de hidrofobina sob o controle de um promotor fúngico-induzível. Em particular, a expressão do ácido nucleico de hidrofobina ocorre em locais infectados por fungos, onde, no entanto, preferencialmente a expressão da sequência de ácido nucleico de hidrofobina permanece essencialmente inalterado em tecidos não infectados por fungos. Em realizações preferenciais, a quantidade de proteína de uma proteína hidrofobina na planta é aumentada por pelo menos 10%, pelo menos 20%, pelo menos 30%, pelo menos 40%, pelo menos 50%, pelo menos 60%, pelo menos 70%, pelo menos 80%, pelo menos 90% ou pelo menos 95% ou mais em comparação a uma planta tipo selvagem que não é transformada com o ácido nucleico de hidrofobina.

MÉTODOS PARA AUMENTAR RESISTÊNCIA FÚNGICA; MÉTODOS PARA MODULAR EXPRESSÃO GÊNICA

[203] A invenção presente também fornece um método para aumentar resistência a patógenos fúngicos, em particular patógenos fúngicos da Família Phacopsoraceae, preferencialmente contra patógenos fúngicos do Gênero Phacopsora, mais preferencialmente contra Phakopsora pachyrhizi (Sydow) e Phakopsora meibomiae (Arthur), também conhecido como ferrugem da soja em plantas ou células vegetais, em que em comparação a plantas tipo selvagem, partes de planta tipo selvagem ou células vegetais tipo selvagem uma proteína hidrofobina ou um fragmento funcional, ortólogo, parálogo ou homólogo dos mesmos é aumentada em expressão.

[204] A presente invenção ainda fornece um método para aumentar a resistência a patógenos fúngicos do Gênero Phacopsora, com a máxima preferência contra Phakopsora pachyrhizi (Sydow) e Phakopsora meibomiae (Arthur), também conhecido como ferrugem da soja em plantas ou células vegetais aumentando a expressão de uma proteína hidrofobina.

[205] Em realizações preferenciais, a quantidade de proteína e/ou função da proteína hidrofobina na planta é aumentada por pelo menos 10%, pelo menos 20%, pelo menos 30%, pelo menos 40%, pelo menos 50%, pelo menos 60%, pelo menos 70%, pelo menos 80%, pelo menos 90% ou pelo menos 95% ou mais em comparação com uma planta tipo selvagem que não é transformada com o ácido nucleico de hidrofobina.

[206] Em uma realização da invenção, a proteína hidrofobina é codificada por: (i) um ácido nucleico que tem pelo menos 60%, pelo menos 70%, por exemplo, pelo menos 75%, mais preferencialmente pelo menos 80%, por exemplo, pelo menos 85%, ainda mais preferencialmente pelo menos 90%, por exemplo, pelo menos 95% ou pelo menos 96% ou pelo menos 97% ou pelo menos 98% com a máxima preferência 99% de identidade com a SEQ ID NO: 1, 3, 5, 7, 9, 11, 13, 39, 41, 55 a 62, 89 ou 90, ou um fragmento funcional do mesmo, ou um ortólogo ou parálogo do mesmo; (ii) um ácido nucleico que codifica uma proteína que tem pelo menos 60% de identidade, pelo menos 70%, por exemplo, pelo menos 75%, mais preferencialmente pelo menos 80%, por exemplo, pelo menos 85%, ainda mais preferencialmente pelo menos 90%, por exemplo, pelo menos 95% ou pelo menos 96% ou pelo menos 97% ou pelo menos 98% com a máxima preferência 99% de homologia com a SEQ ID NO: 2, 4, 6, 8, 10, 12, 14, 40, 42, 43, 44, 45, 46, 87 ou 88, um fragmento funcional do mesmo, um ortólogo ou um parálogo do mesmo; (iii) um ácido nucleico exógeno capaz de hibridizar, sob condições estringentes, com qualquer um dos ácidos nucleicos de acordo com (i) ou (ii) ou uma sequência complementar (complemento) do mesmo; e/ou por (iv) um ácido nucleico que codifica a mesma proteína que os ácidos nucleicos de (i) a (iii) acima, mas difere dos ácidos nucleicos de (i) a (iii) acima devido à degeneração do código genético.

[207] Um método para aumentar resistência fúngica, preferencialmente resistência a Phacopsoracea, por exemplo, ferrugem da soja, em uma planta, parte da planta ou célula vegetal, aumentando a expressão de uma proteína hidrofobina ou de um fragmento funcional, ortólogo, parálogo ou homólogo do mesmo em que a proteína hidrofobina é codificada por: (i) um ácido nucleico exógeno que tem pelo menos 80%, pelo menos 90%, pelo menos 95%, pelo menos 98%, pelo menos 99% de identidade de sequência, ou até 100% de identidade de sequência com a SEQ ID NO: 1, 3, 5, 7, 9, 11, 13, 39, 41, 55 a 62, 89 ou 90, ou um fragmento funcional do mesmo, um ortólogo ou um parálogo do mesmo; (ii) um ácido nucleico exógeno que codifica uma proteína que tem pelo menos 80%, pelo menos 90%, pelo menos 95%, pelo menos 98%, pelo menos 99% de identidade de sequência, ou até 100% de identidade de sequência com a SEQ ID NO: 2, 4, 6, 8, 10, 12, 14, 40, 42, 43, 44, 45, 46, 87 ou 88, ou um fragmento funcional do mesmo, um ortólogo ou um parálogo do mesmo; (iii) um ácido nucleico exógeno capaz de hibridizar, sob condições estringentes, com qualquer um dos ácidos nucleicos de acordo com (i) ou (ii) ou um complemento do mesmo é uma realização adicional da invenção; e/ou por (iv) um ácido nucleico que codifica a mesma proteína que os ácidos nucleicos de (i) a (iii) acima, mas difere dos ácidos nucleicos de (i) a (iii) acima devido à degeneração do código genético.

[208] No método para aumentar resistência a patógenos fúngicos o ácido nucleico exógeno que codifica uma proteína hidrofobina também pode codificar uma proteína de fusão hidrofobina que compreende a proteína hidrofobina e um ou mais elementos selecionados a partir do grupo que consiste em sequência sinal, polipeptídeo parceiro de fusão, sequência ligante e sequência de purificação.

[209] Preferencialmente, a proteína de fusão hidrofobina compreende uma sequência sinal, preferencialmente, a sequência sinal sendo uma sequência sinal de secreção. Preferencialmente, a sequência sinal de secreção é codificada por: (i) um ácido nucleico exógeno que tem pelo menos 80% de identidade com a SEQ ID NO: 23; ou um fragmento funcional do mesmo, um ortólogo ou um parálogo do mesmo; (ii) um ácido nucleico exógeno que codifica uma proteína que tem pelo menos 80% de identidade com a SEQ ID NO: 24; ou um fragmento funcional do mesmo, um ortólogo ou um parálogo do mesmo; (iii) um ácido nucleico exógeno capaz de hibridizar, sob condições estringentes, com qualquer um dos ácidos nucleicos de acordo com (i) ou (ii) ou uma sequência complementar do mesmo; e/ou (iv) um ácido nucleico que codifica a mesma proteína que os ácidos nucleicos de (i) a (iii) acima, mas difere dos ácidos nucleicos de (i) a (iii) acima devido à degeneração do código genético.

[210] Em outra realização, a proteína de fusão hidrofobina compreende um polipeptídeo parceiro de fusão e o polipeptídeo parceiro de fusão é codificado por: (i) um ácido nucleico exógeno que tem pelo menos 60% de identidade com a SEQ ID NO: 15, 17, 19 ou 21; ou um fragmento do mesmo, um ortólogo ou um parálogo do mesmo; (ii) um ácido nucleico exógeno que codifica uma proteína que tem pelo menos 60% de identidade com a SEQ ID NO: 16, 18, 20, 22, 53 ou 54; ou um fragmento do mesmo, um ortólogo ou um parálogo do mesmo; (iii) um ácido nucleico exógeno capaz de hibridizar, sob condições estringentes, com qualquer um dos ácidos nucleicos de acordo com (i) ou (ii) ou uma sequência complementar do mesmo; e/ou (iv) um ácido nucleico que codifica a mesma proteína que os ácidos nucleicos de (i) a (iii) acima, mas difere dos ácidos nucleicos de (i) a (iii) acima devido à degeneração do código genético.

[211] Dessa forma, preferencialmente, no método para aumentar resistência a patógenos fúngicos, a proteína de fusão hidrofobina é codificada por: (i) um ácido nucleico que tem pelo menos 60%, pelo menos 70%, por exemplo, pelo menos 75%, mais preferencialmente pelo menos 80%, por exemplo, pelo menos 85%, ainda mais preferencialmente pelo menos 90%, por exemplo, pelo menos 95% ou pelo menos 96% ou pelo menos 97% ou pelo menos 98% com a máxima preferência 99% de identidade com a SEQ ID NO: 47, 49, 51, 27, 29, 31, 33, 35, 63 a 70, 71, 73, 75, 77, 79, 81, 83 ou 85, um fragmento funcional do mesmo, ou um ortólogo ou um parálogo do mesmo; ou por (ii) um ácido nucleico que codifica uma proteína que tem pelo menos 60% de identidade, pelo menos 70%, por exemplo, pelo menos 75%, mais preferencialmente pelo menos 80%, por exemplo, pelo menos 85%, ainda mais preferencialmente pelo menos 90%, por exemplo, pelo menos 95% ou pelo menos 96% ou pelo menos 97% ou pelo menos 98% com a máxima preferência 99% de homologia com a SEQ ID NO: 48, 50, 52, 28, 30, 32, 34, 36, 72, 74, 76, 78, 80, 82, 84 ou 86, um fragmento funcional do mesmo, um ortólogo ou um parálogo do mesmo; (iii) um ácido nucleico exógeno capaz de hibridizar, sob condições estringentes, com qualquer um dos ácidos nucleicos de acordo com (i) ou (ii) ou uma sequência complementar (complemento) do mesmo; ou por (iv) um ácido nucleico que codifica a mesma proteína que os ácidos nucleicos de (i) a (iii) acima, mas difere dos ácidos nucleicos de (i) a (iii) acima devido à degeneração do código genético.

[212] Em um método adicional da invenção, o método compreende as etapas de: (i) transformar de maneira estável uma célula vegetal com um (i) cassete de expressão recombinante conforme descrito no presente pedido em ligação funcional com um promotor ou (ii) uma construção de vetor recombinante conforme descrito no presente pedido; (ii) regenerar a planta a partir da célula vegetal; e (iii) expressar o dito ácido nucleico, opcionalmente em que o ácido nucleico que codifica uma proteína hidrofobina é expresso em uma quantidade e por um período suficiente para gerar ou para aumentar a resistência à ferrugem da soja na dita planta.

[213] Em um método adicional da invenção, o método compreende as etapas de: (a) transformar de maneira estável uma célula vegetal com um cassete de expressão que compreende: (i) um ácido nucleico que tem pelo menos 60% de identidade, pelo menos 70% de identidade de sequência, pelo menos 80 %, pelo menos 90%, pelo menos 95 %, pelo menos 98%, pelo menos 99% de identidade de sequência, ou mesmo 100% de identidade de sequência com a SEQ ID NO: 1, 3, 5, 7, 9, 11, 13, 39, 41, 55-62, 89, 90, 47, 49, 51, 27, 29, 31, 33, 35, 63 a 70, 71, 73, 75, 77, 79, 81, 83 ou 85; ou um fragmento funcional do mesmo, ou um ortólogo ou um parálogo do mesmo; (ii) um ácido nucleico que codifica uma proteína que tem pelo menos 60% de identidade, pelo menos 70% de identidade de sequência, pelo menos 80 %, pelo menos 90%, pelo menos 95 %, pelo menos 98%, pelo menos 99% de identidade de sequência, ou até 100% de identidade de sequência com a SEQ ID NO: 2, 4, 6, 8, 10, 12, 14, 40, 42, 43, 44, 45, 46, 87, 88, 48, 50, 52, 28, 30, 32, 34, 36, 72, 74, 76, 78, 80, 82, 84 ou 86; ou um fragmento funcional do mesmo, ou um ortólogo ou um parálogo do mesmo; (iii) um ácido nucleico capaz de hibridizar, sob condições estringentes, com qualquer um dos ácidos nucleicos de acordo com (i) ou (ii) ou um complemento do mesmo; e/ou (iv) um ácido nucleico que codifica a mesma proteína que os ácidos nucleicos de (i) a (iii) acima, mas difere dos ácidos nucleicos de (i) a (iii) acima devido à degeneração do código genético; em ligação funcional com um promotor; (b) regenerar a planta a partir da célula vegetal; e (c) expressar o dito ácido nucleico, opcionalmente em que o ácido nucleico que codifica uma proteína hidrofobina é expresso em uma quantidade e por um período suficiente para gerar ou para aumentar a resistência à ferrugem da soja na dita planta.

