MX2013001225A - Metodo para incrementar resistencia contra roya de soya en plantas transgenicas por gen adr-1. - Google Patents

Abstract

La presente invencin se refiere a un método para incrementar resistencia contra roya de la soya en plantas transgénicas y/o células de plantas. En estas plantas, el contenido y/o la actividad de una proteína ADR-1 se incrementan en comparación con las plantas de tipo silvestre que no incluyen un gen de ADR-1 recombinante.

Description

MÉTODO PARA INCREMENTAR RESISTENCIA CONTRA ROYA DE SOYA EN PLANTAS TRANSGENICAS POR GEN ADR-1 La presente invención se refiere a un método para aumentar la resistencia contra la roya de la soya en plantas transgénicas y/o células vegetales. En estas plantas, el contenido y/o la actividad de una proteina de ADR-1 se incrementa en comparación con las plantas de tipo silvestre no incluyendo un gen ADR-1 recombinante .

Además, la invención se refiere a plantas transgénicas y/o células de plantas que tienen una mayor resistencia contra la roya de la soya y a vectores de expresión recombinantes que comprenden una secuencia que es idéntica u homologa a una secuencia que codifica un Gen ADR-1 funcional o fragmentos del mismo.

El cultivo de plantas de cultivo agrícola sirve principalmente para la producción de productos alimenticios para seres humanos y animales. Los monocultivos, en particular, que son la norma en la actualidad, son altamente susceptibles a una epidemia, como la propagación de enfermedades. El resultado es marcadamente rendimientos reducidos. Hasta la fecha, los organismos patógenos han sido controlados principalmente por el uso de pesticidas. En la actualidad, la posibilidad de modificar directamente la disposición genética de una planta o un patógeno también está abierta para el hombre.

Resistencia generalmente significa la capacidad de una planta para prevenir, o por lo menos reducir la infestación y colonización por un patógeno dañino. Diversos mecanismos pueden ser discernidas en la resistencia de origen natural, con el que las plantas defenderse de colonización por organismos fitopatógenos . Estas interacciones especificas entre el patógeno y el huésped determinar el curso de la infección (Schopfer y Brennicke Pflanzenphysiologie (1999), Springer Verlag, Berlin-Heidelberg, Alemania) .

Con respecto a la resistencia especifica de raza, también llamada resistencia del huésped, se hace una diferenciación entre las interacciones compatibles e incompatibles. En la interacción compatible, se produce una interacción entre un patógeno virulento y una planta susceptible. El patógeno sobrevive, y puede crear estructuras de reproducción, mientras que el anfitrión en su mayoría muere. Una interacción incompatible se produce por otro lado cuando el patógeno infecta la planta pero es inhibido en su crecimiento antes o después de un débil desarrollo de los síntomas. En este último caso, la planta es resistente al patógeno correspondiente (Schopfer y Brennick, vide supra) . Sin embargo, este tipo de resistencia es específica para una cepa o patógeno determinados.

En ambas interacciones compatibles e incompatibles se produce una reacción de defensa y especifica del huésped para el agente patógeno. En la naturaleza, sin embargo, esta resistencia se supera a menudo debido al rápido desarrollo evolutivo de nuevas razas virulentas de patógenos (Neu et al. (2003) Americana Cytopathol Society, PMI 16 No. 7: 626-633).

La mayoría de los patógenos son especies específicas de plantas. Esto significa que un agente patógeno puede inducir una enfermedad en ciertas especies de plantas, pero no en otras especies de plantas (Heath (2002) Can J. Plant Pathol. 24: 259-264). La resistencia frente a un patógeno en ciertas especies de plantas se llama sin resistencia del huésped. El huésped sin resistencia ofrece una protección sólida, amplia y permanente de fitopatógenos . Los genes que proporcionan resistencia no huésped ofrecen la oportunidad de una protección fuerte, amplia y permanente contra determinadas enfermedades de las plantas no huéspedes. En particular, una resistencia funciona para diferentes cepas del patógeno.

Los hongos se distribuyen en todo el mundo. Alrededor de 100 000 especies de hongos diferentes se conocen hasta la fecha. Las royas son de gran importancia. Pueden tener un ciclo de desarrollo complicado con hasta cinco etapas diferentes de esporas (spermatium, aecidiospore, uredosporas, teleutospore y basidiosporas ) .

Durante la infección de plantas por hongos patógenos, se suelen observar las diferentes fases. Las primeras fases de la interacción entre los hongos fitopatógenos y sus plantas huésped potenciales son decisivos para la colonización de la planta por el hongo. Durante la primera etapa de la infección, las esporas se adhieren a la superficie de las plantas, germinar y que el hongo penetra la planta. Los hongos pueden penetrar en la planta a través de puertos existentes, tales como los estomas, lenticelas, hidatodos y heridas, o de penetrar en la epidermis de la planta directamente como resultado de la fuerza mecánica y con la ayuda de la pared celular de enzimas digestivas. Las estructuras especificas de infección se desarrollaron para la penetración de la planta. La roya de la soya Phakopsora pachyrhizi penetra directamente en la epidermis de la planta. Después de cruzar la célula epidérmica, el hongo alcanza el espacio intercelular del mesófilo, donde el hongo empieza a extenderse a través de las hojas. Para adquirir los nutrientes que el hongo penetra en las células mesófilas y desarrolla haustorios dentro de la célula mesófila. Durante el proceso de penetración de la membrana plasmática de la célula mesófila penetrada permanece intacta. Por lo tanto el hongo de roya de la soya establece una interacción biotrófica con la soya.

Los hongos fitopatógenos biotróficos, como muchas royas, dependen para su nutrición del metabolismo de las células vivas de las plantas. Los hongos fitopatógenos necrotróficos dependen para su nutrición de las células muertas de las plantas. La roya de la soya ha ocupado una posición intermedia, ya que penetra la epidermis directamente, después de lo cual la célula penetrada se vuelve necrótica. Después de la penetración, el hongo cambia a un estilo de vida obligatorio-biotrófico . El subgrupo de los hongos patógenos biotróficos que sigue esencialmente como una estrategia de infección, para los fines de la presente invención, se refiere como siendo "heminecrotrooico" .

La roya de la soya se ha convertido cada vez más importante en los últimos tiempos. La enfermedad puede ser causada por royas patógenas Phakopsora pachyrhizi (Sydow) y Phakopsora meibomiae (Arthur) . Pertenecen a la clase Basidiomycota, orden de Uredinales, familia Phakopsoraceae . Ambas royas infectan un amplio espectro de plantas huésped leguminosicas . P. pachyrhizi, también conocida como la roya asiática, es el patógeno más agresivo en la soya (Glycine max, y por lo tanto es, por lo menos actualmente, de gran importancia para la agricultura. P. pachyrhizi se pueden encontrar en casi todas las regiones tropicales y subtropicales de soya de cultivo del mundo. P. pachyrhizi es capaz de infectar a 31 especies de 17 familias de las leguminosas en condiciones naturales y es capaz de crecer en otras 60 especies bajo condiciones controladas (Sinclair et al. (Eds.), Procedimientos de taller de roya (1995), National Soya Research Laboratory, publicación No. 1 (1996); Rytter J.L. et al., Plant Dis. 87, 818 (1984)). P. meibomiae ha encontrado en la Cuenca del Caribe y en Puerto Rico y que no ha causado daños importantes por el momento.

P. pachyrhizi actualmente puede ser controlado en el campo sólo por medio de fungicidas. Las plantas de soya con resistencia a todo el espectro de los aislamientos no están disponibles. Durante la búsqueda de plantas resistentes, fueron descubiertos cuatro genes dominantes Rppl-4, que median la resistencia de la soya a P. pachyrhizi. La resistencia se perdió rápidamente, dado que P. pychyrhizi desarrolla nuevas razas virulentas.

En · años recientes, las enfermedades fúngicas, por ejemplo, roya de la soya, ha ganado en importancia como plagas en la producción agrícola. Por consiguiente, era una demanda en la técnica anterior para el desarrollo de métodos para controlar los hongos y para proporcionar fúngicas de plantas resistentes.

Muchas investigaciones se han realizado en cuanto al campo de moho en polvo y velloso que infecta la capa epidérmica de las plantas. Sin embargo, el problema de hacer frente a roya de la soya que infecta el mesófilo sigue sin resolverse .

Sorprendentemente los inventores encontraron que la sobreexpresión del gen de ADR-1 de Arabidopsis aumenta la resistencia contra la roya de la soya.

El objeto de la presente invención es proporcionar un método para aumentar la resistencia contra la roya de la soya en plantas transgénicas y/o células de plantas transgénicas . Un objeto adicional es proporcionar plantas transgénicas resistentes contra la roya de la soya, un método para producir tales plantas, asi como una construcción de vector útil para los métodos anteriores. Este objeto se consigue por la materia objeto de las reivindicaciones principales. Las modalidades preferidas de la invención se definen por las características de las reivindicaciones dependientes .

La presente invención puede entenderse más fácilmente haciendo referencia a la siguiente descripción detallada de las modalidades preferidas de la invención y los ejemplos incluidos en este documento. A menos que se indique lo contrario, los términos en la presente utilizados deben entenderse de acuerdo con el uso convencional por los expertos normales en la técnica pertinente. Además de las definiciones de los términos proporcionados en este documento, las definiciones de términos comunes en biología molecular también se pueden encontrar en Rieger et al., 1991 Glosario del genética: clásica y molecular, 5a edición, Berlín: Springer-Verlag y en Current Protocols en Biología Molecular, FM Ausubel et al., Eds . , Current Protocols, una empresa conjunta entre Greene Publishing Associates, Inc. y John Wiley & Sons, Inc., (Suplemento 1998). Es de entenderse que tal como se utiliza en la memoria descriptiva y en las reivindicaciones, "un" o "una" puede significar uno o más, dependiendo del contexto en el que se utiliza. Así, por ejemplo, la referencia a "una célula" puede significar que por lo menos una célula se puede utilizar. Se ha de entender que la terminología utilizada en la presente es para el propósito de describir modalidades específicas solamente y no se pretende que sean limitantes.

