KR20130018805A - 단백질로 코팅된 스텐트 및 단백질을 이용한 코팅 방법 - Google Patents

단백질로 코팅된 스텐트 및 단백질을 이용한 코팅 방법 Download PDF

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Abstract

하나 이상의 하이드로포빈 유도체 (H), 물 및 추가 성분을 포함하는 조성물을 사용하여 이식형 구조체, 예컨대 스텐트를 코팅하는 방법은 장시간 유용한 임플란트를 제조한다.

Description

단백질로 코팅된 스텐트 및 단백질을 이용한 코팅 방법{COATED STENTS AND PROCESS FOR COATING WITH PROTEIN}
본 발명은 코팅된 의료 기기, 예를 들면 스텐트와 같은 이식형(implantable) 구조체와, 스텐트 및 다른 의료 기기와 같은 이식형 구조체를 단백질로 코팅하는 신규의 방법에 관한 것이다. 본 발명은 또한 의료 기기, 예컨대 스텐트, 문합(anastomotic) 장치 및 혈관주위 랩(perivascular wrap)을 특정 단백질인 하이드로포빈(hydrophobin) 단독 또는 하이드로포빈과 다른 성분, 예컨대 헤파린을 함께 포함하는 조성물로 코팅하는 방법에 관한 것이다.
광범위한 이식형 구조체, 예를 들면 스텐트, 특히 담도(biliary) 스텐트가 공지되어 있다. 다양한 목적을 위해 플라스틱 및 금속 스텐트가 사용되지만, 낮은 제조 비용, 영구적 기능, 및 사용과 교체에 있어 손쉬운 취급성을 갖는 고품질의 스텐트는 통용되지 않고 있다.
본 발명은 하이드로포빈으로 코팅되고, 그리고 특정 실시양태에서는 예를 들어 약물 또는 약물 복합제제, 예컨대 혈관 질환의 예방 및 치료를 위한 약물 또는 약물 복합제제의 국소 전달을 위해 사용될 수 있는 의료 기기, 예를 들면 이식형 구조체 (I)에 관한 것이다. 본 발명은 또한 하이드로포빈으로 코팅된, 스텐트, 문합 장치, 혈관주위 랩, 봉합선(suture) 및 스테이플(staple)을 비롯한 의료 기기에 관한 것이다. 이러한 의료 기기는 질환을 치료 및 예방하고, 생물 유기체에 의료 기기의 도입시 이에 대한 유기체 반응을 최소화하거나 실질적으로 없애기 위해 사용될 수 있다. 또한, 이러한 코팅된 장치는 치유 및 내피세포증식(endothelialization)을 개선하기 위해 사용될 수 있다.
본 발명은 또한 의료 기기, 특히 스텐트와 같은 이식형 구조체를 위한 코팅에 관한 것이다. 본 발명은 또한 이식형 의료 기기로부터 약물, 제제(agent) 및/또는 화합물의 용출률을 제어하기 위한 코팅을 포함한다. 본 발명은 또한 예를 들어 혈관 질환의 치료를 위한 약물의 국소 전달을 위한 약물 전달 시스템에 관한 것이다. 본 발명은 또한 하이드로포빈 및 여기에 부착된 질환 치료용 약물을 갖는 코팅된 의료 기기, 예컨대 이식형 구조체에 관한 것이다.
하이드로포빈 및 유도체는 치마버섯(Schizophyllum commune)과 같은 사상균에서 발견되는 약 100 내지 150개 아미노산의 작은 단백질이다. 이들은 일반적으로 분자 내에 8개의 시스테인 단위(Cys)를 가진다. 하이드로포빈은 곰팡이 기원의 가장 표면 활성인 단백질에 속한다. 하이드로포빈은 1차 서열에서 8개의 Cys 잔기가 4개의 이황화 결합(disulfide bridge)을 형성하는 특징적인 패턴을 공유하는 다양한 아미노산 서열을 포함한다. Cys 잔기에 의해 형성된 이황화 결합은 친수성-소수성 계면에서 제어된 조립을 담당하여 용액 중에서 자발적인 자기-조립을 방지하는 것으로 알려져 있다. 이러한 단백질은 공중(aerial) 성장(예를 들면, 기균사(aerial hyphae), 포자 및 자실체(fruiting body), 예컨대 버섯) 및 고체 지지체로 진균의 부착을 위해 중요한 것으로 밝혀졌다. 하이드로포빈은 매우 안정하며 물의 비등점 가까운 온도를 견딜 수 있다. 하이드로포빈은 천연 공급원으로부터 단리될 수 있지만, 예를 들어 WO 2006/082 251 또는 WO 2006/131 564에 기재된 바와 같이 재조합 방법에 의해 얻어질 수도 있다. 선행 기술은 이미 다양한 적용을 위해 다수의 하이드로포빈의 사용을 제안하고 있다. WO 1996/41882는 소수성 표면을 친수성화하기 위한 유화제 및 농후제로서 하이드로포빈의 사용을 제안하고 있다. 하이드로포빈을 항유화제로서(WO 2006/103251 참조), 증발 지연제로서(WO 2006/128877 참조) 또는 누출 억제제(soiling inhibitor)로서(WO 2006/103215 참조)의 사용이 또한 제안되어져 왔다. 수용액으로부터 다양한 표면, 예컨대 플라스틱 중합체 표면, 유리, 금속 표면, 천연 표면 예컨대 가죽, 면 및 종이 상에 하이드로포빈 유도체의 침착 방법이 WO 2006/082253 및 EP-A 1 252 516에 기재되어 있다.
본 발명은 또한 하이드로포빈을 이용한 의료 기기의 코팅에 관한 것이다. 본 발명의 특정 측면은 하나 이상의 하이드로포빈 유도체 (H)를 포함하는 조성물로 이식형 구조체 (I)의 표면을 처리하는 단계를 포함하는 이식형 구조체 (I)에 대한 신규의 코팅 방법에 관한 것이다.
본 발명은 또한 이식형 구조체 (I)가 스텐트이고 표면을 하나 이상의 하이드로포빈 유도체 (H) 및 하나 이상의 추가 성분 (F)을 포함하는 조성물로 처리하는 것을 특징으로 하는, 이식형 구조체 (I)의 코팅 방법에 관한 것이다.
