MX2012011056A - Stents revestidos y proceso para revestir con proteina. - Google Patents

Abstract

Un proceso para revestir estructuras implantables, tales como stents, al usar una composición que comprende por lo menos un derivado de hidrofobina (H), agua y mas componentes conduce a implantes usables en periodo largo.

Description

STENTS REVESTIDOS Y PROCESO PARA REVESTIR CON PROTEÍNA DESCRIPCIÓN DE LA INVENCIÓN La invención se refiere á dispositivos médicos revestidos, tales como estructuras implantables, por ejemplo, stents, y a procesos nuevos para revestir estructuras implantables, por ejemplo, stents, y otros dispositivos médicos, con una proteína. La invención también se refiere a procesos para revestir dispositivos médicos, tales como stents, dispositivos .anastpmóticos y envoltura perivascular con una composición que contiene uria proteína particular, hidrofobina, ya sea sola o hidrofobina :e n combinación con otros componentes, tal como heparina. .'·.·.

Un rango amplio '-¿Je estructuras implantables, por ejemplo, stents, es conocido,, en particular stents biliares. Se usan stents de plástico y metal para varios propósitos, pero no hay disponibles stents de alta calidad con bajo costo de producción, función permanente y fácil manejó de uso e intercambio.

La presente, invención se refiere a dispositivos médicos, tales como estructuras implantables (I), que se revisten con hidrofobina y que en una modalidad particular se pueden usar, por ejemplo, para la administración local de un fármaco o combinaciones de fármaco, por ejemplo, para la prevención y tratamiento de enfermedades vasculares. La presente, invención también se refiere a dispositivos médicos, incluyendo sténts, dispositivos anastomóticos, envolturas perivasculares, suturas y grapas siendo revestidas con hidrofobina. Estos dispositivos médicos se pueden usar para tratar y prevenir enfermedades y minimizar o sustancialmente eliminar una reacción biológica del organismo, a la introducción del dispositivo médico al organismo. Además, loa dispositivos revestidos se pueden utilizar para promover sanación y endotelialización.

La presente invención también se refiere a revestimientos para dispositivos médicos, .en particular estructuras ¡mplantables tales como stents. Las presente invención también cubre recubrimientos para controlar las velocidades de elución de fármacos, agentes y/o compuestos de . dispositivos médicos ¡mplantables. La presente invención también se; '¡refiere a sistemas de administración de fármaco para la {administración regional de fármacos, tal como para tratar enfermedad vascular. La presente invención también se refiere a dispositivos médicos revestidos, tales como estructuras ¡mplantables, teniendo una hidrofobina y un fármaco fijo a la misma para tratar enfermedades,. ' Las hidrofobinas 'y los derivados son proteínas pequeñas de alrededor de 100 a 150 aminoácidos, que ocurren en hongos filamentosos tal como Schizophyllum commune. Por lo general tienen 8 unidades de cisteína (Cys) en la molécula. Las hidrofobinas están entre las proteínas más activas en superficie de origen fúngico. Las hidrofobinas contienen, diversas secuencias de aminoácido, que están compartiendo un patrón característico de ocho residuos de Cys en su secuencia primaria al formar cuatro puentes de disulfuro. Los puentes'de disúlfuro formados por residuos de Cys son conocidos por justificar el ensamble controlado en interfaces hidrof ílicas-hidrofóbicas previniendo auto-ensamble espontáneo en solución. Estas proteínas se descubre son importantes para crecimiento aéreo (por ejemplo, bifas aéreas, esporas y cuerpos de fruto tales como champiñones) y para .la fijación de hongos a soportes sólidos. Las hidrofobinas son notoriamente estables y pueden soportar temperaturas cerca del punto de ebullición de agua. Las hidrofobinas se pueden aislar de . recu sos naturales pero también se pueden obtener por medio de métodos recombinantes, como se describe, por ejemplo, n O 2006/0.82¦ 251 o WO 2006/131 564. La técnia anterior ya ha propuesto el uso de varias hidrofobinas para varias aplicaciones. WO 1996/41882 propone el uso de hidrofobinas como emuísores y. espesantes para hidrofilizar superficies hidrofóbicas. También se ha .propuesto usar hidrofobinas como un desemulsor, ver WO 2006/103251, como un retardador de evaporación, ver WO 2006/128877 o .como Un, inhibidor de tierra, ver WO 2006/103215. Un método de deposición ;de derivados de hidrofobina en diferentes superficies, tales como superficies poliméricas de plástico, vidrio, superficies metálicas, naturalmente superficies como piel, algodón y papel, de solución acosa se describe en WO 2006/082253 y EP-A 1 252 516.

La presente invención se refiere al revestimiento de dispositivos médicos con una hidrofobina. Un aspecto particular de la invención se refiere a íin proceso nuevo para revestir una estructura implantable (I) que comprende los pasos de tratar la superficie de la estructura implantable (I) con una composición que comprende por lo menos un derivado de hidrofobina (H).

La invención también se refiere a un proceso para revestir una estructura implantable (I), caracterizado porque la estructura implantable (I), es un: stent y que la superficie es tratada con una composición que comprende por lo menos un derivado de hidrofobina (H) y por lo menos otro' componente (F).

La invención también. se refiere a un proceso para revestir una estructura implantablé.(l), en donde la composición comprende por lo menos un derivado dé: tiidrofobina (H) y agua, y potencialmente más componentes. (F), por lo que la cantidad del derivado de hidrofobina (H), con base en la composición global, es de 0,0001 a 20 por ciento, a menudo de 0,001 a: 10 por ciento en peso. En la superficie de la estructura implantable (I), la cantidad del derivado de hidrofobina a menudo está en el rango de 0,1 a 10 mg/m2.

Más componentes pueden ser, por ejemplo, aditivos poliméricos, solventes, regulador, sustancias farmacéuticamente activas y/o auxiliares. 'El término auxilires abarca un ingrediente farmacéuticamente aceptable, fisiológicamente inactivo tal como un aglutinante, un relleno y un compuesto formador de recubrimiento. Más ejemplos de excipientes auxiliares opcionales son antiadhesivos, conservadores,, deslizantes, lubricantes y absorbentes. Las sustancias .adecuadas son conocidas en la técnica.