A lo largo de esta solicitud, se hace referencia a diversas publicaciones. Las descripciones de todas estas publicaciones y de aquellas referencias citadas dentro de esas publicaciones en su totalidad se incorporan por referencia en esta solicitud a fin de describir más completamente el estado de la técnica a la que pertenece esta invención. Las técnicas estándar para la clonación, aislamiento de ADN, amplificación y purificación, para reacciones enzimáticas que implican DNA ligasa, DNA polimerasa, endonucleasas de restricción y similares, y varias técnicas de separación son los conocidos y comúnmente empleados por los expertos en la técnica. Un número de técnicas estándar se describen en Sambrook et al, 1989 Molecular Cloning, segunda edición, Cold Spring Harbor Laboratory, Plainview, NY; .. Maniatis et al, 1982 Molecular Cloning, Cold Spring Harbor Laboratory, Plainview, NY; Wu (Ed .) 1993 Meth. Enzymol. 218, Parte I; Wu (Ed.) 1979 Meth Enzymol. 68; Wu et al., (Eds.) 1983 Meth. Enzymol. 100 y 101; Grossman y Moldave (Eds.) 1980 Meth. Enzymol. 65; Miller (Ed.) 1972. Los experimentos en genética molecular, Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor, NY, Oíd y Primrose, 1981 Principios de la manipulación genética de la Universidad de California Press, Berkeley; Schleif y Wensink, 1982 Métodos prácticos en Molecular Biología; Glover (Ed.) 1985 DNA Cloning vol. I y II, IRL Press, Oxford, Reino Unido; Hames y Higgins (Eds.) 1985 Nucleic Acid Hybridization, IRL Press, Oxford, Reino Unido, y Setlow y Hollaender 1979 Ingeniería Genética: Principios y Métodos, Vols. 1 -4 Press, Plenum, Nueva York. Las abreviaturas y la nomenclatura, donde emplean, se consideran estándar en el campo y utilizadas comúnmente en revistas profesionales tales como las citadas en este documento.

Los "homólogos" de una proteína abarcan péptidos, oligopéptidos , polipéptidos , proteínas y/o enzimas que tienen sustituciones de aminoácidos, supresiones y/o inserciones con relación a la proteína no modificada en cuestión y que tienen actividad funcional similar a la proteina no modificada de la que se derivan.

Los "homólogos" de un ácido nucleico que abarca los nucleótidos y/o polinucleótidos que tienen sustituciones de ácidos nucleicos, supresiones y/o inserciones en relación con el ácido nucleico no modificado en cuestión, en el que la proteina codificada por ácidos nucleicos como se ha similar o mayor actividad funcional en la proteina no modificada codificada por el ácido nucleico no modificado de la que se derivan. En homólogos particulares de un ácido nucleico abarca sustituciones sobre la base del código de aminoácidos degenerativa .

Un "supresión" se refiere a la eliminación de uno o más aminoácidos de una proteina o a la eliminación de uno o más ácidos nucleicos a partir de ADN, ARN monocatenario y/o dsRNA.

Una "inserción" se refiere a uno o más residuos de aminoácidos o residuos de ácido nucleico que se introducen en un sitio predeterminado en una proteina o ácido nucleico.

Una "sustitución" se refiere a la sustitución de aminoácidos de la proteina por otros aminoácidos que tienen propiedades similares (tales como hidrofobicidad similar, hidrofilicidad, antigenicidad, propensión a formar o romper estructuras a-helicoidales o estructuras de lámina ß) .

En el nivel de ácido nucleico se refiere a la sustitución de una sustitución de ácido nucleico con otros ácidos nucleicos, en el que la proteina codificada por el ácido nucleico modificado tiene una función similar. En homólogos particulares de un ácido nucleico abarca sustituciones sobre la base del código de aminoácidos degenerativa .

Las sustituciones de aminoácidos son típicamente de residuos individuales, pero pueden agruparse dependiendo de restricciones funcionales colocadas sobre la proteína y puede variar de 1 a 10 aminoácidos; inserciones o supresión será generalmente del orden de aproximadamente 1 a 10 residuos de aminoácidos. Las sustituciones de aminoácidos son sustituciones de aminoácidos conservadoras preferiblemente ácido .

Tablas de sustitución conservadora son bien conocidas en la técnica (véase, por ejemplo Creighton (1984) Proteins. WH Freeman and Company (Eds) y en la Tabla 1 a continuación) .

Tabla 1: Ejemplos de sustituciones. de aminoácidos conservados Las sustituciones de aminoácidos, supresiones y/o inserciones fácilmente se pueden hacer utilizando técnicas de síntesis de péptidos bien conocidos en la técnica, tales como síntesis de péptidos en fase sólida y similares, o por manipulaciones de ADN recombinante .

Los métodos para la manipulación de secuencias de ADN para producir variantes de sustitución, inserción o supresión de una proteína son bien conocidos en la técnica. Por ejemplo, las técnicas para hacer mutaciones de sustitución en sitios predeterminados en el ADN son bien conocidos por los expertos en la técnica e incluyen la mutagénesis M13, mutagénesis in vitro T7-Gen (USB, Cleveland, OH) , QuickChange Site Directed Mutagénesis (Stratagene, San Diego , CA) , PCR mediada por mutagénesis dirigida al sitio o sitio dirigidas otros protocolos de mutagénesis.

Los ortólogos y parálogos conceptos evolucionarlos utilizados para describir las relaciones ancestroes de los genes. Los parálogos son los genes dentro de las mismas especies que se han originado a través de la duplicación de un gen ancestro; los ortólogos son genes de organismos diferentes que se han originado por especiación y también se derivan de un gen ancestro común.

El término "dominio" se refiere a un conjunto de aminoácidos conservados en posiciones especificas a lo largo de una alineación de secuencias de proteínas relacionadas evolutivamente. Mientras que los aminoácidos en otras posiciones pueden variar entre homólogos, los aminoácidos que están altamente conservadas en las posiciones específicas indican los aminoácidos que probablemente esencial en la estructura, estabilidad o función de una proteína.

Las bases de datos especializadas existen para la identificación de los dominios, por ejemplo, SMART (Schultz et al. (1998) Proc. Nati. Acad. Sci. E.U.A. 95, 5857-5864; Letunic et al. (2002) Nucleic Acids Res. 30, 242 - 244), InterPro (Mulder et al., (2003) Nucí. Acids. Res. 31, 315-318), Prosite (Bucher y Bairoch (1994), una sintaxis de perfil generalizado de secuencias biomoleculares motivos y su función en la interpretación de secuencia automática. (In) ISMB-94; Procedimiento de 2a Conferencia Internacional sobre Sistemas Inteligentes de Biología Molecular Altman R., Brutlag D. P., Karp, Lathrop R . , D. Searls, Eds, págs. 53-61, AAAI Press, Menlo Park; Hulo et al., Nucí Acids Res. 32: D134-D137, (2004)), o Pfam (Bateman et al., Nucleic Acids Research 30 (1): 276-280 (2002)). Un conjunto de herramientas para el análisis in silico de secuencias de proteínas está disponible en el servidor de proteomica ExPASy (Instituto Suizo de Bioinformática (Gasteiger et al., ExPASy: El servidor de proteomica para el conocimiento proteína en profundidad y análisis, Nucleic Acids Res. 31: 3784 -3788 (2003) ) . Los dominios o motivos también se pueden identificar usando técnicas de rutina, tales como por la alineación de secuencias .

Los métodos para la alineación de secuencias para comparación son bien conocidos en la técnica, tales métodos incluyen GAP, BESTFIT, BLAST, FASTA y TFASTA. GAP utiliza el algoritmo de Needleman y Wunsch ((1970) J. Mol. Biol. 48: 443-453) para encontrar la alineación global (es decir, que abarca las secuencias completas) de dos secuencias que maximiza el número de coincidencias y minimiza el número de huecos. El algoritmo BLAST (Altschul et al. (1990) J. Mol. Biol. 215: 403-10) calcula el porcentaje de identidad de secuencia y realiza un análisis estadístico de la similitud entre las dos secuencias. El software para realizar análisis BLAST está públicamente disponible a través del Centro Nacional de Información Biotecnológica (NCBI). Los homólogos pueden ser fácilmente identificados usando, por ejemplo, el algoritmo de alineación de secuencias múltiples ClustalW (versión 1.83), con los parámetros por defecto de alineación por parejas, y un método de puntuación en porcentaje. Porcentajes global de la similitud y la identidad también se puede determinar utilizando uno de los métodos disponibles en el paquete de software MatGAT (Campanella et al., BMC Bioinformatics, 2003 Jul . 10; 4:29 MatGAT: Una aplicación que genera similitud/identidad utilizando matrices de proteínas o secuencias de ADN.). Puede realizarse la edición manual menor para optimizar la alineación entre los motivos conservados, como sería evidente para un experto en la técnica. Además, en lugar de utilizar secuencias de longitud completa para la identificación de homólogos, los dominios específicos que también pueden ser utilizados. Los valores de identidad de secuencia se pueden determinar sobre el ácido nucleico o toda la secuencia de aminoácidos o más de los dominios seleccionados o motivo conservado, utilizando los programas mencionados anteriormente utilizando los parámetros por defecto. Para alineaciones locales, el algoritmo de Smith-Waterman es especialmente útil (Smith TF, Waterman MS (1981) J. Mol. Biol. 147 (1);. 195-7).

Como se usa en la presente, los términos "roya de la soya-resistencia", "resistente a una roya de la soya", "soya resistente a la oxidación", "roya de resistencia", "resistente a la roya", "resistente a la oxidación", "hongos resistencia"," resistente a un hongo "y/o "resistente fúngica" significa la reducción o prevención de una infección por roya de la soya, en particular Phakopsora pachyrhizi (Sydow) y Phakopsora meibomiae (Arthur) . El término "resistencia" se refiere a la resistencia de soya. Resistencia no implica necesariamente que la planta tenga 100% de resistencia a la infección. En modalidades preferidas, la resistencia a la infección por roya de la soya en una planta resistente es mayor que 10%, 20%, 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 80%, 90%, o 95% en comparación con una planta de tipo silvestre que no es resistente a la roya de la soya. Preferiblemente, la planta de tipo silvestre es una planta de una similar, más preferiblemente idénticas, genotipo que la planta de haber aumentado la resistencia a la roya de la soya, pero no comprende un ácido nucleico recombinante de los GEN ADR-1, fragmentos funcionales de los mismos y/o un ácido nucleico capaz de hibridarse con Gen ADR-1. Preferiblemente, la planta de tipo silvestre no comprende un ácido nucleico endógeno de los GEN ADR-1, fragmentos funcionales de los mismos y/o un ácido nucleico capaz de hibridarse con Gen ADR-1.

Los términos "resistencia a la roya de soya-", "resistente a la roya de la soya", "soya resistente a la corrosión", "resistencia a moho", "resistente a la roya", "resistente a la corrosión", fúngicas y resistencia, resistente a un hongo "y/o" resistente fúngica "tal como se utiliza en la presente se refiere a la capacidad de una planta, en comparación con una planta de tipo natural, para evitar la infección por roya de la soya, para matar la roya, para obstaculizar, para reducir, retrasar, detener la multiplicación de desarrollo y/o crecimiento de roya de la soya. El nivel de resistencia a los hongos de una planta se puede determinar de varias maneras, por ejemplo por puntuación/medición del área foliar infectada en relación con el área de la hoja total. Otra posibilidad para determinar el nivel de resistencia es contar el número de colonias de soya de roya en la planta o para medir la cantidad de esporas producidas por estas colonias. Otra forma de resolver el grado de infestación fúngica es medir específicamente la cantidad de roya de ADN por PCR cuantitativo (q) . Las sondas especificas y secuencias de iniciadores para la mayoría de los hongos patógenos están disponibles en la literatura (Frederick RD, Snyder CL, GL Peterson, et al. 2002 Ensayos de polimerasa de reacción en cadena para la detección y discriminación de los patógenos de la roya Phakopsora pachyrhizi y P. meibomiae FITOPATOLOGÍA-92 (2) 217-227) .