[214] Uma realização preferencial é um método para aumentar a resistência à ferrugem da soja em uma planta de soja, parte da planta de soja ou célula vegetal de soja, por aumento da expressão de uma proteína hidrofobina ou proteína de fusão hidrofobina, em que a proteína hidrofobina ou proteína de fusão hidrofobina é codificada por: (i) um ácido nucleico exógeno que tem pelo menos 90%, pelo menos 95%, pelo menos 98%, pelo menos 99% de identidade de sequência, ou até 100% de identidade de sequência com a SEQ ID NO: 1, 3, 5, 7, 9, 11, 13, 39, 41, 55-62, 89, 90, 47, 49, 51, 27, 29, 31, 33, 35, 63-70, 71, 73, 75, 77, 79, 81, 83 ou 85; (ii) um ácido nucleico exógeno que codifica uma proteína que tem pelo menos 90%, pelo menos 95%, pelo menos 98%, pelo menos 99% de identidade de sequência, ou até 100% de identidade de sequência com a SEQ ID NO: 2, 4, 6, 8, 10, 12, 14, 40, 42, 43, 44, 45, 46, 87, 88, 48, 50, 52, 28, 30, 32, 34, 36, 72, 74, 76, 78, 80, 82, 84 ou 86; (iii) um ácido nucleico exógeno capaz de hibridizar, sob condições estringentes, com qualquer um dos ácidos nucleicos de acordo com (i) ou (ii) ou um complemento do mesmo; e/ou por (iv) um ácido nucleico que codifica a mesma proteína que os ácidos nucleicos de (i) a (iii) acima, mas difere dos ácidos nucleicos de (i) a (iii) acima devido à degeneração do código genético; em que o aumento da expressão da proteína hidrofobina é alcançado por transformação da planta de soja, parte da planta ou célula vegetal com um ácido nucleico que compreende o ácido nucleico especificado no item (i), (ii), (iii) ou (iv).

[215] Também, uma realização preferencial é um método para aumentar a resistência à ferrugem da soja em uma planta de soja, parte da planta de soja ou célula vegetal de soja, por aumento da expressão de uma proteína hidrofobina, em que a proteína hidrofobina é codificada por: (i) um ácido nucleico exógeno que tem pelo menos 90%, pelo menos 95%, pelo menos 98%, pelo menos 99% de identidade de sequência, ou até 100% de identidade de sequência com a SEQ ID NO: 1, 3, 27 ou 29; ou (ii) um ácido nucleico exógeno que codifica uma proteína que tem pelo menos 90%, pelo menos 95%, pelo menos 98%, pelo menos 99% de identidade de sequência, ou até 100% de identidade de sequência com a SEQ ID NO: 2, 4, 28 ou 30; em que o aumento da expressão da proteína hidrofobina é alcançado por transformação da planta de soja, parte da planta ou célula vegetal com um ácido nucleico que compreende o ácido nucleico especificado no item (i) ou (ii).

[216] Outra realização da presente invenção é um método para aplicar uma proteína hidrofobina, conforme descrito no presente pedido, a uma superfície de uma planta, parte da planta ou célula vegetal. Partes preferenciais das plantas são folhas, caule, flores, sementes, raízes ou partes das mesmas.

[217] A aplicação da proteína hidrofobina à superfície da planta, parte da planta ou célula vegetal pode ser alcançada de diversas maneiras. Preferencialmente, a proteína hidrofobina é aplicada à superfície da planta por pulverização de uma formulação ou solução contendo a proteína hidrofobina na superfície da planta, parte da planta ou célula vegetal. De maneira alternativa, a planta, parte da planta ou célula vegetal pode ser mergulhada na formulação ou solução contendo hidrofobina ou pode ser cultivada, incubada ou impregnada na solução contendo hidrofobina. Além disso, a aplicação da proteína hidrofobina à superfície da planta, parte da planta ou célula vegetal pode ser alcançada por meio de tecnologia gênica. Por exemplo, a planta transgênica, parte da planta ou célula vegetal pode ser gerada, a qual expressa a proteína hidrofobina e excreta a proteína hidrofobina (preferencialmente por meio de uma proteína de fusão hidrofobina conforme descrito no presente pedido) para a superfície da planta, parte da planta ou célula vegetal.

[218] É dessa forma preferencial um método para aplicação de uma proteína hidrofobina a uma superfície de uma planta, parte da planta ou célula vegetal, em que a proteína hidrofobina é codificada por um ácido nucleico selecionado a partir do grupo que consiste em: (i) um ácido nucleico que tem, em ordem crescente, de preferência, pelo menos 60%, pelo menos 61%, pelo menos 62%, pelo menos 63%, pelo menos 64%, pelo menos 65%, pelo menos 66%, pelo menos 67%, pelo menos 68%, pelo menos 69%, pelo menos 70%, pelo menos 71%, pelo menos 72%, pelo menos 73%, pelo menos 74%, pelo menos 75%, pelo menos 76%, pelo menos 77%, pelo menos 78%, pelo menos 79%, pelo menos 80%, pelo menos 81%, pelo menos 82%, pelo menos 83%, pelo menos 84%, pelo menos 85%, pelo menos 86%, pelo menos 87%, pelo menos 88%, pelo menos 89%, pelo menos 90%, pelo menos 91%, pelo menos 92%, pelo menos 93%, pelo menos 94%, pelo menos 95%, pelo menos 96%, pelo menos 97%, pelo menos 98%, pelo menos 99% ou 100% de identidade de sequência com a sequência de ácido nucleico representada por SEQ ID NO: 1, 3, 5, 7, 9, 11, 13, 39, 41, 55 a 62, 89 ou 90, ou um fragmento funcional, derivado, ortólogo ou parálogo do mesmo; (ii) a sequência complementar de qualquer um dos ácidos nucleicos de (i); (iii) um ácido nucleico que codifica uma proteína hidrofobina que tem, em ordem crescente, de preferência pelo menos 60%, pelo menos 61%, pelo menos 62%, pelo menos 63%, pelo menos 64%, pelo menos 65%, pelo menos 66%, pelo menos 67%, pelo menos 68%, pelo menos 69%, pelo menos 70%, pelo menos 71%, pelo menos 72%, pelo menos 73%, pelo menos 74%, pelo menos 75%, pelo menos 76%, pelo menos 77%, pelo menos 78%, pelo menos 79%, pelo menos 80%, pelo menos 81%, pelo menos 82%, pelo menos 83%, pelo menos 84%, pelo menos 85%, pelo menos 86%, pelo menos 87%, pelo menos 88%, pelo menos 89%, pelo menos 90%, pelo menos 91%, pelo menos 92%, pelo menos 93%, pelo menos 94%, pelo menos 95%, pelo menos 96%, pelo menos 97%, pelo menos 98%, pelo menos 99% ou 100% de identidade de sequência com a sequência de aminoácidos representada por SEQ ID NO: 2, 4, 6, 8, 10, 12, 14, 40, 42, 43, 44, 45, 46, 87 ou 88, ou um fragmento funcional, derivado, ortólogo ou parálogo do mesmo; preferencialmente o polipeptídeo hidrofobina confere resistência fúngica aumentada em relação às plantas de controle; e (iv) uma molécula de ácida nucleico que hibridiza com uma molécula de ácida nucleico de (i) a (iii) sob condições de hibridização de alta estringência; e/ou (v) um ácido nucleico que codifica a mesma proteína que os ácidos nucleicos de (i) a (iv) acima, mas difere dos ácidos nucleicos de (i) a (iv) acima devido à degeneração do código genético.

[219] Ainda preferencial é um método para aplicação de uma proteína hidrofobina, conforme descrito no presente pedido, a uma superfície de uma planta, parte da planta ou célula vegetal, em que a proteína hidrofobina compreende uma sequência de aminoácidos com pelo menos 60% de identidade com a SEQ ID NO: 2, 4, 6, 8, 10, 12, 14, 40, 42, 43, 44, 45, 46, 87 ou 88; ou um fragmento funcional da mesma, um ortólogo ou um parálogo da mesma;

[220] Dessa forma, é preferencial um método para aumentar resistência fúngica em uma planta por aplicação de uma proteína hidrofobina, conforme descrito no presente pedido, a uma superfície de uma planta, parte da planta ou célula vegetal, preferencialmente por pulverização de uma formulação que compreende uma proteína hidrofobina à superfície da planta, parte da planta ou célula vegetal.

[221] Então, a presente invenção também é direcionada ao uso de uma proteína hidrofobina, conforme descrito no presente pedido, para aplicação da proteína hidrofobina à superfície de uma planta, uma parte da planta ou uma célula vegetal.

[222] Preferencialmente, a presente invenção também é direcionada ao uso de uma proteína hidrofobina, conforme descrito no presente pedido, para aumentar a resistência fúngica em uma planta, uma parte da planta ou uma célula vegetal, por aplicação da proteína hidrofobina a uma superfície de uma planta, uma parte da planta ou uma célula vegetal.

[223] Dessa forma, a presente invenção também é direcionada a uma superfície de uma planta, parte da planta ou célula vegetal revestida com uma proteína hidrofobina, conforme descrito no presente pedido.

[224] Preferencialmente, a proteína hidrofobina é aplicada à superfície de uma planta, parte da planta ou célula vegetal, sob a forma de uma proteína hidrofobina de fusão, conforme descrito no presente pedido, preferencialmente com uma proteína de fusão que compreende uma sequência de aminoácidos tendo pelo menos 60%, pelo menos 70 %, pelo menos 80%, pelo menos 85%, pelo menos 90%, pelo menos 92%, pelo menos 95%, pelo menos 97%, pelo menos 98%, pelo menos 99% ou até 100% de identidade de sequência com a SEQ ID NO: 32, 34, 36, 48, 80 ou 52, ou uma sequência de aminoácidos codificada por uma sequência de ácido nucleico que tem pelo menos 60%, pelo menos 70%, pelo menos 80%, pelo menos 85%, pelo menos 90%, pelo menos 92%, pelo menos 95%, pelo menos 97%, pelo menos 98%, pelo menos 99%, ou até 100% de identidade de sequência com a SEQ ID NO: 31, 33, 35, 47, 49 ou 51.

[225] A superfície de uma planta ou parte da planta revestida com uma proteína hidrofobina pode ser a superfície de qualquer órgão da planta. Preferencialmente, a superfície de uma planta ou parte da planta revestida com uma proteína hidrofobina é uma superfície do órgão da planta com o órgão da planta sendo selecionado a partir do grupo que consiste em folha, caule, flores, raízes e sementes.

[226] Também parte da invenção é uma planta, parte da planta ou célula vegetal que tem uma superfície revestida com uma proteína hidrofobina, conforme descrito no presente pedido.

[227] A formulação contendo a hidrofobina preferencialmente compreende um ou mais dos seguintes: solvente, tampão, tensoativo, detergente (iônico e/ou não iônico), estabilizante e conservante. As formulações de hidrofobina e condições apropriadas para o revestimento de uma superfície com uma proteína hidrofobina são descritas nos Exemplos e, por exemplo, nos documentos WO2006/082253A2, WO2006/082251A2 e WO2006/131564A2.

[228] Os patógenos fúngicos oupatógenos similares a fungos (como, por exemplo, Chromista) podem pertencer ao grupo que compreende Plasmodiophoramycota, Oomycota, Ascomycota, Chytridiomycetes, Zygomycetes, Basidiomycota ou Deuteromycetes (Fungos imperfeitos). Os agentes patogênicos que podem ser mencionados a título de exemplo, mas não de limitação, são os detalhados nas Tabelas 2 e 3, e as doenças que estão associadas a eles. TABELA 2 DOENÇAS CAUSADAS POR FUNGOS FITOPATOGÊNICOS BIOTRÓFICOS E/OU HEMINECROTRÓFICOS