A menudo, la composición es una composición a 'base de agua. La invención también se refiere a un proceso para revestir una estructura implantable (I) en donde la estructura implantable (I) es un stent que es tratado con una composición que comprende por lo menos un derivado de" hidrofobina (H), agua y potencialmente más componentes '(F), por lo. que la cantidad del derivado de hidrofobina(H), con basé en la composición global, es de 0,001 a 10 por ciento en pesó.

La invención tamb én se refiere a un proceso para revestir una estructura implantable .(I) en donde una composición se aplica a la superficie dé la estructura implantable (I) que comprende el derivado de hidrofobina ( H }, ;agua y por lo menos un compuesto farmacéuticamente activo (D). El proceso puede abarcar más pasos tales como pasos de limpieza y riego. La invención también se refiere a un proceso pata revestir una estructura implantable (I) en donde una composicion'.-es aplicada a la superficie de la estructura Implantable (I) que comprende el derivado de hidrofobina (H), agua y como otro componente 'farmacéuticamente activo (D) uno o varios compuestos a partir del'..; grupo que comprende heparina, antibióticos (tales como ampicilina o sulbactam o levofloxacina) y compuestos citoestáticos (tales como alquilantia, anti-metabolitos, inhibidores de mitosis u hormonas). La combinación de hidrofobina y heparina y sus derivados (tal como enoxaparina) es de interés particular. Más ejemplos son composiciones comprendiendo una hidrofobina y un derivado de cumarina, tal como Warfarin, Phenprocoumon o Ethylbiscoumacetat. El compuesto farmacéuticamente activo (D) también se puede ligar químicamente a la hidrofobina.

La invención también se refiere a un proceso para revestir una estructura ¡mplantable. (I) en donde el derivado de hidrofobina (H) usado es una hidrofobina de fusión o un derivado de la misma. La invención también se refiere a un proceso para revestir una estructura ¡mplantable (I)' en donde la composición que comprende por lo menos un derivado de hidrofobina (H) se aplica a la superficie de la estructura ¡mplantable (I) a una temperatura de 4°C a 95°C, en particular 20°C a 90°C; d urante un periodo de tiempo de 0,01 hora a 48 horas, en particular 0,1 a .20 horas, a menudo de 1 a 10 horas.

Otro aspecto de. vesta" invención es la estructura ¡mplantable revestida ( I ) co n una su perf icie por lo menos parcialmente tratada con un derivado de hidrofobina (H).

La invención también se refiere a una estructura ¡mplantable revestida (I) que es ; por lo menos parcialmente revestida en superficie con un derivado de hidrofobina (H) por un proceso como se describió antes.

La invención también se refiere a una estructura ¡mplantable revestida (I) en/ donde Ja estructura ¡mplantable (I) es un stent, en particular un stént biliar.

Un objeto adicional de la invención es proveer una composición para el revestimiento de estructuras implantables (I), en donde la composición comprende con base en la composición total 0,0001 a 20 por ciento en peso de hidrofobina (H) y 99,999 a 80 por ciento en peso de más componentes (F). Como otro componente, a menudo se usa el agua de solvente.¦¦ La invención también se refiere a una composición para el revestimiento de estructuras implantables (I) en donde la composición comprende- por lo menos 0,001 a 10 por ciento en peso de por lo meos un derivado de hidrofobina (H), por lo meons 50 por ciento en peso de agua y potencialmente más componentes (F). Otro aspecto es el uso de . -.un derivado de hidrofobina (H) para el revestimiento de. una estructura implantable (I), en particular de un stent. ' ; : Varios tipos de dispositivos médicos tales como las estructuras implantables ' )¦) a menudo se revisten antes de usarse. Como un ejemplo de estructuras implantables, se usan stents biliares para tratar obstrucciones q ue ocurren en los ductos biliares. La bilis es una sustancia que ayuda a digerir grasas y es producida por el hígado, secretada a travos de los ductos biliares y almacenada en la vesícula. Se libera en el intestino delgado después de haber comido un alimento con .'grasa...Hay un número de condiciones, malignas o benignas, que pueden causar contracciones del ducto biliar. El cáncer pancreático es una causa maligna común, cánceres de la vesícula, ducto biliar, hígado e intestino grueso son más ejemplos. Las causas no cancerosas de contracción de ducto biliar incluyen daño a los ductos biliares durante la cirugía para eliminación de vesícula, pancreatitis (inflamación del páncreas), colangitis esclerosante primaria (una inflamación de los ductos biliares), cálculos, terapia de radiación y lesión con elemento contundente al abdomen. ·-.."· Un stent biliar a menudo es una estructura delgada de tipo tubo que se puede revestir eri la superficie y que se usa para soportar una parte estrechada del ducto biliar y prevenir la reformación de contracción. Los stents.-se pueden hacer, por ejemplo, de plástico o metal. Los dos métodos más comunes usados para colocar un stent biliar son colangiopancreotograf ía retrógrada endoscópica (ERCP) y colangiografía transhepática percutánea (PTC). Para ambos métodos, puede ser ventajoso usar dispositivo revestidos. La ERCP es una técnica de escaneo . usada, para diagnosticar enfermedades del páncreas, hígado, vesícula y ductos biliares que también tiene la ventaja de usarse como un dispositivo terapéutico. El endoscopio es un tubo delgado, iluminado,' amarillo fijado a una pantalla para ver y se puede insertar en la .boca de un paciente, por el esófago, a través del estómago., y en la piarte superior del intestino delgado, hasta que alcanza el sitio en don'dé los ductos biliares se vacían. En este punto un tubo pequeño llamado una cánula se inserta a través del endoscopio y se usa para inyectar un tinte de contraste en los ductos. Una serie de ra.yos x entonces es tomada conforme el tinte se mueve a través de :lo's ductos. Si los rayos x muestran que existe una contracción biliar, se puede colocar un stent revestido en un ducto para mitigar la obstrucción. A fin de hacer estp, se insertan instrumentos especiales en el endoscopio y se realiza una esfinterotomía para proveer acceso a los ductos biliares. En algunos casos, la contracción biliar primero se puede dilatar usando un tubo delgado, flexible'. llamado- catéter, seguido por un dispositivo de tipo globo que se infla. El ste'nt revestido después se inserta en el ducto biliar. El otro método para aplicar stents revestidos, cplangiograf ía transhepática pe cutánea o PTC, es similar a ERCP en cuanto a que la prueba se usa'para diagnosticar y tratar obstrucciones que afectan el flujo de bilis desde el hígado al tracto gastrointestinal. Se usa una aguja delgada para inyectar un tinte de contraste a través de la piel y en el hígado o vesícula. Sé toman fotografías de rayos X conforme el tinte se mueve a través de los ductos biliares. Si una contracción biliar se hace evidente, entonces se puede colocar un stent revestido. Se introduce una aguja hueca en el ducto biliar, y un cable de guía delgado insertado en.la aguja.