본 발명은 또한 조성물이 하나 이상의 하이드로포빈 유도체 (H), 물, 및 잠재적으로 추가 성분 (F)을 포함하고, 하이드로포빈 유도체 (H)의 양은 전체 조성물을 기준으로 0.0001 내지 20 중량%, 종종 0.001 내지 10 중량%인 것인, 이식형 구조체 (I)의 코팅 방법에 관한 것이다. 이식형 구조체 (I)의 표면상에서, 하이드로포빈 유도체의 양은 종종 0.1 내지 10 mg/㎡ 범위이다.
추가 성분은 예를 들면 중합체 첨가제, 용매, 버퍼, 약학적으로 활성인 물질 및/또는 보조제일 수 있다. 보조제란 용어는 약학적으로 허용가능한, 생리학적으로 불활성인 성분, 예컨대 바인더, 충전제 및 코팅 형성 화합물을 포함한다. 임의적인 보조제인 부형제의 추가 예로는 부착 방지제, 방부제, 윤활제(glidant, lubricant) 및 흡수제(sorbent)가 있다. 적합한 물질은 당업계에 공지되어 있다.
종종, 조성물은 수계(water-based) 조성물이다. 본 발명은 또한 이식형 구조체 (I)가 하나 이상의 하이드로포빈 유도체 (H), 물, 및 잠재적으로 추가 성분 (F)을 포함하는 조성물로 처리된 스텐트이고, 하이드로포빈 유도체 (H)의 양은 전체 조성물을 기준으로 0.001 내지 10 중량%인, 이식형 구조체 (I)의 코팅 방법에 관한 것이다.
본 발명은 또한 하이드로포빈 유도체 (H), 물 및 하나 이상의 추가의 약학적으로 활성인 화합물 (D)을 포함하는 조성물을 이식형 구조체 (I)의 표면에 도포하는, 이식형 구조체 (I)의 코팅 방법에 관한 것이다. 본 방법은 추가 단계, 예컨대 세정 및 세척 단계를 포함할 수 있다. 본 발명은 또한 하이드로포빈 유도체 (H), 물, 및 추가의 약학적으로 활성인 화합물 (D)로서 헤파린, 항생제(예를 들면, 암피실린 또는 설박탐(sulbactam) 또는 레보플록사신) 및 세포증식억제 화합물(예를 들면, 알킬안티아(alkylantia), 항대사제, 유사분열 억제제 또는 호르몬)을 포함하는 군으로부터 선택된 하나 이상의 화합물을 포함하는 조성물을 이식형 구조체 (I)의 표면에 도포하는, 이식형 구조체 (I)의 코팅 방법에 관한 것이다. 하이드로포빈과 헤파린 및 이의 유도체(예를 들면, 에녹사파린)의 조합이 특히 주목할만한 대상이다. 추가 예는 하이드로포빈 및 쿠마린 유도체, 예컨대 와파린(Warfarin), 펜프로쿠몬(Phenprocoumon) 또는 에틸비스쿰아세타트(Ethylbiscoumacetat)를 포함하는 조성물이다. 추가의 약학적으로 활성인 화합물 (D)은 또한 하이드로포빈에 화학적으로 결합될 수 있다.
본 발명은 또한 사용된 하이드로포빈 유도체(H)가 융합 하이드로포빈 또는 이의 유도체인, 이식형 구조체 (I)의 코팅 방법에 관한 것이다. 본 발명은 또한 하나 이상의 하이드로포빈 유도체(H)를 포함하는 조성물을 4℃ 내지 95℃, 특히 20℃ 내지 90℃의 온도에서, 0.01 시간 내지 48 시간, 특히 0.1 내지 20 시간, 종종 1 내지 10 시간 동안 이식형 구조체 (I)의 표면에 도포하는, 이식형 구조체 (I)의 코팅 방법에 관한 것이다.
본 발명의 추가 측면은 적어도 부분적으로 하이드로포빈 유도체 (H)로 처리된 표면을 갖는 코팅된 이식형 구조체 (I)이다.
본 발명은 또한 상술된 방법에 의해 하이드로포빈 유도체 (H)로 적어도 부분적으로 표면 코팅된, 코팅된 이식형 구조체 (I)에 관한 것이다.
본 발명은 또한 이식형 구조체 (I)가 스텐트, 특히 담도(biliary) 스텐트인, 코팅된 이식형 구조체 (I)에 관한 것이다.
본 발명의 부가적인 목적은 총 조성물을 기준으로 0.0001 내지 20 중량%의 하이드로포빈 (H) 및 99.999 내지 80 중량%의 추가 성분 (F)을 포함하는, 이식형 구조체 (I)의 코팅을 위한 조성물을 제공하는 데 있다. 추가 성분으로서, 용매인 물이 종종 사용된다.
본 발명은 또한 적어도 0.001 중량% 내지 10 중량%의 하나 이상의 하이드로포빈 유도체 (H), 50 중량% 이상의 물 및 잠재적으로 추가 성분 (F)을 포함하는, 이식형 구조체 (I)의 코팅을 위한 조성물에 관한 것이다. 추가의 일 측면은 이식형 구조체 (I), 특히 스텐트의 코팅을 위한 하이드로포빈 유도체 (H)의 용도이다.
이식형 구조체 (I)와 같은 몇몇 유형의 의료 기기는 사용 전에 종종 코팅된다. 이식형 구조체의 일례로서, 담도에서 발생하는 폐쇄를 치료하기 위한 담도 스텐트가 사용된다. 담즙(Bile)은 지방을 소화시키는 역할을 하는 물질로서 간에서 생성되어 담도를 통해 분비되며 담낭에 저장된다. 이는 지방 함유 식이가 섭취된 후 소장으로 분비된다. 담도의 협착을 야기할 수 있는 다수의 악성 또는 양성 조건이 있다. 췌장암이 흔한 악성 요인이며, 담낭암, 담도암, 간암 및 대장암이 추가 예에 해당한다. 담도 협착의 비암(Non-cancerous) 요인은 담낭 제거 수술 동안 담도에 대한 상처, 췌장염(췌장의 염증), 원발경화성담관염(담도의 염증), 담석, 방사선 요법 및 복부에 대한 둔상(blunt trauma)을 포함한다.