TABELA 3 DOENÇAS CAUSADAS POR FUNGOS NECROTRÓFICOS E/OU HEMIBIOTRÓFICOS E OOMICETOS

[229] Os seguintes são especialmente preferenciais: - Plasmodiophoromycota como Plasmodiophora brassicae (clubroot de crucíferas), Spongospora oronate an, Polymyxa graminis, - Oomycota como Bremia lactucae (míldio de alface), Peronospora (míldio) em boca-de-dragão (P. antirrhini), cebola (P. destructor), espinafre (P. orona), soja (P. manchurica), orona (“fungo azul”; P. tabacina) alfalfa e trevo (P. trifolium), Pseudoperonospora humuli (mídio de lúpulo), Plasmopara (míldio de videiras) (P. viticola) e oronat (P. halstedii), Sclerophthora macrospora (míldio em cereais e gramíneas), Pythium (por exemplo, tombamento de beterraba Beta causado por P. debaryanum), Phytophthora infestans (crestamento tardio em batata, tomate e similares), Albugo spec. - Ascomycota como Microdochium nivale (mofo branco de centeio e trigo), Fusarium, Fusarium graminearum, Fusarium culmorum (esterilidade parcial da espiga principalmente no trigo), Fusarium oxysporum (Fusarium wilt de tomate), Blumeria graminis (oídio de cevada (f.sp. hordei) e trigo (f.sp. tritici)), Erysiphe pisi (oídio de ervilha), Nectria galligena (ferida de Nectria de árvores frutíferas), Uncinula necator (oídio de videiras), Pseudopeziza tracheiphila (doença do fogo vermelho de videira), Claviceps purpurea (esporão, por exemplo, trigo e gramíneas), Gaeumannomyces graminis (take-all no trigo, centeio e outras gramíneas), Magnaporthe grisea, Pyrenophora graminea (faixa na folha de cevada), Pyrenophora teres (mancha-reticular da cevada), Pyrenophora tritici-repentis (crestamento foliar de trigo), Venturia inaequalis ( oron-da-macieira), Sclerotinia sclerotium (quebra de talo, apodrecimento do caule), Pseudopeziza medicaginis (manchas foliares de alfalfa, trevo branco e vermelho). - Basidiomycetes como Typhula oronate (crestamento de typhula em ceveda, centeio, trigo), Ustilago maydis ( oronat no milho), Ustilago nuda (ferrugem solta na cevada), Ustilago tritici (ferrugem solta no trigo, espelta), Ustilago avenae (ferrugem solta em aveia), Rhizoctonia solani (apodrecimento radicular de batata), Sphacelotheca spp. (head smut do sorgo), Melampsora lini (ferrugem do linho), Puccinia graminis (ferrugem do caule de trigo, cevada, centeio, aveia), Puccinia oronate (ferrugem da folha do trigo), Puccinia dispersa (ferrugem marrom do centeio), Puccinia hordei (ferrugem da folha da cevada), Puccinia oronate (ferrugem da coroa de aveia), Puccinia striiformis (ferrugem amarela do trigo, cevada, centeio e de um grande número de gramíneas), Uromyces appendiculatus (ferrugem marrom do feijão), Sclerotium rolfsii (apodrecimento de raiz e caule de muitas plantas). - Deuteromycetes (Fungos imperfeitos) como Septoria (Stagonospora) nodorum (glume mancha) do trigo (Septoria tritici), Pseudocercosporella herpotrichoides (eyespot de trigo, cevada, centeio), Rynchosporium secalis (manchas foliares em centeio e cevada), Alternaria solani (crestamento precoce de batata, tomate), Phoma betae (blackleg em beterraba Beta), Cercospora beticola (pontos na folha em beterrana Beta), Alternaria brassicae (pontos pretos em colza, couve e outras crucíferas), Verticillium orona (verticillium wilt), Colletotrichum, Colletotrichum lindemuthianum (antracnose do feijão), Phoma lingam (blackleg de repolho e colza), Botrytis cinerea (mofo cinzento de videira, morango, tomate, lúpulo e similares). - Especialmente preferencial são os patógenos biotróficos, por exemplo, Phakopsora pachyrhizi e/ou esses patógenos que têm essencialmente um mecanismo similar de infecção como Phakopsora pachyrhizi, conforme descrito no presente pedido. Particularmente preferencial são os patógenos da Subclasse Pucciniomycetes, preferencialmente da Ordem Pucciniales (rust), anteriormente conhecida como Uredinales, entre as quais em particular, Melompsoraceae. São preferenciais Phakopsoraceae, mais preferencialmente Phakopsora. Especialmente preferenciais são Phakopsora pachyrhizi e/ou Phakopsora meibomiae.

[230] Fungos da ferrugem também preferenciais são selecionados a partir do grupo de Puccinia, Gymnosporangium, Juniperus, Cronartium, Hemileia e Uromyces; preferencialmente Puccinia sorghi, Gymnosporangium oronat-virginianae, Juniperus virginiana, Cronartium ribicola, Hemileia vastatrix, Puccinia graminis, Puccinia oronate, Uromyces phaseoli, Puccinia hemerocallidis, Puccinia persistens subsp. Triticina, Puccinia striiformis, Puccinia graminis causes e/ou Uromyces appendeculatu.

ORGANISMOS TRANSGÊNICOS; PLANTAS, PARTES DE PLANTAS E CÉLULAS VEGETAIS TRANSGÊNICAS

[231] Uma realização preferencial é uma planta transgênica, parte de planta transgênica ou célula vegetal transgênica que superexpressa uma proteína hidrofobina exógena ou proteína de fusão de hidrofobina, conforme descrito acima. Preferencialmente, a proteína hidrofobina superexpressa na planta, parte da planta ou vegetal é codificada por: (i) um ácido nucleico exógeno que tem pelo menos 60% de identidade com a SEQ ID NO: 1, 3, 5, 7, 9, 11, 13, 39, 41, 55 a 62, 89 ou 90, ou um fragmento funcional do mesmo, um ortólogo ou um parálogo do mesmo; ou por: (ii) um ácido nucleico exógeno que codifica uma proteína que tem pelo menos 60% de identidade com a SEQ ID NO: 2, 4, 6, 8, 10, 12, 14, 40, 42, 43, 44, 45, 46, 87 ou 88, um fragmento funcional do mesmo, um ortólogo ou um parálogo do mesmo; (iii) um ácido nucleico exógeno capaz de hibridizar, sob condições estringentes, com qualquer um dos ácidos nucleicos de acordo com (i) ou (ii) ou um complemento do mesmo. Com a máxima preferência, o ácido nucleico exógeno tem pelo menos 95%, pelo menos 98%, pelo menos 99% de identidade de sequência, ou mesmo 100% de identidade de sequência com a SEQ ID NO: 1; ou compreende um ácido nucleico exógeno que codifica uma proteína que tem pelo menos 95%, pelo menos 98%, pelo menos 99% de identidade de sequência, ou mesmo 100% de identidade de sequência com a SEQ ID NO: 2; e/ou por: (iv) um ácido nucleico que codifica a mesma proteína que os ácidos nucleicos de (i) a (iii) acima, mas difere dos ácidos nucleicos de (i) a (iii) acima devido à degeneração do código genético.

[232] Preferencialmente, a proteína de fusão de hidrofobina superexpressa na planta, parte da planta ou célula vegetal é codificada por: (i) um ácido nucleico exógeno que tem pelo menos 60% de identidade com a SEQ ID NO: 47, 49, 51, 27, 29, 31, 33, 35, 63 a 70, 71, 73, 75, 77, 79, 81, 83 ou 85, ou um fragmento funcional do mesmo, um ortólogo ou um parálogo do mesmo; ou por: (ii) um ácido nucleico exógeno que codifica uma proteína que tem pelo menos 60% de identidade com a SEQ ID NO: 48, 50, 52, 28, 30, 32, 34, 36, 72, 74, 76, 78, 80, 82, 84 ou 86, um fragmento funcional do mesmo, um ortólogo ou um parálogo do mesmo; (iii) um ácido nucleico exógeno capaz de hibridizar, sob condições estringentes, com qualquer um dos ácidos nucleicos de acordo com (i) ou (ii) ou um complemento do mesmo; com a máxima preferência, o ácido nucleico exógeno tem pelo menos 95%, pelo menos 98%, pelo menos 99% de identidade de sequência, ou mesmo 100% de identidade de sequência com a SEQ ID NO: 27 ou 29; ou compreende um ácido nucleico exógeno que codifica uma proteína que tem pelo menos 95%, pelo menos 98%, pelo menos 99% de identidade de sequência, ou mesmo 100% de identidade de sequência com a SEQ ID NO: 28 ou 30; e/ou por: (iv) um ácido nucleico que codifica a mesma proteína que os ácidos nucleicos de (i) a (iii) acima, mas difere dos ácidos nucleicos de (i) a (iii) acima devido à degeneração do código genético.

[233] Mais preferencialmente, a planta transgênica, parte da planta transgênica ou célula vegetal transgênica de acordo com a presente invenção foi obtida por transformação com um vetor recombinante descrito no presente pedido.

[234] Métodos adequados para transformação ou transfecção de células hospedeiras incluindo células vegetais são conhecidos na técnica de biotecnologia vegetal. Qualquer método pode ser usado para transformar o vetor de expressão recombinante nas células vegetais para produzir as plantas transgênicas da invenção. Métodos gerais para transformar plantas dicotiledôneas são divulgados, por exemplo, nas patentes US 4.940.838; 5.464.763, e similares. Métodos para transformar plantas dicotiledôneas específicas, por exemplo, algodão, são apresentados nas patentes 5.004.863, 5.159.135 e 5.846.797. Métodos para transformação de soja que são apresentados nas patentes 4.992.375, 5.416.011, 5.569.834, 5.824.877,6.384.301 e na patente EP 0301749B1 podem ser usados. Os métodos de transformação podem incluir métodos diretos e indiretos de transformação. Métodos diretos adequados incluem absorção de DNA induzida por polietilenoglicol, transformação mediada por lipossomo (patente US 4.536.475), métodos biolísticos com o uso de arma genética (Fromm ME et al., Bio/Technology. 8(9):833-9, 1990; Gordon-Kamm et al. Plant Cell 2:603, 1990), eletroporação, incubação de embriões secos em solução que compreende DNA e microinjeção. No caso desses métodos de transformação direta, os plasmídeos usados não necessitam satisfazer nenhum requisito específico. Plasmídeos simples, como esses da série pUC, pBR322, série M13mp, pACYC184 e similares podem ser usados. Se plantas intactas serão regeneradas a partir das células transformadas, um gene marcador selecionável adicional está preferencialmente localizado no plasmídeo. As técnicas de transformação direta são igualmente adequadas para plantas dicotiledôneas e monocotiledôneas.

[235] A transformação também pode ser realizada por infecção bacteriana por meio de Agrobacterium (por exemplo, patente EP 0.116.718), infecção viral por meio de vetores virais (patente EP 0.067.553, patente US 4.407.956, documento WO 95/34668, documento WO 93/03161) ou por meio de pólen (patente EP 0.270.356, documento WO 85/01856, patente US 4.684.611). As técnicas de transformação baseadas em Agrobacterium (especialmente para plantas dicotiledôneas) são bem conhecidas na técnica. A linhagem de Agrobacterium (por exemplo, Agrobacterium tumefaciens ou Agrobacterium rhizogenes) compreende um plasmídeo (plasmídeo Ti ou Ri) e um elemento de T-DNA que é transferido para a planta após infecção com Agrobacterium. O T- DNA (DNA transferido) é integrado no genoma da célula vegetal. O T-DNA pode estar localizado no plasmídeo Ri ou Ti ou está separadamente compreendido em um, assim chamado, vetor binário. Métodos para a transformação mediada por Agrobacterium são descritos, por exemplo, em Horsch RB et al. (1985) Science, 225:1229. A transformação mediada por Agrobacterium é mais adequada para plantas dicotiledôneas, mas também foi adaptada para plantas monocotiledôneas. A transformção de plantas por Agrobacteria é descrita, por exemplo, em White FF, Vectors for Gene Transfer in Higher Plants, Transgenic Plants, Vol. 1, Engineering and Utilization, editado por S.D. Kung e R. Wu, Academic Press, 1993, páginas 15 - 38; Jenes B et al. Techniques for Gene Transfer, Transgenic Plants, Vol. 1, Engineering and Utilization, editado por S.D. Kung e R. Wu, Academic Press, 1993, páginas 128-143; Potrykus (1991) Annu Rev Plant Physiol Plant Molec Biol 42:205- 225. A transformação pode resultar em transformação temporária ou e expressão estável. Embora uma sequência de nucleotídeo da presente invenção possa ser inserida em qualquer planta e célula vegetal incluídas nessas classes amplas, é particularmente útil em células vegetais de cultura.

[236] As células vegetais modificadas geneticamente podem ser regeneradas através de todos os métodos com os quais um técnico no assunto está familiarizado. Métodos adequados podem ser encontrados nas publicações mencionadas acima por S.D. Kung e R. Wu, Potrykus ou Hofgen e Willmitzer.

[237] Após a transformação, as células ou agrupamentos de células vegetais podem ser selecionados para a presença de um ou mais marcadores que são codificados pelos genes expressíveis na planta cotransfectada com o gene de interesse, após o qual o material transformado é regenerado em uma planta inteira. Para selecionar as plantas transformadas, o material vegetal obtido na transformação é, em regra, submetido a condições seletivas de modo que as plantas transformadas podem ser distinguidas das plantas não transformadas. Por exemplo, as sementes obtidas da maneira acima descrita podem ser plantadas e, após período de crescimento inicial, submetidas a uma seleção adequada por spray. Uma possibilidade adicional consiste no cultivo das sementes, se apropriado após esterilização, em placas de ágar com o uso de um agente de seleção adequado, de modo que somente as sementes transformadas podem crescer como plantas. De maneira alternativa, as plantas transformadas são triadas para a presença de um marcador selecionável como aqueles descritos acima. As plantas transformadas também podem ser diretamente selecionadas por triagem quanto à presença do ácido nucleico de hidrofobina.

[238] Após transferência de DNA e regeneração, plantas supostamente transformadas também podem ser avaliadas, por exemplo, com o uso de análise Southern quanto à presença do gene de interesse, número de cópias e/ou organização genômica. De maneira alternativa ou adicionalmente, os níveis de expressão do DNA recém-introduzido podem ser monitorados com o uso de análise Northern e/ou Western, ambas as técnicas sendo bem conhecidas por técnicos no assunto.