El cable es guiado al área de obstrucción y el stent revestido es avanzado sobre el cable y colocado en el ducto obstruido.

También 'se pueden usar stents en otros campos médicos.

Muchos individuos; .sufren de enfermedad circulatoria causada por un bloqueo progresivo de los vasos sanguíneos que perfunden el corazón y otros .órganos/principales. Más bloqueo severo de vasos sanguíneos a menudo conduce a hipertensión, daño isquémico, embolia o infarto' al miocardio. Las lesiones ateroscleróticas son una causa principal de enfermedad del corazón isquémico. La angioplastía coronaria tránsluminal percutánea es un procedimiento médico cuyo propósito . es aumentar el flujo sanguíneo a través de una arteria. La angioplastía coronaria translumina percutánea es el tratamiento predominante para estenosis de vaso coronario. Una limitación asociada '..con angioplastía coronaria transluminal percutánea es el cierre abrupto del vaso, lo que puede ocurrir inmediatamente después del procedimiento y restenosis, que ocurre gradualmente después-.del procedimiento.

Se han probado numerosos agentes con stents como acciones anti-proliferantes en restenosis y han mostrado alguna actividad en modelos animales experimentales. Algunos agentes que han sido mostrados por reducir . con éxito el grado de hiperplasia íntima en modelos animales incluyen heparína y fragmentos de heparina, taxol, inhibidores de enzima....que convierten angiotensina, angiopeptina, ciclosporina A, terbinafina, interferon-gamma, rapamicina, esteroides, oligonucleótidos anti-sentido y vectores genéticos. También se pueden usa;r. stents revestidos para reducir restenosis.

Estos stents revestidos a menudo son tubos de metal ranurados expandibles con globo (por ejemplo, acero inoxidable), que cuando se expanden dentro:, . del lúmen de una arteria coronaria angioplastiada proveen :.soporte estructural a través de andamiaje rígido a la pared artérial. Este soporte es útil para mantener la permeabilidad de lumen de vaso. Se puede mostrar el éxito angiográfico aumentado de estos stents revestidos después de angioplastía coronaria .transluminal percutánea. Adícionalmente, el revestimiento de stértts con hidrofobina y finalmente más compuestos, tales como'1 heparina y sus derivados, parece tener el beneficio agregado de producir una reducción en trombosis subaguda después de la implantación de stent. El revestimiento de stents con hidrofobina y he pa riña '"(y finalmente otros compuestos) puede tener utilidad clínica; El uso de stents revestidos con hidrofobina también se descubrió ser una manera de administración de fármaco locai. La manera en la cual el fármaco particular (o combinación de fármaco) se fija al dispositivo de administración local, por ejemplo, el stent, juega un rol en la eficacia de este tipo de tratamiento.

Una manera típica de conformidad con la invención es fijar químicamente la molécula de fármaco a la proteína hidrofobina que es revestida en la superficie del dispositivo. El proceso y materiales utilizados para fijar el 'ármaco (o combinación de fármaco) al stent no debe interferir con.; las: /operaciones del fármaco. Además, los procesos y ;.'.·· materiales utilizados deben ser biocompatibles y mantener el fármaco o' combinación de fármaco en el dispositivo local a través de la -administración y sobre un periodo de tiempo largo. Se necesitan s.tents revestidos en especial con proteína que se pueden usar como dispositivos de administración local para la prevención y. tratamiento de enfermedades, tal como daño vascular.

Se ha propuesto; una variedad de métodos para revestimiento de stent y composiciones. Los revestimientos pueden ser capaces por sí mismos de reduc.ir el estímulo que el stent provee a la parte dañada (por ejemplo, p;ared de lumen), así reduciendo la tendencia hacia trombosis o. restenosis. Alternamente, el revestimiento puede administrar un fármaco farmacéutico. El mecanismo para administrar ¦;·:·. 12 el fármaco es, por ejemplo, a través de difusión del agente a través de un polímero . de volumen o a través de poros que son creados en la estructura . p o I i méri.ca , o por erosión de un revestimiento biodegradable. El compuesto de fármaco también puede ser revestido en la superficie.del stent al usar la proteína hidrofobina .

Las composiciones tanto bioabsorbibles como bioestables han sido registradas como materiales de revestimiento para stents. Los revestimientos poliméricos pueden encapsular un fármaco farmacéutico. Otras maneras de unir dicho agente a la superficie son conocidas, por ejemplo, stents revestidos con heparina. Estos revestimientos se aplican al stent en un número de maneras, incluyendo procesos de revestimiento por sumersión, aspersión o hilatura. Una clase de .'materiales poliméricos bioestables que se ha registrado como revestimie-nto para stents es homopol imeros de polifuoro. Se han usá.do homopol imeros de politetrafluoroetileno (PTFE) como implantes .por muchos años. Estos homopol imeros no son solubles en.ningúh'solve.nte a temperaturas razonables y por lo tanto son difíciles de revestir en dispositivos médicos pequeños al mismo tiempo manten rendo características importantes de los dispositivos (por ejemplo, ranuras en stents). Se han sugerido stents con revestimientos hechos de homopolímeros de polivinilideno-fluoruro y que contienen agentes o fármacos farmacéuticos/-terapéuticos para liberar: Sin embargo, son difíciles de aplicar como películas de alta calidad sin someterlas a temperaturas relati amente altas.