Preferiblemente, la resistencia a la roya de la soya es no hospedante-resistencia. No hospedante-resistencia significa que las plantas son resistentes a por lo menos 80%, por lo menos 90%, por lo menos 95%, por lo menos 98%, por lo menos 99% y preferiblemente el 100% de las cepas del patógeno de la roya de soya, preferiblemente las cepas de Phakopsora pachyrhizi .

El término "hibridación" tal como se utiliza en la presente memoria incluye "cualquier proceso mediante el cual una hebra de la molécula de ácido nucleico se une con una cadena complementaria mediante apareamiento de bases". (J. Coombs (1994) Diccionario de la Biotecnología, Stockton Press, Nueva York) . La hibridación y la fuerza de hibridación (es decir, la fuerza de la asociación entre las moléculas de ácidos nucleicos) se ve afectada por factores tales como el grado de complementariedad entre las moléculas de ácido nucleico, rigurosidad de las condiciones implicadas, la Tm del híbrido formado y la relación G: C dentro de las moléculas de ácido nucleico. Tal como se utiliza en la presente, el término "Tm" se usa en referencia a la "temperatura de fusión" . La temperatura de fusión es la temperatura a la que una población de moléculas de doble hebra de ácido nucleico se convierte en un medio disocia en cadenas simples. La ecuación para calcular la Tm de moléculas de ácido nucleico es bien conocida en la técnica. Como se indica en las referencias estándar, una estimación simple del valor Tm se puede calcular por la ecuación: Tm = 81.5 0.41 (% G+ C) , cuando una molécula de ácido nucleico está en solución acuosa a 1 M de NaCl [véase, por ejemplo, Anderson y filtro Young, La hibridación cuantitativa, en Nucleic Acid Hybridization (1985) ] . Otras referencias incluyen cálculos más sofisticados, que tienen estructurales, asi como características de secuencia en cuenta para el cálculo de Tm. Las condiciones rigurosas, son conocidos por los expertos en la técnica y se pueden encontrar en Current Protocols in Molecular Biology, John iley & Sons, NY (1989), 6.3.1 -6.3.6.

En particular, las condiciones de rigurosidad se refiere a condiciones de plazo, en el que 100 nucleótidos contiguas o más, 150 o más nucleótidos contiguas, 200 nucleótidos contiguas o más, o 250 nucleótidos contiguas o más que son un fragmento o idéntica a la molécula complementaria de ácido nucleico (ADN, ARN, ssDNA orssRNA) se híbrida en condiciones equivalentes a la hibridación en sulfato de sodio 7% de dodecilsulfato (SDS) , 0.5 M NaP04, 1 mM EDTA a 50°C con lavado en 2 X SSC, 0.1% SDS a 50°C o 65°C, preferiblemente a 65°C, con una molécula específica de ácido nucleico (ADN, ARN, ssADN o ss ARN) . Preferiblemente, las condiciones de hibridación son equivalentes á la hibridación en sulfato de sodio 7% de dodecilsulfato (SDS), 0.5 M NaP04, 1 mM EDTA a 50°C con lavado en 1 X SSC, 0.1% SDS a 50°C o 65°C, preferiblemente 65°C, más preferiblemente las condiciones de hibridación son equivalentes a la hibridación en sulfato de sodio 7% de dodecilsulfato (SDS), 0.5 M NaP04, 1 mM EDTA a 50°C con lavado en 0.1 X SSC, 0.1% SDS a 50°C o 65°C, preferiblemente 65°C. Preferiblemente, los nucleótidos complementarios se hibridizan con un fragmento o de la totalidad Gen ADR-1. Preferiblemente, el polinucleótido complementaria híbrida con partes del gen ADR-1 capaz de proporcionar resistencia a la roya de soya.

Tal como se utiliza en la presente, el término "Gen ADR-1" se refiere a un gen que tiene por lo menos 60% de identidad con la SEC ID No. 1 o con una secuencia codificante para una proteína que tiene por lo menos 60% de identidad con la SEC ID No. 2 y/o fragmentos funcionales de los mismos. En uno de los homólogos de modalidad del gen ADR-1 tienen, a nivel del ADN y/o nivel de proteína, por lo menos 70%, preferiblemente de por lo menos 80%, en especial preferiblemente de por lo menos 90%, muy especialmente preferible de por lo menos 95 %, muy especialmente preferible de por lo menos 98% o 100% de identidad sobre la región de ADN completa o la región determinada proteína en una secuencia específica descrita en este documento y/o un fragmento funcional de la misma.

Tal como se utiliza en la presente, el término "Proteína ADR-1" se refiere a una proteína que tiene por lo menos 60% de identidad con una secuencia que codifica para una proteína que tiene SEC ID No. 2 y/o un fragmento del mismo. En uno de los homólogos de modalidad de la Proteína ADR-1 tiene por lo menos 70%, preferiblemente de por lo menos 80%, en especial preferiblemente de por lo menos 90%, muy especialmente preferible de por lo menos 95%, muy especialmente preferible de por lo menos 98% o 100% de identidad sobre la región de la proteína completa dada en una secuencia específica descrita en este documento y/o un fragmento funcional de la misma.

La "identidad" u "homología" entre dos ácidos nucleicos y/o se refiere en cada caso sobre toda la longitud del ácido nucleico.

Por ejemplo, la identidad se puede calcular por medio de la Vector NTI Suite 7.1 programa de la empresa Informax (EE.UU.) empleando el método de Clustal (Higgins DG, PM Sharp. Múltiples alineamientos de secuencias rápidas y sensibles en un microordenador. Comput Appl. Biosci. 1989 Apr; 5 (2) : 151-1) con los siguientes ajustes: Parámetro de alineación múltiple: Penalización por apertura de espacio 10 Penalización por extensión de espacio 10 Rango de penalización por separación de espacio 8 Penalización por separación de espacio apagado % De identidad de retardo de alineación 40 Espacios de residuos específicos apagado Espacios de residuos hidrofílicos apagado Peso de transición 0 Parámetro de alineación por parejas: Algoritmo FAST encendido Tamaño de K-tupla 1 Penalización por espacios 3 Tamaño de ventana 5 Número de diagonales mejores 5 Alternativamente, la identidad puede ser determinado de acuerdo con Chenna, Ramu, Sugawara, Hideaki, Koike, Tadashi, López, Rodrigo, Gibson, Toby J. , Higgins, Desmond G, Thompson, Julie D. alineación múltiple de secuencias Clustal con la serie de programas. (2003) Nucleic Acids Res. 31 ( 13 ): 3497-500 , la página web: http://www.ebi.ac.Uk/Tools/clustalw/index.html # y los siguientes ajustes Penalizacion por Apertura de espacios de ADN 15.0 Penalizacion por extensión de espacios de ADN 6.66 Matriz de ADN identidad Penalizacion por apertura de espacio de proteina 10.0 Penalizacion por extensión de espacio de proteina 0.2 Matriz de proteina Gonnet ENDGAP Proteina/ADN -1 GAPDIST Proteina/ADN 4 Todas las secuencias de ácidos nucleicos mencionados en este documento (ADN de cadena sencilla y de doble cadena y las secuencias de ARN, por ejemplo ADNc y ARNm) se puede producir de una manera conocida mediante síntesis química a partir de los bloques de construcción de nucleótidos, por ejemplo, por condensación de fragmentos individuales de superposición, bloques complementarios de ácido nucleico de la doble hélice. La síntesis química de oligonucleótidos puede, por ejemplo, llevarse a cabo de una manera conocida, por el método de fosfoamidita (Voet, Voet, 2a edición, Wiley Press, Nueva York, páginas 896-897) . La acumulación de oligonucleótidos sintéticos y llenado de vacíos por medio del fragmento de Klenow de la ADN polimerasa y reacciones de ligación así como las técnicas generales de clonación se describen en Sambrook et al. (1989), ver más adelante .

La identidad de secuencia entre el ácido nucleico útil de acuerdo con la presente invención y el ADR-1 gen puede ser optimizada mediante comparación de secuencias y algoritmos de alineación conocidos en la técnica (ver Gribskov y Devereux, Primer Análisis de la secuencia, Stockton Press, 1991, y las referencias citadas en la misma) y el cálculo de la diferencia de porcentaje entre las secuencias de nucleótidos, por ejemplo, el algoritmo de Smith-Waterman como se implementa en el programa de software BESTFIT usando parámetros por defecto (por ejemplo, de la Universidad de Wisconsin Grupo de Computación Genética) . Por lo menos 60% de identidad de secuencia, preferiblemente por lo menos 70% de identidad de secuencia, 80% 90%, 95%, 98% de identidad de secuencia, o incluso 100% de identidad e secuencia, con el ácido nucleico que tiene la SEC ID No. 1 se prefiere .

Se pretende que el término "planta" incluya plantas en cualquier etapa de madurez o de desarrollo, así como cualquiera de los tejidos u órganos (partes de la planta) tomado o derivado de cualquier planta tal a menos que se indique claramente por el contexto. Las partes de la planta incluyen, pero no se limitan a, células de la planta, tallos, raíces, flores, óvulos, estambres, semillas, hojas, embriones, regiones meristemáticas, tejido de callo, cultivos de anteras, gametofitos, esporofitos, polen, microesporas, protoplastos, los cultivos de raices pilosas, y/o similares. La presente invención también incluye semillas producidas por las plantas de la presente invención. Preferiblemente, las semillas comprenden el gen recombinante ADR1. En una modalidad, las semillas son una reproducción verdadera para una mayor resistencia a la infección fúngica en comparación con una variedad de tipo silvestre de la semilla de la planta. Como se usa en la presente memoria, una "célula vegetal" incluye, pero no se limita a, un protoplasto, célula productora de gametos y una célula que se regenera en una planta entera. El cultivo de tejidos de diversos tejidos de plantas y la regeneración de plantas de la misma es bien conocido en la técnica y está ampliamente publicada.

En la presente se hace referencia a un gen ADR-1 "endógeno" que se refiere al gen en cuestión tal como se encuentra en una planta en su forma natural (es decir, sin que exista ninguna intervención humana) . El gen ADR-1 recombinante se refiere al mismo gen (o un ácido nucleico/gen sustancialmente homólogo) en una forma aislada posteriormente reintroducido en una planta (un transgén) . Por ejemplo, una planta transgénica que contiene un transgén puede obtener un incremento sustancial de la expresión del transgén en adición a la expresión del gen endógeno. El gen aislado puede ser aislado de un organismo o puede ser formado por el hombre, por ejemplo mediante síntesis química. Una planta transgénica de acuerdo con la presente invención incluye un gen ADR-1 recombinante integrado en cualquier loci genéticos y la opcionalmente planta también puede incluir el gen endógeno en el fondo genético natural. Preferiblemente, la planta no incluye un Gen ADR-1 endógeno.