[239] As plantas transformadas regeneradas podem ser propagadas por uma variedade de formas, como as técnicas de propagação clonal ou de reprodução clássica. Por exemplo, uma planta transformada de primeira geração (ou T1) pode ser autofecundada e os transformantes homozigóticos de segunda geração (ou T2) selecionados, e as plantas T2 podem então ser ainda propagadas através de técnicas clássicas de reprodução. Os organismos transformados gerados podem apresentar uma variedade de formas. Por exemplo, eles podem ser quimeras de células transformadas e células não transformadas; transformantes clonais (por exemplo, todas as células transformadas para conter o cassete de expressão); enxertos de tecidos transformados e não transformados (por exemplo, em plantas, um porta-enxerto transformado enxertado em um descendente não transformado).

[240] Preferencialmente, a planta transgênica da presente invenção ou a planta obtida pelo método da presente invenção tem resistência aumentada contra patógenos fúngicos, preferencialmente contra patógenos fúngicos da Família Phacopsoraceae, mais preferencialmente contra patógenos fúngicos do Gênero Phacopsora, com a máxima preferência contra Phakopsora pachyrhizi (Sydow) e Phakopsora meibomiae (Arthur), também conhecido como ferrugem da soja. Preferencialmente, a resistência contra Phakopsora pachyrhizi (Sydow) e/ou Phakopsora meibomiae (Arthur) é aumentada.

[241] Preferencialmente, a planta, parte da planta ou célula vegetal é uma planta ou derivada de uma planta selecionada a partir do grupo que consiste em feijões, soja, ervilha, trevo, kudzu, luzerna, lentilhas, tremoceiros, vicias (vetches), amendoim, arroz, trigo, cevada, arabidopsis, lentilha, banana, canola, algodão, batata, milho, cana-de-açúcar, alfafa e beterraba.

[242] Em uma realização da presente invenção a planta é selecionada a partir do grupo que consiste em feijões, soja, ervilha, trevo, kudzu, luzerna, lentilhas, tremoceiros, vicias e/ou amendoim. Preferencialmente, a planta é um legume, que compreende plantas do Gênero Phaseolus (que compreende feijão francês, feijão anão, feijão de corda (Phaseolus vulgaris), feijão de Lima (Phaseolus lunatus L.), feijão Tepari (Phaseolus acutifolius A. Gray), feijão runner (Phaseolus coccineus)); o Gênero Glycine (que compreende Glycine soja, sojas (Glycine max (L.) Merill)); ervilha (Pisum) (que compreende ervilhas shelling (Pisum sativum L. convar. sativum), também chamada de ervilhas lisas ou sementes redondas; ervilha marrowfat (Pisum sativum L. convar. medullare Alef. emend. C.O. Lehm), ervilha açúcar (Pisum sativum L. convar. axiphium Alef emend. C.O. Lehm), também chamada de ervilha fresca, ervilha comestível ou mangetout, (Pisum granda sneida L. convar. sneidulo p. shneiderium)); amendoim (Arachis hypogaea), trevo (Trifolium spec.), medick (Medicago), videira kudzu (Pueraria lobata), luzerna comum, alfalfa (M. sativa L.), grão de bico (Cicer), lentilha (Lens) (Lens culinaris Medik.), tremoço (Lupinus); vicias (Vicia), favarola, fava (Vicia faba), vetchling (Lathyrus) (que compreende ervilha chickling (Lathyrus sativus), ervilha do mato (Lathyrus tuberosus)); Gênero Vigna (que compreende feijão moth (Vigna aconitifolia (Jacq.) Maréchal), feijão azuki (Vigna angularis (Willd.) Ohwi & H. Ohashi), feijão urd (Vigna mungo (L.) Hepper), feijão mung (Vigna radiata (L.) R. Wilczek), amendoim bambara (Vigna subterrane (L.) Verdc.), feijão arroz (Vigna umbellata (Thunb.) Ohwi & H. Ohashi), Vigna vexillata (L.) A. Rich., Vigna unguiculata (L.) Walp., nas três subespécies feijão aspargo, feijão fradinho, feijão de vaca)); guandu (Cajanus cajan (L.) Millsp.), o Gênero Macrotyloma (que compreende amendoim geocarpa (Macrotyloma geocarpum (Harms) Maréchal & Baudet), feijão cavalo (Macrotyloma uniflorum (Lam.). Verdc.)); feijão goa (Psophocarpus tetragonolobus (L.) DC.), feijão inhame africano (Sphenostylis stenocarpa (Hochst. ex A. Rich.) Harms), feijão preto egípicio, feijão dolichos, feijão lablab (Lablab purpureus (L.) Sweet), feijão inhame (Pachyrhizus), feijão guar (Cyamopsis tetragonolobus (L.) Taub.); e/ou o Gênero Canavalia (que compreende feijão de porco (Canavalia ensiformis (L.) DC.), feijão espada (Canavalia gladiata (Jacq.) DC.)).

[243] Ainda preferencial é uma planta selecionada a partir do grupo que consiste em feijões, soja, ervilha, trevo, kudzu, luzerna, lentilhas, tremoceiros, vicias e amendoim. Com a máxima preferência, a planta, parte da planta ou célula vegetal é derivada de soja.

MÉTODOS PARA A PRODUÇÃO DE PLANTAS TRANSGÊNICAS

[244] Uma realização de acordo com a presente invenção fornece um método para produzir uma planta transgênica, uma parte de planta transgênica ou uma célula vegetal transgênica resistente a um patógeno fúngico, preferencialmente da Família Phacosporaceae, por exemplo, ferrugem da soja, em que o ácido nucleico recombinante usado para gerar uma planta transgênica compreende um promotor que é funcional na célula vegetal, ligado de maneira funcional a um ácido nucleico de hidrofobina, que é preferencialmente SEQ ID NO: 1, e uma sequência reguladora terminadora.

[245] Em uma realização, a presente invenção refere-se a um método para a produção de uma planta transgênica, parte de planta transgênica ou célula vegetal transgênica que tem resistência fúngica aumentada, que compreende: (a) introduzir uma construção de vetor recombinante de acordo com a invenção presente em uma planta, uma parte da planta ou uma célula vegetal, e (b) gerar uma planta transgênica a partir da planta, parte da planta ou célula vegetal.

[246] Preferencialmente, o método para a produção da planta transgênica, parte da planta transgênica ou célula vegetal transgênica compreende ainda as etapas de: (c) expressar a proteína hidrofobina, preferencialmente codificada por: (i) um ácido nucleico exógeno que tem pelo menos 60% de identidade com a SEQ ID NO: 1, 3, 5, 7, 9, 11, 13, 39, 41, 55 a 62, 89 ou 90, ou um fragmento funcional do mesmo, um ortólogo ou um parálogo do mesmo; ou por: (ii) um ácido nucleico exógeno que codifica uma proteína que tem pelo menos 60% de identidade com a SEQ ID NO: 2, 4, 6, 8, 10, 12, 14, 40, 42, 43, 44, 45, 46, 87 ou 88, um fragmento funcional do mesmo, um ortólogo ou um parálogo do mesmo; (iii) um ácido nucleico exógeno capaz de hibridizar, sob condições estringentes, com qualquer um dos ácidos nucleicos de acordo com (i) ou (ii) ou um complemento do mesmo. Com a máxima preferência, o ácido nucleico exógeno tem pelo menos 95%, pelo menos 98%, pelo menos 99% de identidade de sequência, ou mesmo 100% de identidade de sequência com a SEQ ID NO: 1; ou compreende um ácido nucleico exógeno que codifica uma proteína que tem pelo menos 95%, pelo menos 98%, pelo menos 99% de identidade de sequência, ou mesmo 100% de identidade de sequência com a SEQ ID NO: 2; e/ou por: (iv) um ácido nucleico que codifica a mesma proteína que os ácidos nucleicos de (i) a (iii) acima, mas difere dos ácidos nucleicos de (i) a (iii) acima devido à degeneração do código genético.

[247] No caso da sequência codificadora para uma proteína de fusão de hidrofobina ser transformada, a proteína de fusão de hidrofobina expressa na planta, parte da planta ou célula vegetal é preferencialmente codificada por: (i) um ácido nucleico exógeno que tem pelo menos 60% de identidade com a SEQ ID NO: 47, 49, 51, 27, 29, 31, 33, 35, 63 a 70, 71, 73, 75, 77, 79, 81, 83 ou 85, ou um fragmento funcional do mesmo, um ortólogo ou um parálogo do mesmo; ou por: (ii) um ácido nucleico exógeno que codifica uma proteína que tem pelo menos 60% de identidade com a SEQ ID NO: 48, 50, 52, 28, 30, 32, 34, 36, 72, 74, 76, 78, 80, 82, 84 ou 86, um fragmento funcional do mesmo, um ortólogo ou um parálogo do mesmo; (iii) um ácido nucleico exógeno capaz de hibridizar, sob condições estringentes, com qualquer um dos ácidos nucleicos de acordo com (i) ou (ii) ou um complemento do mesmo. Com a máxima preferência, o ácido nucleico exógeno tem pelo menos 95%, pelo menos 98%, pelo menos 99% de identidade de sequência, ou mesmo 100% de identidade de sequência com a SEQ ID NO: 27 ou 29; ou compreende um ácido nucleico exógeno que codifica uma proteína que tem pelo menos 95%, pelo menos 98%, pelo menos 99% de identidade de sequência, ou mesmo 100% de identidade de sequência com a SEQ ID NO: 28 ou 30; e/ou por: (iv) um ácido nucleico que codifica a mesma proteína que os ácidos nucleicos de (i) a (iii) acima, mas difere dos ácidos nucleicos de (i) a (iii) acima devido à degeneração do código genético;

[248] Preferencialmente, o método para a produção da planta transgênica, parte da planta transgênica ou célula vegetal adicionalmente compreende a etapa de colher as sementes da planta transgênica e plantar as sementes e cultivar as sementes até plantas, em que a(s) planta(s) cultivada(s) compreende(m): (i) um ácido nucleico exógeno que tem pelo menos 60% de identidade com a SEQ ID NO: 1, 3, 5, 7, 9, 11, 13, 39, 41, 55 a 62, 89 ou 90, ou um fragmento funcional do mesmo, um ortólogo ou um parálogo do mesmo; ou por: (ii) um ácido nucleico exógeno que codifica uma proteína que tem pelo menos 60% de identidade com a SEQ ID NO: 2, 4, 6, 8, 10, 12, 14, 40, 42, 43, 44, 45, 46, 87 ou 88, um fragmento funcional do mesmo, um ortólogo ou um parálogo do mesmo; (iii) um ácido nucleico exógeno capaz de hibridizar, sob condições estringentes, com qualquer um dos ácidos nucleicos de acordo com (i) ou (ii) ou um complemento do mesmo. Com a máxima preferência, o ácido nucleico exógeno tem pelo menos 95%, pelo menos 98%, pelo menos 99% de identidade de sequência, ou mesmo 100% de identidade de sequência com a SEQ ID NO: 1; ou compreende um ácido nucleico exógeno que codifica uma proteína que tem pelo menos 95%, pelo menos 98%, pelo menos 99% de identidade de sequência, ou mesmo 100% de identidade de sequência com a SEQ ID NO: 2; e/ou por: (iv) um ácido nucleico que codifica a mesma proteína que os ácidos nucleicos de (i) a (iii) acima, mas difere dos ácidos nucleicos de (i) a (iii) acima devido à degeneração do código genético;

[249] No caso da sequência codificadora para uma proteína de fusão de hidrofobina ser usada, a(s) planta(s) cultivada(s) compreende(m): (i) um ácido nucleico exógeno que tem pelo menos 60% de identidade com a SEQ ID NO: 47, 49, 51, 27, 29, 31, 33, 35, 63 a 70, 71, 73, 75, 77, 79, 81, 83 ou 85, ou um fragmento funcional do mesmo, um ortólogo ou um parálogo do mesmo; ou por: (ii) um ácido nucleico exógeno que codifica uma proteína que tem pelo menos 60% de identidade com a SEQ ID NO: 48, 50, 52, 28, 30, 32, 34, 36, 72, 74, 76, 78, 80, 82, 84 ou 86, um fragmento funcional do mesmo, um ortólogo ou um parálogo do mesmo; (iii) um ácido nucleico exógeno capaz de hibridizar, sob condições estringentes, com qualquer um dos ácidos nucleicos de acordo com (i) ou (ii) ou um complemento do mesmo. Com a máxima preferência, o ácido nucleico exógeno tem pelo menos 95%, pelo menos 98%, pelo menos 99% de identidade de sequência, ou mesmo 100% de identidade de sequência com a SEQ ID NO: 27 ou 29; ou compreende um ácido nucleico exógeno que codifica uma proteína que tem pelo menos 95%, pelo menos 98%, pelo menos 99% de identidade de sequência, ou mesmo 100% de identidade de sequência com a SEQ ID NO: 28 ou 30; e/ou por: (iv) um ácido nucleico que codifica a mesma proteína que os ácidos nucleicos de (i) a (iii) acima, mas difere dos ácidos nucleicos de (i) a (iii) acima devido à degeneração do código genético;

[250] As plantas transgênicas podem ser selecionadas por métodos conhecidos conforme descrito acima (por exemplo, por seleção quanto à presença de um ou mais marcadores que são codificados por genes cotransferidos que podem ser expressos em plantas com o gene de hidrofobina ou diretamente por seleção quanto ao ácido nucleico de hidrofobina).