Ahora sé descubrió ser ventajoso desarrollar revestimientos para estructuras implacables que contienen hidrofobina o derivados de la misma.

Estos revestimientos se pueden aplicar a la superficie del dispositivo médico al usar composiciones que contienen hidrofobina. Estos revestimientos s pueden aplicar a dispositivos médicos implantables que pueden incluir, pero no requieren, el uso de agentes o fármacos farmacéuticos. Estos dispositivos revestidos poseen propiedades físicas y mecánicas efectivas para usarse. Puede ser ventajoso usar los dispositivos médicos revestidos en combinación con, fármacos que tratan enfermedad y minimizan o sustancialmente eliminan una reacción de organismos vivos a la implantación del dispositivo médico. En ciertas circunstancias, es ventajoso desarrollar dispositivos médicos revestidos con hidrofobina en combinación con fármacos, tal como heparina, que promueven sanación de herida y enoOtelialización del dispositivo médico.

En el contexto . de 'ía presente invención, el término "hidrofobinas":. o "derivados de hidrofobina" se puede entender que significan en particular poli péptidos de la fórmula estructural general (I ) ¾ .

XN-C -X1.50-C - X 1.1 O Ó,- C -Xi-ioo-C5-Xi.5o-C6-Xo-5-C7-Xi.5o-C8-Xm (I) en donde X puede ser cualquiera de los 20 aminoácidos que ocurren de manera natural (Phe, teu, Ser, Tyr, Cys, Trp, Pro, His, Gln, Arg, Me, Met, Th'r, Asrí, Lys:¡'. Val, Ala, Asp, Glu, Gly). En la fórmula, los radicales X pueden ser los mismos o diferentes en cada caso. Los índices comparado con X son cada uno el número de aminoácidos en la parte-secuencia particular X, C es cisteína, alanina, serina, glicina, metionina o treonina, en donde por lo menos cuatro de los residuos designados cor) C son cisteína, y los índices n y m son cada uno ¡ndependientemen.te números naturales entre 0 y 500, preferiblemente entre. 15 y 300. Los polipéptidos de la fórmula (I) también se caracterizan por la propiedad que, a temperatura ambiente, después de revestir una superficie de vidrio, causan un aumento en el ángulo de contacto de una gota de agua de por lo menos 20°, preferiblemente por lo menos 25° y más preferible 30°, en comparación en cada caso con el ángulo de contacto de una gota de agua igualmente grande con la superficie de vidrio no revestida.

Los aminoácidos, designados con C1 a C8 son preferiblemente cisteínas. Sin embargo, también se pueden reemplazar por otros aminoácidos con relleno, de espacio similar, preferiblemente por alanina, serina, treonina, metionina o glicina.

Sin embargo, por' lo. menos cuatro, preferiblemente por lo menos 5, más preferible., por .lo menos 6 y en particular por lo menos 7 de las posiciones C1 a C8 deben consistir de cisteínas. En las proteínas inventivas, las cisteínas pueden estar presentes en forma reducida o forman puentes de disulfuro entre sí. Se da particular preferencia a la formación intramolecular de puentes de C-C, en especial aquella con al. menos un puente de disulfuro intramolecular, preferiblemente 2, más: preferible 3 y muy preferible 4 puentes de disulfuro intramoleculares. En el caso del intercambio antes descrito de cisteínas para aminoácidos con relleno de espacio similar, dichas posiciones C se intercambian de manera ventajosa en pares que pueden formar · puentes de disulfuro intramoleculares entre sí. Si también se usan cisteínas, serinas, alaninas, glicinas, metioninas o treoninas en las posiciones designadas con X, la numeración de las posiciones C individuales en las fórmulas generales pueden cambiar de manera correspondiente.

Se da preferencia a usar hidrofobinas de la fórmula general (II) Xn-C'-X3.25"C2-Xo-2-C3-X5 : 5 o -C4-X2-35-C5-X2-i5-C6-Xo.2-C7-X3.35-C8-Xm (II) para ejecutar la presente invención, en donde X, C y los índices comparados con X y C son cada uno como se definió antes, los índices n y m son cada uno números ;entre.O y 350, preferiblemente de 15 a 300, y las proteínas ad ¡ c io n al m e nt . m u es tr.a n el cambio ilustrado antes en ángulo de contacto y, además, por lo: menos 6 de los residuos designados con C son cisteina. Más' preferible, todos los residuos C son cisteína.

Se da particular .. preferencia a usar hidrofobinas -de la fórmula general (III) Xn-C1-X5-g-C2-C3-Xi 1 - 39-C4-X2-23- C5-X5-9 - C6 - C7-Xe - 18" C8-Xm ( I ) en donde X, C y los índices comparados con X son cada uno como se definió antes, los índices; 'n y m son cada uno números entre 0 y 200, y las proteínas muest an adición a. mente el cambio ilustrado antes en ángulo de contacto, y las proteínas . muestran adicionalmente el cambio antes ilustrado en ángulo de contacto, y por lo menos 6 de los residuos designados con C .son cisterna . Más preferible, todos los residuos C son cisteína. Los residuos Xn y Xm pueden ser secuencias de péptido que naturalmente se juntan a., una hidrofobina. Sin embargo, un residuo o ambos residuos pueden ^ ser también secuencias de péptido que naturalmente no se juntan a una hidrofobina.

También se entiende que esto significa aquellos residuos X y/ o Xm en donde una secuencia de péptido que ocurre de manera natural en una hidrofobina se alarga por una secuencia de péptido que no ocurre de manera natural en una hidrofobina.

Si Xn y/o Xm son secuencias de péptido que no se unen de manera natural a hidrofobinas, dichas secuencias por lo general son al menos 20, preferiblemente al menos 35 aminoácidos en longitud. Por ejemplo, pueden ser secuencias de.' '.20 a 500, preferiblemente de 30 a 400 y más preferible 35 a 100 aminoácidos. Dicho residuo que no se junta de manera natural a una hidrofobina también será referida en lo sucesivo como una pareja de fusión. Esto debe expresar que las proteínas pueden consistir de por lo menos una porción de hidrofobina y una porción de pareja de fusión que no ocurren juntos en esta forma en naturaleza. Las hidrofobinas de fusión compuestas de pareja de fusión y porción de hidrofobina se describen,; por ejemplo, en WO 2006/082251 , WO 2006/082253 y WO 2006/131564.