담도 스텐트는, 종종 표면 코팅될 수 있고 담도의 좁아진 부분을 지지하면서 협착의 재형성을 방지하기 위해 사용되는 얇은, 튜브형 구조물이다. 스텐트는 예를 들면 플라스틱 또는 금속으로 제조될 수 있다. 담도 스텐트를 배치하기 위해 사용되는 가장 흔한 두 가지 방법은 내시경적 역행성 담췌관 조영술(ERCP)과 경피 경간 담도 조영술(PTC)이다. 두 방법의 경우, 코팅된 장치를 사용하는 것이 유리할 수 있다. ERCP는 치료 장치로서도 사용되는 이점을 가지면서 췌장, 간, 담낭, 및 담도의 질병을 진단하기 위해 사용되는 이미징 기법이다. 내시경은 영상 스크린에 부착된 얇고, 점등된, 중공형의 튜브이며, 담도가 빈 장소에 도달할 때까지 환자의 입에서 시작하여, 식도로 내려가, 위를 거친 후, 소장의 상부로 삽입될 수 있다. 이 지점에서 캐뉼러로 불리는 작은 튜브가 내시경을 통해 삽입되며 이는 담도안으로 대조 염료를 주입하기 위해 사용된다. 이후, 염료가 담도를 통해 이동함에 따라 일련의 x 선 검사가 이루어진다. x 선이 담도 협착이 존재함을 보여준다면, 코팅된 스텐트는 폐쇄를 완화시키기 위해 담도 안으로 놓여질 수 있다. 이를 위해, 특수 도구가 내시경에 삽입되며 담도로 접근하기 위해 유두괄약근절개술(sphincterotomy)이 수행된다. 몇몇 경우에, 담도 협착은 우선 카테터로 불리는 얇은 가요성 튜브에 이어 팽창된 풍선형 장치를 사용하여 확장될 수 있다. 이후, 코팅된 스텐트가 담도안으로 삽입된다. 코팅된 스텐트를 적용하기 위한 나머지 방법, 경피 경간 담도 조영술 또는 PTC는 간에서부터 위장관으로 담즙의 흐름에 영향을 미치는 폐쇄를 진단하고 치료하는 시험이 이루어진다는 점에서 ERCP와 유사하다. 피부를 통해 간 또는 담낭 안으로 대조 염료를 주입하기 위해 얇은 바늘이 사용된다. 염료가 담도를 통해 이동하는 동안 X선 사진이 촬영된다. 담도 협착이 확실하면, 코팅된 스텐트를 넣을 수 있다. 중공형의 바늘이 담도 안으로 도입되고 상기 바늘 안에는 얇은 가이드 와이어가 삽입된다.
상기 와이어는 폐쇄 영역으로 안내되며 코팅된 스텐트는 와이어 위로 나아가 폐쇄된 담도에 놓여진다.
스텐트는 또한 다른 의료 분야에서 사용될 수 있다.
많은 개체들이 심장 및 다른 주요 기관을 관류하는 혈관의 진행성 차단에 의해 야기된 순환계 질환을 앓고 있다. 혈관의 보다 심각한 봉쇄는 종종 고혈압, 허혈 손상, 뇌졸중, 또는 심근경색을 야기한다. 동맥경화성 병소가 허혈성 심장 질환의 주 원인이다. 경피적 경혈관 관상동맥 확장술은 동맥을 통과하는 혈류를 증가시키기 위한 의료처치 과정이다. 경피적 경혈관 관상동맥 확장술은 관상 혈관 협착에 대한 주된 치료법이다. 경피적 경혈관 관상동맥 확장술과 관련한 한계는 혈관의 갑작스런 폐쇄이며, 이는 시술 직후 및 시술 이후 점진적으로 발생하는 재협착 직후에 일어날 수 있다.
재협착시 항증식 작용을 하는 다수의 제제가 스텐트를 사용하여 시험되고 있으며 실험실 동물 모델에서 일부 활성을 보이고 있다. 동물 모델에서 혈관내막 증식(intimal hyperplasia)의 정도를 성공적으로 감소시키는 것으로 보고된 몇몇 제제로는 헤파린 및 헤파린 분획, 탁솔, 안기오텐신 전환 효소 억제제, 안기오펩틴, 시클로스포린 A, 테르비나핀, 인터페론-감마, 라파마이신, 스테로이드, 안티센스 올리고뉴클레오티드 및 유전자 벡터를 포함한다. 코팅된 스텐트는 재협착을 감소시키는데 사용될 수도 있다.
이러한 코팅된 스텐트는 종종 풍선-확장성 슬롯형 금속 튜브(예를 들면, 스테인레스강)이며, 이는 성형된 관상 동맥의 루멘 내에서 확장될 경우 동맥벽에 대한 견고한 스캐폴딩을 통한 구조적 지지체를 제공한다. 이러한 지지체는 혈관 루멘 개방성(potency)을 유지하는데 도움이 된다. 경피적 경혈관 관상동맥 확장술 후 이러한 코팅된 스텐트의 증가된 조영술상 성공이 확인될 수 있다. 부가적으로, 하이드로포빈과 최종적으로 추가 화합물, 예컨대 헤파린 및 이의 유도체를 이용한 스텐트의 코팅은 스텐트 이식 후 아급성 혈전증(subacute thrombosis)을 감소시키는 부가의 이점을 가지는 것으로 보인다. 하이드로포빈과 헤파린(및 최종적으로 다른 화합물)을 이용한 스텐트의 코팅은 임상적 효용을 가질 수 있다.
하이드로포빈 코팅된 스텐트의 사용은 또한 국소 약물 전달의 일 방법인 것으로 확인되었다. 특정 약물(또는 약물 조합)이 국소 전달 장치, 예를 들어 스텐트에 부착되는 방식은 이러한 유형의 치료의 효능에 일 역할을 담당한다.
본 발명에 따른 일 전형적인 방식은 장치의 표면상에 코팅된 하이드로포빈 단백질에 약물 분자를 화학적으로 고정하는 것이다. 약물(또는 약물 조합)을 스텐트에 부착하는데 사용되는 방법 및 재료는 약물의 작용을 방해하지 않아야 한다. 또한, 사용되는 방법 및 재료는 생물적합성이어야 하고 약물 또는 약물 조합을 국소 장치상에서 전달을 통해 그리고 장시간에 걸쳐 유지해야 한다. 혈관 손상과 같은 질환의 예방 및 치료를 위한 국소 전달 장치로서 사용될 수 있는 특수하게 단백질 코팅된 스텐트에 대한 필요성이 존재한다.