Para los fines de la invención, "recombinante" significa con respecto a, por ejemplo, una secuencia de ácido nucleico, un cásete de expresión o un vector que comprende la construcción de fen ADR-1, todas aquellas construcciones provocada por métodos tecnológicos de genes en que cualquiera de (a) las secuencias de ADR-1 que codifican proteínas ADR-1, o (b) secuencia de control genético que está unida operativamente con la secuencia de ácido nucleico ADR-1 de acuerdo con la invención, por ejemplo un promotor, o (c) a) y b) no se encuentran en su ambiente genético natural o se han modificado por métodos de tecnología del gen. La modificación puede tomar la forma de, por ejemplo, una sustitución, adición, supresión, inversión o inserción de uno o más residuos de nucleótidos. El entorno genético natural se entiende en el sentido del genómica natural o locus cromosómico en la planta original o la presencia en una biblioteca genómica o de la combinación con el promotor natural .

En el caso de una biblioteca genómica, el ambiente genético natural de la secuencia de ácido nucleico es preferiblemente retenida, por lo menos en parte. El ambiente flanquea la secuencia de ácido nucleico por lo menos en un lado y tiene una longitud de secuencia de por lo menos 50 pb, preferiblemente por lo menos 500 pb, especialmente preferiblemente por lo menos 1000 pb, más preferiblemente por lo menos 5000 pb.

Un cásete de expresión de origen natural, por ejemplo la combinación de origen natural del promotor natural de las secuencias de ácidos nucleicos con la secuencia de ácido nucleico correspondiente que codifica una proteina útil en los métodos de la presente invención, como se ha definido anteriormente, se convierte en un cásete de expresión recombinante cuando este cásete de expresión se modifica por no naturales, métodos sintéticos ("artificiales") tales como, por ejemplo, el tratamiento mutagénico. Los métodos adecuados se describen, por ejemplo, en US 5,555,350 o WO 00/15815. Además, un cásete de expresión de origen natural, se convierte en un cásete de expresión recombinante, por ejemplo la combinación de origen natural del promotor natural de las secuencias de ácidos nucleicos con la secuencia de ácido nucleico correspondiente que codifica una proteina útil en los métodos de la presente invención, como se define anteriormente cuando este cásete de expresión no se integra en el entorno genético natural, pero en un ambiente genético diferente .

Además, deberá tenerse en cuenta que en el contexto de la presente invención, el término "ácido nucleico aislado" o "proteína aislada" puede en algunos casos ser considerado como un sinónimo de un "ácido nucleico recombinante" o una "proteína recombinante", respectivamente y se refiere a un ácido nucleico o proteína que no se encuentra en su ambiente natural genético y/o que ha sido modificado mediante métodos de tecnología del gen.

Una planta transgénica para los fines de la invención, se entiende en el sentido de que los ácidos ADR-1-nucleicos no están presentes en el genoma de la planta original y/o están presentes en el genoma de la planta original u otra planta que no está en su locus natural del genoma de la planta original. El locus natural significa la localización en un cromosoma específico, preferiblemente la ubicación entre ciertos genes, más preferiblemente el fondo misma secuencia que en la planta original. Siendo posible que los ácidos nucleicos que se expresa homologa o heteróloga. Transgénico se entiende preferiblemente en el sentido de la expresión de los ácidos nucleicos de acuerdo con la invención no en la planta original y/o en un locus no natural en el genoma, es decir, se lleva a cabo la expresión heteróloga de los ácidos nucleicos.

Tal como se utiliza en la presente, el término "transgénico" se refiere preferiblemente a cualquier planta, parte de la célula de planta, callo, tejido de planta o una planta que contiene toda o parte del gen ADR-1 no en su locus natural. Preferiblemente, toda o parte del gen ADR-1 se integra establemente en un cromosoma o elemento extracromosómico estable, de modo que se transmite a generaciones sucesivas.

El término "expresión" o "expresión génica" o "incremento de contenido" significa la transcripción de un gen especifico o genes específicos o una construcción de vector específico genética. El término "expresión" o "expresión génica", en particular, significa la transcripción de un gen o genes o vector con la construcción genética en el ARN estructurales (ARNr, ARNt) o ARNm con o sin posterior traducción de este último en una proteína. El proceso incluye la transcripción de ADN y la transformación del producto de ARNm resultante.

El término "incremento de la expresión" o "sobreexpresión" o "incremento de contenido", como se usa en la presente significa cualquier forma de expresión que sea adicional al nivel de expresión original de tipo silvestre. Para los fines de esta invención, el original de tipo silvestre nivel de expresión también puede ser cero (ausencia de expresión) .

Los métodos para aumentar la expresión de genes o productos génicos están bien documentados en la técnica e incluyen, por ejemplo, la sobreexpresión conducida por promotores apropiados, el uso de potenciadores de la transcripción o potenciadores de la traducción. Ácidos nucleicos aislados que sirven como promotor o potenciador de los elementos se puede introducir en una posición apropiada (típicamente aguas arriba) de una forma no heteróloga de un polinucleótido con el fin de regular por incremento la expresión de un ácido nucleico que codifica la proteína de interés. Por ejemplo, los promotores endógenos se pueden alterar in vivo por mutación, supresión y/o sustitución (ver, Kmiec, US 5.565.350; Zarling et al, W09322443), o promotores aislados se pueden introducir en una célula vegetal en la orientación apropiada y distancia de un gen de la presente invención para controlar la expresión del gen.

Si se desea la expresión de la proteína, generalmente es deseable incluir una región de poliadenilación en el extremo 3' de una región de polinucleótido de codificación. La región de poliadenilación se puede derivar del gen natural, de una variedad de otros genes de plantas, o de T-ADN. La secuencia del extremo 3' que se añaden pueden ser derivados de, por ejemplo, de la nopalina sintasa o genes de octopina sintasa, o alternativamente de otro gen vegetal, o menos preferiblemente de cualquier otro gen eucariote.

Una secuencia de intrón también puede ser añadido a la región 5' no traducida (UTR) y/o la secuencia de codificación de la secuencia codificante parcial para incrementar la cantidad del mensaje de madurez que se acumula en el citosol. La inclusión de un intrón empalmable en la unidad de transcripción tanto en plantas y animales constructos de expresión se ha demostrado que aumenta la expresión génica tanto en el mRNA y los niveles de proteina hasta 1000-veces (Buchman y Berg (1988) Mol. Cell Biol. 8: 4395-4405; Callis et al. (1987) Genes Dev. 1: 1183 - 1200). Dicho incremento de intrón de la expresión génica es típicamente mayor cuando se coloca cerca del extremo 5' de la unidad de transcripción. El uso de los intrones de maíz Adhl-S intrón 1, 2, y 6, el intrón Bronze-1 son conocidos en la técnica. Para información general véase: el maíz Handbook, Capítulo 116, Freeling y albot, Eds, Springer, Nueva York (1994) .

El término "fragmento funcional" se refiere a cualquier ácido nucleico y/o proteína que comprende sólo una parte del ácido nucleico de longitud completa y/o proteína de longitud completa pero todavía proporciona la misma función, es decir, resistencia a la roya de soya cuando se expresa en una planta. Preferiblemente, el fragmento comprende por lo menos 50%, por lo menos 60%, por lo menos 70%, por lo menos 80%, por lo menos 90%, por lo menos 95%, por lo menos 98%, por lo menos 99% de la secuencia original. Preferiblemente, el fragmento funcional comprende ácidos nucleicos contiguos o aminoácidos como en el ácido nucleico original, y/o la protexna original.

En una modalidad, el fragmento del ácido ADR-1-nucleico tiene una identidad como se ha definido anteriormente en una longitud de por lo menos 500, por lo menos 1000, por lo menos 1500, por lo menos 2000 nucleótidos a la Gen ADR-1.

El término "actividad funcional similar" o "función similar" en este contexto significa que cualquier homólogo y/o fragmento de soya proporcionar resistencia a la oxidación cuando se expresa en una planta. Preferiblemente actividad funcional similar, significa por lo menos 50%, por lo menos 60%, por lo menos 70%, por lo menos 80%, por lo menos 90%, por lo menos 95%, por lo menos 98%, por lo menos 99% o 100% o más de la resistencia a la roya de la soya en comparación con la actividad funcional proporcionada por la expresión recombinante de la secuencia de ADR-l-nucleótidos SEC ID No. 1 y/o recombinante Proteina ADR-1 de secuenciá SEC ID No. 2.

El término "mayor actividad" como se usa en la presente, significa cualquier proteina que tenga una mayor actividad de soya proporciona un incremento de la resistencia a la oxidación en comparación con la planta de tipo silvestre sólo por expresar la endógeno Gen ADR-1. Para los fines de esta invención, el original de tipo silvestre nivel de expresión también puede ser cero (ausencia de expresión) .

El término "introducción" o "transformación" como se refiere en la presente memoria para abarcar la transferencia de un polinucleótido exógeno en una célula huésped, independientemente del método utilizado para la transferencia. El tejido vegetal capaz de propagación clonal posterior, ya sea por organogénesis o embriogénesis, puede ser transformado con una construcción de vector de la presente invención y una planta entera regenerada a partir de allí. El tejido particular escogido variará dependiendo de los sistemas de propagación clonal disponibles para, y más adecuados para, las especies particulares que se están transformado. Los ejemplos de objetivos de tejidos incluyen discos de hojas, polen, embriones, cotiledones, hipocotilos, megagametofitos, tejido de callo, tejido meristemático existente (por ejemplo, meristemo apical, yemas axilares, y meristemos de raíz), y tejido de meristemo inducido (por ejemplo, meristemo de cotiledón y meristemo del hipocotilo) . El polinucleótido puede ser introducido transitoriamente o establemente en una célula huésped y puede ser mantenido no integrado, por ejemplo, como un plásmido. Alternativamente, puede ser integrado en el genoma del huésped. La célula vegetal resultante transformada puede entonces ser utilizada para regenerar una planta transformada de una manera conocida para las personas expertas en la técnica.

El término "terminador" abarca una secuencia de control que es una secuencia de ADN al final de una unidad transcripcional que señala el procesamiento 3' y la poliadenilación de un transcripto primario y terminación de la transcripción. El terminador puede ser derivado del gen natural, de una variedad de otros genes de plantas, o de T-ADN. El terminador que se añaden pueden ser derivados de, por ejemplo, de la nopalina sintasa o genes de octopina sintasa, o alternativamente de otro gen vegetal, o menos preferiblemente de cualquier otro gen eucariota.

