BR112013003035B1 - Método para aumentar resistência à ferrugem de soja,método para produzir uma planta transgênica de soja emétodo para produzir um produto - Google Patents

Abstract

método para aumentar resist~encia a ferrugem de feijão-soja em plantas e/ou células de planta, construto de vetor recombinante, planta de soja transgênica, método para a produção de uma planta transgênica que tem resistência aumentada contra ferrugem de feijão-soja, partes colhíveis de uma planta, produto derivado de uma planta e método para a produção de um produto. a presente invenção refere-se a um método de aumento de resistência contra ferrugem de feijão-soja em plantas transgênicas e/ou células de planta. nessas plantas, o teor e/ou a atividade de um proteína de adr-1 é aumentada em comparação com as plantas de tipo selvagem que não incluem um gene de adr-1 recombinante.

Description

(54) Título: MÉTODO PARA AUMENTAR RESISTÊNCIA À FERRUGEM DE SOJA, MÉTODO PARA PRODUZIR UMA PLANTA TRANSGÊNICA DE SOJA E MÉTODO PARA PRODUZIR UM PRODUTO (51) Int.CI.: C12N 15/82; A01H 1/00; C12N 15/05; C12N 5/04; C12N 5/14.

(30) Prioridade Unionista: 19/08/2010 EP 10173393.9; 19/08/2010 US 61/375,053.

(73) Titular(es): BASF PLANT SCIENCE COMPANY GMBH.

(72) Inventor(es): HOLGER SCHULTHEISS.

(86) Pedido PCT: PCT IB2011053615 de 16/08/2011 (87) Publicação PCT: WO 2012/023099 de 23/02/2012 (85) Data do Início da Fase Nacional: 07/02/2013 (57) Resumo: MÉTODO PARA AUMENTAR RESIST-ENCIA A FERRUGEM DE FEIJÃO-SOJA EM PLANTAS E/OU CÉLULAS DE PLANTA, CONSTRUTO DE VETOR RECOMBINANTE, PLANTA DE SOJA TRANSGÊNICA, MÉTODO PARA A PRODUÇÃO DE UMA PLANTA TRANSGÊNICA QUE TEM RESISTÊNCIA AUMENTADA CONTRA FERRUGEM DE FEIJÃO-SOJA, PARTES COLHÍVEIS DE UMA PLANTA, PRODUTO DERIVADO DE UMA PLANTA E MÉTODO PARA A PRODUÇÃO DE UM PRODUTO. A presente invenção refere-se a um método de aumento de resistência contra ferrugem de feijão-soja em plantas transgênicas e/ou células de planta. Nessas plantas, o teor e/ou a atividade de um proteína de ADR-1 é aumentada em comparação com as plantas de tipo selvagem que não incluem um gene de ADR-1 recombinante.

1/58 “MÉTODO PARA AUMENTAR RESISTÊNCIA À FERRUGEM DE SOJA, MÉTODO PARA PRODUZIR UMA PLANTA TRANSGÊNICA DE SOJA E MÉTODO PARA PRODUZIR UM PRODUTO” [001] A presente invenção refere-se a um método de aumento de resistência contra ferrugem de soja em plantas transgênicas e/ou células vegetais. Nessas plantas, o teor e/ou a atividade de uma proteína ADR-1 são aumentados em comparação com as plantas de tipo selvagem que não incluem um gene de ADR-1 recombinante.

[002] Ademais, a invenção se refere a plantas transgênicas e/ou células vegetais que têm uma resistência aumentada contra ferrugem de soja e a vetores de expressão recombinantes que compreendem uma sequência que é idêntica ou homóloga a uma sequência que codifica um gene de ADR-1 funcional ou fragmentos do mesmo.

[003] O cultivo de plantas de cultura agrícola serve principalmente para a produção de gêneros alimentícios para humanos e animais. As monoculturas em particular, as quais são a regra atualmente, são altamente suscetíveis a uma disseminação similar a epidemia de doenças. O resultado é rendimentos reduzidos acentuadamente. Até o presente momento, os organismos patogênicos têm sido controlados principalmente usando-se pesticidas. Atualmente, a possibilidade de modificar diretamente a disposição genética de uma planta ou patógeno também está aberta ao homem.

[004] Resistência geralmente significa a capacidade de uma planta de evitar, ou pelo menos encurtar a infestação e colonização por um patógeno prejudicial. Os mecanismos diferentes podem ser discernidos na resistência de ocorrência natural, com a qual as plantas afastam colonização por organismos fitopatogênicos. Essas interações específicas entre o patógeno e o hospedeiro determinam o curso de infecção (Schopfer e Brennicke (1999) Pflanzenphysiologie, Springer Verlag, Berlin-Heidelberg, Alemanha).

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2/58 [005] Com relação à resistência específica por raça, também chamada de resistência de hospedeiro, uma diferenciação é feita entre interações compatíveis e incompatíveis. Na interação compatível, uma interação ocorre entre um patógeno virulento e uma planta suscetível. O patógeno sobrevive, e por acumular estruturas de reprodução, enquanto que o hospedeiro, em sua maior parte, morre. Por outro lado, uma interação incompatível ocorre quando o patógeno infecta a planta, mas é inibido em seu crescimento antes após desenvolvimento fraco de sintomas. No caso anterior, a planta é resistente ao respectivo patógeno (Schopfer e Brennick, consulte supra). Entretanto, esse tipo de resistência é específica para uma determinada cepa ou patógeno.

[006] Em ambas as interações compatíveis e incompatíveis uma reação específica e defensiva do hospedeiro para o patógeno ocorre. Na natureza, entretanto, essa resistência é frequentemente superada por conta do desenvolvimento evolucionário rápido de novas raças virulentas dos patógenos (Neu et al. (2003) American Cytopathol. Society, MPMI 16 No. 7: 626 a 633).

[007] A maioria dos patógenos são específicos por espécie de planta. Isso significa que um patógeno pode induzir uma doença em uma determinada espécie de planta, mas não em outra espécie de planta (Heath (2002) Can. J. Plant Pathol. 24: 259 a 264). A resistência contra um patógeno em determinada espécie de planta é chamada de resistência de não hospedeiro. A resistência de não hospedeiro oferece proteção permanente, ampla e forte contra fitopatógenos. Os genes que fornecem resistência de não hospedeiro fornecem a oportunidade de uma proteção permanente, ampla e forte contra determinadas doenças em plantas não hospedeiras. Em particular tal resistência funciona para cepas diferentes do patógeno.

[008] Os fungos são distribuídos mundialmente.

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Aproximadamente 100.000 espécies fúngicas diferentes são conhecidas até o presente momento. As ferrugens são de grande importância. Elas podem ter um ciclo de desenvolvimento complicado com até cinco estágios de esporo diferentes (espermátia, aecidioesporo, uredosporo, teleutosporo e basidiósporo).

[009] Durante a infecção das plantas por fungos patogênicos, fases diferentes são geralmente observadas. As primeiras fases da interação entre fungos fitopatogênicos e suas plantas hospedeiras potenciais são decisivas para a colonização da planta pelo fungo. Durante o primeiro estágio da infecção, os esporos se tornam fixados à superfície das plantas, germina e o fungo penetra na planta. Os fungos podem penetrar na planta por meio de portas existentes, tais como estômato, lenticelas, hidatódios e ferimentos, ou então penetram na epiderme da planta diretamente como o resultado da força mecânica e com o auxílio de enzimas digestoras de parede celular. As estruturas de infecção específicas são desenvolvidas para penetração da planta. A ferrugem de soja Phakopsora pachyrhizi penetra diretamente na epiderme da planta. Após cruzar a célula epidérmica, o fungo atinge o espaço intercelular do mesófilo, em que o fungo começa a disseminar através das folhas. Para adquirir nutrientes o fungo penetra células de mesófilo e desenvolve haustório dentro da célula de mesófilo. Durante o processo de penetração a membrana plasmática da célula de mesófilo penetrada permanece intacta. Portanto, o fungo de ferrugem de soja estabelece uma interação biotrófica com a soja.

[010] Os fungos fitopatogênicos biotróficos, tal como muitas ferrugens, dependem para sua nutrição do metabolismo de células vivas das plantas. Os fungos fitopatogênicos necrotróficos dependem para sua nutrição de células mortas das plantas. Ferrugem de soja ocupou uma posição intermediária, visto que penetra a epiderme diretamente, na qual a célula

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4/58 penetrada se torna necrótica. Após a penetração, o fungo altera para um estilo de vida biotrófico obrigatório. O subgrupo dos patógenos fúngicos biotróficos que segue essencialmente tal estratégia de infecção, para os propósitos da presente invenção, será chamado de heminacrotrótico.

[011] A ferrugem de soja se tornou cada vez mais importante em recentemente. A doença pode ser causada pelas ferrugens patogênicas Phakopsora pachyrhizi (Sydow) e Phakopsora meibomiae (Arthur). Elas pertencem à classe Basidiomycota, ordem Uredinales, família Phakopsoraceae. Ambas as ferrugens infectam um espectro amplo de plantas hospedeiras leguminosas. P. pachyrhizi, também referida como Ferrugem asiática, é o patógeno mais agressivo em soja (Glicina max), e é, portanto, pelo menos atualmente, de grande importância para agricultura.

P. pachyrhizi pode ser encontrada em quase todas as regiões de cultivo de soja subtropicais e tropicais do mundo. P. pachyrhizi tem capacidade de infectar 31 espécies de 17 famílias das Leguminosas sob condições naturais e tem capacidade de proliferar em 60 espécies adicionais sob condições controladas (Sinclair et al. (eds.), Proceedings of the rust workshop (1995), National SoyaResearch Laboratory, Publication No. 1 (1996); Rytter J.L. et al., Plant Dis. 87, 818 (1984)). P. meibomiae foi encontrada na Bacia Caribenha e em Porto Rico, e não causou danos substanciais ainda.

[012] P. pachyrhizi pode, atualmente, ser controlado no campo somente por meio de fungicidas. As plantas de soja com resistência ao espectro inteiro dos isolados não estão disponíveis. Quando se procura por plantas resistentes, quatro genes dominantes Rpp1-4, os quais mediam resistência de soja a P. pachyrhizi, foram descobertos. A resistência foi perdida rapidamente, conforme P. pychyrhizi desenvolve novas raças virulentas.

[013] Nos últimos anos, doenças fúngicas, por exemplo,

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5/58 ferrugem de soja, ganhou em importância como praga em produção agrícola. Existiu, portanto, uma demanda na técnica anterior para desenvolver métodos para controlar fungos e para fornecer plantas resistentes a fungos.

[014] Muita pesquisa foi realizada no campo de oídio e míldio que infetam a camada epidérmica de plantas. Entretanto, o problema para lidar com ferrugem de soja a qual infecta o mesófilo permanece não resolvido.

[015] Surpreendentemente os inventores observaram que a superexpressão do gene de ADR-1 de Arabidopsis aumenta a resistência contra ferrugem de soja.

[016] O objetivo da presente invenção é fornecer um método de aumento de resistência contra ferrugem de soja em plantas transgênicas e/ou células vegetais transgênicas. Um objetivo adicional é fornecer plantas transgênicas resistentes contra ferrugem de soja, um método para produzir tais plantas bem como uma construção de vetor útil para os métodos acima. Esse objetivo é alcançado pela matéria das reivindicações principais. As realizações preferenciais da invenção são definidas pelos recursos das sub-reivindicações.

[017] A presente invenção pode ser compreendida mais prontamente por referência à seguinte descrição detalhada das realizações preferenciais da invenção e os exemplos incluídos no presente documento. Salvo observação em contrário, os termos usados no presente documento devem ser compreendidos de acordo com uso convencional por aqueles de habilidade comum na técnica relevante. Adicionalmente, as definições de termos fornecidos no presente documento, definições de temos comuns em biologia molecular também podem ser encontradas em Rieger et al., 1991 Glossary of genetics: classical and molecular, 5^a Edição, Berlin: SpringerVerlag; e em Current Protocols in Molecular Biology, F.M. Ausubel et al., Eds., Current Protocols, um empreendimento conjunto entre Greene Publishing Associates, Inc. e John Wiley & Sons, Inc., (1998 Supplement). Deve ser

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6/58 compreendido que conforme usado no relatório descritivo e nas reivindicações, “um” ou “uma” podem significar um ou mais, dependendo do contexto no qual é usado. Portanto, por exemplo, referência a “uma célula” pode significa que pelo menos uma célula pode ser utilizada. Deve ser compreendido que a terminologia usada no presente documento é para o propósito de descrever realizações específicas somente não é destinada a ser limitadora.

[018] Por todo esse pedido, várias publicações são referidas. A revelação de todas essas publicações e aquelas referências citadas dentro daquelas publicações sem suas totalidades são ora incorporados a título de referência nesse pedido para descrever mais completamente o estado da técnica para ao qual essa técnica se refere. Técnicas padrão para clonagem, isolamento de DNA, amplificação e purificação, para reações enzimáticas que envolvem DNA ligase, DNA polimerase, endonucleases de restrição e similares e várias técnicas de separação são aquelas conhecidas e empregadas comumente pelas pessoas versadas na técnica. Diversas técnicas padrão são descritas em Sambrook et al., 1989 Molecular Cloning, Segunda Edição, Cold Spring Harbor Laboratory, Plainview, N.Y.; Maniatis et al., 1982 Molecular Cloning, Cold Spring Harbor Laboratory, Plainview, N.Y.; Wu (Ed.) 1993 Meth. Enzymol. 218, Part I; Wu (Ed.) 1979 Meth Enzymol. 68; Wu et al., (Eds.) 1983 Meth. Enzymol. 100 e 101; Grossman e Moldave (Eds.) 1980 Meth. Enzymol. 65; Miller (Ed.) 1972 Experiments in Molecular Genetics, Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor, N.Y.; Old and Primrose, 1981 Principles of Gene Manipulation, University of California Press, Berkeley; Schleif and Wensink, 1982 Practical Methods in Molecular Biology; Glover (Ed.) 1985 DNA Cloning Vol. I e II, IRL Press, Oxford, UK; Hames e Higgins (Eds.) 1985 Nucleic Acid Hybridization, IRL Press, Oxford, UK; e Setlow and Hollaender 1979 Genetic Engineering: Principles and Methods, Vols. 1 a 4, Plenum Press, New York. As abreviações e nomenclatura, quando empregadas, são consideradas

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7/58 padrão no campo e usadas comumente em periódicos profissionais tal como aqueles citados no presente documento.