[251] Além disso, é fornecido o uso do ácido nucleico exógeno de hidrofobina ou da construção de vetor recombinante que compreende o ácido nucleico de hidrofobina para a transformação de uma planta, parte da planta ou célula vegetal para fornecer uma planta resistente a fungos, parte da planta ou célula vegetal.

PARTES COLETÁVEIS E PRODUTOS

[252] Partes coletáveis da planta transgênica de acordo com a presente invenção são parte da invenção. As partes coletáveis podem ser sementes, raízes, folhas e/ou flores que compreendem o ácido nucleico de hidrofobina ou proteína hidrofobina ou partes das mesmas. Partes preferenciais de plantas de soja são as sojas que compreendem o ácido nucleico de hidrofobina ou proteína hidrofobina.

[253] Os produtos derivados de uma planta transgênica de acordo com a presente invenção, partes da mesma ou partes coletáveis da mesma são parte da invenção. Um produto preferencial é alimento de soja ou óleo de soja.

[254] Preferencialmente, a parte coletável da planta transgênica ou do produto derivado da planta transgênica compreende um ácido nucleico exógeno de hidrofobina, em que o ácido nucleico exógeno de hidrofobina é selecionado a partir do grupo que consiste em: (i) um ácido nucleico exógeno que tem, em ordem crescente, de preferência pelo menos 60%, pelo menos 61%, pelo menos 62%, pelo menos 63%, pelo menos 64%, pelo menos 65%, pelo menos 66%, pelo menos 67%, pelo menos 68%, pelo menos 69%, pelo menos 70%, pelo menos 71%, pelo menos 72%, pelo menos 73%, pelo menos 74%, pelo menos 75%, pelo menos 76%, pelo menos 77%, pelo menos 78%, pelo menos 79%, pelo menos 80%, pelo menos 81%, pelo menos 82%, pelo menos 83%, pelo menos 84%, pelo menos 85%, pelo menos 86%, pelo menos 87%, pelo menos 88%, pelo menos 89%, pelo menos 90%, pelo menos 91%, pelo menos 92%, pelo menos 93%, pelo menos 94%, pelo menos 95%, pelo menos 96%, pelo menos 97%, pelo menos 98%, pelo menos 99% ou 100% de identidade de sequência com a sequência de ácido nucleico representada por SEQ ID NO: 1, 3, 5, 7, 9, 11, 13, 39, 41, 55 a 62, 89 ou 90, ou um fragmento funcional, derivado, ortólogo ou parálogo do mesmo; (ii) a sequência complementar de qualquer um dos ácidos nucleicos de (i); (iii) um ácido nucleico exógeno que codifica uma proteína hidrofobina que tem, em ordem crescente, de preferência pelo menos 60%, pelo menos 61%, pelo menos 62%, pelo menos 63%, pelo menos 64%, pelo menos 65%, pelo menos 66%, pelo menos 67%, pelo menos 68%, pelo menos 69%, pelo menos 70%, pelo menos 71%, pelo menos 72%, pelo menos 73%, pelo menos 74%, pelo menos 75%, pelo menos 76%, pelo menos 77%, pelo menos 78%, pelo menos 79%, pelo menos 80%, pelo menos 81%, pelo menos 82%, pelo menos 83%, pelo menos 84%, pelo menos 85%, pelo menos 86%, pelo menos 87%, pelo menos 88%, pelo menos 89%, pelo menos 90%, pelo menos 91%, pelo menos 92%, pelo menos 93%, pelo menos 94%, pelo menos 95%, pelo menos 96%, pelo menos 97%, pelo menos 98%, pelo menos 99% ou 100% de identidade de sequência com a sequência de aminoácidos representada por SEQ ID NO: 2, 4, 6, 8, 10, 12, 14, 40, 42, 43, 44, 45, 46, 87 ou 88, ou um fragmento funcional, derivado, ortólogo ou parálogo do mesmo; preferencialmente o polipeptídeo hidrofobina confere resistência fúngica aumentada em relação às plantas de controle; (iv) uma molécula de ácida nucleico exógena que hibridiza com uma molécula de ácida nucleico de (i) a (iii) sob condições de hibridização de alta estringência; e (v) um ácido nucleico que codifica a mesma proteína que os ácidos nucleicos de (i) a (iv) acima, mas difere dos ácidos nucleicos de (i) a (iv) acima devido à degeneração do código genético; ou em que a parte coletável da planta transgênica ou o produto derivado da planta transgênica compreende uma proteína hidrofobina codificada por qualquer um dos ácidos nucleicos de hidrofobina de (i) a (v).

MÉTODO PARA A FABRICAÇÃO DE UM PRODUTO

[255] Em uma realização o método para a produção de um produto compreende: a) cultivar as plantas da invenção ou que podem ser obtidas pelos métodos da invenção, e b) produzir o dito produto a partir de, ou pelas plantas da invenção e/ou partes dessas plantas, por exemplo, sementes.

[256] Em uma realização adicional, os métodos compreendem as etapas de a) cultivar as plantas da invenção, b) remover as partes coletáveis das plantas, conforme descrito acima, e c) produzir o dito produto a partir de, ou pelas partes coletáveis de acordo com a invenção.

[257] Preferencialmente, o produto obtido pelo dito método compreende um ácido nucleico exógeno de hidrofobina selecionado a partir do grupo que consiste em: (i) um ácido nucleico exógeno que tem, em ordem crescente, de preferência pelo menos 60%, pelo menos 61%, pelo menos 62%, pelo menos 63%, pelo menos 64%, pelo menos 65%, pelo menos 66%, pelo menos 67%, pelo menos 68%, pelo menos 69%, pelo menos 70%, pelo menos 71%, pelo menos 72%, pelo menos 73%, pelo menos 74%, pelo menos 75%, pelo menos 76%, pelo menos 77%, pelo menos 78%, pelo menos 79%, pelo menos 80%, pelo menos 81%, pelo menos 82%, pelo menos 83%, pelo menos 84%, pelo menos 85%, pelo menos 86%, pelo menos 87%, pelo menos 88%, pelo menos 89%, pelo menos 90%, pelo menos 91%, pelo menos 92%, pelo menos 93%, pelo menos 94%, pelo menos 95%, pelo menos 96%, pelo menos 97%, pelo menos 98%, pelo menos 99% ou 100% de identidade de sequência com a sequência de ácido nucleico representada por SEQ ID NO: 1, 3, 5, 7, 9, 11, 13, 39, 41, 55 a 62, 89 ou 90, ou um fragmento funcional, derivado, ortólogo ou parálogo do mesmo; (ii) a sequência complementar de qualquer um dos ácidos nucleicos de (i); (iii) um ácido nucleico exógeno que codifica uma proteína hidrofobina que tem, em ordem crescente, de preferência pelo menos 60%, pelo menos 61%, pelo menos 62%, pelo menos 63%, pelo menos 64%, pelo menos 65%, pelo menos 66%, pelo menos 67%, pelo menos 68%, pelo menos 69%, pelo menos 70%, pelo menos 71%, pelo menos 72%, pelo menos 73%, pelo menos 74%, pelo menos 75%, pelo menos 76%, pelo menos 77%, pelo menos 78%, pelo menos 79%, pelo menos 80%, pelo menos 81%, pelo menos 82%, pelo menos 83%, pelo menos 84%, pelo menos 85%, pelo menos 86%, pelo menos 87%, pelo menos 88%, pelo menos 89%, pelo menos 90%, pelo menos 91%, pelo menos 92%, pelo menos 93%, pelo menos 94%, pelo menos 95%, pelo menos 96%, pelo menos 97%, pelo menos 98%, pelo menos 99% ou 100% de identidade de sequência com a sequência de aminoácidos representada por SEQ ID NO: 2, 4, 6, 8, 10, 12, 14, 40, 42, 43, 44, 45, 46, 87 ou 88, ou um fragmento funcional, derivado, ortólogo ou parálogo do mesmo; preferencialmente o polipeptídeo hidrofobina confere resistência fúngica aumentada em relação às plantas de controle; (iv) uma molécula de ácida nucleico exógena que hibridiza com uma molécula de ácida nucleico de (i) a (iii) sob condições de hibridização de alta estringência; e (v) um ácido nucleico que codifica a mesma proteína que os ácidos nucleicos de (i) a (iv) acima, mas difere dos ácidos nucleicos de (i) a (iv) acima devido à degeneração do código genético; ou em que o produto obtido pelo dito método compreende uma proteína hidrofobina codificada por qualquer um dos ácidos nucleicos de hidrofobina de (i) a (v).

[258] O produto pode ser produzido no local onde a planta foi cultivada, as plantas e/ou partes das mesmas podem ser removidas do local onde as plantas foram cultivadas para produzir o produto. Tipicamente, a planta é cultivada, as partes coletáveis desejadas são removidas da planta, se possível, em ciclos repetidos, e o produto produzido a partir das partes coletáveis da planta. A etapa de crescimento da planta pode ser realizada apenas uma vez a cada vez que os métodos da invenção são realizados, embora permitindo repetidas vezes as etapas de produção do produto, por exemplo, por remoção repetida de partes coletáveis das plantas da invenção e, se necessário, posterior processamento dessas partes para se chegar ao produto. Também é possível que a etapa de cultivo das plantas da invenção seja repetida e as plantas ou partes coletáveis sejam armazenadas até que a produção do produto seja então executada uma vez para as plantas ou partes das plantas acumuladas. Também, as etapas de cultivo das plantas e produção do produto podem ser realizadas com uma sobreposição de tempo, mesmo que simultaneamente a uma grande extensão, ou sequencialmente. Geralmente as plantas são cultivadas por algum tempo antes do produto ser produzido.

[259] Em uma realização, os produtos produzidos pelos métodos da invenção são produtos de plantas como, mas não se limitam a, um gênero alimentício, ração para animais, um suplemento alimentar, suplemento de ração, fibra, cosmético e/ou produto farmacêutico. Gêneros alimentícios são considerados como composições usadas para nutrição e/ou para nutrição suplementar. Rações para animais e suplementos de alimentação animal, em particular, são considerados como gênero alimentício.

[260] Em outra realização, os métodos inventivos para produção são usados para produzir produtos agrícolas como, mas não se limitando a, extratos vegetais, proteínas, aminoácidos, carboidratos, gorduras, óleos, polímeros, vitaminas e similares.

[261] É possível que um produto vegetal consista em um ou mais produtos agrícolas em grande parte.

[262] As plantas transgênicas da invenção podem ser cruzadas com plantas transgênicas similares ou com plantas transgênicas que carecem dos ácidos nucleicos da invenção ou com plantas não transgênicas, com o uso dos métodos de cruzamento de plantas, para preparar sementes. Ainda, as células vegetais ou plantas transgênicas da presente invenção podem compreender e/ou serem cruzadas com outra planta transgênica que compreende um ou mais ácidos nucleicos exógenos, criando assim uma “pilha” de transgenes na planta e/ou na sua progênie. A semente é então plantada para se obter uma planta transgênica fértil cruzada que compreende o ácido nucleico de hidrofobina. A planta transgênica fértil cruzada pode ter o cassete de expressão específico herdado através de um parental feminino ou através de um parental masculino. A segunda planta pode ser uma planta inata. A transgênica fértil cruzada pode ser um híbrido. Também incluídos na presente invenção estão as sementes de qualquer uma dessas plantas transgênicas férteis cruzadas. As sementes desta invenção podem ser colhidas de plantas transgênicas férteis e serem usadas para cultivar gerações de progênie de plantas transformadas desta invenção, incluindo linhagens de plantas híbridas que compreendem o ácido nucleico exógeno.

MÉTODO PARA REPRODUÇÃO

[263] Dessa forma, uma realização da presente invenção é um método para reprodução de uma planta resistente a fungos que compreende as etapas de: (a) cruzar uma planta transgênica descrita no presente pedido ou uma planta que pode ser obtida por um método descrito no presente pedido com uma segunda planta; (b) obter uma semente ou sementes resultantes da etapa de cruzamento descrita em (a); (c) plantar a dita semente ou sementes e cultivar a semente ou sementes até plantas; e (d) selecionar a partir das ditas plantas que expressam uma proteína hidrofobina, preferencialmente codificada por: (i) um ácido nucleico exógeno que tem pelo menos 60% de identidade com a SEQ ID NO: 1, 3, 5, 7, 9, 11, 13, 39, 41, 55 a 62, 89 ou 90, ou um fragmento funcional do mesmo, um ortólogo ou um parálogo do mesmo; ou por: (j) ) um ácido nucleico exógeno que codifica uma proteína que tem pelo menos 60% de identidade com a SEQ ID NO: 2, 4, 6, 8, 10, 12, 14, 40, 42, 43, 44, 45, 46, 87 ou 88, um fragmento funcional do mesmo, um ortólogo ou um parálogo do mesmo; (k) i) um ácido nucleico exógeno capaz de hibridizar, sob condições estringentes, com qualquer um dos ácidos nucleicos de acordo com (i) ou (ii) ou um complemento do mesmo. Com a máxima preferência, o ácido nucleico exógeno tem pelo menos 95%, pelo menos 98%, pelo menos 99% de identidade de sequência, ou mesmo 100% de identidade de sequência com a SEQ ID NO: 1; ou compreende um ácido nucleico exógeno que codifica uma proteína que tem pelo menos 95%, pelo menos 98%, pelo menos 99% de identidade de sequência, ou mesmo 100% de identidade de sequência com a SEQ ID NO: 2; e/ou por: (l) ) um ácido nucleico que codifica a mesma proteína que os ácidos nucleicos de (i) a (iii) acima, mas difere dos ácidos nucleicos de (i) a (iii) acima devido à degeneração do código genético.