스텐트 코팅을 위한 다양한 방법 및 조성물이 제안되고 있다. 코팅은 스텐트가 상처난 부위(예, 루멘 벽)에 제공하는 자극을 스스로 감소시킬 수 있으며, 이에 혈전증 또는 재협착 성향을 줄여준다. 또한, 코팅은 약물을 전달할 수 있다. 약물 전달 기전은 예를 들면 벌크 중합체를 통하거나 중합체 구조 내에 만들어진 포어를 통한 제제의 확산에 의하거나 생분해성 코팅의 침식(erosion)에 의해서이다. 약물 화합물은 또한 단백질 하이드로포빈을 사용하여 스텐트의 표면상에 코팅될 수 있다.
생물흡수성 및 생물안정성 조성물 둘다 스텐트용 코팅 재료로서 보고되고 있다. 중합체 코팅은 약물을 포접할 수 있다. 이러한 제제를 표면에 부착하는 다른 수단, 예를 들어 헤파린-코팅된 스텐트가 공지되어 있다. 이러한 코팅은 딥, 분무, 또는 스핀 코팅 공정을 비롯한 다수의 방식으로 스텐트에 적용된다. 스텐트용 코팅으로서 보고된 일 부류의 생물안정성 중합체 재료로는 폴리플루오로 단독중합체가 있다. 폴리테트라플루오로에틸렌(PTFE) 단독중합체가 수년간 임플란트로서 사용되어져 왔다. 이러한 단독중합체는 적당한 온도에서 임의의 용매에서 불용성이며 이에 따라 장치의 중요한 특징부(feature)(예를 들어, 스텐트 내 슬롯)를 유지하면서 작은 의료 기기상에 코팅되기는 어렵다. 폴리비닐리덴플루오라이드 단독중합체로 제조되고 방출될 약학적/치료학적 제제 또는 약물을 함유하는 코팅을 갖는 스텐트가 제안되어져 왔다. 그러나, 이들은 비교적 고온에 노출됨이 없이 표면상에 고 품질의 막으로서 도포되기가 어렵다.
하이드로포빈 또는 이의 유도체를 함유한 이식형 구조체에 대한 코팅을 개발하는 것이 유리한 것으로 밝혀졌다.
이러한 코팅은 하이드로포빈을 함유한 조성물을 사용하여 의료 기기의 표면에 도포될 수 있다. 이러한 코팅은 약학적 제제 또는 약물을 포함할 수 있는(그러나 이의 사용이 필수사항은 아님) 이식형 의료 기기에 도포될 수 있다. 이러한 코팅된 장치는 사용에 효과적인 물리적 및 기계적 성질을 보유한다. 이러한 코팅된 의료 기기는, 질환을 치료하면서 의료 기기의 이식에 대한 생물 유기체의 반응을 최소화하거나 실질적으로 없애는 약물과 함께 사용하는 것이 유리할 수 있다. 특정 환경에서, 하이드로포빈-코팅된 의료 기기는, 상처 치유 및 의료 기기의 내피세포증식을 촉진하는 약물, 예컨대 헤파린과 조합된 형태로 개발되는 것이 유리하다.
본 발명의 문맥상, "하이드로포빈" 또는 "하이드로포빈 유도체"란 용어는 특히 구조식
Figure pct00001
의 폴리펩티드를 의미하는 것으로 해석될 수 있다:
Figure pct00002
여기서, X는 20개의 천연 아미노산(Phe, Leu, Ser, Tyr, Cys, Trp, Pro, His, Gln, Arg, Ile, Met, Thr, Asn, Lys, Val, Ala, Asp, Glu, Gly) 중 임의의 것일 수 있다. 상기 식에서, X 라디칼은 각각의 경우에 동일하거나 상이할 수 있다. X 옆의 지수들은 각각 특정 부분-서열 X에서 아미노산의 개수이며, C는 시스테인, 알라닌, 세린, 글리신, 메티오닌 또는 트레오닌이며, 여기서 C로 표시된 잔기 중 4개 이상은 시스테인이며, 지수 n 및 m은 각각 독립적으로 0 내지 500, 바람직하게는 15 내지 300의 자연수이다. 식
Figure pct00003
의 폴리펩티드는 또한 유리 표면의 코팅 후 실온에서 수액적(water droplet)의 접촉각이 비코팅된 유리 표면과 대등하게 큰 수액적의 접촉각과 비교했을 때 20°이상, 바람직하게는 25°이상, 더욱 바람직하게는 30°증가하는 성질을 특징으로 한다.
C1 내지 C8로 표시된 아미노산은 바람직하게는 시스테인이다. 그러나, 이들은 또한 유사한 공간-충전을 갖는 다른 아미노산, 바람직하게는 알라닌, 세린, 트레오닌, 메티오닌 또는 글리신으로 대체될 수 있다.
그러나, 위치 C1 내지 C8 중 4개 이상, 바람직하게는 5개 이상, 더욱 바람직하게는 6개 이상, 특히 7개 이상이 시스테인으로 이루어진다. 본 발명의 단백질에서, 시스테인은 환원된 형태로 존재하거나 또는 서로 이황화 결합을 형성할 수 있다. 분자내(intramolecular) C-C 결합 형성이 특히 바람직하며, 특히 하나 이상의 분자내 이황화 결합, 바람직하게는 2개, 더욱 바람직하게는 3개, 가장 바람직하게는 4개의 분자내 이황화 결합이 바람직하다. 시스테인을 유사한 공간-충전을 갖는 아미노산으로 상술한 바와 같이 교환하는 경우, 그러한 C 위치들은 서로 분자내 이황화 결합을 형성할 수 있는 쌍으로 교환되는 것이 유리하다. 시스테인, 세린, 알라닌, 글리신, 메티오닌 또는 트레오닌이 X로 표시된 위치에서 또한 사용된다면, 상기 식에서 개개 C 위치의 넘버링은 이에 대응하여 변할 수 있다.
본 발명을 실시하기 위해 식 (II)의 하이드로포빈을 사용하는 것이 바람직하다:
Figure pct00004
여기서, X, C, 및 X와 C 옆의 지수들은 각각 앞서 정의한 바와 같고, 지수 n 및 m은 각각 0 내지 350, 바람직하게는 15 내지 300의 수이며, 단백질은 부가적으로 접촉각에 있어 상술된 변화를 특징으로 하며, 또한, C로 표시된 잔기 중 6개 이상은 시스테인이다. 더욱 바람직하게는, 모든 C 잔기가 시스테인이다.