[019] “Homólogos” de uma proteína englobam peptídeos, oligopeptídeos, polipeptídeos, proteínas e/ou enzimas que têm substituições, deleções e/ou inserções de aminoácido em relação à proteína não modificada em questão e que tem atividade funcional semelhante à proteína não modificada a partir da qual eles são derivados.

[020] “Homólogos” de um ácido nucleico englobam nucleotídeos e/ou polinucleotídeos que têm substituições, deleções e/ou inserções de ácido nucleico em relação ao ácido nucleico não modificado em questão, em que a proteína codificada por tais ácidos nucleicos têm atividade funcional semelhante ou superior à proteína não modificada codificada pelo ácido nucleico não modificado a partir do qual eles são derivados. Em particular, homólogos de um ácido nucleico englobam substituições com base no código de aminoácido degenerativo.

[021] Uma “deleção” se refere à remoção de um ou mais aminoácido de uma proteína ou à remoção de um ou mais ácidos nucleicos de DNA, ssRNA e/ou dsRNA.

[022] Uma “inserção” se refere a um ou mais resíduos de aminoácido ou resíduos de ácido nucleico que são introduzidos no interior de um sítio predeterminado em uma proteína ou no ácido nucleico.

[023] Uma “substituição” se refere à substituição de aminoácido da proteína com outro aminoácido que tem propriedades semelhantes (tal como hidrofobicidade, hidrofilicidade, antigenicidade, probabilidade semelhante de formar ou quebrar estruturas α-helicoidais ou estruturas folha-β).

[024] No nível de ácido nucleico uma substituição se refere a uma substituição de ácido nucleico com outros ácidos nucleicos, em que a proteína codificada pelo ácido nucleico modificado tem uma função

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8/58 semelhante. Em particular, os homólogos de um ácido nucleico englobam substituições com base no código de aminoácido degenerativo.

[025] Substituições de aminoácido são tipicamente de resíduos únicos, mas podem ser agrupadas dependendo das limitações funcionais colocadas na proteína e podem estar na faixa de 1 a 10 aminoácidos; inserções ou deleção serão geralmente da ordem de cerca de 1 a 10 resíduos de aminoácido. As substituições de aminoácido são preferencialmente substituições de aminoácido conservativas. As Tabelas de substituição conservativa são bem conhecidas na técnica (consulte, por exemplo, Creighton (1984) Proteins. W.H. Freeman e Company (Eds) e Tabela 1 abaixo).

Tabela 1: Exemplos de substituições de aminoácido conservado

Resíduo	Substituições Conservatives	Resíduo	Substituições Conservativas
Ala	Ser	Leu	Ile; Val
Arg	Lys	Lys	Arg; Gln
Asn	Gln; His	Met	Leu; Ile
Asp	Glu	Phe	Met; Leu; Tyr
Gln	Asn	Ser	Thr; Gly
Cys	Ser	Thr	Ser; Val
Glu	Asp	Trp	Tyr
Gly	Pro	Tyr	Trp; Phe
His	Asn; Gln	Val	Ile; Leu
Ile	Leu, Val

[026] Substituições de aminoácido, deleções e/ou inserções podem ser feitas prontamente com o uso de técnicas de peptídeo sintético bem conhecidas na técnica, tal como síntese de peptídeo de fase sólida e similares, ou por manipulação de DNA recombinante.

[027] Os métodos para a manipulação de sequências de DNA para produzir variantes de substituição, inserção ou deleção de uma proteína são bem conhecidos na técnica. Por exemplo, técnicas para produzir mutações de substituição em sítio predeterminados em DNA são bem conhecidas por aqueles versados na técnica e incluem mutagênese de M13, mutagênese in vitro de gene T7 (USB, Cleveland, OH), mutagênese direcionada por sítio de

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QuickChange (Stratagene, San Diego, CA), mutagênese direcionada por sítio mediada por PCR ou outros protocolos de mutagênese direcionada por sítio.

[028] Ortólogos e parálogos englobam conceitos evolucionários usados para descrever as relações ancestrais de genes. Parálogos são genes dentro da mesma que se originaram da duplicação de um gene ancestral; ortólogos são genes de organismos diferentes que se originaram da especiação e também são derivados de um gene ancestral em comum.

[029] O termo domínio se refere a um conjunto de aminoácidos conservados em posições específicas ao longo de um alinhamento de sequências de proteínas relacionadas evolucionariamente. Enquanto que aminoácidos em outras posições podem variar entre homólogos, aminoácidos que são altamente conservados em posições específicas indicam aminoácidos que provavelmente são essenciais na estrutura, estabilidade ou função de uma proteína.

[030] As bases de ados especialistas existem para a identificação de domínios, por exemplo, SMART (Schultz et al. (1998) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 95, 5.857 a 5.864; Letunic et al. (2002) Nucleic Acids Res 30, 242 a 244), InterPro (Mulder et al., (2003) Nucl. Acids. Res. 31, 315 a 318), Prosite (Bucher e Bairoch (1994), Um sintaxe de perfil generalizado para motivos de sequências biomoleculares e sua função em interpretação de sequência automática. (In) ISMB-94; Proceedings 2nd International Conference on Intelligent Systems for Molecular Biology. Altman R., Brutlag D., Karp P., Lathrop R., Searls D., Eds., páginas 53 a 61, AAAI Press, Menlo Park; Hulo et al., Nucl. Acids. Res. 32:D134 a D137, (2004)), ou Pfam (Bateman et al., Nucleic Acids Research 30(1): 276 a 280 (2002)). Um conjunto de ferramentas para análise in silica de sequências de proteína está disponível a partir do servidor de proteômicos de ExPASy (Swiss Institute of Bioinformatics (Gasteiger et al., ExPASy: the proteomics server for in-depth protein knowledge

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10/58 and analysis, Nucleic Acids Res. 31:3.784 a 3.788(2003)). Domínios ou motivos também pode ser identificado com o uso de técnicas de rotina, tal como por alinhamento de sequência.

[031] Métodos para o alinhamento de sequências para comparação são bem conhecidos na técnica, tais métodos incluem GAP, BESTFIT, BLAST, FASTA e TFASTA. GAP usa o algoritmo de Needleman e Wunsch ((1970) J Mol Biol 48: 443 a 453) para encontrar o alinhamento global (isto é, englobando as sequências completas) de duas sequências que maximizam o número de correspondências e minimiza o número de vãos. O algoritmo de BLAST (Altschul et al. (1990) J Mol Biol 215: 403 a 10) calcula a porcentagem de identidade de sequência e realiza uma análise estatística da semelhança entre as duas sequências. O software para realizar análise BLAST está disponível publicamente a partir do National Centre for Biotechnology Information (NCBI). Os homólogos podem ser identificados prontamente com o uso, por exemplo, do algoritmo de alinhamento de sequência múltiplo ClustalW (versão 1.83), com os parâmetros de alinhamento em pares padrão, e um método de pontuação em porcentagem. As porcentagens globais de semelhança e identidade também podem ser determinadas com o uso de um dos métodos disponíveis no pacote de software de MatGAT (Campanella et al., BMC Bioinformatics. 2003 Jul 10;4:29. MatGAT: an application that generates similarity/identity matrices using protein or DNA sequences.). Uma edição manual menor pode ser realizada para otimizar alinhamento entre motivos conservados, conforme seria aparente para uma pessoa versada na técnica. Ademais, ao invés de usar sequências de comprimento completo para a identificação de homólogos, domínios específicos também podem ser usados. Os valores de identidade de sequência podem ser determinados ao longo do ácido nucleico inteiro ou sequência de aminoácidos ou ao longo de domínios selecionados ou motivo(s) conservado(s), com o uso dos programas

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11/58 mencionados acima com o uso dos parâmetros padrão. Para alinhamentos locais, o algoritmo Smith-Waterman é particularmente útil (Smith TF, Waterman MS (1981) J. Mol. Biol 147(1);195 a 7).

[032] Conforme usado no presente documento os termos “resistência à ferrugem de soja”, “resistente a uma ferrugem de soja”, “resistente à ferrugem de soja”, “resistência à ferrugem”, “resistente a uma ferrugem”, “resistência à ferrugem”, “resistência fúngica”, “resistente a um fungo” e/ou “resistente a fungos” significam reduzir ou evitar uma infecção por ferrugem de soja, em particular Phakopsora pachyrhizi (Sydow) e Phakopsora meibomiae (Arthur). O termo “resistência” se refere a resistência de soja. A resistência não significa que a planta tem necessariamente 100% de resistência à infecção. Em realizações preferenciais, a resistência à infecção por ferrugem de soja em uma planta resistente é maior que 10%, 20%, 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 80%, 90%, ou 95% em comparação com uma planta de tipo selvagem que não é resistente a ferrugem de soja. Preferencialmente a planta de tipo selvagem é uma planta de um genótipo semelhante, com mais preferência idêntico, à planta que tem resistência aumentada à ferrugem de soja, mas não compreende um ácido nucleico recombinante do gene de ADR1, fragmentos funcionais do mesmo e/ou um ácido nucleico capaz de hibridizar ao gene de ADR-1. Preferencialmente, a planta de tipo selvagem não compreende um ácido nucleico endógeno do gene de ADR-1, fragmentos funcionais do mesmo e/ou um ácido nucleico capaz de hibridizar ao gene de ADR-1.

[033] Os termos “resistência à ferrugem de soja”, “resistente a uma ferrugem de soja”, “resistente a ferrugem de soja”, “resistência à ferrugem”, “resistente a uma ferrugem”, “resistência à ferrugem”, resistência fúngica, resistente a um fungo” e/ou “resistente a fungos” conforme usado no presente documento se referem à capacidade de uma planta, em comparação

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12/58 com uma planta de tipo selvagem, de evitar infecção por ferrugem de soja, para eliminar ferrugem, para dificultar, reduzir, atrasar, parar o desenvolvimento, crescimento e/ou multiplicação de ferrugem de soja. O nível de resistência fúngica de uma planta pode ser determinado de várias formas, por exemplo, através de pontuação/medição da área de folha infectada em relação à área de folha total. Outra possibilidade para determinar o nível de resistência é contar o número de colônias de ferrugem de soja na planta ou medir a quantidade de esporos produzir por essas colônias. Outra forma de determinar o grau de infestação fúngica é medir especialmente a quantidade de DNA de ferrugem por (q) PCR quantitativa. Sondas específicas e sequências de iniciador para a maioria de patogênicos fúngicos estão disponíveis na literatura (Frederick RD, Snyder CL, Peterson GL, et al. 2002 Polymerase chain reaction assays for the detection and discrimination of the rust pathogens Phakopsora pachyrhizi e Pmeibomiae PHYTOPATHOLOGY 92(2) 217 a 227). Preferencialmente, a resistência à ferrugem de soja é resistência de não hospedeiro. Resistência de não hospedeiro significa que as plantas são resistentes a pelo menos 80%, pelo menos 90%, pelo menos 95%, pelo menos 98%, pelo menos 99% e de preferência 100% das cepas da ferrugem de soja patógeno, preferencialmente as cepas de Phakopsora pachyrhizi.

[034] O termo hibridização conforme usado no presente documento inclui qualquer processo pelo qual um filamento de molécula de ácido nucleico se une com um filamento complementar através de emparelhamento de base. (J. Coombs (1994) Dictionary of Biotechnology, Stockton Press, New York). A hibridização e a força de hibridização (isto é, a força da associação entre as moléculas de ácido nucleico) são embutidas por tais fatores como o grau de complementaridade entre as moléculas de ácido nucleico, rigorosidade das condições envolvidas, a Tm do híbrido formado, e a razão de G:C dentro das moléculas de ácido nucleico. Conforme usado no

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13/58 presente documento, o termo Tm é usado em referência á temperatura de fusão. A temperatura de fusão é a temperatura na qual uma população de moléculas de ácido nucleico de filamento duplo se torna meio dissociado em filamentos únicos. A equação para calcular a Tm de moléculas de ácido nucleico é bem conhecida na técnica. Conforme indicado por referência padrão, uma simples estimativa do valor de Tm pode ser calculada pela equação: Tm=81,5+0,41(% G+C), quando uma molécula de ácido nucleico está em solução aquosa em 1M NaCl [consulte, por exemplo, Anderson e Young, Quantitative Filter Hybridization, em Nucleic Acid Hybridization (1985)]. Outras referências incluem computações mais sofisticadas, as quais levam características estruturais bem como características de sequência em consideração para o cálculo de Tm. Condições rigorosas são conhecidas por aqueles versados na técnica e podem ser encontrados em Current Protocols in Molecular Biology, John Wiley & Sons, N.Y. (1989), 6.3.1 a 6.3.6.

[035] Em particular, o termo condições rigorosas se referem a condições, em que 100 nucleotídeos contíguos ou mais, 150 nucleotídeos contíguos ou mais, 200 nucleotídeos contíguos ou mais ou 250 nucleotídeos contíguos ou mais os quais são um fragmento ou idênticos à molécula de ácido nucleico de complementaridade (DNA, RNA, ssDNA ou ssRNA) hibridiza sob condições equivalentes a hibridização em 7% de dodecil sulfato de sódio (SDS), 0,5 M de NaPO4, 1 mM de EDTA a 50°C com lavagem em 2 X SSC, 0,1% de SDS a 50°C ou 65°C, de preferência a 65°C, com uma molécula de ácido nucleico específica (DNA; RNA, ssDNA ou ssRNA). Preferencialmente, as condições de hibridização são equivalentes a hibridização em 7% de dodecil sulfato de sódio (SDS), 0,5 M de NaPO4, 1 mM de EDTA a 50°C com lavagem em 1 X SSC, 0,1% de SDS a 50°C ou 65°C, de preferência 65°C, com mais preferência as condições de hibridização são equivalentes a hibridização em 7% de dodecil sulfato de sódio (SDS), 0,5 M de NaPO4, 1 mM de EDTA a 50°C

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14/58 com lavagem em 0,1 X SSC, 0,1% de SDS a 50°C ou 65°C, de preferência 65°C. Preferencialmente, os nucleotídeos de complementaridade hibridizam a um fragmento ou ao gene de ADR-1 inteiro. Preferencialmente, o polinucleotídeo de complementaridade hibridiza com partes do gene de ADR-1 capazes de fornecer resistência à ferrugem de soja.