La porción de pareja de fusión se puede seleccionar a partir de una multitud de proteínas. Es posible que sólo una pareja de fusión individual se una a la porción de hidrofobina, o también es posible que una pluralidad de parejas de fusión se junten a una porción de hidrofobina, por ejemplo, en la terminal á mi no (X„) y en la terminal carboxilo (Xm) de la porción de hidrofobina. :S:n embargo, también es posible, por ejemplo, que dos parejas de fusión .sé unan a una posición (Xn o Xm) de la proteína inventiva. Las parejas dé. fusión particularmente adecuadas son proteínas que ocurren de manera natural en microorganismos, en especial Escherischia coli o Bacil.kis subtilis. Ejemplos de dichas parejas de fusión son las secuencias yaad.(SEC ID NO: 16 en WO 2006/082251 ), yaae (SEC ID NO: 18 en WO 2006/082251 ), ubiquitina y tioredoxina.

También son muy adecuados los fragmentos o derivados de estas secuencias que comprenden sólo algunas, por ejemplo de 70 a 99%, preferencialmente de 5 a 50%, y más preferible de 10 a 40% de las secuencias mencionadas, o en donde los aminoácidos individuales o nucleótidos han sido' cambiados comparados con la secuencia mencionada, en cuyo caso los porcentajes cada uno se basa en el número de aminoácidos. En vez de la pareja de fusión completa, puede ser ventajoso usar un res id úo- truncado.

En particular el residuo .truncado puede comprender por lo menos 20, preferiblemente por . lo menos 35 aminoácidos. En otra modalidad preferida, la hidrofobina d fusión, así como la pareja de fusión mencionada cómo uno dé los grupos Xn o Xm o como un constituyente terminal de dicho grupo;, también tienen un tan llamado dominio de afinidad (etiqueta de afinidad/cola de afinidad). En una manera conocida en princi io, esto comprnde grupos de ancla que pueden interactuar con grupos complementarios. "particulares y pueden servir para elaboración y purificación de las proteínas. Ejemplos de dichos dominios de afinidad comprenden grupos (fl¡s)k, (Arg)k, (Asp)k, (Phe)k o (Cys)k, en donde k es de 4 a 6. En este caso, . -el, grupo Xn y/o Xm puede consistir exclusivamente de dicho dominio de afinidad, o de lo contrario un radical de Xn o Xm que está no no natural.menteV , unido a una hidrofobina se extiende por un dominio de afinidad term-injal.

Las hidrofobinas usadas de conformidad con la invención también se pueden modificar en ' s'uV secuencia de polipéptido, por ejemplo por glicosilación, acetilación b de lo contrario por entrelazamiento químico, por ejemplo con glutaraidehído. Las hidrofobinas también se pueden entrelazar cón un. p o I i s a c á.'r i d o ,. tal como heparina.

Se descubrió que es ventajoso desarrollar dispositivos revestidos que no están afectando de: manera adversa el revestimiento al implantar el dispositivo médico. Además, dichos dispositivos revestidos con hidrofobina proveen al medico con un medio para posicionar con facilidad y precisión el dispositivo médico en el área objetivo. También se descubrió que es ventajoso desarrollar revestimientos de hidrofobina para dispositivos médicos que permiten el control preciso de la velocidad de elución de un fármaco (tal. como heparina) de los dispositivos médicos.

Los dispositivos revestidos con hidrofobina que proveen la liberación de uno o más agentes que actúan a través de diferentes mecanismos moleculares, afectando la proliferación celular, también son sujeto de la invención.

Para propósitos de prueba, se revistieron stents de plástico biliares comercialmente disponibles ya -sea con hidrofobina sola o con hidrofobina y antibióticos y/o heparinia. Después de un periodo de incubación de 28 días en bilis humana, .'se investigó, si se redujo el material de taponamiento en la superficie de los stents revestidos. Se descubrió que el revestimiento de los stents de plástico con hidrofobina condujo a una reducción significativa del material adherente en la superficie de los stents.

También sé probó-' el: -acoplamiento de ampicilina/sulbactam o levofloxacina a los stents '.revestidos con hidrofobina. El revestimiento de stents de plástico biliares, con hidrofobina o con hidrofobina. y heparina se descubrió ser., un método prometedor para retrasar el proceso de taponamiento.

Si el ajuste c.l iníco requiere colocación de un stent sobre un periodo más largo, a menudo'es necesario intercambio de stent endoscópico, pero el desarrollo de stents biliares revestidos con hidrofobina con velocidades de patencia más largas se .descubrió ser de uso particular. En un modelo in vitro, se probaron diferentes revestimientos de stents de plástico comercialmente disponibles con una hidrofobina. Se descubrió una reducción del proceso de taponamiento. Además, se acoplaron antibióticos y heparina a esta; proteína hidrofobina para mejorar el desempeño de los stents de plástico. El concepto que resultó de los descubrimientos de estudio microscópico electrónico de exploración lo que indicó que hebras pequeñas parecen jugar un Y ol crucial en el proceso de taponamiento.

Ejemplo 1 Para el siguiente estudio, se usaron stents biliares de plástico teniendo con un diámetro de 10 French y una longitud de 8 cm entre aletas ( o I i e t i I en o ,· tipo Co.tton-Leu ng® , Fa. Cook® Medical).

Se colocaron stents: d-'e plástico nativos y revestidos con hidrofobina en bilis humana durante u n p e r i o d o de 28 días. Después, los stents fueron examinados por microscopio electrónico de exploración.

Antes de iniciar el procedimiento de revestimiento, los stents fueron cortados en piezas de 1 cm (adecuadas para microscopio electrónico de exploración final). La modificación de superficie y/o selección de varios activos se realizaron por' un révestimiento con una hidrofobina modificada.