식 (III)의 하이드로포빈을 사용하는 것이 특히 바람직하다:
Figure pct00005
여기서, X, C, 및 X 옆의 지수들은 각각 앞서 정의한 바와 같고, 지수 n 및 m은 각각 0 내지 200의 수이며, 단백질은 부가적으로 접촉각에 있어 상술된 변화를 특징으로 하며, C로 표시된 잔기 중 6개 이상은 시스테인이다. 더욱 바람직하게는, 모든 C 잔기가 시스테인이다. Xn 및 Xm 잔기는 하이드로포빈에 자연적으로 결합된 펩티드 서열일 수 있다. 그러나, 하나의 잔기 또는 두 잔기가 하이드로포빈에 자연적으로 결합되지 않은 펩티드 서열일 수도 있다.
이는 또한 하이드로포빈에 자연적으로 존재하는 펩티드 서열이 하이드로포빈에 자연적으로 존재하지 않는 펩티드 서열에 의해 연장된 Xn 및/또는 Xm 잔기를 의미하는 것으로 해석된다.
Xn 및/또는 Xm이 하이드로포빈에 자연적으로 결합되지 않은 펩티드 서열이라면, 이러한 서열은 일반적으로 길이가 20개 이상, 바람직하게는 35개 이상의 아미노산이다. 이들은 예를 들면 20 내지 500개, 바람직하게는 30 내지 400개, 더욱 바람직하게는 35 내지 100개 아미노산의 서열일 수 있다. 하이드로포빈에 자연적으로 결합되지 않은 이러한 잔기는 이하에서 또한 "융합 파트너(fusion partner)"로 지칭된다. 이는 단백질이 (자연에서 이러한 형태가 함께 존재하지 않는) 하나 이상의 하이드로포빈 부분(moiety)과 융합 파트너 부분으로 이루어질 수 있음을 표현하기 위한 의도이다. 융합 파트너와 하이드로포빈 부분으로 이루어진 융합 하이드로포빈은 예를 들면 WO 2006/082251, WO 2006/082253 및 WO 2006/131564에 기재되어 있다.
융합 파트너 부분은 다수의 단백질들로부터 선택될 수 있다. 예를 들면 하이드로포빈 부분의 아미노 말단(Xn)과 카르복실 말단(Xm)에서, 오직 하나의 융합 파트너가 하이드로포빈 부분에 결합되거나, 또는 복수개의 융합 파트너가 하나의 하이드로포빈 부분에 결합될 수도 있다. 그러나, 예를 들면 2개의 융합 파트너가 본 발명의 단백질의 하나의 위치(Xn 또는 Xm)에 결합될 수 있다. 특히 적합한 융합 파트너는 미생물, 특히 이쉐리키아 콜라이(Escherichia coli) 또는 바실러스 서브틸리스(Bacillus subtilis)에 자연적으로 존재하는 단백질이다. 이러한 융합 파트너의 예로는 서열 yaad (WO 2006/082251의 서열번호: 16), yaae (WO 2006/082251의 서열 번호: 18), 유비퀴틴 및 티오레독신이 있다.
앞서 언급한 서열의 오직 일부, 예를 들면 70 내지 99%, 선호적으로는 5 내지 50%, 더욱 바람직하게는 10 내지 40%를 포함하거나, 또는 앞서 언급한 서열에 비해 개개 아미노산 또는 뉴클레오티드가 변화된 서열의 분획 또는 유도체가 또한 매우 적합하며, 이 경우 퍼센티지는 각각 아미노산의 개수를 기준으로 한다. 완전한 융합 파트너 대신에, 끝잘린(truncated) 잔기를 사용하는 것이 유리할 수 있다.
특히, 끝잘린 잔기는 20개 이상, 바람직하게는 35개 이상의 아미노산을 포함할 수 있다. 추가의 바람직한 실시양태에서, Xn 또는 Xm 기 중 하나로서 또는 이러한 기의 말단 요소로서 앞서 언급한 융합 파트너뿐만 아니라 융합 하이드로포빈이 또한 소위 친화성 도메인(친화성 태그(tag) / 친화성 테일(tail))을 가진다. 대체로 알려진 방식에 따르면, 이는 특정 상보성 기와 상호작용할 수 있고 단백질의 보다 손쉬운 워크업(workup) 및 정제를 위해 기여할 수 있는 앵커(anchor) 기를 포함한다. 이러한 친화성 도메인의 예로는 (His)k, (Arg)k, (Asp)k, (Phe)k 또는 (Cys)k 기들을 포함하며, 여기서 k는 일반적으로 1 내지 10의 자연수이다. 이는 바람직하게는 (His)k 기일 수 있으며, 여기서 k는 4 내지 6이다. 이 경우에, Xn 및/또는 Xm 기는 이러한 친화성 도메인만으로 구성될 수 있거나, 또는 하이드로포빈에 자연적으로 결합되거나 결합되지 않은 Xn 또는 Xm 라디칼이 말단 친화성 도메인에 의해 연장된다.
본 발명에 따라 사용된 하이드로포빈은 또한 자신의 폴리펩티드 서열에서, 예를 들어 글리코실화, 아세틸화 또는 화학적 가교결합에 의해, 예를 들면 글루타르알데히드로 개질될 수 있다. 하이드로포빈은 또한 다당류, 예컨대 헤파린으로 가교될 수 있다.
이식할 때 코팅에 악영향을 주지 않는 코팅된 (의료) 장치(device)를 개발하는 것이 유리한 것으로 밝혀졌다. 또한, 이러한 하이드로포빈-코팅된 장치는 의료진으로 하여금 의료 기기를 표적 영역에 용이하게 그리고 정확하게 배치하기 위한 수단을 제공한다. 또한, 의료 기기로부터 약물(예를 들면, 헤파린)의 용출률의 정확한 제어를 가능하게 하는 의료 기기용 하이드로포빈 코팅을 개발하는 것이 유리한 것으로 밝혀졌다.
세포 증식에 영향을 미치는 다양한 분자 기전을 통해 작용하는 하나 이상의 제제의 방출을 제공하는 하이드로포빈 코팅된 장치가 또한 본 발명의 주제(subject)이다.