[036] Conforme usado no presente documento, o termo “gene de ADR-1” se refere a um gene que tem pelo menos 60% de identidade com SEQ ID No. 1 ou com uma sequência que codifica para uma proteína que tem pelo menos 60% de identidade com SEQ ID No. 2 e/ou fragmentos funcionais do mesmo. Em uma realização, os homólogos do gene de ADR-1 têm, no nível de DNA e/ou nível de proteína, pelo menos 70%, de preferência de pelo menos 80%, especialmente de preferência de pelo menos 90%, muito especialmente de preferência de pelo menos 95%, muito especialmente de preferência de pelo menos 98% ou 100% de identidade ao longo da região de DNA inteira ou região de proteína dada em uma sequência revelada especificamente no presente documento e/ou um fragmento funcional do mesmo.

[037] Conforme usado no presente documento, o termo “proteína ADR-1” se refere a uma proteína que tem pelo menos 60% de identidade para uma sequência que codifica para uma proteína que tem SEQ ID No. 2 e/ou um fragmento da mesma. Em uma realização, os homólogos da proteína ADR-1 têm pelo menos 70%, de preferência de pelo menos 80%, especialmente de preferência de pelo menos 90%, muito especialmente de preferência de pelo menos 95%, muito especialmente de preferência de pelo menos 98% ou 100% de identidade ao longo da região de proteína inteira dada em uma sequência revelada especificamente no presente documento e/ou um fragmento funcional do mesmo.

[038] Identidade ou “homologia” entre dois ácidos nucleicos

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15/58 e/ou se refere em cada caso ao longo do comprimento inteiro do ácido nucleico.

[039] Por exemplo, a identidade pode ser calculada por meio do programa Vector NTI Suite 7.1 da empresa Informax (USA) que emprega o método Clustal (Higgins DG, Sharp PM. Alinhamentos de sequência múltiplos rápidos e sensíveis em um microcomputador. Comput Appl. Biosci. 1989 Apr; 5(2):151 a 1) com as seguintes configurações:

Parâmetro de alinhamento múltiplo:
Penalidade de abertura de vão	10
Penalidade de extensão de vão	10
Faixa de penalidade de separação de vão	8
Penalidade de separação de vão	desativado
% de identidade para atraso de alinhamento	40
Vãos de resíduo específico	desativado
Vão de resíduo específico	desativado
Pesagem de transição	0
Parâmetro de alinhamento em pares:
Algoritmo de FAST	ativado
Tamanho de tupla K	1
Penalidade de vão	3
Tamanho de janela	5
Número de melhores diagonais	5

[040] Alternativamente, a identidade pode ser determinada de acordo com Chenna, Ramu, Sugawara, Hideaki, Koike, Tadashi, Lopez, Rodrigo, Gibson, Toby J, Higgins, Desmond G, Thompson, Julie D. Alinhamento de sequência múltiplo com a série de programas de Clustal. (2003) Nucleic Acids Res 31 (13):3.497 a 500, a página da web:

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16/58 http://www.ebi.ac.Uk/Tools/clustalw/index.html# e as seguintes configurações

Penalidade de vão aberto de DNA	15,0
Penalidade de extensão de vão de DNA	6,66
Matriz de DNA	Identidade
Penalidade de vão aberto de proteína	10,0
Penalidade de extensão de vão de proteína	0,2
Matriz de Proteína	Gonnet
ENDGAP de Proteína/DNA	-1
GAPDIST de Proteína/DNA	4

[041] Todas as sequências de ácido nucleico mencionadas no presente documento (sequências de RNA e DNA de filamento duplo e filamento único, por exemplo, cDNA e mRNA) podem ser produzidas de uma forma conhecida por síntese química a partir dos blocos de construção de nucleotídeo, por exemplo, por condensação de fragmento de superposição de indivíduo, blocos de construção de ácido nucleico complementares da hélice dupla. A síntese química de oligonucleotídeos por, por exemplo, ser realizada de uma forma conhecida, pelo método de fosfoamidita (Voet, Voet, 2^a edição, Wiley Press, New York, páginas 896 a 897). O acúmulo de oligonucleotídeos sintéticos e preenchimento de vãos por meio do fragmento de Klenow de DNA polimerase e reações de ligação bem como técnicas de clonagem gerais são descritas em Sambrook et al. (1989), consulte abaixo.

[042] A identidade de sequência entre o ácido nucleico útil de acordo com a presente invenção e o gene de ADR-1 pode ser otimizada por comparação de sequência e algoritmos de alinhamento conhecidos na técnica (consulte Gribskov e Devereux, Sequence Analysis Primer, Stockton Press,

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1991, e referências citadas no presente documento) e cálculo da diferença de porcentagem entre as sequências de nucleotídeo pelo, por exemplo, algoritmo de Smith-Waterman conforme implantado no programa de software de BESTFIT com o uso de parâmetros padrão (por exemplo, University of Wisconsin Genetic Computing Group). Pelo menos 60% de identidade de sequência, de preferência pelo menos 70% de identidade de sequência, 80% 90%, 95%, 98% de identidade de sequência, ou até mesmo 100% de identidade de sequência, em que o ácido nucleico tem SEQ ID No. 1 é preferencial.

[043] O termo “planta” é pretendido englobar plantas em qualquer estágio de maturidade ou desenvolvimento, bem como quaisquer tecidos ou órgãos (partes de planta) tomados ou derivados de qualquer tal planta a menos que indicado claramente de outra forma pelo contexto. As partes de planta incluem, sem limitação, células vegetais, caules, raízes, flores, óvulos, estames, sementes, folhas, embriões, regiões merismáticas, tecido de calo, culturas de antera, gametófitos, esporófitos, pólen, microesporos, protoplastos, culturas de raiz cabeluda, e/ou similares. A presente invenção também inclui sementes produzidas pelas plantas da presente invenção. Preferencialmente, as sementes compreendem o gene de ADR-1 recombinante. Em uma realização, as sementes são de reprodução autêntica para uma resistência aumentada à infecção fúngica em comparação com uma variedade de tipo selvagem da semente de planta. Conforme usado no presente documento, uma “célula vegetal” inclui, sem limitação, um protoplasto, um gameta que produz célula e uma célula que regenera em uma planta inteira. A cultura de tecido de vários tecidos de plantas e regeneração de plantas disto é bem conhecida e é publicada amplamente.

[044] A referência no presente documento a um gene de ADR-1 “endógeno” se refere ao gene em questão conforme encontrado em uma planta

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18/58 em sua forma natural (isto é, sem existir qualquer intervenção humana). O gene de ADR-1 recombinante se refere ao mesmo gene (ou um ácido nucleico/gene substancialmente homólogo) em uma forma isolada subsequentemente (re)introduzido no interior de uma planta (um transgene). Por exemplo, uma planta transgênica que contém tal transgene pode encontrar um aumento substancial da expressão de transgene em adição à expressão do gene endógeno. O gene isolado pode ser isolado a partir de um organismo ou pode ser sintético, por exemplo, por síntese química. Uma planta transgênica de acordo com a presente invenção inclui um gene de ADR-1 recombinante integrado em locais genético e opcionalmente a planta pode incluir o gene endógeno dentro do fundo genético natural. Preferencialmente, a planta não inclui um gene endógeno de ADR-1.

[045] Para os propósitos da invenção, recombinante significa em relação a, por exemplo, uma sequência de ácido nucleico, um cassete de expressão ou uma construção de vetor que compreende o gene de ADR-1, todas as construções efetuadas por métodos gentecnológicos nos quais ou (a) as sequências de ADR-1 que codificam proteínas de ADR-1, ou (b) sequência(s) de controle genético a(s) qual(is) é(são) ligada(s) de forma operacional com a sequência de ácido nucleico de ADR-1 de acordo com a invenção, por exemplo, um promotor, ou (c) a) e b) [046] não estão localizados em seu ambiente genético natural ou foram modificados por métodos gentecnológicos. A modificação pode tomar a forma de, por exemplo, uma substituição, adição, deleção, inversão ou inserção de um ou mais resíduos de nucleotídeo. O ambiente genético natural é compreendido como significando o local cromossômico ou genômico natural na planta original ou na presença em uma biblioteca genômica ou na

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19/58 combinação com o promotor natural.

[047] No caso de uma biblioteca genômica, o ambiente genético natural da sequência de ácido nucleico é preferencialmente retida, pelo menos em parte. O ambiente flanqueia a sequência de ácido nucleico pelo menos em um lado e tem um comprimento de sequência de pelo menos 50 bp, de preferência pelo menos 500 bp, especialmente de preferência pelo menos 1.000 bp, com máxima preferência pelo menos 5.000 bp.

[048] Um cassete de expressão de ocorrência natural - por exemplo, a combinação de ocorrência natural do promotor natural das sequências de ácido nucleico com a sequência de ácido nucleico correspondente que codifica uma proteína útil nos métodos da presente invenção, conforme definido acima - se torna um cassete de expressão recombinante quando esse cassete de expressão é modificado por métodos sintéticos (“artificial”) não naturais tal como, por exemplo, tratamento mutagênico. Os métodos adequados são descritos, por exemplo, no documento U.S. 5.565.350 ou WO 00/15815. Ademais, um cassete de expressão de ocorrência natural - por exemplo, a combinação de ocorrência natural do promotor natural das sequências de ácido nucleico com a sequência de ácido nucleico correspondente que codifica uma proteína útil nos métodos da presente invenção, conforme definido acima - se torna um cassete de expressão recombinante quando esse cassete de expressão não está integrado no ambiente genético natural, mas em um ambiente genético diferente.

[049] Será observado adicionalmente no contexto da presente invenção, o termo “ácido nucleico isolado” ou “proteína isolada” podem em alguns casos ser considerado como um sinônimo para um “ácido nucleico recombinante” ou uma “proteína recombinante”, respectivamente e se refere a um ácido nucleico ou proteína que não está localizada em seu ambiente

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20/58 genético natural e/ou que foi modificada por métodos gentécnicos.

[050] Uma planta transgênica para os propósitos da invenção é, portanto, compreendida como significando que os ácidos nucleicos de ADR-1 não estão presentes no genoma da planta original e/ou estão presentes no genoma da planta original ou uma outra planta não em seu local natural do genoma da planta original. O local natural significa a localização em um cromossomo específico, preferencialmente a localização entre determinados genes, com mais preferência o mesmo fundo de sequência que na planta original. Sendo possível para os ácidos nucleicos serem expressos de forma homogênea ou heterogênea. Transgênico é compreendido, de preferência, como significando a expressão dos ácidos nucleicos de acordo com a invenção não na planta original e/ou em um local não natural no genoma, isto é expressão heteróloga dos ácidos nucleicos acontece.

[051] Conforme usado no presente documento, o termo “transgênico” se refere, de preferência, a qualquer planta, célula vegetal, calo, planta tecido, ou parte de planta que contém todo ou parte do gene de ADR-1 não em seu local natural. Preferencialmente, todo ou parte do gene de ADR-1 é integrado, de forma estável no interior de um cromossomo ou elemento extracromossômico adequado, de modo que seja passado para sucessivas gerações.

[052] O termo “expressão” ou “expressão de gene” ou “aumento de teor” significa a transcrição de um gene específico ou genes específicos ou construção de vetor genético específico. O termo “expressão” ou “expressão de gene” significa, em particular, a transcrição de um gene ou genes ou construção de vetor genético em RNA estrutural (rRNA, tRNA) ou mRNA com ou sem tradução subsequente do anterior em uma proteína. O processo inclui transcrição de DNA e processamento do produto de mRNA resultante.

[053] O termo “expressão aumentada” ou “superexpressão” ou

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21/58 “aumento de teor” conforme usado no presente documento significa qualquer forma de expressão que é adicional ao nível de expressão de tipo selvagem original. Para os propósitos dessa invenção, o nível de expressão de tipo selvagem original também pode ser zero (ausência de expressão).

[054] Os métodos para aumentar expressão de genes ou produtos de gene são bem conhecidos na técnica e incluem, por exemplo, superexpressão acionada por promotores apropriados, o uso de acentuadores de transcrição ou acentuadores de tradução. Os ácidos nucleicos isolados os quais servem como promotor ou elementos acentuadores podem ser introduzidos em uma posição apropriada (tipicamente a montante) de uma forma não heteróloga de um polinucleotídeo de modo a regular de forma ascendente a expressão de um ácido nucleico que codifica a proteína de interesse. Por exemplo, promotores endógenos pode ser alterados in vivo por mutação, deleção, e/ou substituição (consulte, Kmiec, U.S. 5.565.350; Zarling et al., WO9322443), ou promotores isolados podem ser introduzidos no interior de uma célula vegetal na orientação própria e distância de um gene da presente invenção de modo a controlar a expressão do gene.

[055] Se expressão de proteína for desejada, é geralmente desejável inclui uma região de poliadenilação na extremidade 3' de uma região de codificação de polinucleotídeo. A região de poliadenilação pode ser derivada do gene natural, a partir de uma variedade de outros genes de planta, ou a partir de T-DNA. A sequência de extremidade 3' para ser adicionada pode ser derivada a partir, por exemplo, de genes de nopalina sintase ou octopina sintase, ou alternativamente a partir de outro gene de planta, ou com menos preferência a partir de qualquer gene eucariótico.

[056] Uma sequência de íntron também pode ser adicionada à região não traduzida de 5' (UTR) e/ou à sequência de codificação da sequência de codificação parcial para aumentar a quantidade da mensagem madura que

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22/58 acumula no citosol. Inclusão de um íntron emendável na unidade de transcrição em ambas as construções de expressão de planta e animal foi mostrada para aumentar a expressão de gene ambos os níveis de mRNA e proteína até 1.000 vezes (Buchman e Berg (1988) Mol. Cell biol. 8: 4.395 a 4.405; Callis et al. (1987) Genes Dev 1:1.183 a 1.200). Tal acentuação de íntron expressão de gene é tipicamente maior quando colocado perto da extremidade 5' da unidade de transcrição. O uso de íntrons de maís de Adh1-S 1, 2, e 6, o íntron de Bronze-1 são conhecidos na técnica. Para informações gerais consulte: The Maize Handbook, Capítulo 116, Freeling e Walbot, Eds., Springer, N.Y. (1994).