Las células de plantas transgénicas pueden ser transformadas con uno de los constructos de vector descritos anteriormente. Los métodos adecuados para transformar o transfectar células huésped, incluyendo células vegetales son bien conocidos en la técnica de la biotecnología vegetal. Cualquier método puede ser utilizado para transformar el vector de expresión recombinante en células de plantas para producir las plantas transgénicas de la invención. Los métodos generales para la transformación de plantas dicotiledóneas se describen, por ejemplo, en la patente de E.U.A. Nos. 4,940,838; 5,464,763, y similares. Los métodos para transformar las plantas dicotiledóneas especificas, por ejemplo, el algodón, se exponen en las patentes de E.U.A. Nos. 5,004,863; 5,159,135 y 5,846,797. Se pueden utilizar los métodos de transformación de la soya se exponen en la patente de E.U.A. Nos. 4,992,375; 5,416,011; 5,569,834; 5,824,877; 6,384,301 y en el documento EP 0301749B1. Los métodos de transformación pueden incluir métodos directos e indirectos de transformación. Métodos directos adecuados incluyen polietilenglicol ADN inducida por la absorción, transformación mediada por liposomas (US 4,536,475), métodos biolisticos utilizando la pistola de genes (Fromm ME et al., Bio/Technology 8(9) : 833-9, 1990; Gordon-Kamm et al. Plant Cell 2:603, 1990), la electroporación, la incubación de embriones secos en solución que comprende el ADN, y la microinyección. En el caso de estos métodos de transformación directa, los plásmidos utilizados no tienen que cumplir los requerimientos particulares. Plásmidos simples, tales como los de la serie pUC, pBR322, serie M13mp, pACYC184 y similares pueden ser utilizados. Si las plantas intactas se van a regenerar a partir de las células transformadas, un gen marcador seleccionable adicional está situado preferiblemente en el plásmido. Las técnicas de transformación directa son igualmente adecuadas para plantas dicotiledóneas y monocotiledóneas .

La transformación también puede llevarse a cabo por infección bacteriana por medio de Agrobacterium (por ejemplo EP 0 116 718), la infección viral por medio de vectores víricos (EP 0 067 553; EE.UU. 4, 407, 956, O 95/34668, WO 93/03161) o por medio de polen (documento EP 0 270 356, WO 85/01856; E.U.A. 4,684,611). Las técnicas de transformación basados en Agrobacterium (especialmente para plantas dicotiledóneas) son bien conocidos en la técnica. La cepa de Agrobacterium (por ejemplo, Agrobacterium tumefaciens o Agrobacterium rhizogenes) comprende un plásmido (plásmido Ti o Ri) y un elemento de T-ADN que se transfiere a la planta después de la infección con Agrobacterium. El ADN-T (ADN transferido) está integrado en el genoma de la célula vegetal. El ADN-T puede ser localizada en el plásmido Ri o Ti o está separado comprendido en un vector binario así llamado. Los métodos para la transformación se describen, por ejemplo, en Horsch RB et al. (1985) Science 225:1229. La transformación mediada por Agrobacterium es el más adecuado para las plantas dicotiledóneas, pero también ha sido adaptado a las plantas monocotiledóneas . La transformación de plantas por agrobacterias se describe en, por ejemplo, White FF, los vectores de transferencia de genes en plantas superiores, las plantas transgénicas , vol . 1, Ingeniería y uso, editado por S. D. Kung y R. Wu, Academic Press, 1993, págs. 15 a 38; Jenes B et al. Las técnicas de transferencia de genes, plantas transgénicas , vol . 1, Ingeniería y uso, editado por S. D. Kung y R. Wu, Academic Press, 1993, pp 128-143; Potrykus (1991) Annu Rev Plant Physiol Plant Molec Biol. 42:205 - 225. La transformación puede dar como resultado la transformación transitoria o estable y expresión. Aunque una secuencia de nucleótidos de la presente invención se puede insertar en cualquier célula de planta y planta comprendidos dentro de estas amplias categorías, es particularmente útil en células de plantas de cultivo. Las células de las plantas genéticamente modificadas pueden ser regeneradas a través de todos los métodos con los que el trabajador calificado es familiar. Los métodos adecuados se pueden encontrar en la publicaciones mencionadas por S.D. Kung y R. Wu, Potrykus o Hófgen y Willmitzer.

Generalmente después de la transformación, las células vegetales o agrupaciones de células se seleccionan para la presencia de uno o más marcadores que son codificados por genes expresables en plantas co-transferidos con el gen de interés, después de lo cual se regenera el material transformado en una planta completa. Para seleccionar las plantas transformadas, el material vegetal obtenido en la transformación es, por regla general, sometida a condiciones selectivas de modo que las plantas transformadas se pueden distinguir de las plantas no transformadas. Por ejemplo, las semillas obtenidas de la manera descrita anteriormente se puede sembrar y, después de un periodo inicial de crecimiento, sometido a una selección adecuada por pulverización. Una posibilidad adicional consiste en el cultivo de las semillas, en su caso después de la esterilización, en placas de agar utilizando un agente de selección adecuado, de modo que sólo las semillas transformadas pueden crecer en las plantas. Alternativamente, las plantas transformadas son examinados para detectar la presencia de un marcador seleccionable, tal como los descritos anteriormente.

Después de la transferencia del ADN y la regeneración, las plantas transformadas putativamente también se pueden evaluar, por ejemplo utilizando análisis Southern, para la presencia del gen de interés número de copia y/u organización genómica. Alternativa o adicionalmente, los niveles de expresión del ADN recientemente introducido se pueden controlar mediante análisis Northern y/o Western, ambas técnicas bien conocidas por personas que tienen experiencia ordinaria en la técnica.

Las plantas transformadas generadas se pueden propagar mediante una variedad de medios, tales como por propagación clonal o técnicas clásicas de reproducción. Por ejemplo, una primera generación (o TI) planta transformada puede ser autofecundadas y seleccionado homocigotos de segunda generación (o T2) transformantes, y las plantas T2 entonces pueden propagarse más a través de técnicas de reproducción clásicas. Los organismos transformados generados pueden tomar una variedad de formas. Por ejemplo, ellos pueden ser quimeras de células transformadas y células no transformadas; los transformantes clónales (por ejemplo, todas las células transformadas para contener el cásete de expresión) ; injertos de tejidos transformados y no transformados (por ejemplo, en plantas, un rizoma transformado injertado a un esqueje no transformado).

La presente invención proporciona un método para aumentar la resistencia a la roya en plantas y/o células vegetales, en el que el contenido y/o la actividad de por lo menos una RA -l-proteína se incrementa en comparación con las plantas de tipo silvestre y/o células vegetales.

En una modalidad del método de la proteína de ADR-1 es codificada por un ácido nucleico recombinante que tiene por lo menos 60%, por lo menos 70%, por lo menos 80%, por lo menos 90%, por lo menos 95%, por lo menos 98% de identidad o 100% de identidad con la SEC ID No. 1, un fragmento funcional del mismo y/o un ácido nucleico capaz de hibridar con un ácido nucleico y/o es una proteína que tiene por lo menos 60%, por lo menos 70%, por lo menos 80%, por lo menos 90%, por. lo menos 95%, por lo menos 98% de identidad o 100% de identidad con la SEC ID No. 2, un fragmento funcional de la misma, un ortólogo y/o un parálogo del mismo.

En una modalidad, el método comprende (a) transformar de manera estable una célula de planta con un cásete de expresión que comprende (i) una secuencia de ácido nucleico recombinante que tiene por lo menos 60%, por lo menos 70%, por lo menos 80%, por lo menos 90% por lo menos un 95%, por lo menos 98% de identidad o 100% de identidad con la SEC ID No. 1 y/o un fragmento funcional en unión funcional con un promotor y/o (ii) un ácido nucleico recombinante que codifica para una proteina que tiene por lo menos 60%, por lo menos 70%, por lo menos 80%, por lo menos 90%, por lo menos 95%, por lo menos 98% de identidad o 100% con la SEC ID No. 2, un fragmento funcional de la misma, un ortólogo y/o uno de sus parálogo, (b) regenerar la planta a partir de la célula vegetal; y (c) expresar dicha secuencia de ácido nucleico que codifica para una proteina ADR-1 en una cantidad y durante un periodo suficiente para generar o incrementar una resistencia a la roya de la soya en dicha planta.

En una modalidad, la planta es una planta leguminosa, que comprende plantas del género Phaseolus (que comprende habichuela, frijol enano, frijol trepador (Phaseolus vulgaris), frijol Lima (Phaseolus lunatus L.), frijol Tepari (Phaseolus acutifolius A. Gray) , haba de corredor (Phaseolus coccineus) ) , el género Glycine (que comprende soya Glycine, la soya (Glycine max (L. ) Merrill) ) ; guisante (Pisum) (que comprende los guisantes para desgranar (Pisum sativum L. convar sativum) , también llamados guisantes sembrados lisos o redondos, guisante marrowfat (Pisum sativum L. convar. medullare Alef. EMEND. Lehm CO) , guisante dulce (Pisum sativum L. convar. Axiphium Alef emend. Lehm CO) , también llamado arveja, vaina de guisante comestible o tirabeques (Pisum granda sneida L. convar. sneidulo p. shneiderium) ) ; maní (Arachis hypogaea) , trébol (Trifolium spec) , Medick (Medicago) , viña kudzu (Pueraria lobata) , alfalfa común, alfalfa (L M. sativa) , garbanzo (Cicer) , lentejas (Lens) (Lens culinaris Medik) , altramuces. (Lupinus) ; algarrobas (Vicia) , frijol de campo, haba (Vicia faba) , titarros (Lathyrus) (que comprende guisante chícharo (Lathyrus sativus) , guisante de calor (Lathyrus tuberosus) ) ; género Vigna (que comprende palomilla del frijol (Vigna aconitifolia (Jacq.) Marechal) , frijol Adzuki (Vigna angularis (Willd. ) Ohwi y Ohashi H.), frijoles Urd (Vigna mungo (L.) Hepper) , frijol mungo (Vigna radiata (L.) R. Wilczek) , maní bambara (Vigna subterreno (L.) Verde), frijol de arroz (Vigna umbellata (Thunb.) Ohwl y H. Ohashi), Vigna vexillata (L.) A. Rich., Vigna unguiculata (L.) Walp. , en las tres subespecies frijol espárrago, frijol, haba catjang) ) ; gandul (Cajanus cajan (L.) Millsp) , el Macrotyloma género (que comprende maní molido (Macrotyloma geocarpum (Harms.) arechal y Baudet) , frijol caballo (Macrotyloma uniflorum (Lam. ) Verde)); haba goa ( Psophocarpus tetragonolobus (L.) DC) , jicama Africana (Sphenostylis stenocarpa (Hochst. ex A. Rich.) Harms), frijol negro egipcio, frijol Dolichos, frijol Lablab (Lablab purpureus (L.) Sweet), jicama (Pachyrhizus) , guar, (Cyamopsis tetragonolobus (L.) Taub.), y/o el género Canavalia (que comprende jack bean (Canavalia ensiformis (L.) DC) , frijol Sword (Canavalia gladiata (Jacq.) DC) . ) .

Preferiblemente, la planta de acuerdo con la presente invención es la soya.