시험 목적을 위해, 시판되는 담도 플라스틱 스텐트를 하이드로포빈 단독으로 또는 하이드로포빈과 항생제 및/또는 헤파린으로 코팅하였다. 인간 담즙에서 28일간 인큐베이션한 후, 코팅된 스텐트의 표면상에서 막힘 유발(clogging) 재료가 감소되었는지 여부를 조사하였다. 하이드로포빈으로 플라스틱 스텐트의 코팅은 스텐트의 표면상에서 부착 재료의 상당한 감소를 유도한 것을 확인하였다.
하이드로포빈-코팅된 스텐트로의 암피실린/설박탐 또는 레보플록사신의 커플링을 또한 시험하였다. 하이드로포빈 또는 하이드로포빈과 헤파린을 이용한 담도 플라스틱 스텐트의 코팅은 막힘 진행(process)을 지연시키는 유망한 방법인 것으로 확인되었다.
임상적 셋팅이 보다 장시간에 걸쳐 스텐팅을 요구한다면, 내시경 스텐트 교환이 종종 필요하지만, 보다 긴 개방율을 갖는 하이드로포빈-코팅된 담도 스텐트의 개발이 특별히 유용한 것으로 밝혀졌다. 시험관내 모델에서, 하이드로포빈을 이용한 시판되는 담도 플라스틱 스텐트의 다양한 코팅을 시험하였다. 막힘 진행의 감소가 확인되었다. 또한, 항생제와 헤파린을 이러한 하이드로포빈 단백질에 커플링하여 플라스틱 스텐트의 성능을 더욱 개선시켰다. 이러한 개념은 작은 실(thread)이 막힘 과정에 중요한 역할을 담당하는 것으로 여겨짐을 보여주는 주사 전자 현미경 연구를 통한 발견에 기인한 것이었다.
실시예 1
하기 연구를 위해, 직경이 10 프렌치(French)이고 플랩(폴리에틸렌, 타입 Cotton-Leung?,Fa. Cook? Medical)들 간의 길이가 8 cm인 담도 플라스틱 스텐트를 사용하였다.
네이티브 플라스틱 스텐트와 하이드로포빈-코팅된 스텐트를 28일간 인간 담즙에 넣어두었다. 이후 주사 전자 현미경으로 스텐트를 조사하였다.
코팅 과정을 시작하기 이전에, 스텐트를 (최종 주사 전자 현미경에 적합한) 1 cm의 피스(pieces)로 컷팅하였다. 다양한 활성물질의 표면 개질 및/또는 표적화는 개질된 하이드로포빈을 이용한 코팅에 의해 이루어졌다.
단백질 "H*단백질 A"의 생성 및 성질이 문헌[Wohlleben W, Subkowski T, Bollschweiler C et al. "Recombinantly produced hydrophobins from fungal analogues as highly surface-active performance proteins" in Eur Biophys J, 2009]에 기재되어 있다.
첫번째 실험에서, 14개의 네이티브 스텐트를 사용하였다. 11개의 스텐트를 하이드로포빈 단백질(H*단백질 A, BASF SE)을 이용한 일반적인 코팅 기법으로 코팅하였고 3개의 스텐트를 하이드로포빈(암피실린+설박탐(Unacid?, Pfizer Pharma)과 조합된 H*단백질 A)으로 코팅하였다. 또한, H*단백질 A/레보플록사신(Tavanic?, Sanofi-Aventis) 조합물과 H*단백질 A/헤파린 조합물을 시험하였다.
10 mg 하이드로포빈(H*단백질 A)/ml 멸균 증류수의 용액을 준비한 후, 단백질을 코팅 버퍼(50 mM Tris-HCI pH 8.0, 1 mM CaCl2)에서 1 mg/mL로 희석하였다. 스텐트를 1 mL H*단백질 A 용액에서 밤새 80℃에서 인큐베이션하고, 증류수로 3회 세척한 다음 건조하였다.
실시예 2 (표면상에서 하이드로포빈의 검출)
H*단백질 A의 코팅을 단백질의 헥사-His 태그에 대한 특이적 항체를 사용하여 검출하였다:
- 1% 블로킹 용액(Roche 1921673)에서 TTBS 버퍼(20 mM Tris-HCI pH 7.5, 150 mM NaCl, 0.05% Tween 20)에서; 실온(RT)에서 1시간 동안 코팅된 스텐트와 비코팅된 스텐트의 인큐베이션.
- TTBS 버퍼로 3회 세척
- TTBS 버퍼/0.01 % BSA (Sigma A7888)에서 1:2000 희석된 항-폴리-His-POD 항체 접합체(Sigma A7058)를 실온에서 1시간 동안 인큐베이션
- TTBS 버퍼로 2회 세척
- TBS 버퍼(20 mM Tris-HCl pH 7.5, 150 mM NaCl)로 세척
- 100 mM Na-아세테이트 pH 4.9로 세척
- 퍼록시다제 기질의 첨가:
100 μL DMSO에서 1 타블렛 TMB-기질(Sigma T5525)
10 mL 0.1 M Na-아세테이트 pH 4.9
14.7 μL 3% H202
- 실온에서 5분간 인큐베이션
- 405 nm에서 검출.
실시예 3 (하이드로포빈 및 헤파린으로 플라스틱 스텐트의 코팅)
헤파린을 스텐트의 H*단백질 A 코팅에 커플링하였다. 100 mM MES 버퍼(Sigma M2933) pH 4.5에서 헤파린(헤파린 나트륨염, Sigma H4784)과 커플링 시약 1-에틸-3-(3-디메틸아미노프로필)카보디이미드(EDC)(Sigma 7750)의 혼합물 1 mg/mL를 새로이 준비하였다. 헤파린의 최종 농도는 50 U/mL, 500 U/mL 및 5000 U/mL 였다. 회전기에서 실온에서 2시간 동안 1 mL의 커플링 용액과 함께 스텐트를 인큐베이션한 후, 멸균 증류수로 3단계 세척하여 반응을 중지시켰다.
유리 카르복실기를 통해, 헤파린을 H*단백질 A의 아미노기에 커플링시키고: EDC가 1차 아민의 커플링을 위한 카르복실 활성화제로서 사용되어 아마이드 결합을 얻었다.