[057] O termo “fragmento funcional” se refere a qualquer ácido nucleico e/ou proteína a qual compreende meramente parte do ácido nucleico de comprimento completo e/ou proteína de comprimento completo, mas ainda fornece a mesma função, isto é resistência à ferrugem de soja quando expressado em uma planta. Preferencialmente, o fragmento compreende pelo menos 50%, pelo menos 60%, pelo menos 70%, pelo menos 80%, pelo menos 90% pelo menos 95%, pelo menos 98 %, pelo menos 99% da sequência original. Preferencialmente, o fragmento funcional compreende ácidos nucleicos ou aminoácidos contíguos conforme no ácido nucleico original e/ou proteína original.

[058] Em uma realização, o fragmento do ácido nucleico de ADR-1 tem uma identidade conforme definido acima ao longo de um comprimento de pelo menos 500, pelo menos 1.000, pelo menos 1.500, pelo menos 2.000 nucleotídeos ao gene de ADR-1.

[059] O termo “atividade funcional semelhante” ou “função semelhante” no contexto significa que qualquer homólogo e/ou fragmento fornece resistência à ferrugem de soja quando expressado em uma planta. Preferencialmente atividade funcional semelhante significa pelo menos 50%, pelo menos 60%, pelo menos 70%, pelo menos 80%, pelo menos 90%, pelo

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23/58 menos 95%, pelo menos 98 %, pelo menos 99% ou 100% ou superior da resistência à ferrugem de soja em comparação com atividade funcional fornecida pela expressão recombinante da sequência de nucleotídeo de ADR-1 SEQ ID No. 1 e/ou sequência de proteína recombinante de ADR-1 de SEQ ID No. 2.

[060] O termo “atividade aumentada” conforme usado no presente documento significa qualquer proteína que tem atividade aumentada fornece uma resistência à ferrugem de soja aumentada em comparação com a planta de tipo selvagem que meramente expressa o gene endógeno de ADR-1. Para os propósitos dessa invenção, o nível de expressão de tipo selvagem original também pode ser zero (ausência de expressão).

[061] O termo “introdução” ou “transformação” conforme referido no presente documento engloba a transferência de um polinucleotídeo exógeno para o interior de uma célula hospedeira, independentemente do método usado para transferir. O tecido de planta que tem capacidade para propagação clonal subsequente, por organogênese ou embriogênese, pode ser transformado com uma construção de vetor da presente invenção e uma planta inteira regenerada a partir disto. O tecido particular escolhido irá variar dependendo dos sistemas de propagação clonal disponíveis para, e mais adequado para, a espécie particular sendo transformada. Os alvos de tecido exemplificativos incluem discos de folha, pólen, embriões, cotilédones, hipocótilos, megagametófitos, tecido de calo, tecido merismático existente (por exemplo, meristema apical, brotos auxiliares, e meristemas de raiz), e tecido de meristema induzido (por exemplo, meristema de cotilédone e meristema de hipocótilo). O polinucleotídeo pode ser introduzido de forma transiente ou estável no interior de uma célula hospedeira e pode ser mentido não integrado, por exemplo, como um plasmídeo. Alternativamente, pode ser integrado no

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24/58 interior do genoma hospedeiro. A célula vegetal transformada resultante pode então ser usada para regenerar uma planta transformada de uma forma conhecida para pessoas versadas na técnica.

[062] O termo “terminador” engloba uma sequência de controle a qual é uma sequência de DNA na extremidade de uma unidade de transcrição as qual sinaliza processamento de 3' e poliadenilação de um transcrito primário e terminação de transcrição. O terminador pode ser derivado do gene natural, a partir de uma variedade de outros genes de planta, ou do TDNA. O terminador a ser adicionado pode ser derivado a partir, por exemplo, dos genes de nopalina sintase ou octopina sintase, ou alternativamente a partir de outro gene de planta, ou com menos preferência a partir de qualquer outro gene eucariótico.

[063] As células vegetais transgênicas podem ser transformadas com uma das construções de vetores descritos acima. Os métodos adequados para transformar ou transfectar célula hospedeiras que incluem células vegetais são bem conhecidas na técnica de biotecnologia de planta. Qualquer método pode ser usado para transformar o vetor de expressão recombinante no interior de células vegetais para proporcionar as plantas transgênicas da invenção. Os métodos gerais para transformar plantas dicotiledôneas são revelados, por exemplo, nas Patentes sob n^os U.S. 4.940.838; 5.464.763, e similares. Métodos para transformar plantas dicotiledôneas específicas, por exemplo, algodão, são apresentados nas Patentes sob n^os U.S. 5.004.863; 5.159.135; e 5.846.797. Os métodos de transformação de soja são apresentados nas Patentes sob n^os U.S. 4.992.375; 5.416.011; 5.569.834; 5.824.877; 6.384.301 e em EP 0301749B1 podem ser usados. Os métodos de transformação podem incluir métodos diretos e indiretos de transformação. Os métodos diretos adequados incluem absorção de DNA induzida por polietileno glicol, transformação mediada por lipossoma

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25/58 (U.S. 4.536.475), métodos biolísticos com o uso de pistola de gene (Fromm ME et al., Bio/Technology. 8(9):833 a 9, 1990; Gordon-Kamm et al. Plant Cell

2:603, 1990), eletroporação, incubação de embriões secos em solução que compreende DNA, e microinjeção. No caso desses métodos de transformação diretos, os plasmídeos usados não precisam satisfazer quaisquer requisitos particulares. Os plasmídeos simples, tal como aqueles da série pUC, pBR322, série M13mp, pACYC184 e similares podem ser usados. Se plantas intactas devem ser regeneradas a partir das células transformadas, um gene de marcador selecionável adicional está localizado, de preferência, no plasmídeo. As técnicas de transformação diretas são igualmente adequadas para plantas dicotiledôneas e monocotiledôneas.

[064] A transformação também pode ser executada por infecção bacteriana por meio de Agrobacterium (por exemplo, EP 0 116 718), infecção viral por meio de vetores virais (EP 0 067 553; US 4.407.956; WO 95/34668; WO 93/03161) ou por meio de pólen (EP 0 270 356; WO 85/01856; US 4.684.611). As técnicas de transformação baseadas em Agrobacterium (especialmente para plantas dicotiledôneas) são bem conhecidas na técnica. A cepa de Agrobacterium (por exemplo, Agrobacterium tumefaciens ou Agrobacterium rhizogenes) compreende um plasmídeo (Ti ou Ri plasmídeo) e um elemento de T-DNA o qual é transferido para a seguinte infecção com Agrobacterium da planta. O T-DNA (DNA transferido) é integrado no interior de genoma da célula vegetal. O T-DNA pode ser localizado no Ri- ou Ti-plasmídeo ou é compreendido separadamente em um assim chamado vetor binário. Os métodos para a transformação mediada por Agrobacterium são descritos, por exemplo, em Horsch RB et al. (1985) Science 225:1229. A transformação mediada por Agrobacterium é mais bem adequada para plantas dicotiledôneas, mas também foi adaptada para plantas monocotiledôneas. A transformação de plantas por Agrobactérias é descrita em, por exemplo, White FF, Vectors for

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Gene Transfer in Higher Plants, Transgenic Plants, Vol. 1, Engineering and Utilization, editada por S.D. Kung e R. Wu, Academic Press, 1993, páginas 15 a 38; Jenes B et al. Techniques for Gene Transfer, Transgenic Plants, Vol. 1, Engineering and Utilization, editada por S.D. Kung e R. Wu, Academic Press, 1993, páginas 128 a 143; Potrykus (1991) Annu Rev Plant Physiol Plant Molec Biol 42:205 a 225. A transformação pode resultar em transformação e expressão transiente ou estável. Embora uma sequência de nucleotídeo da presente invenção possa ser inserida no interior de qualquer planta e célula vegetal que caem dentro dessas classes amplas, é particularmente útil em células vegetais de safra. As células vegetais modificadas geneticamente podem ser regeneradas por meio de todos os métodos com os quais o trabalhador versado é familiar. Os métodos adequados podem ser encontrados nas publicações supracitadas por S.D. Kung e R. Wu, Potrykus ou Hofgen e Willmitzer.

[065] Geralmente, após a transformação, as células vegetais ou aglomerações de célula são selecionadas para a presença de um ou mais marcadores os quais são codificados por genes expressáveis por planta cotransferidos com o gene de interesse, após o qual o material transformado é regenerado em uma planta inteira. Para selecionar plantas transformadas, o material de planta obtido na transformação é, como uma regra, submetido a condições seletivas severas de modo que plantas transformadas possam ser distinguidas de plantas não transformadas. Por exemplo, as sementes obtidas da forma descrita acima podem ser plantadas e, após um período de crescimento inicial, submetidas a uma seleção adequada por aspersão. Uma possibilidade adicional consiste em cultivar as sementes, se apropriado após esterilização, em placas de ágar com o uso de um agente de seleção adequado de modo que somente as sementes transformadas possam crescer em plantas. Alternativamente, as plantas transformadas são triadas para a

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27/58 presença de um marcador adequado tal como aqueles descritos acima.

[066] Após transferência de DNA e regeneração, as plantas transformadas de forma putativa também podem ser avaliadas, por exemplo, com o uso da análise Southern, para a presença do gene de interesse, número de cópia e/ou organização genômica. Alternativa ou adicionalmente, os níveis de expressão do DNA introduzido recentemente podem ser monitorados com o uso da análise Northern e/ou Western, sendo que ambas técnicas são bem conhecidas para pessoas que têm habilidade comum na técnica.

[067] As plantas transformadas geradas podem ser propagadas por uma variedade de meios, tal como por técnicas de propagação clonal ou reprodução clássica. Por exemplo, uma planta transformada de primeira geração (ou T1) pode ser autofecundada e transformantes de segunda geração homozigotas (ou T2) selecionadas, e as plantas T2 podem então ser propagadas através de técnicas de reprodução clássica. Os organismos transformados gerados podem tomar uma variedade de formas. Por exemplo, eles podem ser quimeras de células transformadas e células não transformadas; transformantes clonais (por exemplo, todas as células transformadas para conter o cassete de expressão); enxertos de tecidos transformados e não transformados (por exemplo, em plantas, um porta-enxerto enxertado a um epibioto não transformado).

[068] A presente invenção fornece um método para aumentar resistência em plantas e/ou células vegetais a ferrugem, em que o teor e/ou atividade de pelo menos uma proteína ADR-1 é aumentado em comparação com plantas de tipo selvagem e/ou células vegetais.

[069] Em uma realização do método a proteína ADR-1 é codificada por um ácido nucleico recombinante que tem pelo menos 60%, pelo menos 70%, pelo menos 80%, pelo menos 90%, pelo menos

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95%, pelo menos 98% ou 100% de identidade com SEQ ID No. 1, um fragmento funcional do mesmo e/ou um ácido nucleico tem capacidade de hibridizar com tal ácido nucleico e/ou é uma proteína que tem pelo menos 60%, pelo menos 70%, pelo menos 80%, pelo menos 90%, pelo menos 95%, pelo menos 98% ou 100% de identidade com SEQ ID No. 2, um fragmento funcional do mesmo, um ortólogo e/ou um parálogo do mesmo.

[070] Em uma realização o método compreende:

(a) transformar de forma estável uma célula vegetal com um cassete de expressão que compreende (i) uma sequência de ácido nucleico recombinante que tem pelo menos 60%, pelo menos 70%, pelo menos 80%, pelo menos 90% pelo menos 95%, pelo menos 98% ou 100% de identidade com SEQ ID No. 1 e/ou um fragmento funcional do mesmo em ligação funcional com um promotor e/ou (ii) um ácido nucleico recombinante que codifica para uma proteína que tem pelo menos 60%, pelo menos 70%, pelo menos 80%, pelo menos 90%, pelo menos 95%, pelo menos 98% ou 100% de identidade com SEQ ID No. 2, um fragmento funcional do mesmo, um ortólogo e/ou um parálogo do mesmo, (b) regenerar a planta a partir da célula vegetal; e (c) expressar a dita sequência de ácido nucleico a qual codifica para uma proteína ADR-1 em uma quantidade e por um período suficiente para gerar ou aumentar uma resistência à ferrugem de soja na dita planta.

[071] Em uma realização a planta é um legume que compreende plantas do gênero Phaseolus (compreendendo vagem, feijão anão, feijão de trepar (Phaseolus vulgaris), Feijão fava (Phaseolus lunatus L.), Feijão tepari (Phaseolus acutifolius A. Gray), feijão trepador (Phaseolus coccineus)); o gênero Glicina (que compreende soja de Glicina, feijões-soja

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29/58 (Glicina max (L.) Merill)); ervilha (Pisum) (compreendendo ervilhas de grão (Pisum sativum L. convar. sativum), também chamadas ervilhas em vagem ou lisa; ervilha medulosa (Pisum sativum L. convar. medullare Alef. emend. C.O. Lehm), ervilhas de quebrar (Pisum sativum L. convar. axiphium Alef emend. C.O. Lehm), também chamada de ervilhas frescas, orelha de padre, ervilha mange-toute, (Pisum granda sneida L. convar. sneidulo p. shneiderium)); amendoim (Arachis hypogaea), trevo (Trifolium spec.), luzerna (Medicago), videira kudzu (Pueraria lobata), luzerna comum, alfafa (M. sativa L.), grão-de bico (Cicer), lentilha (Lens) (Lens culinaris Medik.), tremoço (Lupinus); ervilhaca (Vicia), feijão de campo, feijão largo (Vicia faba), chícharo (Lathyrus) (que compreende chícaro (Lathyrus sativus), ervilha tuberosa (Lathyrus tuberosus)); gênero Vigna (que compreende feijão mungo (Vigna aconitifolia (Jacq.) Maréchal), feijão adzuki (Vigna angularis (Willd.) Ohwi & H. Ohashi), feijão-daíndia (Vigna mungo (L.) Hepper), feijão da china (Vigna radiata (L.) R. Wilczek), feijão bambara (Vigna subterrane (L.) Verdc.), feijão-arroz (Vigna umbellata (Thunb.) Ohwi & H. Ohashi), Vigna vexillata (L.) A. Rich., Vigna unguiculata (L.) Walp., nas três subespécies feijão aspargo, feijão de liba, feijão de corda)); guandu (Cajanus cajan (L.) Millsp.), o gênero Macrotyloma (que compreende feijão de geocarpa (Macrotyloma geocarpum (Harms) Maréchal & Baudet), feijão cavalo (Macrotyloma uniflorum (Lam.) Verdc.)); feijão de goa (Psophocarpus tetragonolobus (L.) DC.), Feijão inhame Africano (Sphenostylis stenocarpa (Hochst. ex A. Rich.) Harms), feijão preto egípcio, feijão dólico, feijão da índia (Lablab purpureus (L.) Sweet), feijão inhame (Pachyrhizus), feijão de guar (Cyamopsis tetragonolobus (L.) Taub.); e/ou o gênero Canavalia (que compreende feijão do porco (Canavalia ensiformis (L.) DC.), feijão espadinho (Canavalia gladiata (Jacq.) DC.)).