[264] No caso da sequência codificadora para uma proteína de fusão de hidrofobina ser usada, as plantas que expressam uma proteína de fusão de hidrofobina são selecionadas, preferencialmente codificadas por: (i) um ácido nucleico exógeno que tem pelo menos 60% de identidade com a SEQ ID NO: 47, 49, 51, 27, 29, 31, 33, 35, 63 a 70, 71, 73, 75, 77, 79, 81, 83 ou 85, ou um fragmento funcional do mesmo, um ortólogo ou um parálogo do mesmo; ou por: (ii) um ácido nucleico exógeno que codifica uma proteína que tem pelo menos 60% de identidade com a SEQ ID NO: 48, 50, 52, 28, 30, 32, 34, 36, 72, 74, 76, 78, 80, 82, 84 ou 86, um fragmento funcional do mesmo, um ortólogo ou um parálogo do mesmo; e/ou por: (iii) um ácido nucleico exógeno capaz de hibridizar, sob condições estringentes, com qualquer um dos ácidos nucleicos de acordo com (i) ou (ii) ou um complemento do mesmo. Com a máxima preferência, o ácido nucleico exógeno tem pelo menos 95%, pelo menos 98%, pelo menos 99% de identidade de sequência, ou mesmo 100% de identidade de sequência com a SEQ ID NO: 27 ou 29; ou compreende um ácido nucleico exógeno que codifica uma proteína que tem pelo menos 95%, pelo menos 98%, pelo menos 99% de identidade de sequência, ou mesmo 100% de identidade de sequência com a SEQ ID NO: 28 ou 30; e/ou por: (iv) um ácido nucleico que codifica a mesma proteína que os ácidos nucleicos de (i) a (iii) acima, mas difere dos ácidos nucleicos de (i) a (iii) acima devido à degeneração do código genético.

[265] As plantas transgênicas podem ser selecionadas por métodos conhecidos conforme descrito acima (por exemplo, por seleção quanto à presença de um ou mais marcadores que são codificados por genes cotransferidos que podem ser expressos em plantas com o gene de hidrofobina ou por seleção quanto ao próprio ácido nucleico de hidrofobina).

[266] De acordo com a invenção presente, o ácido nucleico de hidrofobina introduzido pode ser mantido estavelmente na célula vegetal se este for incorporado em um replicon autônomo não cromossômico ou integrado nos cromossomos da planta. Se presente em uma construção de vetor extracromossômico não replicante ou replicante ou em uma construção de vetor que é integrado em um cromosssomo, o ácido nucleico exógeno de hidrofobina preferencialmente reside em um cassete de expressão de planta. Um cassete de expressão de planta preferencialmente contém sequências reguladoras capazes de dirigir a expressão gênica em células vegetais que são funcionalmente ligadas de modo que cada sequência possa cumprir sua função, por exemplo, terminação da transcrição por sinais de poliadenilação. Sinais de poliadenilação preferenciais são aqueles que se originam do t-DNA de Agrobacterium tumefaciens de modo que o gene 3 conhecido octopina sintase do plasmídeo Ti pTiACH5 (Gielen et al., 1984, EMBO J. 3:835) ou equivalentes funcionais do mesmo, mas também todos os outros terminadores funcionalmente ativos em plantas são adequados. Visto que a expressão gênica de planta muitas vezes não está limitada aos níveis de transcrição, um cassete de expressão de planta preferencialmente contém outras sequências funcionais ligadas como enhancers de tradução, como a sequência de alta atividade contendo a sequência líder 5’ não traduzida do vírus mosaico do tabaco, aumentando o polipeptídeo por razão de RNA. Acids Research 15:8693-8711). Exemplos de vetores de expressão de planta incluem aqueles detalhados em: Becker, D. et al., 1992, New plant binary vectors with selectable markers located proximal to the left border, Plant Mol. Biol. 20:1195-1197; Bevan, M.W., 1984, Binary Agrobacterium vectors for plant transformation, Nucl. Acid. Res. 12:8711-8721; e Vectors for Gene Transfer in Higher Plants; em: Transgenic Plants, Vol. 1, Engineering and Utilization, eds.: Kung e R. Wu, Academic Press, 1993, S. 15-38.

EXEMPLOS

[267] Os Exemplos a seguir não têm a intenção de limitar o escopo das reivindicações da invenção, mas especialmente têm a intenção de ser exemplares de certas realizações. Quaisquer variações dos métodos exemplificados que ocorram a um técnico no assunto têm a intenção ser incluídas no escopo da presente invenção.

EXEMPLO 1 MÉTODOS GERAIS

[268] A síntese química de oligonucleotídeos pode ser afetada, por exemplo, de forma conhecida, com o uso do método da fosfoamidita (Voet, Voet, 2a Edição, Wiley Press Nova York, páginas 896-897). As etapas de clonagem realizadas para os propósitos da presente invenção, como, por exemplo, clivagens de restrição, eletroforese em gel de agarose, purificação de fragmentos de DNA, transferência de ácidos nucleicos para membranas de nitrocelulose e de nylon, ligação de fragmentos de DNA, transformação de células de E. coli, culturas bacterianas, multiplicação de fagos e análise da sequência de DNA recombinante, são realizadas conforme descrito por Sambrook et al. Cold Spring Harbor Laboratory Press (1989), ISBN 0-87969-309-6. O sequenciamento das moléculas de DNA recombinante é realizado com um sequenciador de DNA por fluorescência a laser MWG-Licor seguindo o método de Sanger (Sanger et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 74, 5463 (1977)).

EXEMPLO 2 CLONAGEM DE CONSTRUÇÕES DE VETOR DE SUPEREXPRESSÃO

[269] Os cDNAs de todos os genes mencionados neste pedido foram gerados por síntese de DNA (Geneart, Regensburg, Alemanha).

[270] Os ácidos nucleicos de hidrofobina (conforme mostrado no SEQ ID NO: 27 e SEQ ID NO: 29) foram sintetizados de modo que o sítio de restrição Pacl se localizasse na frente do sítio de iniciação ATG e de um sítio de restrição Ascl a jusante do códon de parada. Os cDNAs foram digeridos com o uso das enzimas de restrição PacI e AscI (NEB Biolabs) e ligadas em um vetor pENTRY Gateway digerido por Pacl/Ascl (Invitrogen, Life Technologies, Carlsbad, Califórnia, EUA) de modo que o fragmento inteiro estivesse localizado na direção sense, entre o promotor Glyma02g47670 (promotor epiderme-específico) e o gene terminador inibidor da catepsina D (CATHD) de Solanum tuberosum (batata).

[271] Para obter o vetor de transformação das plantas binárias, uma reação LR tripla (sistema Gateway Invitrogen, Life Technologies, Carlsbad, Califórnia, EUA) foi realizada de acordo com o protocolo dos fabricantes com o uso de um vetor pENTRY-A vazio, do promotor::cDNA::terminador em vetor pENTRY-B e de um vetor pENTRY-C vazio. Como alvo, foi usado um vetor binário pDEST, composto de: (1) um cassete de resistência à espectinomicina/estreptomicina para a seleção de bactérias (2) uma origem pVS1 para replicação em Agrobacteria (3) uma origem de replicação pBR322 para a manutenção estável em E. coli e (4) entre as bordas direita e esquerda uma seleção AHAS sob controle do promotor pcUbi (Figura 4). A reação de recombinação foi transformada em E. coli (DH5alpha), preparada e triada por digestões de restrição específicas. Um clone positivo de cada construção de vetor foi sequenciado e submetido à transformação de soja.

EXEMPLO 3 TRANSFORMAÇÃO DE SOJA

[272] As construções de vetor de expressão (consulte Exemplo 2) foram transformados em soja.

3.1 ESTERILIZAÇÃO E GERMINAÇÃO DAS SEMENTES DE SOJA

[273] Na prática, qualquer semente de qualquer variedade de soja pode ser empregada no método da invenção. Uma variedade de cultivar de soja (incluindo Jack, Williams 82, Jake Stoddard e Resnik) é apropriada para a transformação de soja. As sementes de soja foram esterilizadas em câmara com gás de cloro produzido pela adição por gotejamento de 3,5 mL de HCl 12 N em 100 mL de água sanitária (hipoclorito de sódio 5,25%) em um dessecador com tampa hermética. Após 24 a 48 horas na câmara, as sementes foram removidas e aproximadamente 18 a 20 sementes foram semeadas em meio GM sólido com ou sem 5 μM de 6-benzil-aminopurina (BAP) em placas de Petri de 100 mm. As mudas sem BAP estavam mais alongados e com as raízes mais desenvolvidas, especialmente com a formação de raízes secundárias e laterais. O BAP fortalece a muda, com a formação de mudas mais baixas e fortes.

[274] Mudas com sete dias, cultivadas à luz (>100 μEinstein/m2s) a 25°C foram usadas para material de explante para os três tipos de explantes. Neste momento, as camadas das sementes foram divididas, e o epicótilo, com as folhas unifoliadas cresceu até, no mínimo, o comprimento dos cotilédones. O epicótilo deve ser de pelo menos 0,5 cm para evitar o tecido de nó cotiledonar (uma vez que os cultivares de soja e lotes de sementes podem variar no tempo de desenvolvimento, uma descrição do estágio de germinação é mais específica do que um tempo de germinação específica).

[275] Para inoculação de mudas inteiras, consulte Método A (Exemplo 3.3. e 3.3.2) ou explantes foliares, consulte Método B (Exemplo 3.3.3). Para o método C (consulte Exemplo 3.3.4), o hipocótilo e um e meio, ou parte de ambos os cotilédones foram removidos de cada muda. As mudas foram então colocadas em meios de propagação durante 2 a 4 semanas. As mudas produzem vários brotos ramificados, de onde se obtém explantes. A maioria dos explantes é originada a partir do crescimento da plântula da gema apical. Estes explantes foram preferencialmente usados como tecido alvo.

3.2 CRESCIMENTO E PREPARAÇÃO DA CULTURA DE AGROBACTERIUM

[276] Culturas de Agrobacterium foram preparadas e aplicadas por esfregaço de Agrobacterium (por exemplo, A. tumefaciens ou A. rhizogenes) carregando o vetor binário desejado (por exemplo, H. Klee R. Horsch e S. Rogers 1987 Agrobacterium-Mediated Plant Transformation and its further Applications to Plant Biology; Annual Review of Plant Physiology Vol. 38: 467-486), sobre o meio de cultivo sólido YEP, meio YEP: 10 g de extrato de levedura, 10 g de Peptona Bacteriológica, 5 g de NaCl, pH ajustado para 7,0 e volume final atingido com 1 litro de H2O, para placas de ágar YEP, adicionou-se 20 g de ágar, autoclavou-se) e incubação a 25°C até as colônias aparecerem (cerca de 2 dias). Dependendo dos genes marcadores selecionáveis presentes no plasmídeo Ti ou Ri, o vetor binário e os cromossomos bacterianos, foram usados compostos de seleção diferentes para seleção de A. tumefaciens e rhizogenes em meio YEP sólido e líquido. Várias linhagens de Agrobacterium podem ser usadas para o método de transformação.

[277] Depois de aproximadamente dois dias, uma única colônia (com um palito estéril) foi selecionada e 50 mL de YEP líquido foi inoculado com antibióticos e agitado a 175 rpm (25°C) até uma OD600 entre 0,8 a 1,0 ser alcançada (aproximadamente 2 dias). Soluções estoque de glicerol (15%) para transformação são preparadas e 1 mL de solução estoque de Agrobacterium é aliquotado em tubos Eppendorf de 1,5 mL, em seguida armazenadas a -80°C.

[278] Um dia antes da inoculação do explante, 200 mL de YEP foram inoculados com 5 μl a 3 mL de solução estoque de Agrobacterium em um frasco Erlenmeyer de 500 mL O frasco foi agitado durante a noite a 25°C até a OD600 estar entre 0,8 e 1,0. Antes de preparar os explantes de soja, as Agrobacterium foram peletizadas por centrifugação durante 10 min a 5500 xg a 20°C. O pélete foi ressuspenso em CCM líquido para a densidade desejada (OD600 0,5-0,8) e colocado à temperatura ambiente, pelo menos, 30 minutos antes do uso.

3.3 PREPARAÇÃO DE EXPLANTE E COCULTIVO (INOCULAÇÃO) 3.3.1 MÉTODO A: PREPARAÇÃO DO EXPLANTE NO DIA DA TRANSFORMAÇÃO

[279] Neste momento, as mudas tinham epicótilo alongado de pelo menos 0,5 cm, mas em geral, entre 0,5 e 2 cm. Epicótilos alongados, com até 4 cm de comprimento, tinham sido empregados com sucesso. Os explantes foram então preparados com: i) com ou sem algumas raízes, ii) com cotilédones parciais, um cotilédone ou ambos os cotilédones, todas as folhas pré-formadas foram removidas, incluindo o meristema apical e, o nó localizado no primeiro conjunto de folhas, foi lesionado com vários cortes com o uso de bisturi afiado.