Además, la presente invención comprende una construcción de vector recombinante que comprende: (a) un ácido nucleico recombinante (i) que tiene por lo menos 60%, por lo menos 70%, por lo menos 80%, por lo menos 90%, por lo menos 95%, por lo menos 98% o 100% de identidad con la SEC ID No. 1, un fragmento de la misma funcionales y/o un ácido nucleico capaz de hibridar con un ácido nucleico y/o (ii) que comprende un ácido nucleico recombinante que codifica para una proteína que tiene por lo menos 60%, por lo menos 70%, por lo menos 80%, por lo menos 90%, por lo menos 95%, por lo menos 98% de identidad o 100% con la SEC ID No. 2, un fragmento funcional de la misma, un ortólogo y/o un parálogo, unidos operativamente con (b) un promotor y (c) una secuencia de terminación de la transcripción .

Con respecto a una construcción de vector recombinante y/o el ácido nucleico recombinante, el término "funcional ligada" se pretende que signifique que el ácido nucleico recombinante está unido a la secuencia reguladora, incluyendo promotores, secuencias terminadoras reguladoras, potenciadores y/o expresión de otra elementos de control (por ejemplo, señales de poliadenilación) , en una manera que permite la expresión del gen ADR-1 (por ejemplo, en una célula de planta huésped cuando el vector se introduce en la célula de la planta huésped) . Tales secuencias reguladoras se describen, por ejemplo, en Goeddel, Tecnología de la Expresión Génica: Methods in Enzymology 185, Academic Press, San Diego, CA (1990) y Gruber y Crosby, en: Methods in Plant Molecular Biology and Biotechnology, Eds . Glick y Thompson, Capítulo 7, 89-108, CRC Press: Boca Ratón, Florida, incluyendo las referencias en él. Las secuencias reguladoras incluyen aquellas que dirigen la expresión constitutiva de una secuencia de nucleótidos en muchos tipos de células huésped y aquellas que dirigen la expresión de la secuencia de nucleótidos sólo en ciertas células huésped o bajo ciertas condiciones. Se apreciará por los expertos en la técnica que el diseño del vector puede depender de factores tales como la elección de la célula huésped a transformar, el nivel de expresión de ARN deseado, y/o similares. Las construcciones de vectores de la invención pueden ser introducidas en células huésped de plantas para producir con ello Proteina ADR-1 con el fin de prevenir y/o reducir las infecciones de roya de la soya.

Los promotores de acuerdo con la presente invención puede ser constitutiva, inducible, en particular patógenos inducibles, el grado de desarrollo preferido, el tipo de células preferida, preferida de tejido y/o órgano preferido. Los promotores constitutivos son activos bajo la mayoría de condiciones. Los ejemplos no limitantes de promotores constitutivos incluyen el CaMV 19S y 35S promotores (Odell et al., 1985, Nature 313:810-812), el promotor sX CaMV 35S (Kay et al., 1987, Science 236:1299-1302), el promotor SEP1, el promotor de actina de arroz (McElroy et al., 1990, Plant Cell 2:163-171), el promotor de actina de Arabidopsis, el promotor de ubiquitina (Christensen et al., 1989, Plant Molec. Biol . 18:675 - 689); PEMU (Last et al, 1991, Theor. Appl . Genet . 81: 581-588), el promotor del virus de mosaico de la escrofularia 35S, el promotor Smas (Velten et al., 1984, EMBO J. 3:2723-2730), el promotor GRP1-8, el promotor de la alcohol deshidrogenasa de cinamilo (Patente de E.U.A. No. 5,683,439), los promotores de ADN-T de Agrobacterium, tales como la manopina sintasa, nopalina sintasa, y octopina sintasa, la subunidad pequeña delpromotor ribulosa bifosfato carboxilasa (ssuRUBISCO) , y/o similares. Los promotores que expresan el ARN en una célula que se pone en contacto por hongos, en particular, roya de la soya, son los preferidos. Alternativamente, el promotor puede dirigir la expresión del ARN en un tejido vegetal a distancia desde el sitio de contacto con el hongo, y el ARN puede transportarse por la planta a una célula que está en contacto con el hongo, en particular células, y/o cerca de los sitios infectados por hongos .

Preferiblemente, el promotor es un promotor constitutivo, el promotor especifico de raíz, el promotor especifico del mesófilo, y/o un promotor inducible por hongos. Un promotor es inducible, si su actividad, medida sobre la cantidad de ARN producida bajo el control del promotor, es por lo menos 30%, 40%, 50%, preferiblemente por lo menos 60%, 70%, 80%, 90% más preferido a por lo menos 100%, 200%, 300% superior en su estado inducido, que en su estado inducido por las Naciones Unidas. Un promotor es por células, de tejidos o especificas de órgano, si su actividad, medida sobre la cantidad de ARN producida bajo el control del promotor, es por lo menos 30%, 40%, 50% preferiblemente por lo menos 60%, 70%, 80%, 90% más preferiblemente por lo menos 100%, 200%, 300% superior en un tipo particular de célula, tejido u órgano, a continuación, en otros tipos de células o tejidos de la misma planta, preferiblemente los otros tipos de células o tejidos son tipos de células o tejidos del órgano de la planta misma, por ejemplo, una raíz. En el caso de promotores específicos de órganos, el promotor de la actividad tiene que ser comparada con la actividad del promotor en otros órganos de la planta, por ejemplo, hojas, tallos, flores o semillas.

Los promotores preferidos en etapa de desarrollo se expresan preferiblemente en ciertas etapas de desarrollo. Promotores de tejidos y órganos preferidos incluyen aquellos que se expresan preferiblemente en ciertos tejidos u órganos, tales como hojas, raíces, semillas y/o xilema. Ejemplos de promotores preferidos de tejidos preferidos y órganos incluyen, pero no se limitan a fruta preferida, óvulo preferido, tejido andrógeno preferido, semilla preferida, integumento preferido, tubérculos preferidos, tallo preferido, pericarpio preferido, hoja preferida, estigma preferida, polen preferido, antera preferida, pétalo preferido, sépalo preferido, pedicelo preferido, silicua preferida, tallo preferido, raíz preferida, promotores y/o similares. Los promotores de semillas preferidas se expresan preferiblemente durante semilla desarrollo y/o la germinación. Por ejemplo, los promotores preferidos de semillas puede ser embrión preferida, endospermo preferida y/o cubierta de la semilla preferida. Véase Thompson et al., 1989, BioEssays 10:108. Ejemplos de promotores de semillas preferidas incluyen, pero no están limitados a la celulosa sintasa (CELA) , Ciml, gamma-zeina, globulina-1, zeina del maíz de 19 kD (cZ19Bl), y/o similares.

Otros promotores adecuados preferidos del tejido o del órgano preferido incluyen, pero no se limitan a, el promotor del gen napina de la colza (Patente de E.U.A. No. 5,608,152), el promotor USP de Vicia faba (Baeumlein et al., 1991, Mol Gen Genet. 225 (3):459-67), el promotor oleosina de Arabidopsis (Solicitud PCT No. WO 98/45461), el promotor faseolina de Phaseolus vulgaris (Patente de E.U.A. No. 5.504.200), el promotor Bce4 de Brassica (Solicitud PCT No. WO 91/13980), o el promotor legumina B4 (LeB4; Baeumlein et al., 1992, Plant Journal, 2 (2) :233-9), asi como promotores que confieren expresión especifica de semillas en plantas monocotiledóneas como maíz, cebada, trigo, centeno, arroz, etc promotores adecuados a tener en cuenta son el promotor del gen Ipt2 o IPT1 de la cebada (Solicitud PCT No. WO 95/15389 y la solicitud PCT No. WO 95/23230) o los descritos en los Solicitud PCT No. WO 99/16890 (promotores del gen hordeína de cebada, el arroz gen glutelina, orizina gen arroz, arroz gen prolamina, del gen gliadina del trigo, el trigo gen glutelina, del gen glutelina de la avena, gen Kasirina de sorgo y/o gen secalina de centeno) Los promotores útiles de acuerdo con la invención incluyen, pero no se limitan a, son la clorofila importante un promotor/b proteina de unión, los promotores de histona, el promotor Ap3, el promotor de ß-conglicina, el promotor de napina, el promotor de lectina de soya, el maíz zeina 15kD promotor, el promotor de zeina 22kD, el promotor de zeina de 27 kD, el promotor de g-zeina, cera, reducción 1, reducción 2, promotores de bronce, el promotor Zml3 (patente de E.U.A. No. 5,086,169), los promotores de poligalacturonasa del maíz (PG) (patentes de E.U.A. Nos. 5,412,085 y 5,545,546), el promotor SGB6 (patente de E.U.A. No. 5,470,359), asi como promotores naturales sintéticos y/o de otro tipo.

Promotores Epidermiespecificos pueden seleccionarse del grupo que consiste de: - WIR5 (= GSTA1); acc. X56012; Dudler y Schweizer, - GLP4, acc. AJ310534; Wei Y., Z. Zhang, CH Andersen, E. Schmelzer, PL Gregersen, DB Collinge, V. Smedegaard-Petersen y H. Thordal-Christensen, Plant Molecular Biology 36, 101 (1998) , GLP2a, acc. AJ237942, Schweizer P., A. Christoffel y Dudler R . , Plant J. 20, 541 (1999); Prx7, acc. AJ003141, Kristensen BK, Ammitzboll H . , Rasmussen SK y Nielsen KA, Molecular Plant Pathology, 2 (6) , 31 1 (2001) ; - Gera, acc. AF250933; S. Wu, A. Druka, H. Horvath, A. Kleinhofs, G. Kannangara y on ettstein D., Plant Phys.

Biochem 38, 685 (2000) ; - OsROCI, acc. AP004656 - RTBV, acc. AAV62708, AAV62707; Kloti A. , Henrich C, S. Bieri, Él X., G. Chen, PK Burkhardt, J. Wunn, P. Lucca, T. Hohn, I. Potrykus y J. Futterer, PMB 40, 249 (1999); - Quitinasa ChtC2-Proraotor de la patata (Ancillo et al., Planta 217 (4), 566, (2003)); AtProT3 Promotor (Grallath et al., Plant Physiology 137 (1), un 17 (2005).); SHN-promotores de Arabidopsis (AP2/EREBP factores de transcripción implicados en la producción de cutina y cera) (Aaron et al., Plant Cell 16 (9), 2463 (2004)), y/o - GSTA1 de trigo (Dudler et al, WP2005306368 y Altpeter et al., Plant Molecular Biology 57 (2), 271 (2005)).

Promotores Mesofiloespecificos se pueden seleccionar del grupo que consiste de: - PPCZml (= PEPC) ; Kausch AP, Owen P, Zachwieja SJ, Flynn AR y J. Sheen, Plant Mol. Biol. 45, 1 (2001); - OsrbcS, Kyozuka et al, Planta Física 102, 991 (1993); Kyozuka J. cElroy D..