[072] Preferencialmente, a planta de acordo com a presente invenção é soja.

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30/58 [073] Além disso, a presente invenção compreende construção de vetor recombinante que compreende:

(a) um ácido nucleico recombinante (i) que tem pelo menos 60%, pelo menos 70%, pelo menos 80%, pelo menos 90%, pelo menos 95%, pelo menos 98% ou 100% de identidade com SEQ ID No. 1, um fragmento funcional do mesmo e/ou um ácido nucleico capaz de hibridizar com tal ácido nucleico e/ou (ii) que compreende um ácido nucleico recombinante que codifica para uma proteína que tem pelo menos 60%, pelo menos 70%, pelo menos 80%, pelo menos 90%, pelo menos 95%, pelo menos 98% ou 100% de identidade com SEQ ID No. 2, um fragmento funcional do mesmo, um ortólogo e/ou um parálogo, operativamente ligado a (b) um promotor e (c) uma sequência de terminação de transcrição.

[074] Em relação a uma construção de vetor recombinante e/ou ao ácido nucleico recombinante, o termo “ligado de modo funcional” é pretendido significar que o ácido nucleico recombinante é ligado à sequência reguladora, que inclui promotores, sequências reguladoras de promotor, acentuadores e/ou outros elementos de controle de expressão (por exemplo, sinais de poliadenilação), de uma forma a qual permite expressão do gene de ADR-1 (por exemplo, em uma célula vegetal hospedeira quando o vetor é introduzido no interior da célula vegetal hospedeira). Tais sequências reguladoras são descritas, por exemplo, em Goeddel, Gene Expression Technology: Métodos in Enzymology 185, Academic Press, San Diego, CA (1990) e Gruber e Crosby, em: Métodos in Plant Molecular Biology and Biotechnology, Eds. Glick e Thompson, Capítulo 7, 89 a 108, CRC Press: Boca Raton, Florida, em que inclui as referências nisto. As sequências reguladoras

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31/58 incluem aquelas que direcionam expressão constitutiva de uma sequência de nucleotídeo em muitos tipos de célula hospedeiras e aquelas que direcionam expressão da sequência de nucleotídeo somente em determinadas células hospedeiras ou sob determinadas condições. Será apreciado por aqueles versados na técnica que o projeto do vetor pode depender de tais fatores como a escolha da célula hospedeira a ser transformada, do nível de expressão de RNA desejado, e/ou similares. As construções de vetores da invenção podem ser introduzidas no interior de células hospedeiras de planta para, através disso, produzir proteína ADR-1 a fim de evitar e/ou reduzir infecções de ferrugem de soja.

[075] Os promotores de acordo com a presente invenção podem ser constitutivos, induzíveis, em particular induzíveis por patógeno, preferencial por estágio de desenvolvimento, preferencial por tipo de célula, preferencial por tecido e/ou preferencial por órgão. Os promotores constitutivos são ativos sob a maioria das condições. Os exemplos não limitadores de promotores constitutivos incluem os promotores de CaMV 19S e 35S (Odell et al., 1985, Nature 313:810 a 812), o promotor de sX CaMV 35S (Kay et al., 1987, Science 236:1.299 a 1.302), o promotor de Sep1, o promotor de actina de arroz (McElroy et al., 1990, Plant Cell 2:163 a 171), o promotor de actina de Arabidopsis, o promotor de ubiquitina (Christensen et al., 1989, Plant Molec. Biol. 18:675 a 689); pEmu (Last et al., 1991, Theor. Appl. Genet. 81:581 a 588), o promotor de 35S de vírus mosaico de figwort, o promotor de Smas (Velten et al., 1984, EMBO J. 3:2.723 a 2.730), o promotor de GRP1-8, o promotor de cinamil álcool desidrogenase (Patente sob N^o U.S. 5.683.439), promotores do T-DNA de Agrobacterium, tal como manopina sintase, nopalina sintase, e octopina sintase, a subunidade pequena de promotor de ribulose bifosfato carboxilase (ssuRUBISCO) e/ou similares. Os promotores que expressam o RNA em uma célula que entra em contato com fungo, Em particular ferrugem

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32/58 de soja, são preferenciais. Alternativamente, o promotor pode acionar expressão do RNA em um tecido de planta remoto do sítio de contato com o fungo e o RNA pode então ser transportado pela planta para uma célula que entra em contato com o fungo, em particular células de e/ou próxima a sítios infectados por fungos.

[076] Preferencialmente, o promotor é um promotor constitutivo, promotor específico de raiz, promotor específico de mesófilo, e/ou um promotor induzível por fungo. Um promotor é induzível, se sua atividade, medida na quantidade de RNA produzido sob controle do promotor, for pelo menos 30%, 40%, 50% de preferência pelo menos 60%, 70%, 80%, 90%, com mais preferência pelo menos 100%, 200%, 300% superior em seu estado induzido, do que em seu estado não induzido. Um promotor é específico por órgão, tecido ou célula, se sua atividade, medida na quantidade de RNA produzido sob controle do promotor, for pelo menos 30%, 40%, 50% de preferência pelo menos 60%, 70%, 80%, 90%, com mais preferência menos 100%, 200%, 300% superior em um órgão, tecido ou tipo de célula particular, do que em outros tipos de célula ou tecidos da mesma planta, de preferência os outros tipos de célula ou tecidos são tipos de célula ou tecidos do mesmo órgão de planta, por exemplo, uma raiz. No caso de promotores específicos por órgão, a atividade de promotor deve ser comparada à atividade de promotor atividade em outros órgãos de planta, por exemplo, folhas, caules, flores ou sementes.

[077] Os promotores preferenciais por estágio de desenvolvimento são expressos de preferência em determinados estágios de desenvolvimento. Os promotores preferenciais por órgão e tecido incluem aqueles que são preferencialmente expressados em determinados tecidos ou órgãos, tal como folhas, raízes, sementes e/ou xilema. Exemplos de promotores preferenciais por órgão e preferenciais por tecido incluem, sem limitação, promotores preferenciais por fruto, preferenciais

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33/58 por óvulo, preferenciais por tecido de macho, preferenciais por semente, preferenciais por tegumento, preferenciais por tubérculo, preferenciais por talo, preferenciais por pericarpo, preferenciais por folha, preferenciais por estigma, preferenciais por pólen, preferenciais por antera, a preferenciais por pétala, preferenciais por sépala, preferenciais por pedículo, preferenciais por síliqua, preferenciais por caule, preferenciais por raiz e/ou similares. Os promotores preferenciais por semente são expressados preferencialmente durante desenvolvimento de semente e/ou germinação. Por exemplo, promotores preferenciais por semente podem ser preferenciais por embrião, preferenciais por endoesperma e/ou preferenciais por revestimento de semente. Consulte Thompson et al., 1989, BioEssays 10:108. Exemplos de promotores preferenciais por semente incluem, sem limitação celulose sintase (celA), Cim1, gama-zeína, globulina-1, zeína de 19 kD de maís (cZ19B1) e/ou similares.

[078] Outros promotores preferenciais por tecido ou preferenciais por órgão adequados incluem, sem limitação, o promotor de gene de napina de semente de colza (Patente n^o U.S. 5.608.152), o promotor de USP da Vicia faba (Baeumlein et al., 1991, Mol Gen Genet. 225(3):459 a 67), o promotor de oleosina da Arabidopsis (Pedido PCT sob n^o WO 98/45461), o promotor de faseolina da Phaseolus vulgaris (Patente sob n^o U.S. 5.504.200), o promotor de Bce4 da Brassica (Pedido PCT sob N^o WO 91/13980), ou o promotor de legumina B4 (LeB4; Baeumlein et al., 1992, Plant Journal, 2(2):233 a 9), bem como promotores que conferem expressão específica por semente em plantas monocotiledôneas como maís, cevada, trigo, centeio, arroz, etc. Os promotores adequados para observar são o promotor de gene de lpt2 ou lpt1 da cevada (Pedido PCT sob n^o WO 95/15389 e Pedido PCT sob n^o WO 95/23230) ou aqueles descritos no Pedido PCT sob n^o WO 99/16890 (promotores do gene de

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34/58 hordeína de cevada, gene de glutelina de arroz, gene de orizina de arroz, gene de prolamina de arroz, gene de gliadina de trigo, gene de glutelina de trigo, gene glutelina de aveia, gene de casirina de sorgo, e/ou gene de secalina de centeio) [079] Os promotores úteis de acordo com a invenção incluem, sem limitação, são os promotores de proteína de ligação de clorofila a/b, promotores de histona, o promotor de Ap3, o promotor de βconglicina, o promotor de napina, o promotor de lectina de soja, o promotor de zeína de 15kD de maís, o promotor de zeína de 22kD, o promotor de zeína de 27kD, o promotor de g-zeína, os promotores de bronze waxy, shrunk 1, shrunk 2, o promotor de Zm13 (Patente sob No U.S. 5,086,169), os promotores de poligalacturonase de maís PG) (Patente sob n^o U.S. 5.412.085 e 5.545.546), o promotor de SGB6 (Patente sob n^o U.S. 5,470,359), bem como promotores sintéticos e/ou outro natural.

[080] Os promotores específicos de epiderme podem ser selecionados a partir do grupo que consiste em:

WIR5 (=GstA1); acc. X56012; Dudler & Schweizer,

GLP4, acc. AJ310534; Wei Y., Zhang Z., Andersen C.H., Schmelzer E., Gregersen P.L., Collinge D.B., Smedegaard-Petersen V. e Thordal-Christensen H., Plant Molecular Biology 36, 101 (1998),

GLP2a, acc. AJ237942, Schweizer P., Christoffel A. e Dudler R., Plant J. 20, 541 (1999);

Prx7, acc. AJ003141, Kristensen B.K., Ammitzboll H., Rasmussen S.K. e Nielsen K.A., Molecular Plant Pathology, 2(6), 311 (2001);

GerA, acc. AF250933; Wu S., Druka A., Horvath H., Kleinhofs A., Kannangara G. e von Wettstein D., Plant Phys Biochem 38, 685 (2000);

OsROC1, acc. AP004656

RTBV, acc. AAV62708, AAV62707; Kloti A., Henrich C., Bieri S.,

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He X., Chen G., Burkhardt P.K., Wünn J., Lucca P., Hohn T., Potrykus I. e Fütterer J., PMB 40, 249 (1999);

Promotor de Chitinase ChtC2 da batata (Ancillo et al., Planta. 217(4), 566, (2003));

Promotor de AtProT3 (Grallath et al., Plant Physiology. 137(1), 117 (2005));

Promotores de SHN de Arabidopsis (fatores de transcrição de AP2/EREBP envolvidos em produção de cutina e cera) (Aarón et al., Plant Cell. 16(9), 2463 (2004)); e/ou

GSTA1 do trigo (Dudler et al., WP2005306368 e Altpeter et al., Plant Molecular Biology. 57(2), 271 (2005)).

[081] Promotores específicos de mesófilo podem ser selecionados a partir do grupo que consiste em:

PPCZm1 (=PEPC); Kausch A.P., Owen T.P., Zachwieja S.J., Flynn A.R. e Sheen J., Plant Mol. Biol. 45, 1 (2001);

OsrbcS, Kyozuka et al., PlaNT Phys 102, 991 (1993); Kyozuka J., McElroy D., Hayakawa T., Xie Y., Wu R. e Shimamoto K., Plant Phys. 102, 991 (1993);

OsPPDK, acc. AC099041;

TaGF-2.8, acc. M63223; Schweizer P., Christoffel A. e Dudler R., Plant J. 20, 541 (1999);

TaFBPase, acc. X53957;

TaWIS1, acc. AF467542; US 200220115849;

HvBIS1, acc. AF467539; US 200220115849; e/ou

ZmMIS1, acc. AF467514; US 200220115849;

[082] Promotores induzíveis por patógeno podem ser selecionados a partir do grupo que consiste em:

HvPR1a, acc. X74939; Bryngelsson et al., Mol. Plant Microbe

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Interacti. 7 (2), 267 (1994);

HvPRIb, acc. X74940; Bryngelsson et al., Mol. Plant Microbe Interact. 7(2), 267 (1994);

HvB1,3gluc; acc. AF479647;

HvPrx8, acc. AJ276227; Kristensen et al., Molecular Plant

Pathology, 2(6), 311 (2001); e/ou

HvPAL, acc. X97313; Wei Y., Zhang Z., Andersen C.H.,

Schmelzer E., Gregersen P.L., Collinge D.B., Smedegaard-Petersen V. e Thordal-Christensen H. Plant Molecular Biology 36, 101 (1998).

[083] Promotores constitutivos podem ser selecionados a partir do grupo que consiste em:

Promotor de PcUbi de salsa (WO 03/102198)

Promotor de CaMV 35S: promotor de vírus mosaico couve-flor

35S (Benfey et al. 1989 EMBO J. 8(8): 2.195 a 2.202),

Promotor de STPT: promotor de translocador de triose-fosfato curto de Arabidopsis thaliana (Acesso NM_123979)

Promotor de Act1: promotor de gene de actina 1 de Oryza sativa (McElroy et al. 1990 PLANT CELL 2(2) 163-171 a) e/ou

Promotor de EF1A2: fator de alongamento de tradução máximo de Glicina EF1 alfa (US 20090133159).