[280] Estes cortes no nó, não só induziram infecção em Agrobacterium, mas também distribuíram as células do meristema axilar e danificaram brotos pré-formados. Depois do ferimento e preparação, os explantes foram separados em uma placa de Petri e, subsequentemente cocultivados com a mistura líquida CCM/Agrobacterium durante 30 minutos. Os explantes foram então removidos do meio líquido e colocados sobre de papel filtro estéril em placas de Petri de 15x100 mm contendo meio sólido de cocultura. Os tecidos- alvo feridos foram colocados de modo que eles ficassem em contato direto com o meio.

3.3.2 MÉTODO A MODIFICADO: PREPARAÇÃO DO EXPLANTE DE EPICÓTILO

[281] Epicótilos de soja segmentados, preparados a partir de mudas com 4 a 8 dias, foram usadas como explantes para regeneração e transformação. As sementes de soja cv. L00106CN, 93-41131 e Jack foram germinadas em 1/10 MS de sais ou meio com composição similar, com ou sem citocininas, durante 4 a 8 dias. Explantes de epicótilos foram preparados por remoção do nó cotiledonar e do nó do caule a partir da secção do caule. O epicótilo foi cortado em 2 s 5 segmentos. Os segmentos especialmente preferenciais são os ligados ao nó primário ou superior que compreendem o tecido meristemático axilar.

[282] Os explantes foram utilizados para infectar a Agrobacterium. Agrobacterium AGL1 abrigando um plasmídeo com o gene de interesse (GOI) e os genes marcadores selecionáveis AHAS, bar ou dsdA, foram cultivados durante a noite em meio LB com antibióticos apropriados, colhidos e ressuspensos em meio de inoculação com acetoseringona. Segmentos de epicótilos recentemente preparados foram embebidos em suspensão de Agrobacterium durante 30 a 60 minutos e, em seguida, os explantes foram secos por absorção em papel filtro estéril. Os explantes inoculados foram então cultivados durante 2 a 4 dias em meio de cocultura com L-cisteína e TTD e outros produtos químicos, como acetoseringona, para aumentar a distribuição de T- DNA. Os explantes de epicótilos foram, então, colocados em meio de indução de brotos com agentes de seleção, como imazapyr (para o gene AHAS), glufosinato (para o gene bar) ou D-serina (para o gene dsdA). Os brotos regenerados foram subcultivados em meio de alongamento com agente seletivo.

[283] Para a regeneração de plantas transgênicas os segmentos foram cultivados meio com citocininas, como, BAP, TDZ e/ou Cinetina, para indução de brotos. Após 4 a 8 semanas, os tecidos cultivados foram transferidos para um meio com uma concentração mais baixa de citocinina, para o alongamento de brotos. Os brotos alongados foram transferidos para meio com auxina, para o desenvolvimento das raízes e das plantas. Vários brotos foram regenerados.

[284] Muitos setores transformados estáveis mostrando forte expressão de cDNA foram recuperados. Plantas de soja foram regeneradas a partir de explantes epicótilos. Foram demonstradas distribuição eficiente de T- DNA e setores transformados estáveis.

3.3.3 MÉTODO B: EXPLANTES FOLIARES

[285] Para a preparação do explante foliar, os cotilédones foram removidos a partir do hipocótilo. Os cotilédones foram separados um do outro e o epicótilo foi removido. As folhas primárias, que consistem na lâmina, no pecíolo e nas estípulas, foram removidas do epicótilo cuidadosamente por corte na base das estípulas, de modo que os meristemas axilares foram incluídos no explante. Para ferir o explante, bem como para estimular a formação de novo de brotos, quaisquer brotos pré-formados foram removidos e a área entre as estípulas foi cortada 3 a 5 vezes com um bisturi afiado.

[286] Os explantes são tanto completamente imersos como os pecíolos feridos são mergulhados na suspensão de Agrobacterium imediatamente após a preparação do explante. Após a inoculação, os explantes são transferidos para papel filtro estéril, para remoção do excesso da cultura de Agrobacterium, e colocados com o lado ferido em contato com um disco de 7 centímetros de papel Whatman, sobrepondo o meio sólido CCM (consulte acima). Este papel filtro previne o crescimento excessivo de A. tumefaciens nos explantes de soja. Cinco placas foram enroladas com ParafilmTM “M” (American National Can, Chicago, Illinois, EUA) e incubadas durante três a cinco dias no escuro ou à luz a 25°C.

3.3.4 MÉTODO C: PROPAGAÇÃO DO MERISTEMA AXILAR

[287] Para a preparação do explante de meristema axilar propagado, foram utilizados plântulas com 3 a 4 semanas. Explantes de meristemas axilares podem ser preparados a partir do primeiro ao quarto nó. Em média de três a quatro explantes podem ser obtidos a partir de cada muda. Os explantes foram preparados a partir de plântulas, por meio de cortes de 0,5 a 1,0 cm abaixo do nó axilar, nos entrenós, e remoção do pecíolo e folha a partir do explante. A ponta onde os meristemas axilares estavam foi cortada com um bisturi, para induzir o crescimento de novo do broto e permitir o acesso de células alvo para a Agrobacterium. Portanto, um explante de 0,5 cm incluía o caule e o broto.

[288] Uma vez cortados, os explantes foram imediatamente colocados em suspensão de Agrobacterium durante 20 a 30 minutos. Após a inoculação, os explantes foram transferidos para papel filtro esterilizado para remoção do excesso de cultura de Agrobacterium, em seguida, colocados quase completamente imersos no CCM sólido ou no topo de um papel filtro com 7 cm sobrepondo o CCM sólido, dependendo da linhagem de Agrobacterium. Este papel filtro previne o crescimento excessivo de Agrobacterium nos explantes de soja. As placas foram embrulhados com ParafilmTM “M” (American National Can, Chicago, Illinois, EUA) e incubadas durante dois a três dias no escuro a 25°C.

3.4 INDUÇÃO DE BROTOS

[289] Após 3 a 5 dias de cocultivo no escuro a 25°C, os explantes foram enxaguados em meio SIM líquido (para remoção do excesso de Agrobacterium) (SIM, consulte Olhoft et al 2007 A novel Agrobacterium rhizogenes-mediated transformation method of soy using primary-node explants from seedlings In Vitro Cell. Dev. Biol.—Plant (2007) 43:536-549; para remoção do excesso de Agrobacterium) ou meio Modwash (1X sais principais B5, 1X sais secundários B5, 1X ferro MSIII, sacarose 3%, 1X vitaminas B5, 30 mM de MES, 350 mg/L de TimentinTM pH 5,6, documento WO 2005/121345) e secos por absorção em papel filtro estéril (para evitar danos, especialmente sobre a lâmina) antes da colocação no meio SIM sólido. Os aproximadamente 5 explantes (Método A) ou os 10 a 20 (Métodos B e C) foram colocados de modo que o tecido alvo estava em contato direto com o meio. Durante as 2 primeiras semanas, os explantes poderiam ser cultivados com ou sem meio seletivo. Preferencialmente, os explantes foram transferidos para SIM sem seleção durante uma semana.

[290] Para explantes foliares (Método B), o explante deve ser colocado no meio de forma que fique perpendicular à superfície do meio com o pecíolo incrustado no meio da lâmina e fora do meio.

[291] Para propagação do meristema axilar (Método C), o explante foi colocado no meio de forma que estava paralelo à superfície do meio (basípeta) com o explante parcialmente incrustado no meio.

[292] As placas enroladas com venting tape Scotch 394 (3M, St. Paul, Minnesota, EUA), foram colocados em uma câmara de crescimento durante duas semanas com uma temperatura média de 25°C, sob ciclo de 18 horas de luz /6 horas de escuro a 70-100 μE/m2s. Os explantes permaneceram no meio SIM, com ou sem seleção, até que o crescimento de novo dos brotos ocorresse na área-alvo (por exemplo, meristemas axilares no primeiro nó, acima do epicótilo). As transferências para o meio fresco podem ocorrer durante este momento. Os explantes foram transferidos do SIM, com ou sem seleção para o SIM com a seleção depois de cerca de uma semana. Neste momento, havia um considerável desenvolvimento de novo dos brotos na base do pecíolo dos explantes foliares em uma variedade de SIM (Método B), no nó primário para os explantes das mudas (Método A), e nos gânglios axilares de explantes propagados (Método C).

[293] Preferencialmente, todos os brotos formados antes da transformação foram removidos até 2 semanas antes do cocultivo, para estimular novo crescimento a partir de meristemas. Isto ajudou a reduzir o quimerismo no transformante primário e aumentou a amplificação de células meristemáticas transgênicas. Durante este tempo, o explante pode ou não ser cortado em pedaços pequenos (isto é, destacando o nó do explante por corte do epicótilo).

3.5 ALONGAMENTO DOS BROTOS

[294] Depois de 2 a 4 semanas (ou até que a massa dos brotos estivesse formada) em meio SIM (preferencialmente com seleção), os explantes foram transferidos para meio SEM (meio de alongamento, consulte Olhoft et al 2007 A novel Agrobacterium rhizogenes-mediated transformation method of soy using primary-node explants from seedlings. In Vitro Cell. Dev. Biol.—Plant (2007) 43:536-549), que estimula o alongamento de brotos do broto primordial. Este meio pode ou não conter um composto de seleção.

[295] Após cada 2 a 3 semanas, os explantes foram transferidos para meio SEM fresco (preferencialmente com seleção) depois de, cuidadosamente, remover o tecido morto. Os explantes devem permanecer em conjunto e não fragmentarem-se em pedaços e manterem- se um pouco saudáveis. Os explantes continuaram a ser transferidos até morrerem ou os brotos se alongarem. Brotos alongados >3 cm foram removidos e colocados em meio RM durante cerca de 1 semana (Método A e B), ou cerca de 2 a 4 semanas, dependendo do tempo em cultivo (Método C) sobre o qual as raízes começaram a se formar. No caso de explantes com raízes, estes foram transferidos diretamente para o solo. Brotos enraizados foram transferidos para o solo e fortificados em uma câmara de crescimento durante 2 a 3 semanas antes da transferência para a estufa. As plantas regeneradas, obtidas com uso deste método, estavam férteis e produziram, em média, 500 sementes por planta.

[296] Após 5 dias de cocultura com Agrobacterium tumefaciens, a expressão transitória do gene de interesse (GOI) foi generalizada nos explantes de meristemas axilares das mudas, especialmente nas regiões feridas durante a preparação dos explantes (Método A). Os explantes foram colocados em meio de indução de brotos, sem seleção para consultar como o nó primário responde a indução de brotos e a regeneração. Dessa forma, mais de 70% dos explantes eram formados de novos brotos nesta região. A Expressão do GOI estava estável após 14 dias no SIM, o que implica a integração do T-DNA no genoma da soja. Além disso, experiências preliminares, resultaram na formação de cDNA expressando brotos que se formam após 3 semanas no SIM.

[297] Para o Método C, o tempo médio de regeneração de uma plântula de soja, com o uso do protocolo meristema axilar propagado, era de 14 semanas a partir da inoculação do explante. Portanto, este método tem um tempo de regeneração rápido, que resulta em plantas de soja férteis e saudáveis.

EXEMPLO 4 ENSAIO DE PATÓGENO 4.1. RECUPERAÇÃO DOS CLONES

[298] 2-3 clones por evento T0 foram envasados em pequenos potes de 6 cm. Para a recuperação, os clones foram mantidos durante 12-18 dias em fitocâmara (ritmo de 16 horas-dia e 8 horas-noite, a uma temperatura de 16° a 22°C e umidade de 75%).

4.2 INOCULAÇÃO

[299] As plantas foram inoculadas com P. pachyrhizi.

[300] A fim de obter material de esporos adequados para a inoculação, as folhas de soja que tinham sido infectadas com ferrugem há 15 a 20 dias, foram retiradas 2 a 3 dias antes da inoculação e transferidas para placas de ágar (ágar a 1% em H2O). As folhas foram colocadas com o seu lado superior sobre o ágar, o que permitiu aos fungos crescerem através do tecido e produzirem esporos muito jovens. Para a solução de inoculação, os esporos foram derrubados das folhas e adicionados à uma solução de Tween-H2O. A contagem de esporos foi efetuada sob um microscópio de luz por meio de câmara de contagem Thoma. Para a inoculação das plantas, a suspensão de esporos foi adicionada a um frasco de spray de ar comprimido e aplicada uniformemente sobre as plantas ou as folhas até que a superfície da folha estivesse bem hidratada. Para ensaios macroscópicos utilizou-se uma densidade de esporos de 1 a 5x105 esporos/mL. Para a microscopia, uma densidade >5 x 105 esporos/mL. As plantas inoculadas foram colocadas durante 24 horas em estufa, com média de 22°C e >90% de umidade do ar. O cultivo seguinte foi realizado em uma câmara com uma média de 25°C e 70% de umidade do ar.