La generación y pío piedad de esta protejan "H*proteína A" se ha descrito en ' ' Wohllebe'n:'. W, - Subkowski T, Bollschweiíer C y otros " Recombinantly¦ produceü hydrophobins from fungal analogues as highly surface-active performance pr.oteins" en Eur Biophys J, 2009.

En los primeros experimentos, se usaron 14 stents naturales. Se revistieron 11 stents por técnicas de revestimiento generales con la proteína hidrofobina (H* .proteína A, BASF SE) y se probaron 3 stents con hidrofobinas (H* proteina A en combinación con ampicilina + sulbactam (Unacid®, Pfizer Pharria). Además, las combinaciones H*proteína A/levof loxacina (Tavanic®, Sanofi-Aventis) y H* proteina A/heparina.

Después de preparar una solución de 10 mg de hidrofobina (H* proteína A/mL agua destilada estéril, la proteína fue diluida a 1 mg/mL en el regulador de revestimiento: 50 mM Tris-HCI pH 8.0, 1 mM CaCI2. Los stents fueron incubados en 1 mL de solución de H* proteína A durante la noche a 80°C, lavados tres veces en agua destilada y secados.

Ejemplo 2 (Detección d e h-i d rpf obi n a en la superficie) El revestimiento de' H* ..proteína A fue detectado por un anticuerpo específico dirigido contra la etiqueta Hexa-His de la proteina: incubación de stents revestidos y no revestidos en 1% de solución de bloqueo (Roche 1921673) en regulador de TTBS (20 mM Tris-HCI pH 7.5, 150 m M . a C ! . 0.05% Tween 20); 1 hora a temperatura ambiente (RT) lavado 3 veces con regulador de TTBS ¦ ' ÷? ¦'. 21 incubación con conjugado de anticuerpo de anti-poli-His-POD (Sigma A7058), dVluido 1:2000 en regulador de TTBS/0.01% BSA (Sigma A7838); 1 hora a RT lavado 2 veces co.ri;'regülador de TTBS - lavado con regulador de TBS (20 mM Tris-HCI pH 7.5, 150 mM NaCI) lavado con;100 m M/Na-acetato pH 4.9 adición de sustrato do peroxidasa: 1 tableta dé sustrato de.TMB (Sigma T5525) en 100 µ? DMSO 10 mL 0.1 M Na-acetato pH 4.9 14.7 ,uL 3% H20 5 minutos de incubación a RT detección a 405 nm.

Ejemplo 3 (Revestimiento de stents de plástico con hidrofobina y heparina) La heparina fue acoplada al revestimiento de H* proteína A de los stents. Una mezcla ce heparina (sal sódica de heparina, Sigma H4784) y el reactivo de; acoplamiento 1 -etil-3-(3-dimetilaminopropil)-carbodlimida (EDC) (Sigraa 7,750) 1 mg/mL en 100 mM regulador de MES (Sigma M2933) pH 4.5 fue preparado de manera fresca. La concentración final de heparina fue 50 U/mL, 500 U/mL y 5000 U/mL. Después de la incubación de los stents a RT durante 2 horas con 1 mL de la solución de; acoplamiento en un rotator la reacción fue detenida por .3 pasos dé .lavado con agua destilada estéril.

Vía el grupo carbtíxilo libre, la heparina fue acoplada a grupos amino de H *·.'·' proteira Á:EDC usada como un agente activador de carboxilo para el a copla miento de aminas primarias para producir enlaces de amida. ;:- Ejemplo 4 (Stents revestidos con H* proteína A y ampicilina + sulbactam (Unacid®, Pfizer Pharma) ;:.

Unacid® se disolvió en agua destilada estéril a una concentración total (ampicilina + sulbactam) de 100 mg/mL. La reacción con H* proteíria A en la superficie de los stents se realizó en agua destilada por la adición de Unacid® a una concentración total final de 100 y de glutardialdehído (Aldrich 34,085-5) en una concentración final de 0.05%. Después de incubación durante la noche a RT, los stents fueron lavados 3 veces con agua destilada estéril. Ampicilina como-uno de los 2 compuestos activos en Unacid® se pudo acoplar bajo 'Jas condiciones de reacción: el grupo amino primario de ampicilina y grupos amino accesibles de la H* proteína A se entrelazan por glutardialdehído.

Ejemplo 5 (Stents revestidos con H* proteína A y levofloxacina (Tavanic®, Sanof i-Aventis) Tavanic® se diluyó-en 100 mM regulador de MES pH 4.5 a una concentración final dé; 1.3 mg/mL y se mezcló con EDC (concentración final i .6 mg/mL). La reacción con - los stentes revestidos con H* prote'ína A se realizó a RT durante 2.5 horas. Finalmente, los stents s:e:lavaron 3 veces con agua destilada estéril.

La levofloxacina se acopló a la H* proteina A por la generación de una amida: grupo carboxilo de levofloxacina entrelazada a grupos amino de H* proteína A por EDC.

Ejemplo 6 (Incubación en bilis humana) Todos los ; stentsv re vestidos fueron almacenados durante 28 días en tubos rellenos con bilis humana (recolectada de drenaje transhepático percutáneo, los pacientes dieron consentimiento informado para el uso de su bilis). Los tubos fueron volteados con una velocidad de 2 rpm (rondas por minuto) al usar un aparato como se muestra en la figura 1.

En esta figura 1 , la abreviación T es un tubo con stent almacenando bilis humano, B es una tabla en movimiento de péndulo lento, E es un motor eléctrico. Este tratamiento en el aparato se hizo para simular el flujo: piliar. La incubación se realizó a una temperatura constante de 37°C.

Ejemplo 7 (Microscopio electrónico de exploración) Después de 28. dúas d.e incubación todos los stents fueron lavados con agua destilada estéril, fijos y almacenados en 4% de glutaraldenido.- regu a do...Después de una serie calificada de alcohol para deshidratación , todas, las muestras se secaron usando un secador de punto crítico,; se pegaron a puntas usando hoja adhesiva y revestir con chisporroteo con 15nm de oro-paladio. Se llevaron a cabo investigaciones ce SEM usando un SEM de emisión de campo Philips con salida; digital;.:.