[084] Um tipo de construção de vetor recombinante é um “plasmídeo,” o qual se refere a um laço de DNA de filamento duplo circular no qual segmentos de DNA adicionais podem ser ligados. Outro tipo de vetor é um vetor viral, em que segmentos de DNA adicionais podem ser ligados no interior do genoma viral. Determinadas construções de vetores recombinantes têm capacidade de replicação autônoma em uma célula vegetal hospedeira na qual eles são introduzidos. Outras construções de vetores recombinantes são integradas no interior do genoma de uma célula vegetal hospedeira mediante

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37/58 introdução no interior da célula hospedeira, e através disso são replicados junto com o genoma hospedeiro. Em particular, a construção de vetor é capaz de direcionar a expressão de gene para o qual os vetores são ligados de modo funcional. Entretanto, a invenção é destinada a incluir tais outras formas de construções de vetores de expressão, tal como vetores virais (por exemplo, vírus X de batata, vírus rattle de tabaco, e/ou Geminivírus), os quais servem funções equivalentes.

[085] Uma construção de vetor preferencial compreende a sequência que tem SEQ ID No. 9.

[086] A presente invenção fornece adicionalmente uma planta de soja transgênica, parte de planta ou célula vegetal transformada com uma construção de vetor que compreende o gene de ADR-1. Preferencialmente, a construção de vetor é uma construção de vetor conforme definido acima.

[087] As partes colhíveis da planta de soja transgênica de acordo com a presente invenção são parte da invenção. As partes colhíveis podem ser sementes, raízes, folhas e/ou flores que compreendem o gene de ADR-1. Os feijões-soja preferenciais são os que compreendem o gene de ADR-1 transgênico.

[088] Os produtos derivados da planta de soja transgênica de acordo com a presente invenção, partes da mesma ou partes colhíveis da mesma são parte da invenção.

[089] A presente invenção também inclui métodos para a produção de um produto que compreende a) cultivar as plantas da invenção e b) produzir o dito produto a partir ou pelas plantas da invenção e/ou partes das mesmas, por exemplo, sementes dessas plantas. Em uma realização adicional o método compreende as etapas a) cultivar as plantas da invenção, b) remover as partes colhíveis conforme definido acima das plantas e c) produzir o dito produto a partir ou pelas partes colhíveis da invenção.

[090] Em uma realização o método para a produção de um

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38/58 produto compreende

a) cultivar as plantas da invenção ou obteníveis pelos métodos DA invenção e

b) produzir o dito produto a partir ou pelas plantas da invenção e/ou partes, por exemplo, sementes dessas plantas.

[091] O produto pode ser produzido no sítio em que a planta foi cultivada, as plantas e/ou partes das mesmas podem ser removidas do sítio em que as plantas foram cultivadas para produzir o produto. Tipicamente, a planta é cultivada, as partes colhíveis desejadas são removidas da planta, se possível em ciclos repetidos, e o produto feito a partir das partes colhíveis da planta. A etapa de cultivo da planta pode ser realizada uma somente uma vez toda vez que os métodos da invenção forem realizados, enquanto que permite repetidas vezes as etapas de produção de produto, por exemplo, por remoção repetida de partes colhíveis das plantas da invenção e se necessário processamento adicional dessas partes para chegar ao produto. Também é possível que a etapa de cultivo das plantas da invenção seja repetida e plantas ou partes colhíveis sejam armazenadas até que a produção do produto seja então realizada uma vez para as plantas ou partes de planta acumuladas. Além disso, as etapas de cultivo das plantas e produção do produto podem ser realizadas com uma sobreposição no tempo, até mesmo simultaneamente para uma extensão grande ou sequencialmente. Geralmente as plantas são cultivadas por algum tempo antes de o produto ser produzido.

[092] Em uma realização os produtos produzidos pelos ditos métodos da invenção são produtos de planta tal como, sem limitação, um gênero comestível, gênero alimentício, um suplemento comestível, suplemento alimentício, fibra, cosmético ou farmacêutico. Gêneros comestíveis são considerados como composições usadas para nutrição ou para complementar

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39/58 nutrição. Rações de animal e suplementos alimentícios de animal, Em particular, são considerados como gêneros comestíveis.

[093] Um produto preferencial é farelo de soja e/ou óleo de soja.

[094] Em outra realização os métodos inventivos para a produção são usados para fazer produtos agrícolas tal como, se limitação, extratos de planta, proteínas, aminoácido, carboidratos, gorduras, óleos, polímeros, vitaminas e similares.

[095] É possível que um produto de planta consista em um ou mais produtos agrícolas por uma extensão grande.

[096] As plantas transgênicas da invenção podem ser cruzadas com outras plantas transgênicas semelhantes ou com plantas transgênicas que carecem dos ácidos nucleicos da invenção ou com plantas não transgênicas, com o uso de métodos conhecidos de reprodução de planta, para preparar sementes. Adicionalmente, as células vegetais transgênicas ou plantas da presente invenção podem compreender, e/ou ser cruzadas com outra planta transgênica que compreende um ou mais ácidos nucleicos, criando-se, então, uma “pilha” de transgenes na planta e/ou sua progenia. A semente é então plantada para obter uma planta transgênica cruzada fértil que compreende o ácido nucleico da invenção. A planta transgênica cruzada fértil pode ter o cassete de expressão particular herdado através de um pai fêmea ou através de um pai macho. A segunda planta pode ser uma planta inata. O transgênico fértil cruzado pode ser um híbrido. Também incluídos dentro da presente invenção são sementes de quaisquer dessas plantas transgênicas férteis cruzadas. As sementes dessa invenção podem ser colhidas a partir de plantas transgênicas férteis e ser usadas para cultivar gerações de progenia de plantas transformadas dessa invenção que inclui linhagens de planta híbrida que compreendem o ácido nucleico recombinante que compreende o gene de ADRPetição 870190140342, de 27/12/2019, pág. 48/133

40/58 transgênico.

[097] De acordo com a presente invenção, o ácido nucleico recombinante introduzido pode ser mantido na célula vegetal de forma estável se for incorporado no interior de um replicão autônomo não cromossômico ou integrado no interior dos cromossomos de planta. Se presente em uma construção de vetor replicante ou não replicante extra-cromossômico ou uma construção de vetor que é integrada no interior de um cromossomo, o ácido nucleico recombinante reside, preferencialmente em um cassete de expressão de planta. Um cassete de expressão de planta contém, preferencialmente sequências reguladoras capazes de acionar expressão de gene em células vegetais que ligadas de modo funcional de modo que cada sequência possa cumprir sua função, por exemplo, terminação de transcrição por sinais de poliadenilação. Os sinais de poliadenilação preferenciais são aqueles se originam do t-DNA de Agrobacterium tumefaciens tal como o gene 3 conhecido como octopina sintase do Ti-plasmídeo pTiACH5 (Gielen et al., 1984, EMBO J. 3:835) ou equivalentes funcionais do mesmo, mas também todos os outros terminadores funcionalmente ativos em plantas são adequados. Como expressão de gene de planta é muito frequentemente não limitada em níveis transcricionais, um cassete de expressão de planta contém preferencialmente todas as outras sequências ligadas de modo funcional como acentuadores traducionais tal como sequência de Overdrive que contém a sequência líder não traduzida de 5' do vírus mosaico de tabaco que acentua o polipeptídeo por razão de RNA (Gallie et al., 1987, Nucl. Acids Research 15:8.693 a 8.711). Exemplos de vetores de expressão de planta incluem aqueles detalhados em: Becker, D. et al., 1992, New plant binary vectors with selectable markers located proximal to the left border, Plant Mol. Biol. 20:1.195 a 1.197; Bevan, M.W., 1984, Binary Agrobacterium vectors for plant transformation, Nucl. Acid. Res. 12:8.711 a 8.721; e Vectors for Gene Transfer in Higher Plants; in:

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Transgenic Plants, Vol. 1, Engineering and Utilization, eds.: Kung e R. Wu, Academic Press, 1993, S. 15 a 38.

[098] De acordo com a presente invenção o gene de ADR-1 tem capacidade de aumentar a quantidade de proteína ou função da proteína ADR-1 em célula vegetal e/ou no fungo. Em realizações preferenciais, o aumento na quantidade de proteína ou função da proteína ADR-1 acontece de uma forma específica por tecido ou constitutiva. Em realizações especialmente preferenciais, um aumento induzido essencialmente por patogênico na quantidade de proteína ou função de proteína acontece, por exemplo, por expressão recombinante do gene de ADR-1 sob o controle de um promotor induzível por fungo. Em particular, a expressão do gene de ADR-1 acontece em sítios infectados por fungo, em que, entretanto, preferencialmente a expressão do gene de ADR-1 permanece essencialmente inalterada em tecidos não infectados por fungo. Em realizações preferenciais, a quantidade de proteína da proteína ADR-1 na planta e/ou o fungo é aumentado por pelo menos 10%, pelo menos 20%, pelo menos 30%, pelo menos 40%, pelo menos 50%, pelo menos 60%, pelo menos 70%, pelo menos 80%, pelo menos 90%, ou pelo menos 95% ou mais em comparação com a planta de tipo selvagem que não é transformada com o ácido nucleico de ADR-1. Preferencialmente, a planta de tipo selvagem é uma planta de um genótipo semelhante, com mais preferência idêntico ao da planta transformada com o ácido nucleico de ADR-1.

[099] Adicionalmente, a presente invenção fornece um método para a produção de uma planta transgênica que tem resistência aumentada contra ferrugem, sendo que compreende:

(a) introduzir uma construção de vetor recombinante conforme definido acima no interior de uma planta ou célula vegetal, (b) regenerar a planta a partir da célula vegetal e (c) expressar uma proteína

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42/58 (i) que tem pelo menos 60%, pelo menos 70%, pelo menos 80%, pelo menos 90% pelo menos 95%, pelo menos 98% ou 100% de identidade com SEQ ID No. 2, um fragmento funcional do mesmo, um ortólogo e/ou parálogo do mesmo e/ou (ii) uma proteína codificada por um ácido nucleico que tem pelo menos 60%, pelo menos 70%, pelo menos 80%, pelo menos 90%, pelo menos 95%, pelo menos 98% ou 100% de identidade com SEQ ID No. 1, um fragmento funcional do mesmo e/ou um ácido nucleico capaz de hibridizar com tal ácido nucleico.

[0100] A sequência de ácido nucleico de ADR-1 pode compreender um motivo super-hélice N-terminal, um sítio de ligação de nucleotídeo e/ou um motivo de repetição rica em leucina C-terminal.

[0101] Preferencialmente, o motivo super-hélice N-terminal tem pelo menos 70%, pelo menos 80%, pelo menos 90%, pelo menos 95%, pelo menos 98% ou 100% de identidade com SEQ ID No 3.

[0102] Preferencialmente, o sítio de ligação de nucleotídeo tem pelo menos 70%, pelo menos 80%, pelo menos 90%, pelo menos 95%, pelo menos 98% ou 100% de identidade com SEQ ID No 5.

[0103] Preferencialmente, o motivo de repetição rica em leucina C-terminal tem pelo menos 70%, pelo menos 80%, pelo menos 90%, pelo menos 95%, pelo menos 99% ou 100% de identidade com SEQ ID No 7.

[0104] A sequência de proteína ADR-1 compreende, preferencialmente, um motivo super-hélice N-terminal, um sítio de ligação de nucleotídeo e/ou um motivo de repetição rica em leucina C-terminal.

[0105] Preferencialmente, o motivo super-hélice N-terminal tem pelo menos 70%, pelo menos 80%, pelo menos 90%, pelo menos 95%, pelo menos 98% ou 100% de identidade com SEQ ID No 4.

[0106] Preferencialmente, o sítio de ligação de nucleotídeo tem

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43/58 pelo menos 70%, pelo menos 80%, pelo menos 90%, pelo menos 95%, pelo menos 98% ou 100% de identidade com SEQ ID No 6.

[0107] Preferencialmente, o motivo de repetição rica em leucina C-terminal tem pelo menos 70%, pelo menos 80%, pelo menos 90%, pelo menos 95%, pelo menos 98% ou 100% de identidade com SEQ ID No 8.

[0108] Todas as definições dadas para termos usados em tipo específico de categoria (método para produzir uma planta e/ou parte da mesma resistente a ferrugem de soja, célula vegetal transgênica, construção de vetor, uso de construção de vetor etc.) também pode ser aplicável para outras categorias.

Figuras [0109] A Figura 1 mostra a sequência de comprimento completo do gene de ADR-1 de Arabidopsis thaliana que tem SEQ ID No.1.

[0110] A Figura 2 mostra a sequência da proteína ADR-1 (SEQ ID 2).

[0111] A Figura 3 mostra motivos diferentes no gene de ADR-1 (SEQ ID Nos. 3, 5, 7) e da proteína ADR-1 (SEQ ID Nos. 4, 6, 8).

[0112] A Figura 4 mostra um esquema de uma construção de vetor útil de acordo com a presente invenção.

[0113] A Figura 5 mostra a sequência de nucleotídeo inteira de uma construção de vetor de acordo com a presente invenção (SEQ ID No. 9).

[0114] A Figura 6 mostra o sistema de pontuação usado para determinar o nível de área de folha com doença de plantas de soja de tipo selvagem e transgênicas (que expressa ADR-1) contra o fungo de ferrugem P. pachyrhizi.

[0115] A Figura 7 mostra o resultado da pontuação de 22 plantas de soja transgênicas que expressam a construção de vetor de superexpressão de ADR-1. Plantas de soja de T0 que expressam de proteína ADR-1 foram

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44/58 inoculados com esporos de Phakopsora pachyrhizi. A avaliação da área de folha com doença em todas as folhas foi realizada 14 dias após inoculação. A média da porcentagem da área de folha que mostra colônias fúngicas ou amarelamento/escurecimento forte em todas as folhas foi considerada como área de folha com doença. Em todas as 22 plantas de To soja que expressam ADR-1 (expressão verificada por RT-PCR) foram avaliadas em paralelo a plantas de controle não transgênicas. A média da área de folha com doença é mostarda na Figura 7. A superexpressão de ADR-1 reduz fortemente a área de folha com doença em comparação com plantas de controle não transgênicas.

Exemplos [0116] Os exemplos seguintes não são destinados a limitar o escopo das reivindicações para a invenção, mas são, em vez disso, destinados a determinadas realizações. Quaisquer variações nos métodos exemplificados que ocorrem ao técnico versado são destinadas a cair dentro do escopo da presente invenção.