EXEMPLO 5 TRIAGEM MICROSCÓPICA

[301] Para a avaliação do desenvolvimento do patógeno, as folhas de plantas inoculadas foram coradas com azul de anilina 48 horas após a infecção.

[302] A coloração com azul de anilina serve para detectar substâncias fluorescentes. Durante as reações de defesa nas interações hospedeiro e interações não hospedeiro, substâncias, como fenóis, calose ou acumulados de lignina ou foram produzidas e incorporadas na parede da célula, quer localmente, em papilas, ou em toda a célula (reação de hipersensibilidade, HR). Complexos foram formados em associação com o azul de anilina, o que levou, por exemplo, no caso da calose, à fluorescência amarela. O material da folha foi transferido para tubos falcon ou pratos contendo solução de descoloração II (etanol/ácido acético a 6/1) e incubado em banho-maria a 90°C durante 10 a 15 minutos. A solução de descoloração II foi removida imediatamente, e as folhas foram lavadas 2x com água. Para a coloração, as folhas foram incubadas durante 1,5 a 2 horas em solução de coloração II (0,05% azul de anilina = azul de metila, 0,067 M di-hidrogenofosfato de potássio) e analisadas por microscopia imediatamente.

[303] Os diferentes tipos de interação foram avaliados (contados) por microscopia. Um microscópio Olympus UV BX61 (luz incidente) e um filtro UV LongPath (excitação: 375/15, divisor de feixe: 405 LP) foram usados. Após coloração com azul de anilina, os esporos apareceram em azul sob luz UV. As papilas podiam ser reconhecidas sob os apressórios fúngicos com coloração verde/amarela. A reação de hipersensibilidade (HR) foi caracterizada pela fluorescência de células inteiras.

EXEMPLO 6 AVALIAÇÃO DA SUSCETIBILIDADE DA FERRUGEM DA SOJA

[304] A progressão da doença da ferrugem da soja foi avaliada pela estimativa da área doente (a área que foi coberta por esporulação de uredinea) na porção traseira (porção abaxial) da folha. Além disso, o amarelamento da folha foi levado em consideração (para esquema, consulte Figura 2).

[305] Plantas T0 de soja, expressando a proteína hidrofobina, (conforme mostrado na SEQ ID NO: 30) foram inoculadas com esporos de Phakopsora pachyrhizi. Os sintomas macroscópicos da doença da soja contra o P. pachyrhizi de 25 plantas T0 de soja foram avaliados 14 dias após a inoculação.

[306] A média da porcentagem da área foliar mostrando colônias de fungos ou forte amarelamento/escurecimento em todas as folhas foi considerada como área foliar doente. Todas as 25 plantas T0 de soja, expressando hidrofobina, (expressão verificada por RT-PCR) foram avaliadas em paralelo com as plantas controle, não transgênicas. Clones de plantas de soja não transgênicas foram usados como controle. A média da área foliar doente é mostrada na Figura 7 para as plantas que expressam hidrofobina recombinante em comparação a plantas de tipo selvagem. A superexpressão de hidrofobina reduz a área foliar doente, em comparação a plantas controle não transgênicas, em 26% em média ao longo de todos os eventos gerados. Estes dados indicam claramente que a expressão in-planta do vetor de construção de expressão da hidrofobina significantemente (*: p <0,05) leva a um escore menor da doença de plantas transgênicas em comparação aos controles não transgênicos. Assim, a expressão de um ácido nucleico de hidrofobina (conforme mostrado na SEQ ID NO: 29) na epiderme da soja, aumenta a resistência da soja contra a ferrugem.

EXEMPLO 7 PRODUÇÃO DE PROTEÍNAS HIDROFOBINAS PURIFICADAS

[307] As proteínas hidrofobinas podem ser encomendadas em várias empresas. Por exemplo, a hidrofobina SC3 (SEQ ID NO: 43, SEQ ID NO: 44) foi adquirida junto à Biomade Tecnologia (Groningen, Holanda) e proteína HFPII (SEQ ID NO: 45, SEQ ID NO: 46) foi sintetizada de modo personalizado pela VTT (VTT Technical Research Centre of Finland, LASKUT, Finlândia). As outras proteínas hidrofobina foram produzidas como proteínas de fusão, com a proteína yaad para uma melhor expressão (yaaD_TT1: SEQ IDNO: 52, yaaD_HFPI: SEQ ID NO: 50, yaaD_HFBII: SEQ ID NO: 48). A proteína yaad representa a subunidade de sintase Pdx1 (Yaad) de Plp sintase de Bacillus subtilis. As proteínas de fusão foram subsequentemente purificadas, conforme descrito no documento WO 2007/014897.

EXEMPLO 8 APLICAÇÃO POR SPRAY DE PROTEÍNAS HIDROFOBINA

[308] Plantas de soja tipo selvagem foram cultivadas em fitocâmara por 12 a 18 dias (16 horas-dia e 8 horas-noite, a uma temperatura de 16° 22°C e umidade de aproximadamente 75%).

[309] Plantas com vinte e cinco (25) dias foram pulverizadas com uma solução de proteína hidrofobina (dissolvida em PBS) para obter concentração de 1 mg/m2, que é suficiente para obtenção de uma monocamada totalmente coberta de hidrofobina. 24h após a aplicação de hidrofobina, as plantas foram inoculadas com esporos de soja com ferrugem, conforme descrito no Exemplo 4. Para cada proteína de hidrofobina, 10 plantas foram inoculadas com o fungo causador da ferrugem da soja Phakopsora pachyrhizi.

[310] Quatorze (14) dias após a inoculação com ferrugem da soja, a área foliar doente foi pontuada pela estimativa da área doente (área que estava coberta por esporulação de uredinea) na porção traseira (porção abaxial) da folha. Adicionalmente, o amarelamento da folha foi levado em consideração (para esquema, consulte Figura 2).

[311] Os sintomas macroscópicos da doença da soja pulverizada com hidrofobina (10 plantas por variante de hidrofobina) foram pontuados 14 dias após a inoculação. A média da porcentagem da área foliar, mostrando colônias de fungos ou forte amarelamento/escurecimento em todas as folhas, foi considerada como área foliar doente. Ao todo, 50 plantas T0 de soja foram pulverizadas com cinco variedades diferentes de hidrofobina (HFBII: SEQ ID NO: 45, Hidrofobina SC3: SEQ-ID NO: 43, yaad TT1: SEQ ID NO: 52, yaad HFPI: SEQ ID NO: 50, Yaad HFBII: SEQ ID NO: 48).

[312] A média da área foliar doente é mostrada na Figura 9 para as plantas pulverizadas com hidrofobina HFBII, hidrofobina SC3 e yaaD_HFPI em comparação as plantas de soja não tratadas. A pulverização com estas variantes de hidrofobina reduz a área foliar doente, em comparação as plantas de controle não transgênicas, de 6% a 20%, em média sobre todas as plantas testadas. Os resultados para yaaD TT1 e yaaD HFBII foram 51,1% e 47,3%, respectivamente. Estes resultados podem ser explicados observando que a cobertura das folhas com a hidrofobina após a pulverização foi parcialmente incompleta.

[313] Os dados obtidos com a aplicação de hidrofobinas a uma superfície da planta indicam claramente que a aplicação de hidrofobinas leva a um escore de doença mais branda em comparação aos controles não transgênicos. A formulação para a aplicação das hidrofobinas a superfície da planta por pulverização pode ser ainda melhorada, por exemplo, pela adição de agentes tensoativos ou detergentes.

[314] Os resultados gerais demonstram que a aplicação de hidrofobinas em plantas de soja aumenta a resistência da soja contra patógenos fúngicos.

Claims (14)

1. MÉTODO PARA AUMENTAR A RESISTÊNCIA À INFECÇÃO POR PHAKOPSORA EM UMA PLANTA DE SOJA TRANSGÊNICA, uma parte da planta de soja transgênica ou uma célula vegetal de soja transgênica, caracterizado por compreender: fornecer à superfície da folha da dita planta de soja transgênica, parte de planta de soja transgênica ou célula vegetal de soja transgênica com uma proteína hidrofobina compreendendo uma sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 42, em que a proteína hidrofobina confere resistência contra Phakopsora melhorada na mesma, em comparação a uma planta de soja tipo selvagem, parte da planta de soja tipo selvagem ou célula vegetal de soja tipo selvagem, e cultivar a planta de soja transgênica, parte de planta de soja transgênica ou célula vegetal de soja transgênica na presença de um fungo patogênico de um gênero de Phakopsora, em que infecção por Phakopsora é prevenida, reduzida ou retardada na planta de soja transgênica, parte de planta de soja transgênica ou célula vegetal de soja transgênica em comparação a uma planta de soja tipo selvagem, parte da planta de soja tipo selvagem ou célula vegetal de soja tipo selvagem.

2. MÉTODO, de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pela proteína hidrofobina exógena que compreende a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 42 ser codificada por um gene em um ácido nucleico exógeno, em que o gene da hidrofobina está em ligação funcional com um promotor, em que o dito ácido nucleico exógeno compreende SEQ ID NO: 41 ou as sequências degeneradas da mesma, codificando a proteína hidrofobina que compreende a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 42.

3. MÉTODO, de acordo com a reivindicação 2, caracterizado pelo ácido nucleico exógeno compreender um ou mais elementos selecionados a partir do grupo que consiste em sequência sinal, polipeptídeo parceiro de fusão, sequência ligante e sequência de purificação, e em que a proteína hidrofobina é uma proteína hidrofobina de fusão.

4. MÉTODO, de acordo com a reivindicação 3, caracterizado pela proteína de fusão hidrofobina compreender uma sequência sinal.

5. MÉTODO, de acordo com a reivindicação 4, caracterizado pela sequência sinal de secreção de SEQ ID NO: 24 ser codificada por um ácido nucleico exógeno de SEQ ID NO: 23.

6. MÉTODO, de acordo com a reivindicação 3, caracterizado pela proteína de fusão hidrofobina compreender um polipeptídeo parceiro de fusão de SEQ ID NO: 16 codificado por um ácido nucleico exógeno de SEQ ID NO: 15.

7. MÉTODO, de acordo com a reivindicação 2, caracterizado pelo promotor ser um promotor constitutivo, induzível por patógeno, um promotor mesófilo-específico ou um promotor epiderme-específico, preferivelmente um promotor epiderme-específico.

8. MÉTODO, de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fungo patogênico ser Phakopsora meibomiae, Phakopsora pachyrhizi ou uma combinação dos mesmos.

9. MÉTODO, de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pela planta ser selecionada a partir do grupo que consiste em feijões, soja, ervilha, trevo, kudzu, luzerna, lentilhas, tremoceiros, vicias (vetches), amendoim, arroz, trigo, cevada, arabidopsis, lentilha, banana, canola, algodão, batata, milho, cana-de-açúcar, alfafa e beterraba.

10. MÉTODO PARA A PRODUÇÃO DE UMA PLANTA DE SOJA TRANSGÊNICA, parte da planta de soja transgênica ou célula vegetal de soja transgênica, que tem resistência à infecção por Phakopsora aumentada, caracterizado por compreender: (a) introduzir um cassete de expressão que compreende: (1) um ácido nucleico exógeno de SEQ ID NO: 41 ou sequências degeneradas da mesma que codifica uma proteína que tem uma sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 42, em ligação funcional com um promotor; e (b) gerar uma planta de soja transgênica, parte da planta de soja transgênica ou célula vegetal de soja transgênica a partir da planta, parte da planta ou célula vegetal; em que expressão do ácido nucleico exógeno conduz à resistência à infecção por Phakopsora aumentada na mesma em comparação a uma planta de soja tipo selvagem, parte da planta de soja tipo selvagem ou célula vegetal de soja tipo selvagem.

11. MÉTODO, de acordo com a reivindicação 10, caracterizado por compreender adicionalmente a etapa de coletar as sementes da planta transgênica, plantar as sementes e cultivar as sementes até plantas, em que as plantas cultivadas compreendem o ácido nucleico exógeno de SEQ ID NO: 41 ou sequências degeneradas da mesma que codifica uma proteína que tem uma sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 42.

12. MÉTODO PARA A PRODUÇÃO DE UM PRODUTO, caracterizado por compreender: (a) cultivar uma planta transgênica, que pode ser obtida pelo método, conforme definido em qualquer uma das reivindicações 10 a 11, e (b) produzir o dito produto a partir ou pela planta e/ou parte da planta transgênica, em que o produto compreende um ácido nucleico exógeno de hidrofobina de SEQ ID NO: 41 ou sequências degeneradas da mesma que codifica uma proteína que tem uma sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 42.

13. MÉTODO, de acordo com a reivindicação 12, caracterizado pelo dito produto ser produzido a partir ou pelas partes coletáveis da planta.

14. MÉTODO PARA CRIAR UMA PLANTA TRANSGÊNICA RESISTENTE A FUNGOS, caracterizado por compreender: (a) cruzar a planta transgênica, que pode ser obtida pelo método, conforme definido em qualquer uma das reivindicações 10 a 11, com uma segunda planta; (b) obter sementes a partir do cruzamento da etapa (a); (c) plantar as ditas sementes e cultivar as sementes até plantas; e (d) selecionar a partir das ditas plantas produzidas na etapa (c), plantas que expressam uma proteína hidrofobina.

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