Hayakawa T., Y. Xie, R. y K. Wu Shimamoto, Phys. vegetales. 102, 991 (1993); - OsPPDK, acc. AC099041; TagF-2.8, acc. M63223; Schweizer P., A. Christoffel y Dudler R. , Plant J. 20, 541 (1999); - TaFBPase, acc. X53957; - TaWISI, acc. AF467542; US 200220115849; - HvBISI, acc. AF467539; US 200220115849, y/o - ZmMISI, acc. AF467514; US 200220115849; Promotores patógeno inducibles pueden ser seleccionados del grupo que consiste de - HvPRI una, acc. X74939; Bryngelsson et al, Mol. Microbe Interact Plant 7 (2), 267 (1994); - HvPRI b, acc. X74940; Bryngelsson et al, Mol.. Microbio Planta Interact. 7 (2), 267 (1994); - HvBl, 3gluc; acc. AF479647; HvPrx8, acc. AJ276227; Kristensen et al, Molecular Plant Pathology, 2 (6), 311 (2001);., Y/o - HvPAL, acc. X97313; ei Y., Z. Zhang, CH Andersen, E. Schmelzer, PL Gregersen, DB Collinge, V.

Smedegaard-Petersen y Thordal-Christensen H. Plant Molecular Biology 35, 101 (1998) .

Constitutve promotores se pueden seleccionar entre el grupo que consiste en - PcUbi promotor de perejil (WO 03/102198) - Promotor CaMV 35S: Virus Mosaico de la Coliflor promotor 35S (Benfey et al 1989 EMBO J. 8 (8): 2195-2202.), STPT promotor: Arabidopsis thaliana Corto Aquellos promotor translocador Phosphat (adhesión NM_123979) - Actl promotor: - Oryza sativa actina 1 promotor del gen (. McElroy et al 1990 Plant Cell 2 (2) 163-171 a) y/o EF1A2 promotor; Glycine max traducción factor de elongación EF1 alfa (US 20090133159) .

Un tipo de construcción del vector recombinante es un "plásmido", que se refiere a un bucle circular de ADN de doble cadena en el que segmentos de ADN adicionales se pueden ligar. Otro tipo de vector es un vector viral, en el que segmentos de ADN adicionales se pueden ligar en el genoma viral. Ciertas construcciones de vectores recombinantes son capaces de replicación autónoma en una célula de la planta huésped en la que se introducen. Otras construcciones de vectores recombinantes se integran en el genoma de una célula vegetal huésped tras la introducción en la célula huésped, y de ese modo se replican junto con el genoma del huésped. En particular, la construcción del vector es capaz de dirigir la expresión de genes a los que los vectores unidos funcionales.

Sin embargo, la invención pretende incluir dichas otras formas de construcciones de vectores de expresión, tales como vectores virales (por ejemplo, virus de la papa X, tabaco virus cascabel, y/o virus Gemini), que sirven funciones equivalentes.

Un constructor de vector preferido comprende la secuencia que tiene SEC ID No. 9.

La presente invención proporciona además una planta de soya transgénica, parte de planta o célula de planta transformada con una construcción de vector que comprende el Gen ADR-1. Preferiblemente, la construcción del vector es una construcción de vector como se ha definido anteriormente.

Las partes cosechables de la planta de soya transgénica de acuerdo con la presente invención son parte de la invención. Las partes cosechables pueden ser semillas, raices, hojas y/o las flores que componen el Gen ADR-1. Se prefieren los granos de soya transgénica que comprende el Gen ADR-1.

Productos derivados de la planta de la soya transgénica de acuerdo con la presente invención, partes de la misma o de partes cosechables de los mismos son parte de la invención.

La presente invención también incluye métodos para la producción de un producto que comprende a) el cultivo de las plantas de la invención y la producción de b) a partir de dicho producto o de las plantas de la invención y/o partes del mismo, por ejemplo, semillas, de estas plantas. En una modalidad adicional, el método comprende los pasos de a) cultivar las plantas de la invención, b) Extracción de las partes cosechables como se define anteriormente de las plantas y c) producir dicho producto a partir de o por las partes cosechables de la invención.

En una modalidad, el método para la producción de un producto comprende a) el cultivo de las plantas de la invención u obtenible por los métodos de la invención y la producción de b) a partir de dicho producto o de las plantas de la invención y/o partes, por ejemplo, semillas, de estas plantas .

El producto puede ser producido en el sitio donde se ha crecido la planta, las plantas y/o partes de los mismos pueden ser retirados del lugar donde las plantas han sido cultivadas para producir el producto. Típicamente, la planta se cultiva, las partes cosechables deseados se eliminan de la planta, si es posible en ciclos repetidos, y el producto hecho de las partes cosechables de la planta. La etapa de crecimiento de la planta se puede realizar sólo una vez cada vez que los métodos de la invención se lleva a cabo, al tiempo que permite repetidas veces las etapas de ejemplo de producción de productos por extracción repetida de las partes cosechables de las plantas de la invención y si el procesamiento necesario más de estas partes para llegar al producto. También es posible que se repita la etapa de crecimiento de las plantas de la invención y las plantas o partes cosechables se almacenan hasta que la producción del producto se realiza a continuación una vez acumuladas para las plantas o partes de plantas. Además, las etapas de crecimiento de las plantas y la producción del producto se pueden realizar con un solapamiento en el tiempo, incluso de forma simultánea en una gran medida o de forma secuencial. En general se cultivan las plantas durante algún tiempo antes de que se produzca el producto.

En una modalidad, los productos producidos por dichos métodos de la invención son productos de origen vegetal tales como, pero no limitado a, un producto alimenticio, pienso, un suplemento alimenticio, suplemento alimenticio, fibra, cosmética o farmacéutica. Los productos alimenticios son considerados como composiciones utilizadas para la nutrición o para complementar la nutrición. Alimentos para animales y suplementos de piensos para animales, en particular, se consideran como productos alimenticios.

Un producto preferido es la harina de soya y/o aceite de soya.

En otra modalidad, los métodos de la invención para la producción se utilizan para hacer productos agrícolas tales como, pero no limitados a, extractos de plantas, proteínas, aminoácidos, carbohidratos, grasas, aceites, polímeros, vitaminas y similares.

Es posible que un producto vegetal se componga de uno o más productos agrícolas en gran medida.

Las plantas transgénicas de la invención se pueden cruzar con plantas transgénicas o similares con plantas transgénicas que carecen de los ácidos nucleicos de la invención o con las plantas no transgénicas, utilizando métodos conocidos de cultivo de plantas, para preparar las semillas. Además, las células de plantas transgénicas o plantas de la presente invención pueden comprender, y/o ser cruzadas con otra planta transgénica que comprende uno o más ácidos nucleicos, creando así una "pila" de transgenes en la planta y/o su progenie. La semilla se planta entonces para obtener una planta transgénica fértil cruzada que comprende el ácido nucleico de la invención. La planta transgénica fértil cruzada puede tener la cásete de expresión heredado particular a través de un progenitor femenino o a través de un progenitor masculino. La segunda planta puede ser una planta endogámica. El transgénica fértil cruzada puede ser un híbrido. También se incluyen dentro de la presente invención son las semillas de cualquiera de estos cruzado las plantas transgénicas fértiles. Las semillas de esta invención se pueden recolectar de plantas transgénicas fértiles y usarse para crecer generaciones de progenie de plantas transformadas de esta invención incluyen líneas de plantas híbridas que comprenden el ácido nucleico recombinante que comprende el gen ADR-1 transgénico.

De acuerdo con la presente invención, el ácido nucleico introducido recombinante puede mantenerse en la célula de la planta de manera estable si se incorpora en un replicón autónomo no cromosómico o integrado en los cromosomas de la planta. Ya sea que esté presente en una construcción de vector extra-cromosómico no replicante o de replicación o de una construcción de vector que se integra en un cromosoma, el ácido nucleico recombinante preferiblemente reside en un cásete de expresión de la planta. Un cásete de expresión de planta contiene preferiblemente secuencias reguladoras capaces de dirigir la expresión de genes en células de plantas que son funcionales unidos de modo que cada secuencia puede cumplir su función, por ejemplo, terminación de la transcripción por señales de poliadenilación . Señales de poliadenilación preferidas son las procedentes de ADN-T de Agrobacterium tumefaciens tales como el gen 3 conocido como octopina sintasa del plásmido Ti pTiACH5 (Gielen et al., 1984, EMBO J. 3:835) o equivalentes funcionales de los mismos, sino también todos los otros terminadores funcionalmente activos en ' plantas son apropiados. Como expresión de genes de plantas no está muy a menudo limitado en los niveles transcripcionales, un cásete de expresión de la planta preferiblemente contiene otras secuencias funcionales unidos como potenciadores traduccionales tales como la saturación de secuencia que contiene la secuencia líder 5' no traducida del virus del mosaico del tabaco mejora de la relación de polipéptido por ARN (Gallie et al., 1987, Nucí. Acids Research 15:8693-871 1) . Ejemplos de vectores de expresión de plantas incluyen los detallados en: Becker, D. et al., 1992, New vectores binarios de plantas con marcadores seleccionables situada próxima al borde izquierdo, , Plant Mol. Biol. 20:01 195 a 1197; Bevan, MW, 1984, Binary vectores de Agrobacterium para la transformación de plantas, Nucí. Acid. Res. 12:8711 -8721 y vectores para la transferencia de genes en las plantas superiores, en: Plantas transgénicas , vol. 1, Ingeniería y uso, eds.: Kung y R. Wu, Academic Press, 1993, S. 15-38.

De acuerdo con la presente invención, el Gen ADR-1 es capaz de aumentar la cantidad de proteína o la función de la Proteína ADR-1 en células de plantas y/o el hongo. En modalidades preferidas, el incremento de la cantidad de proteína o la función de la Proteína ADR-1 se lleva a cabo de una manera constitutiva o específica de tejido. En modalidades especialmente preferidas, un incremento esencialmente inducido por patógenos en la cantidad de proteína o función de las proteínas se lleva a cabo, por ejemplo, por expresión recombinante del gen ADR-1 bajo el control de un promotor fúngico-inducible . En particular, la expresión del gen ADR-1 tiene lugar en sitios infectados por hongos, en donde, sin embargo, preferiblemente la expresión del gen ADR-1 permanece esencialmente sin cambios en los tejidos no infectados por hongos. En modalidades preferidas, la cantidad de proteina de la Proteina ADR-1 en la planta y/o el hongo se incrementa en por lo menos 10%, por lo menos 20%, por lo menos 30%, por lo menos 40%, por lo menos 50%, por lo menos 60%, por lo menos 70%, por lo menos 80%, por lo menos 90%, o por lo menos 95% o más en comparación con una planta de tipo silvestre que no se transforma con el ácido ADR-1-nucleico. Preferiblemente, la planta de tipo silvestre es una planta de un genotipo similar, más preferiblemente idéntica a la planta transformada con el ácido nucleico ADR-1.