Primero los descubrimientos de los stents no revestidos se compararon a los stents revestidos con H* proteína A. Después, los stents revestidos con H* proteína A se compararon a los stents revestidos con H* proteína A y el compuesto de fármaco antibiótico o heparina.

Se descubrieron los siguientes resultados: a) Stents no revestidos:, Después del periodo de incubación de 28 días el microscopio electrónico de exploración reveló cantidades similares de material adherente en la superficie interna y externa de los stents no revestidos. Se descubrió que el material es más confluente en la superficie interna de stent, mientras que fue más ondulante en la superficie externa. Los componentes fueron predominantemente material amorfo con cantidades diferentes de bacteria y estructuras pequeñas en la proximidad de bacteria así como independiente de su ocurrencia. b) Stents revestidos con H* proteína A La hidrofobina modificada usada en este estudio consiste de la hidrofobina DewA de Áspergillus nidulans, la proteína de fusión N-terminal yaad y la etiqueta Hexa-His C-terminal. Debido a los anticuerpos específicos.: contra esta secuencia de etiqueta una detección de "tipo westérn blot" de la proteína en la superficie se pudo realizar. La enzima POD (acoplada al anticuerpo) se pudo detectar por la generación de color de un sustrato específico.

Detección de densidad óptica a 405 nm El grado reducid de material adherente comparado con los stents no revestidos se puede observar con magnificación baja por microscopio electrónico de exploración.

Los componentes/demostrados en stents no revestidos están presentes también en lós! stents revestidos (material amorfo, bacteria y estructuras pequeñas en proximidad y distante de la bacteria). Una capa muy delgada (de hjdrofobina) fue detectable cerca de la superficie de stent. c) Stents: '-.revestidos .: con; H* pro teína A y ampicilina + sulbactam (Unacid®, Pfizer Pharm.a) Incluso con magnificación mayor no hubo indicación de material adherente reducido en -comparación con los stents revestidos con H* proteína A sola. Por el contrario, la cantidad de bacteria pareció más bien pronunciada en algunos segmentos de stent. d) Stents revestidos ton H* proteína A y levofloxacina (Tavanic®, Sanofi-Aventis) .: El estudio de microscopio electrónico de exploración reveló ninguna diferencia a los stents revestidos con ampicilina + sulbactam. Por lo tanto, en este grupo pareció no haber diferencia alguna a los stents revestidos con H* proteína A sola también. e) Stents revestidos con H* proteína A - heparina (concentraciones: 50 Ü ml, 5.00 U/ml y 5000 U/ml) los stents revestidos con H* proteína A y la concentración más baja de hepariná tuyo descubrimientos similares microscópicos electrónicos de\ exploración como los stents revestidos con H* proteina A solo's. Los ..stents revestidos con H* proteina A y la concentración más alta de heparina emergió conforme los stents con la menor cantidad de material adherente. Los stents revestidos con H* proteína A y la concentración intermedia de heparina también mostró buenos resultadas.

Los experimentos .muestran que el revestimiento de stents de plástico con la h'idrofobina H* proteina A condujeron a una reducción de material adherente en comparación con stents de plástico no revestidos en el modelo in vitro. El acoplamiento de hidrofobina con heparina en una concentración alta redujo más el proceso de adhesión.

Ya que los stents de plástico tienen una superficie hidrofóbica, después del revestimiento con hidrofobinas su superficie se hace hidrofílíca.

Estas propiedades, están prometiendo optimizar la superficie de endoprostesas plásticas biliares con respecto a la inhibición del proceso de taponamiento. Una de las hidrofobinas útiles particulares es la H* proteína A, descrita en la literatura. Además es posible acoplar fármacos a esta H* proteína A.

Se estudió el mecanismo que condujo a la adhesión reducida en el modelo in vitro. En estudio de microscopio electrónico de exploración reciente, se descubrió un patrón de taponamiento bastante uniforme de stents biliares y pancreáticos después de diferentes intervalos de colocación de stents. Un caso crucial en el proceso de taponamiento es la adhesión de hebras pequeñas a la superficie de 'stent Interna y la estabilización del material de taponamiento por estas hebras pequeñas. El estudio in vitro de revestimientos de los stent s condujo a una reducción de la cantidad de material adherente.

Se descubrió q u e...e I acoplamiento de heparina a la hidrofobina en una concentración 'alta redujo el material adherente. Esto puede confirmarse en experimentos en animales.

Para mejorar la patencia de stents, se han investigado tipos de plástico diferentes. ' Incluso un stent de plástico con hidrómero-revestimiento hidrof Mico; y' uria superficie al parecer lisa no condujo a una patencia.: de stent.' .prolongada. Lo mismo fue cierto para stents sin agujeros laterales (Stent Tannenbaum) ya que los agujeros laterales habían sido sp.spechsos por acelerar taponamiento de stent.

Los stents tratados con una composición de conformidad con la invención tienen superficies lisas y conducen a una patencia de stent prolongada.

Claims (14)

REIVINDICACIONES

1 - Un proceso ·· para el revestimiento de una estructura implantable (l) que comprende el paso de tratar la superficie de la estructura implantable. (I) con una composición que comprende por lo menos un derivado de . h id rof o bina (H) de la fórmula estructural general (I) Xn-C1-Xi.5o-C2-Xo-5_C3-X' ,ioo_C'4-Xi-ioo_C5-Xi.5o-C6-Xo.5_C7-Xi.5o-C8-Xm (I) en donde' X puede ser cualquiera de los 20 aminoácidos que ocurren de manera natural (Phe, Leu, Ser, Tyr, Cys, Trp, Pro, His, Gln, Arg, lie, Met; Thr, As , Lys, Val, Ala, Asp, Glu, Gly), en donde los radicales X pueden ser los mismos o diferentes en cada caso, en donde. los índices comparado con X son cada uno el número de aminoácidos en la parte-secuencia particular X, en donde C es cisterna, alanina, serina, glicina, metionina o treonina, en donde por lo menos cuatro de los residuos designados con C son cisteína, y en donde los índices n y m son cada uno independientemente números naturales entre 0 y 500, y en donde la estructura implantable (I) es un stent.