Exemplo 1 métodos Gerais [0117] A síntese química de oligonucleotídeos pode ser afetada, por exemplo, na forma conhecida com o uso do método de fosfoamidita (Voet, Voet, 2^a Edição, Wiley Press New York, páginas 896 a 897). As etapas de clonagem realizadas para os propósitos da presente invenção tal como, por exemplo, clivagens de restrição, eletroforese de gel de agarose, purificação de fragmentos de DNA, transferência de ácidos nucleicos a nitrocelulose e membranas de náilon, fragmentos de DNA de ligação, transformação de células de E. coli, culturas bacterianas, multiplicação de fago e análise de sequência de DNA recombinante, são realizadas conforme descrito por Sambrook et al. Cold Spring Harbor Laboratory Press (1989), ISBN 0-87969-309-6. O sequenciamento de moléculas de DNA recombinante é realizado com um sequenciador de DNA

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45/58 de fluorescência de laser MWG-Licor após o método de Sanger (Sanger et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 74, 5.463 (1977)).

Exemplo 2

Clonagem de construção de vetor de superexpressão de ADR-1 [0118] A construção de vetor de superexpressão de ADR-1 (Figuras 4 e 5) foi preparado como a seguir:

[0119] Salvo especificação em contrário, os métodos padrão conforme descritos em Sambrook et al., Molecular Cloning: A laboratory manual, Cold Spring Harbor 1989, Cold Spring Harbor Laboratory Press são usados.

[0120] cDNA foi produzido a partir de RNA de Arabidopsis thaliana (ecotipo Col-0) usando-se o kit de síntese de cDNA Superscript II (Invitrogen). Todas as etapas de preparação e purificação de cDNA foram realizadas conforme descrito no manual.

[0121] A sequência de SEQ ID No.1 foi amplificado a partir de cDNA por PCR conforme descrito no protocolo da Phusion hot-start, Pfu Ultra, Pfu Turbo ou Herculase DNA polimerase (Stratagene). A composição para o protocolo da Pfu Ultra, Pfu Turbo ou Herculase DNA polimerase foi como a seguir: 1x de tampão de PCR, 0,2 mM de cada dNTP, 100 ng de cDNA de Arabidopsis thaliana (var Columbia-0) , 50 pmol de iniciador de avanço, 50 pmol de iniciador inverso, 1 u Phusion hot-start, Pfu Ultra, Pfu Turbo ou Herculase DNA polimerase.

[0122] Os ciclos de amplificação foram como a seguir:

[0123] 1 ciclo de 60 segundos a 98°C, seguido por 35 ciclos de em cada caso 10 segundos a 98°C, 30 segundos a 60°C e 60 segundos a 72°C, seguido por 1 ciclo de 10 minutos a 72°C, então 4°C.

[0124] As seguintes sequências de iniciador foram usadas para amplificar especificamente o ORF de comprimento completo de ADR-1 para propósitos de clonagem:

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i) iniciador de avanço: 5'CCGGTACCATGGCTTCGTTCATAGAT3' (SEQ ID NO: 10) ii) iniciador inverso: 5'-TTGTCGACCTAATCGTCAAGCCAATC3'(SEQ ID NO: 11) [0125] Os fragmentos amplificados foram digeridos com o uso das enzimas de restrição Acc65I e Sail (NEB Biolabs) e ligadas em um vetor de Gateway pENTRY digerido de Acc65I / Sail (Invitrogen, Life Technologies, Carlsbad, California, USA) de tal forma que o fragmento de ADR-1 de comprimento completo seja localizado em direção de senso entre os sítios de recombinação de attL1 e attL2.

[0126] Para obter o vetor de transformação de planta binário, uma reação de LR tripla (sistema Gateway, (Invitrogen, Life Technologies, Carlsbad, California, USA) foi realizada de acordo com protocolo de fabricantes usando-se um vetor de pENTRY-A que contém um promotor de ubiquitina de salsa, o ADR-1 em um vetor de pENTRY-B e um vetor de pENTRY-C que contém um terminador de t-Nos. Como alveja um vetor de pDEST binário foi usado o qual é composto de: (1) um cassete de resistência de canamicina para seleção bacteriana (2) um origem de pVS1 para replicação em Agorbacteria (3) uma origem de pBR322 de replicação para manutenção adequada em E. coli e (4) entre o canto direito e esquerdo uma seleção de AHAS sob controle de um promotor de pcUbi (Figura 4). A reação de recombinação foi transformada em E. coli (DH5alpha), mini-preparado e triado por digestões de restrição específicas. Um clone positivo de cada construção de vetor foi sequenciado e submetido a transformação de soja.

Exemplo 3

Transformação de Soja [0127] A construção de vetor de expressão de ADR-1 (consulte exemplo 2) foi transformado em soja.

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3.1 - Esterilização e Germinação de Sementes de Soja [0128] Virtualmente qualquer semente de qualquer variedade de soja pode ser empregada no método da invenção. Uma variedade de cultivar de soja (que inclui Jack, Williams 82, e Resnik) é apropriada para transformação de soja. As sementes de soja foram esterilizadas em uma câmara com um gás de cloro produzindo adicionando-se 3,5 ml de 12N HCl por gotejamento em 100 ml de branqueador (5,25% de hipoclorito de sódio) em um dessecador com uma tampa hermética. Após 24 a 48 horas na câmara, as sementes foram removidas e aproximadamente 18 a 20 sementes foram plaqueadas em meio de GM sólido com ou sem 5 μΜ de 6-benzil-aminopurina (BAP) em 100 mm de pratos de Petri. As mudas em BAP são mais alongadas e raízes se desenvolvem, especialmente formação de raiz lateral e secundária. BAP fortalece a muda formando-se uma muda mais robusta e mais curta.

[0129] As mudas de sete dias de idade cultivadas na luz (>100 μEinstein/m²s) a 25°C foram usadas para explantar material para os três tipos de explante. Nesse momento, o revestimento de semente foi rompido e o epicótilo com as folhas unifoliares cresceram para, no mínimo, o comprimento dos cotilédones. O epicótilo dever ser pelo menos 0,5 cm para evitar o tecido de nó cotiledonário (visto que cultivares de soja e lotes de semente podem variar no tempo de desenvolvimento, uma descrição do estágio de germinação é mais preciso que um tempo de germinação específico).

[0130] Para inoculação de mudas inteiras (Método A, consulte exemplo 3.3.1 e 3.3.2) ou explantes de folha (Método B, consulte exemplo 3.3.3), as mudas estavam então prontas para transformação.

[0131] Para o método C (consulte exemplo 3.3.4), o hipocótilo e um e meio ou parte de ambos cotilédones foram removidos de cada muda. As mudas foram então colocadas em meio de propagação por 2 a 4 semanas. As mudas produzem brotos ramificados para obter explantes. A maioria dos

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48/58 explantes originaram da plântula que cresce a partir do broto apical. Esses explantes foram usados preferencialmente como tecido alvo.

3.2 - Crescimento e Preparação de Cultura de Agrobacterium [0132] Culturas de Agrobacterium foram preparadas estriando-se Agrobacterium (por exemplo, A. tumefaciens ou A. rhizogenes) que transportam o vetor binário desejado (por exemplo, H. Klee. R. Horsch e S. Rogers 1987 Agrobacterium-Mediated Plant Transformation and its further Applications to Plant Biology; Annual Review of Plant Physiology Vol. 38: 467 a 486) em meio YEP de meio de crescimento de YEP sólido: 10 g de extrato de levedura. 10 g de Bacto Peptona. 5 g de NaCl. Ajustar pH para 7,0, e levar volume final para 1 litro com H2O, para placas de ágar de YEP adicionar 20g Agar, autoclave) e incubar a 25°C. até que colônias apareçam (cerca de 2 dias). Dependendo dos genes de marcador selecionável presentes no plasmídeo de Ti ou Ri, no vetor binário, e nos cromossomos bacterianos, compostos de seleção diferentes foram usados para seleção de A. tumefaciens e rhizogenes no meio de líquido e sólido de YEP. Várias cepas de Agrobacterium podem ser usadas para o método de transformação.

[0133] Após aproximadamente dois dias, uma única colônia (com um palito estéril) foi obtida e 50 ml de YEp líquido foram inoculados com antibióticos e sacudidos a 175 rpm (25°C.) até que um OD.sub.600 entre 0,8 a 1,0 seja atingido (aproximadamente 2 d). Estoques de glicerol de trabalho (15%) para transformação são preparados e um-ml de estoque de Agrobacterium aliquotado em tubos de 1,5 ml Eppendorf então armazenados a -80 °C.

[0134] O dia anterior á inoculação de explante, 200 ml de YEP foram inoculados com 5 ml a 3 ml de estoque de Agrobacterium de trabalho em um frasco de 500 ml Erlenmeyer. O frasco foi sacudido de um dia para o outro

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49/58 a 25°C. até que o OD.sub.600 estivesse entre 0,8 e 1,0. Antes de preparar os explantes de soja, as Agrobacteria foram sedimentadas por centrifugação por 10 min em 5.500.vezes.g a 20°C. A pelota foi ressuspensa em CCM líquido para a densidade desejada (OD.sub.600 0,5 a 0,8) e colocada em temperatura ambiente pelo menos 30 minutos antes de uso.

3.3 - Preparação de Explante e Cocultivo (Inoculação)

3.3.1 - Método A: Preparação de Explante no Dia da Transformação.

[0135] Mudas nesse momento tinham epocótilos alongados a partir de pelo menos 0,5 cm mas geralmente entre 0,5 e 2 cm. Os epicótilos alongados de até 4 cm em comprimento foram empregados com sucesso. Os explantes foram então preparados com: i) com ou sem algumas raízes, ii) com um parcial, um ou ambos cotilédones, todas as folhas pré-formadas foram removidas incluindo meristema apical, e o nó localizado no primeiro conjunto de folhas foi danificado com diversos cortes com o uso de um bisturi afiado.

[0136] Esse corte no nó não somente induziu infecção de Agrobacterium mas também distribui as células de meristema e brotos préformados danificados. Após ferimento e preparação, os explantes foram colocados de lado em um prato de Petri e cultivados subsequentemente com uma mistura de CCM/Agrobacterium líquida por 30 minutos. Os explantes foram então removidos do meio líquido e plaqueado no topo de um papel de filtro estéril com placas de Petri de 15.vezes.100 mm com meio de cocultivo sólido. Os tecidos alvo feridos foram colocados de modo que eles entrem em contato direto com o meio.

3.3.2 - Método Modificado A: Preparação de Explante de Epicótilo [0137] Os segmentos de epicótilo de soja preparados a partir de mudas de 4 a 8 dias de idade foram usados como explantes para regeneração e transformação. As sementes de sojaacv L00106CN, 93-41131 e

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Jack foram germinadas em 1/10 MS de sais ou um meio de composição semelhante com ou sem citocinas por 4 a cerca de 8 dias. Os explantes de epicótilo foram preparados removendo-se o nó cotiledôneo e nó de caule da seção de caule. O epicótilo foi cortado em 2 a 5 segmentos. Especialmente preferenciais são segmentos fixados ao nó superior ou primário que compreende tecido merismático auxiliar.

[0138] Os explantes foram usados para infecção de Agrobacterium. Agrobacterium AGL1 que abriga um plasmídeo com o gene de marcador de GUS e o gene de marcador selecionável de AHAS, bar ou dsdA foi cultivado em meio de LB com antibióticos apropriados de um dia para o outro, colhidos e ressuspensos em um meio de inoculação com acetosiringona . Os segmentos de epicótilo preparados recentemente foram encharcados na suspensão de Agrobacterium por 30 a 60 minutos e então os explantes foram enxugados em papéis filtro estéreis. Os explantes inoculados foram então cultivados em um meio de cocultura com L-cisteína e TTD e outros produtos químicos tal como acetosiringona para acentuar entrega de T-DNA por 2 a 4 dias. Os explantes de epicótilo infectados foram então colocados em um meio de indução de broto com agentes de seleção tal como imazapii (para gene de AHAS), glufosinato (para gene de bar), ou D-serina (para gene de gene). Os brotos regenerados foram subcultivados em meio de alongamento com agente seletivo.

[0139] Para regeneração de plantas transgênicas, os segmentos foram então cultivados em um meio com citocinas tal como BAP, TDZ e/ou Kinetin para indução de broto. Após 4 a 8 semanas, os tecidos cultivados foram transferidos para um meio com concentração inferior de citocinina para alongamento de broto. Os brotos alongados foram transferidos para um meio com auxina para enraizamento e desenvolvimento de planta. Múltiplos brotos foram regenerados.

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51/58 [0140] Muitos setores transformados estáveis que mostram expressão de GUS forte foram recuperados. As plantas de soja foram regeneradas a partir de explantes de epicótilo. A entrega de T-DNA eficiente e setores transformados estáveis foram demonstrados.

3.3.3 - Método B: Explantes de Folha [0141] Para a preparação do explante de folha o cotilédone foi removido do hipocótilo. Os cotilédones foram separados um do outro e o epicótilo é removido. As folhas primárias, as quais consistem na camada, no pecíolo, e nas estípulas, foram removidas do epicótilo cortando-se cuidadosamente na base das estípulas de modo que os meristemas auxiliares fossem incluídos no explante. Para ferir o explante bem como para estimular formação de broto, quaisquer brotos pré-formados foram removidos e a área entre as estípulas foi cortada com um bisturi afiado 3 a 5 vezes.

[0142] Os explantes são ou imersos complemente ou a extremidade de pecíolo ferida imersa na suspensão de Agrobacterium imediatamente após preparação de explante. Após inoculação, os explantes são enxugados em papel filtro estéril para remover excesso de cultura de Agrobacterium e colocar explantes com o lado ferido em contato com um papel Whatman de 7 cm arredondado sobreposto ao meio de CCM sólido (consulte acima). Esse papel filtro evitar A. tumefaciens crescimento exagerado nos explantes de soja. Enrolar cinco placas com Parafilm.TM. M (American National Can, Chicago, Ill., USA) e incubar por três a cinco dias no escuro ou na luz a 25°C.