실시예 4 (H*단백질 A와 암피실린+설박탐(Unacid?, Pfizer Pharma)으로 코팅된 스텐트)
Unacid?를 멸균 증류수에 용해시켜 최종 농도(암피실린+설박탐) 100 mg/mL가 되도록 했다. 스텐트의 표면상에서 H*단백질 A와의 반응은 증류수에서 Unacid?를 100 ㎍/ml의 최종 총 농도로 첨가하고 글루타르디알데히드(Aldrich 34,085-5)를 0.05%의 최종 농도로 첨가하여 수행되었다. 실온에서 밤새 인큐베이션한 후, 스텐트를 멸균 증류수로 3회 세척하였다. Unacid?에서 2개의 활성 화합물 중 하나인 암피실린이 반응 조건하에 커플링될 수 있었다: 암피실린의 1차 아미노기와 H*단백질 A의 접근성 아미노기가 글루타르디알데히드에 의해 가교결합된다.
실시예 5 (H*단백질 A와 레보플록사신(Tavanic? Sanofi-Aventis)로 코팅된 스텐트)
Tavanic?을 100 mM MES 버퍼 pH 4.5에서 1.3 mg/mL의 최종 농도로 희석하고 EDC(최종 농도 1.6 mg/mL)와 혼합하였다. H*단백질 A로 코팅된 스텐트와의 반응은 실온에서 2.5 시간 동안 수행되었다. 마지막으로, 스텐트를 멸균 증류수로 3회 세척하였다.
레보플록사신을 아마이드의 생성에 의해 H*단백질 A에 커플링하였다: 레보플록사신의 카르복실기가 EDC에 의해 H*단백질 A의 아미노기에 가교결합된다.
실시예 6 (인간 담즙에서 인큐베이션)
코팅된 스텐트 모두를 인간 담즙(피부간경유배액술로 수집됨, 환자는 자신의 담즙의 사용에 대해 동의서를 제출함)이 충전된 튜브에서 28일간 보관하였다. 도 1에 도시된 장치를 사용하여 튜브를 2 rpm(분당 회전율)의 속도로 회전시켰다.
도 1에서, 약어 T는 스텐트를 보관중인 인간 담즙을 가진 튜브이고, B는 느린 진자 운동을 하는 보드(board)이며, E는 전기 모터이다. 장치에서 이러한 처리는 담즙 유동을 시뮬레이션하기 위해 행해졌다. 37℃의 일정한 온도에서 인큐베이션을 수행하였다.
실시예 7 (주사 전자 현미경검사)
인큐베이션 28일 후, 모든 스텐트를 멸균 증류수로 세척하고, 고정하며, 4% 완충 글루타르알데히드에서 보관하였다. 등급된 연속의(graded series) 알콜로 탈수 후, 모든 시료를 접착 호일 및 15 nm 금-팔라듐이 코팅된 스퍼터를 사용하여 스텁(stub)에 부착된 임계점 건조기를 사용하여 건조하였다. SEM-검사는 디지털 출력값을 제공하는 Philips 전계발광 SEM을 사용하여 수행되었다.
먼저, 코팅되지 않은 스텐트에 대한 결과값을 H*단백질 A로 코팅된 스텐트의 것과 비교하였다. 이후, H*단백질 A로 코팅된 스텐트를 H*단백질 A와 항생제 약물 화합물 또는 헤파린으로 코팅된 스텐트와 비교하였다.
하기 결과가 확인되었다:
a) 비코팅된 스텐트
28일간의 인큐베이션 후, 주사 전자 현미경 검사는 비코팅된 스텐트의 내부 및 외부 표면상에서 유사한 양의 부착 재료를 보여주었다. 이 재료는 내부 스텐트 표면상에서 보다 합류성(confluent)인 것으로 밝혀졌으며, 반면에 외부 표면상에서는 보다 기복이 있는(undulating) 것으로 나타났다. 부착 재료의 조성 측면에서는 차이가 없었다. 성분들은 주로 무정형 재료였으며 상이한 양의 박테리아가 존재했고 박테리아 근처에 그리고 이들의 출현과 무관하게 작은 구조물이 존재했다.
b) H*단백질 A로 코팅된 스텐트
본 연구에서 사용된 개질된 하이드로포빈은 아스퍼질러스 니둘란스(Aspergillus nidulans)의 하이드로포빈 DewA, N-말단 융합 단백질 yaad 및 C-말단 헥사-His 태그로 이루어진다. 이러한 태그 서열에 대한 특이적 항체로 인해 표면상에서 단백질의 "웨스턴 블롯 유사" 검출이 수행될 수 있었다. 특이적 기질의 색 생성에 의해 (항체에 커플링된) 효소 POD를 검출할 수 있었다.
Figure pct00006
비코팅된 스텐트와 비교해서 부착 재료의 감소 정도를 주사 전자 현미경 검사에 의해 저 배율로 확인할 수 있다.
비코팅된 스텐트에서 확인된 성분들(무정형 재료, 박테리아, 및 박테리아로부터 근처 및 멀리 떨어져 존재하는 작은 구조물)은 코팅된 스텐트상에서도 존재한다. 스텐트 표면 가까이에서 (하이드로포빈의) 매우 얇은 층이 검출가능했다.
c) H*단백질 A 및 암피실린+설박탐(Unacid? Pfizer Pharma)으로 코팅된 스텐트
H*단백질 A만으로 코팅된 스텐트와 비교했을 때 보다 높은 배율에서 조차 부착 재료의 감소에 대한 징후는 없었다. 반면에, 박테리아의 양이 일부 스텐트 세그먼트상에서 다소 현저한 것으로 나타났다.
d) H*단백질 A 및 레보플록사신(Tavanic? Sanofi-Aventis)으로 코팅된 스텐트
스텐트의 주사 전자 현미경 연구는 암피실린+설박탐으로 코팅된 스텐트와 어떠한 차이도 나타내지 않았다. 따라서 이러한 그룹에서는 H*단백질 A만으로 코팅된 스텐트와 차이가 없는 것으로 여겨졌다.
e) H*단백질 A - 헤파린(농도: 50 U/ml, 500 U/ml 및 5000 U/ml)으로 코팅된 스텐트
H*단백질 A와 최저 농도의 헤파린으로 코팅된 스텐트는 H*단백질 A 만으로 코팅된 스텐트와 유사한 주사 전자 현미경 조사 결과가 얻어졌다. H*단백질 A와 최고 농도의 헤파린으로 코팅된 스텐트는 최저량의 부착 재료를 갖는 스텐트로서 나타났다. H*단백질 A와 중간 농도의 헤파린으로 코팅된 스텐트 또한 우수한 결과를 보여주었다.