2.- El proceso para revestir una estructura implantable (I) de conformidad con la reivindicación 1, caracterizado además porque la superficie se trata con una composición que comprende por lo menos un derivado de hidrofobina (H) y por lo menos otro componente (F).

3. - El proceso para revestir una estructura implantable (I) de conformidad con .cualquiera de las reivindicaciones 1 y 2, en donde la composición comprende por lo menos un derivado de hidrofobina (H) y agua, y potencial mente más componentes (F), por lo que la cantidad del derivado de., hidrofobina (H), con base en la composición global, es de 0,0001 a 20. por ciento en peso.

4. - El proceso para, revestir una estructura implantable (I) de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 1 a 3, en donde la estructura implantable; (l) es un stent que es tratado con una composición que comprende por lo menos un derivado de hidrofobina (H), agua y potencialmente más componentes (F), por lo que la cantidad del derivado de hidrofobina (H), con base en la composición global, es de 0,001 a 10- por ciento en peso.

5. - El proceso para: revestir una estructura implantable (I) de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 1 a 4, en donde una composición es aplicada a la superficie de la estructura implantable (I) que comprende el derivado de hidrofobina (H), agua y por lo menos otro compuesto farmacéuticamente activo (D).

6. - El proceso para, revestir una estructura implantable (I) de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 1 a 5, en donde se aplica una composición a la superficie de la estructura implantable (I) qu.e comprende el derivado de hidrofobina (H), agua y como otro compuesto farmacéuticamente activo (D) un compuesto a partir del grupo que consiste de heparina, antibióticos y compuestos citoestáticos .

7. - El proceso para revestir una estructura implantable (I) de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 1 a 6, en donde el derivado de' hidrofobina (H) usado es una hidrofobina de fusión o un derivado, del mismo,

8. - El proceso para revestir una estructura implantable (I) de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 1 a 7, en donde la comp os un derivado de hidrofobi structura implantable (I) a una periodo de tiempo de 0,01 hora a 48 horas. :.

9. - Una estructura implantable revestida (I) con una superficie por lo menos parcialmente tratada con un derivado de hidrofobina (H) de la fórmula estructural general (I) Xn-C -??-50-C -X0-5-C -X1.100-C -X 1.1 oo" C 5-X 1 -50-C 6-Xo-5- C 7-X 1.50- C8-X m (I) en donde X puede ser cualquiera de los 20 aminoácidos que ocurren de manera natural (Phe, Leu, Ser, Tyr, Cys, Trp, Pro, His, Gln, Arg, lie, Met, Thr, Asn, Lys, Val, Ala, Asp, Glu, Gly), en donde los radicales X pueden ser. los mismos o diferentes en cada caso, en donde, los índices comparado con X son cada uno el número de aminoácidos en la parte-secuencia particular X, en donde C es cisterna, alanina, serina, glicina, metionina o treonina, en donde por' lo menos cuatro de los residuos designados con C son cisteína, y en donde, los índices n y m son cada uno independientemente números naturales entre 0 y 500, en donde la estructura implantable (I) es un stent.

10. - Una estructura implantable revestida (I) que es por lo menos parcialmente revestida en superficie con un derivado de hidrofobina (H) por un proceso de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones: 1 a 8 , e n · d o n d e la estructura implantable (I) es un stent.

11. - La estructura mplantable revestida (I) de conformidad con la reivindicación 10, en, donde la estructura implantable (I) es un stent biliar. ,:

12.- Una composición para el revestimiento de estructuras implantables (l),.en don;d;.e la estructura implantable (I) és un stent, y en donde la composición,: comprende 0,0001 a 20 por ciento en peso de hidrofobina (H) de la fórmula estructural general (I) Xn-C1-Xi.5o-C2-Xo.5-C3-Xi.ioo-C -Xi-ioo-C -Xi.5o-C6-Xa-5-C7-Xi.5o-C8-Xm (I) en donde X puede: ser cualquiera de los 20 aminoácidos que ocurren de manera natural (Phe, Leu, Ser, Tyr, Cys, Trp, Pro, His, Gln, Arg, He, Met, Thr, As.n, Lys, Val, Ala, Asp, Glu, Gly), en donde los radicales X pueden ser los mismos o diferentes en cada caso, en donde los índices' comparado con X son cada uno el número de aminoácidos en la parte-secuencia particular X, en donde C es cistéína, alanina, serina, glicina, metionina o treonina, en donde por lo menos cuatro de los residuos designados con C son cisteína, y en donde los índices, n y m son cada uno independientemente números naturales entre 0 y 500, y 99,999 a 80 por ciento en peso de más componentes (F), en donde los otros componentes incluyen agua y por lo menos otro compuesto farmacéuticamente activo (D) a partir del grupo que consiste de heparina, antibióticos y compuestos citoestáticos .

13.- La composición, de conformidad con la reivindicación 12, en donde la composición- comprende por lo menos 0,001 a 10 por ciento en peso de' por lo menos un derivado de hidrofobina (H).

14.- Uso de un derivado de hidrofobina (H) de la fórmula estructural general (I) :-; Xn-C -Xi_5o-C - X o -5- C 3-X i . i oó5" C -Xi-ioo"C -Xi-5o-C6-Xo-5-C7-Xi_5o-C8-Xm (') en donde X puede ser cualquiera de los 20 aminoácidos que ocurren de manera natural (Phe, Leu, Ser, Tyr, Cys, Trp, Pro, His, Gln, Arg, Me, Met, Thr, Asn, Lys, Val, Ala, Asp, Glu, Gly), en donde los radicales X pueden ser los mismos o diferentes en cada caso, en donde los índices comparado con X son cada uno el número de aminoácidos en la parte-secuencia particular X, en donde C es ci.steína, alanina, se riña, glicina, metionina o treonina, en donde por.-lo menos cuatro de los residuos designados con C son cisteína, y en donde los índices n y m son cada uno independientemente números naturales entre.0 y 500, para el revestimiento de un stent. RESUMEN DE LA INVENCIÓN Un proceso para revestir estructuras implantables, tales como stents, al usar: una composición que comprende por lo menos un derivado de hidrofobiriá (H), agua y más componentes conduce a implantes usables en periodo largo.