3.3.4 - Método C: Meristema Axilar Propagado [0143] Para a preparação do explante de meristema axilar propagado, plântulas de três semanas de idade propagadas foram usadas. Os explantes de meristema axilar podem ser preparados a partir do primeiro e quarto nó. Um média de três a quatro explantes poderiam ser

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52/58 obtidos a partir de cada muda. Os explantes foram preparados a partir de plântulas cortando-se 0,5 a 1,0 cm abaixo do nó axilar no inter-nó e removendo-se o pecíolo e folha do explante. A ponta em que os meristemas axilares ficam foi cortada com um bisturi para induzir crescimento de broto e permitir acesso de células alvo à Agrobacterium. Portanto, um explante de 0,5 cm incluía o caule e um broto.

[0144] Uma vez cortado, os explantes foram colocados imediatamente na suspensão de Agrobacterium por 20 a 30 minutos. Após inoculação, os explantes foram enxugados em papel filtro estéril para remover excesso de cultura de Agrobacterium então colocados quase completamente imersos em CCM sólido ou no topo de um papel filtro de 7 cm arredondado sobreposto ao CCM sólido, dependendo da cepa de Agrobacterium. Esse papel filtro evita Agrobacterium crescimento exagerado nos explantes de soja. As placas foram enroladas com Parafilm.TM. M (American National Can, Chicago, Ill., USA) e incubadas por dois a três dias no escuro a 25°C.

3.4 - Indução de Broto [0145] Após cocultivo de 3 a 5 dias no escuro a 25°C., os explantes foram enxaguados em meio de SIM líquido (para remover Agrobacterium em excesso) (SIM, consulte Olhoft et al 2007 A novel Agrobacterium rhizogenes-mediated transformation method of soyusing primary-node explants from seedlings In Vitro Cell. Dev. Biol.—Plant (2007) 43:536 a 549; para remover Agrobacterium em excesso) ou meio de Modwash (1X de sais principais de B5, 1X de sais menores de B5, 1X de ferro de MSIII, 3% de sacarose, 1X de vitaminas B5, 30 mM de MES, 350 mg/l de Timentin™ pH 5,6, WO 2005/121345) e enxugado em papel filtro estéril (para evitar danos especialmente na lamina) antes de colocadas no meio de SIM sólido. Os aproximadamente 5 explantes (Método A) ou 10 a

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53/58 (Métodos B e C) explantes foram colocados de modo que o tecido alvo estivesse em contato direto com o meio. Durante as primeiras 2 semanas, os explantes poderiam ser cultivados com ou sem meio seletivo. Preferencialmente, os explantes foram transferidos em SIM sem seleção por uma semana.

[0146] Para explantes de folha (Método B), o explante deveria ser colocado no meio de modo que esteja perpendicular á superfície do meio com o pecíolo embutido no meio e a lamina fora do meio.

[0147] Para meristema axilar propagado (Método C), o explante foi colocado no meio de modo que estivesse paralelo à superfície do meio (basípeta) com o explante parcialmente embutido no meio.

[0148] Placas enroladas com fita de ventilação de Scotch 394 (3M, St. Paul, Minn., USA) foram colocadas em uma câmara de crescimento por duas semanas com uma temperatura no meio de 25°C sob ciclo de 18 horas de luz/6 horas escuro em 70 a 100 .mu.E/m.sup.2s. Os explantes permaneceram no meio de SIM com ou sem seleção até que crescimento de broto ocorresse na área alvo (por exemplo, meristemas axilares no primeiro nó acima do epicótilo). A transferências meio fresco pode ocorrer durante esse tempo. Os explantes foram transferidos do SIM com ou sem seleção para SIM com seleção após cerca de uma semana. Nesse momento, existiu desenvolvimento de broto considerável na base do pecíolo dos explantes de folha em uma variedade de SIM (Método B), no nó primário para explantes de muda (Método A), e nos nós axilares de explantes propagados (Método C).

[0149] Preferencialmente, todos os brotos formados antes de transformação foram removidos até 2 semanas após cocultivo para estimular novo crescimento a partir dos meristemas. Isso ajudou a reduzir

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54/58 quimerismo no transformante primário e aumentar amplificação de células merismáticas transgênicas. Durante esse momento o explante pode ou não pode ser cortado em pedaços menores (isto é destacar o node do explante cortando-se o epicótilo).

3.5 - Alongamento de Broto [0150] Após 2 a 4 semanas (ou até que uma massa de brotos fosse formada) em meio de SIM (preferencialmente com seleção), os explantes foram transferidos para meio de SEM (meio de alongamento de broto, consulte Olhoft et al 2007 A novel Agrobacterium rhizogenesmediated transformation method of soyusing primary-node explants from seedlings In Vitro Cell. Dev. Biol.—Plant (2007) 43:536 a 549) que estimula alongamento de broto do primórdio de broto. Esse meio pode ou não conter um composto de seleção.

[0151] Após cada 2 a 3 semanas, os explantes foram transferidos para meio de SEM fresco (que contém preferencialmente seleção) após remover cuidadosamente tecido morto. Os explantes deveriam manter juntos e não fragmentar em pedaços e reter alguma saúde. Os explantes continuaram a ser transferidos até que o explante morra ou o broto alongue. Os brotos alongados >3 cm foram removidos e colocados em meio de RM por cerca de 1 semana (Método A e B), ou cerca de 2 a 4 semanas dependendo do cultivar (Método C) no momento que raízes começaram a formar. No caso de explantes com raízes, elas foram transferidas diretamente para o solo. Os brotos enraizados foram transferidos para o solo e endurecidos em uma câmara de crescimento por 2 a 3 semanas antes de transferir para a estufa. As plantas regeneradas obtidas com o uso desse método estavam férteis e produzidas em média 500 sementes por planta.

[0152] A expressão de GUS transiente após 5 dias de

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55/58 cocultivo com Agrobacterium tumefaciens foi expandida nos explantes de meristema axilar de muda especialmente nas regiões com ferimento durante preparação de explante (Método A). Os explantes foram colocados em meio de indução de broto sem seleção para ver como o nó primário responde a indução e regeneração de broto e regeneração. Até o momento, mais que 70% dos explantes foram transformados em novos brotos nessa região. A expressão do gene de GUS estava estável após 14 dias em SIM, em que implica integração do T-DNA no genoma de soja. Adicionalmente, experimentos preliminares resultaram na formação de brotos positivos de GUS que formam após 3 semanas em SIM.

[0153] [Para o Método C, o tempo de regeneração médio de uma plântula de soja com o uso do protocolo de meristema axilar foi 14 semanas a partir da inoculação de explante. Portanto, esse método tem um tempo de regeneração rápido que leva a plantas de soja com saúde fértil.

Exemplo 4 Ensaio de Patógeno 4.1 - Recuperação de clones [0154] 2 a 3 clones por evento de TO foram postos em pequenos potes de 6cm. Para recuperação, os clones foram mantidos por 12 a 18 dias na Fitocâmara (Ritmo de 16 horas de dia e 8 horas de noite em uma temperatura de 16° bis 22°C e uma umidade de 75% foram cultivados).

4.2 - INOCULAÇÃO [0155] O fungo de ferrugem é um isolado selvagem do Brasil. As plantas foram inoculadas com P.pachyrhizi .

[0156] A fim de obter material de esporo apropriado para a inoculação, folhas de soja as quais foram infectadas com ferrugem 15 a 20 dias atrás, foram tomadas 2 a 3 dias antes da inoculação e transferidas para placas de ágar (1 % de ágar em H2O). As folhas foram colocadas com

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56/58 seu lado superior no ágar, o que permitiu que o fungo crescesse através do tecido e produzisse esporos muito novos. Para a solução de inoculação, os esporos foram retirados das folhas e foram adicionados a uma solução de Tween-H2O. A contagem de esporos foi realizada sob um microscópio leve por meio de uma câmara de contagem de Thoma. Para a inoculação das plantas, a suspensão de esporo foi adicionada em um frasco de aspersão operado por ar comprimido e aplicada de forma uniforme nas plantas ou nas folhas até que a superfície da folha estivesse bem úmida. Para ensaios macroscópicos usamos uma densidade de esporo de 1 a 5x10⁵ esporos/ml. Para o microscópio, uma densidade de >5 x 10⁵ esporos/ml é usada. As plantas inoculadas foram colocadas por 24 horas em uma câmara de estufa com uma média de 22°C e >90% de umidade do ar. O seguinte cultivo foi realizado em uma câmara com uma média de 25°C e 70% de umidade do ar.

Exemplo 5

Triagem microscópica [0157] Para a avaliação do desenvolvimento de patógeno, as folhas inoculadas de plantas foram manchadas com anilina azul 48 horas após infecção.

[0158] A coloração de anilina azul serve para a detecção de substâncias fluorescentes. Durante as reações de defesa em interações de hospedeiro e interações de não hospedeiro, as substâncias tais como fenóis, calose ou lignina acumulada ou foram produzidas e foram incorporadas na parede celular ou localmente em papilas ou na célula inteira (reação hipersensível, HR). Os complexos foram formados em associação com anilina azul, a qual leva, por exemplo, no caso de calose a fluorescência amarela. O material de folha foi transferido para tubos tipo falcon ou pratos que contêm solução descolorante II (etanol / ácido acético

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6/1) e foi incubada em um banho de água a 90°C por 10 a 15 minutos. A solução descolorante II foi removida posteriormente, e as folhas foram lavadas 2x com água. Para a coloração, as folhas foram incubadas por 1,5 a 2 horas em solução de coloração II (0.05% anilina azul = metila azul, 0,067 M de di-potássio fosfato de hidrogênio) e analisada por microscópio imediatamente após.

[0159] Os tipos diferentes de interação foram avaliados (contados) por microscópio. Um microscópio Olympus UV BX61 (luz incidente) e um filtro Longpath de UV (excitação: 375/15, divisor de feixe: 405 LP) são usados. Após a coloração de anilina azul, os esporos apareceram azul sob luz UV. As papilas poderiam ser reconhecidas abaixo do apressório fúngico por uma coloração amarela/verde. A reação hipersensível (HR) foi caracterizada por uma fluorescência de célula inteira.

Exemplo 6

Avaliação da suscetibilidade a ferrugem de soja [0160] A progressão da doença de ferrugem de soja foi pontuada pela estimação da área com doença (área a qual estava coberta por uredínia de esporulação) no lado posterior (lado abaxial) da folha. Adicionalmente o amarelamento da folha foi levado em consideração. (para esquema consulte Figura 6).

[0161] As plantas de soja de T0 que expressam proteína ADR-1 foram inoculadas com esporos de Phakopsora pachyrhizi. Os sintomas de doença macroscópica de soja contra P. pachyrhizi de 22 plantas de soja de T0 foram pontuados 14 dias após inoculação.

[0162] A média da porcentagem da área de folha que mostra as colônias fúngicas ou escurecimento/amarelamento forte em todas as folhas foi considerado como área de folha com doença. Em todas 22

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58/58 plantas TO de soja que expressam ADR-1 (expressão verificada por RTPCR) foram avaliadas em paralelo a plantas de controle não transgênicas. Clones de Plantas de soja não transgênicas foram usados como controle. A média da área de folha com doença é mostrada na Figura 7 para plantas que expressam ADR-1 recombinante em comparação com plantas de tipo selvagem. A superexpressão de ADR-1 reduz bastante a área de folha com doença em comparação com plantas de controle não transgênicas. Esses dados indicam claramente que a expressão de planta de construção de vetor de expressão de ADR-1 leva a uma pontuação de doença inferior de plantas transgênicas em comparação com controles não transgênicos. Então, a expressão de ADR-1 em soja acentua a resistência de soja contra ferrugem de soja.

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Claims (9)

1. Reivindicações

   1. MÉTODO PARA AUMENTAR RESISTÊNCIA À

   FERRUGEM DE SOJA, em plantas e/ou células da planta de soja, caracterizado por compreender introduzir e expressar em uma planta ou célula da planta de soja pelo menos um ácido nucleico recombinante de SEQ ID NO: 1; que codifica uma proteína com a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 2;

   em uma quantidade e por um período suficiente para aumentar a resistência à ferrugem de soja em dita planta ou célula de planta de soja em comparação com a planta de soja selvagem ou a célula de planta de soja selvagem.
2. 2. MÉTODO, de acordo com a reivindicação 1, caracterizado por compreender:

   (a) transformar de forma estável uma célula de planta de soja com um cassete de expressão que compreende um ácido nucleico recombinante que codifica a dita pelo menos uma proteína com uma ligação funcional a um promotor; e (b) regenerar uma planta de soja a partir da célula de planta de soja.
3. 3. MÉTODO, de acordo com a reivindicação 2, caracterizado pelo promotor ser um promotor induzível por patógeno, um promotor constitutivo, ou um promotor específico de mesófilo.
4. 4. MÉTODO PARA PRODUZIR UMA PLANTA

   TRANSGÊNICA DE SOJA, que tem resistência aumentada contra ferrugem de soja, caracterizado por compreender:

   (a) introduzir e expressar em uma planta de soja ou célula de planta de soja, um ácido nucleico de SEQ ID NO: 1, que codifica uma proteína com a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 2, em que um aumento na

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   2/2 quantidade e/ou atividade da proteína codificada pelo dito ácido nucleico confere resistência aumentada contra a ferrugem de soja em dita planta transgênica de soja ou célula de planta de soja, em comparação com uma planta de soja selvagem ou uma célula de planta de soja selvagem.
5. 5. MÉTODO PARA PRODUZIR UM PRODUTO, caracterizado por compreender:

   a) cultivar as plantas transgênicas obtidas pelo método, conforme definido na reivindicação 4; e

   b) produzir dito produto a partir ou por meio de plantas e/ou partes de ditas plantas transgênicas.
6. 6. MÉTODO, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 5, caracterizado pela ferrugem de soja ser Phakopsora paryhizi e/ou Phakopsora meibomiae.
7. 7. MÉTODO, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 6, caracterizado pelo ácido nucleico ser operacionalmente ligado a um promotor selecionado do grupo que consiste em um promotor constitutivo, um promotor induzível por patógeno, e um promotor específico de mesófilo.
8. 8. MÉTODO, de acordo com a reivindicação 7, caracterizado por ainda compreender a seleção de uma planta transgênica que tem resistência aumentada contra a ferrugem de soja em comparação com a planta de soja controle não transgênica.
9. 9. MÉTODO, de acordo com a reivindicação 8, caracterizado por ainda compreender obter as sementes ou progênie da dita planta transgênica de soja.

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