이러한 실험들은 시험관내 모델에서 하이드로포빈 H*단백질 A를 이용한 플라스틱 스텐트의 코팅이 비코팅된 플라스틱 스텐트와 비교해서 부착 재료의 감소를 유도함을 보여준다. 고농도의 헤파린과 하이드로포빈의 커플링은 부착 진행을 더욱 감소시켰다.
플라스틱 스텐트가 소수성 표면을 가지기 때문에, 하이드로포빈을 이용한 코팅 후, 이들의 표면은 친수성이 된다.
이러한 특성은 막힘 진행의 방해와 관련하여 담도 플라스틱 관내인공삽입물(endoprostheses)의 표면을 최적화하는데 유망하다. 특히 유용한 하이드로포빈 중 하나는 문헌에 기재된 H*단백질 A이다. 또한, 이러한 H*단백질 A에 약물을 커플링할 수 있다.
시험관내 모델에서 부착 감소를 유도하는 기전이 연구되었다. 최근의 주사 전자 현미경 연구에서, 상이한 스텐팅 간격 후 담도 및 췌장 스텐트의 매우 균일한 막힘 패턴이 확인되었다. 막힘 과정에서 중요한 사건은 내부 스텐트 표면으로 작은 실의 부착과 이러한 작은 실에 의한 막힘 재료의 안정화이다. 스텐트의 코팅에 대한 시험관내 연구는 부착 재료 양의 감소를 유도했다.
하이드로포빈으로 고농도 헤파린의 커플링은 부착 재료를 감소시키는 것으로 확인되었다. 이는 동물 실험에서 확인될 수 있다.
스텐트 개방성을 개선하기 위해, 다양한 유형의 플라스틱이 연구되어져 왔다. 친수성 하이드로머(hydromer) 코팅 및 겉으로 보기에 평탄한 표면을 갖는 플라스틱 스텐트 조차 연장된 스텐트 개방성을 유도하지 못했다. 사이드홀(sidehole)이 스텐트 막힘을 촉진하는 것으로 추측되어져 왔지만 사이드홀이 없는 스텐트(Tannenbaum 스텐트)의 경우에도 동일한 결과가 얻어졌다.
본 발명에 따른 조성물로 처리된 스텐트는 평탄한 표면을 가지고 연장된 스텐트 개방성을 유도한다.

Claims (15)

  1. 하나 이상의 하이드로포빈 유도체 (H)를 포함하는 조성물로 이식형 구조체 (I)의 표면을 처리하는 단계를 포함하는, 이식형 구조체 (I)의 코팅 방법.
  2. 제1항에 있어서, 이식형 구조체 (I)는 스텐트이고, 표면을 하나 이상의 하이드로포빈 유도체 (H) 및 하나 이상의 추가 성분 (F)을 포함하는 조성물로 처리하는 것을 특징으로 하는 방법.
  3. 제1항 또는 제2항에 있어서, 조성물은 하나 이상의 하이드로포빈 유도체 (H), 물, 및 잠재적으로 추가 성분 (F)을 포함하고, 하이드로포빈 유도체(H)의 양은 전체 조성물을 기준으로 0.0001 내지 20 중량%인 것인 방법.
  4. 제1항 내지 제3항 중 어느 한 항에 있어서, 이식형 구조체 (I)는 하나 이상의 하이드로포빈 유도체 (H), 물, 및 잠재적으로 추가 성분 (F)을 포함하는 조성물로 처리된 스텐트이고, 하이드로포빈 유도체 (H)의 양은 전체 조성물을 기준으로 0.001 내지 10 중량%인 것인 방법.
  5. 제1항 내지 제4항 중 어느 한 항에 있어서, 하이드로포빈 유도체 (H), 물 및 하나 이상의 추가의 약학적으로 활성인 화합물 (D)을 포함하는 조성물을 이식형 구조체 (I)의 표면에 도포하는 것인 방법.
  6. 제1항 내지 제5항 중 어느 한 항에 있어서, 하이드로포빈 유도체 (H), 물, 및 추가의 약학적으로 활성인 화합물 (D)로서 헤파린, 항생제 및 세포증식억제 화합물을 포함하는 군으로부터 선택된 화합물을 포함하는 조성물을 이식형 구조체 (I)의 표면에 도포하는 것인 방법.
  7. 제1항 내지 제6항 중 어느 한 항에 있어서, 사용된 하이드로포빈 유도체 (H)는 융합 하이드로포빈 또는 이의 유도체인 것인 방법.
  8. 제1항 내지 제7항 중 어느 한 항에 있어서, 하나 이상의 하이드로포빈 유도체 (H)를 포함하는 조성물을 4℃ 내지 95℃의 온도에서 0.01 시간 내지 48 시간 동안 이식형 구조체 (I)의 표면에 도포하는 것인 방법.
  9. 하이드로포빈 유도체 (H)로 적어도 부분적으로 처리된 표면을 갖는 코팅된 이식형 구조체 (I).
  10. 제1항 내지 제8항 중 어느 한 항에 따른 방법에 의해 하이드로포빈 유도체 (H)로 적어도 부분적으로 표면 코팅된, 코팅된 이식형 구조체 (I).
  11. 제10항에 있어서, 이식형 구조체 (I)는 스텐트, 특히 담도(biliary) 스텐트인 것인 코팅된 이식형 구조체 (I).
  12. 0.0001 내지 20 중량%의 하이드로포빈 (H) 및 99.999 내지 80 중량%의 추가 성분 (F)을 포함하는, 이식형 구조체 (I)의 코팅을 위한 조성물.
  13. 제11항에 있어서, 조성물은 적어도 0.001 내지 10 중량%의 하나 이상의 하이드로포빈 유도체 (H), 50 중량% 이상의 물 및 잠재적으로 추가 성분 (F)을 포함하는 것인 조성물.
  14. 이식형 구조체 (I)의 코팅을 위한 하이드로포빈 유도체 (H)의 용도.
  15. 스텐트의 코팅을 위한 하이드로포빈 유도체 (H)의 용도.
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