Además la presente invención proporciona un método para la producción de una planta transgénica que tiene una mayor resistencia contra la oxidación, que comprende (a) introducir un vector recombinante construir como se ha definido anteriormente en una célula vegetal o planta, (b) regenerar la planta a partir de la célula de la planta y (c) expresar una proteina (i) que tiene por lo menos 60%, por lo menos 70%, por lo menos 80%, por lo menos 90%, por lo menos 95%, por lo menos 98% o 100% de identidad con la SEC ID No. 2, un fragmento funcional de la misma, un ortólogo y/o los mismos paralogo y/o (ii) una proteina codificada por un ácido nucleico que tiene por lo menos 60%, por lo menos 70%, por lo menos 80%, por lo menos 90%, por lo menos 95%, por lo menos 98% de identidad o 100% con la SEC ID No. 1, un fragmento funcional de la misma y/o un ácido nucleico capaz de hibridar con un ácido nucleico.

La secuencia de ácido ADR-l-nucleico puede comprender un N-terminal espiral de la bobina motivo, un sitio de unión de nucleótidos y/o un C-terminal rica en leucina motivo de repetición.

Preferiblemente, el N-terminal de enrollado de la bobina motivo tiene por lo menos 70%, por lo menos 80%, por lo menos 90%, por lo menos 95%, por lo menos 98% o 100% de identidad con la SEC ID NO. 3.

Preferiblemente, el sitio de unión de nucleótidos que tiene por lo menos 70%, por lo menos 80%, por lo menos 90%, por lo menos 95%, por lo menos 98% o 100% de identidad con la SEC ID No. 5.

Preferiblemente, el C-terminal rica en leucina motivo de repetición tiene por lo menos 70%, por lo menos 80%, por lo menos 90%, por lo menos 95%, por lo menos 99% o 100% de identidad con la SEC ID No. 7.

La secuencia de Proteina ADR-1 comprende preferiblemente un N-terminal espiral de la bobina motivo, un sitio de unión de nucleótidos y/o un C-terminal rica en leucina motivo de repetición.

Preferiblemente, N-terminal espiral de la bobina motivo tiene por lo menos 70%, por lo menos 80%, por lo menos 90%, por lo menos 95%, por lo menos 98% o 100% de identidad con la SEC ID No. 4.

Preferiblemente, el sitio de unión de nucleótidos que tiene por lo menos 70%, Por lo menos 80%, por lo menos 90%, por lo menos 95%, por lo menos 98% o 100% de identidad con la SEC ID NO. 6.

Preferiblemente, el motivo de repetición C-terminal rico en leucina tiene por lo menos 70%, por lo menos 80%, por lo menos 90%, por lo menos 95%, por lo menos 98% o 100% de identidad con la SEC ID No. 8.

Todas las definiciones que se dan a los términos utilizados en el tipo especifico de categoría (método para producir una planta y/o parte de la misma resistente a la roya de la soya, célula de planta transgénica, construcción de vector, el uso de la construcción del vector, etc.) pueden ser también aplicable para las otras categorías .

Figuras : La Figura 1 muestra la longitud completa de la secuencia del gen ADR-1 de Arabidopsis thaliana que tiene la SEC ID No.l.

La Figura 2 muestra la secuencia de la Proteina ADR-1 (SEQ-ID-2) .

La Figura 3 muestra motivs diferentes en el Gen ADR-1 (SEC ID Nos. 3, 5, 7) y de la Proteina ADR-1 (SEC ID Nos. 4, 6, 8) .

La Figura 4 muestra un esquema de una construcción de vector útil de acuerdo con la presente invención.

La Figura 5 muestra la secuencia completa de nucleótidos de una construcción de vector de acuerdo con la presente invención (SEC ID No. 9) .

La Figura 6 muestra el sistema de puntuación utilizado para determinar el nivel de área de hoja enferma del tipo silvestre y transgénicos (que expresa ADR-1) plantas de la soya contra el hongo de la roya P. pachyrhizi.

La Figura 7 muestra el resultado de la puntuación de las 22 plantas de la soya transgénicos que expresan la ADR-1 vector de sobreexpresion de construir. A las plantas de soya que expresan ADR-1 de proteina se inocularon con esporas de Phakopsora pachyrhizi. La evaluación del área de hoja enferma en todas las hojas se realizó 14 días después de la inoculación. La media del porcentaje del área de la hoja que muestra las colonias de hongos o amarilleamiento/pardeamiento fuerte en todas las hojas fue considerada como zona de hoja enferma. En todas las plantas To de soya 22 que expresan ADR-1 (expresión revisada por RT-PCR) se evaluaron en paralelo a las plantas de control no transgénicas . La mediana del área de hoja enferma se muestra en la Figura 7. La sobreexpresión de ADR-1 reduce en gran parte el área de la hoja enferma en comparación con las plantas testigo no transgénicas.

Ej emplos Los siguientes ejemplos no están destinados a limitar el alcance de las reivindicaciones a la invención, sino que son destinados a ser ejemplares de ciertas modalidades. Cualquier variación en los métodos ejemplificados que se producen por el técnico experto se pretende que caigan dentro del alcance de la presente invención .

Ejemplo 1: Métodos generales La síntesis química de oligonucleótidos puede ser afectado, por ejemplo, de la manera conocida usando el método de fosfoamidita (Voet, Voet, 2a edición, iley Press New York, páginas 896-897). Las etapas de clonación realizadas para los fines de la presente invención tal como, por ejemplo, escisiones de restricción, electroforesis en gel de agarosa, purificación de fragmentos de ADN, transferencia de ácidos nucleicos a nitrocelulosa y membranas de nylon, que unen fragmentos de ADN, transformación de células de E. coli , cultivos de bacterias, multiplicación de fagos y análisis de la secuencia de ADN recombinante, se llevó a cabo como se describe por Sambrook et al. Cold Spring Harbor Laboratory Press (1989), ISBN 0-87969-309-6. La secuenciación de moléculas de ADN recombinante se lleva a cabo con un secuenciador MWG-Licor láser ADN de fluorescencia siguiendo el método de Sanger (Sanger et al., Proc. Nati. Acad. Sci . EE.UU. 74, 5463 (1977) ) .

Ejemplo 2: Clonación de construcción de vector de sobreexpresión ADR-1 La sobreexpresión del constructor de vector ADR-1 (Figuras 4 y 5) se preparó como sigue: A menos que se especifique lo contrario, se utilizan los métodos estándar como se describen en Sambrook et al, Molecular Cloning: . Un manual de laboratorio, Cold Spring Harbor 1989, Cold Spring Harbor Laboratory Press.

El cDNA fue producido a partir de Arabidopsis thaliana (ecotipo Col-0) de ARN mediante el uso del kit de síntesis de Superscript II de ADNc (Invitrogen) . Todos los pasos de preparación de cDNA y la purificación se realizaron de acuerdo como se describe en el manual.

La secuencia SEC ID No. 1 se amplificó a partir de cDNA por PCR como se describe en el protocolo de arranque en caliente Phusion, ADN polimerasa Ultra Pfu, Pfu Turbo o Herculase (Stratagene) . La composición para el protocolo de ADN Ultra Pfu, Turbo Pfu o polimerasa Herculase fue el siguiente: lx solución reguladora de PCR, 0.2 mM de cada dNTP, 100 ng de cDNA de Arabidopsis thaliana (var Columbia-0) , iniciador de avance 50 pmol, iniciador inverso 50 pmol, inicio en aliente 1 u Phusion, ADN polimerasa Ultra Pfu Turbo Pfu o Herculase.

Los ciclos de amplificación fueron las siguientes: 1 ciclo de 60 segundos a 98 °C, seguido por 35 ciclos en cada caso de 10 segundos a 98°C, 30 segundos a 60°C y 60 segundos a 72°C, seguido por 1 ciclo de 10 minutos a 72°C, luego 4°C.

Las secuencias de iniciadores siguientes fueron utilizadas para amplificar específicamente la ADR-1 de longitud completa ORF para fines de clonación: i) iniciador de avance: 5' CCGGTACCATGGCTTCGTTCATAGAT-3 ' (SEC ID NO: 10) ii) el iniciador inverso: 5' TTGTCGACCTAATCGTCAAGCCAATC-3 ' (SEC ID NO: 11) Los fragmentos amplificados se digirieron utilizando enzimas de restricción Acc651 y Salí (NEB Biolabs) y se ligó en un vector pENTRY Gateway digerido por Acc651/Sail (Invitrogen, Life Technologies, Carlsbad, California, USA) de una manera que la longitud completa del fragmento ADR-1 se encuentra en dirección en sentido entre los attl_l y attl_2 sitios de recombinación.

Para obtener el vector de transformación de plantas binario, un triple reacción LR (sistema de puerta de enlace, (Invitrogen, Life Technologies, Carlsbad, California, EE.UU.) se realizó de acuerdo al protocolo de los fabricantes mediante el uso de un pENTRY-Un vector que contiene un promotor de ubiquitina perejil, el ADR- 1 en un vector pENTRY-B y un vector pENTRY-C que contenia un terminador t-Nos como objetivo un vector pDEST binario se utilizó el cual se compone de:. (1) un Cásete de resistencia a kanamicina para la selección bacteriana (2) un origen de replicación para pVSl en Agorbacteria (3) un origen de replicación de pBR322 para el mantenimiento estable en E. coli y (4) entre el borde derecho y el izquierdo una selección AHAS bajo control de un promotor pcUbi (Figura 4). La reacción de recombinación se transformó en E. coli (DH5alfa) , mini-preparadas y seleccionadas por digestiones de restricción especificas. Un clon positivo de cada construcción del vector se secuenció y se presentó transformación de soya.

Ejemplo 3 Transformación de soya El ADR-1 constructo de vector de expresión (véase el ejemplo 2) se transformó en soya. 3.1 Esterilización y germinación de las semillas de soya Prácticamente cualquier semillas de una variedad de soya se pueden emplear en el método de la invención. Una variedad de cultivo de soya (incluyendo Jack, Williams 82, y Resnik) es apropiado para la transformación de soya. Las semillas de soya se esterilizaron en una cámara con un gas de cloro producido por la adición de 3.5 mi de 12N HC1 gota a gota en 100 mi de lejía (5.25% de hipoclorito de sodio) en un desecador con una tapa hermética. Después de 24 a 48 horas en la cámara, se eliminaron las semillas y de aproximadamente 18 a 20 semillas se sembraron en medio G sólido con o sin 5 µ? 6-bencil-aminopurina (BAP) en 100 mm placas de Petri. Las plántulas sin BAP son más alargadas y las raices se desarrollan, sobre todo la formación de raíces laterales y secundarias. BAP refuerza la plántula mediante la formación de una planta de semillero más corto y voluminoso.

Las plantas de siete días de edad, desarrolladas en la luz (> 100 yEinstein/m2s) en 25°C fueron utilizados para el material de explante para los tres tipos de explantes. En este momento, la cubierta de la semilla se dividió y el epicótilo con las hojas unifoliadas han crecido hasta, como mínimo, la longitud de los cotiledones. El epicótilo debe ser de por lo menos 0.5 cm para evitar el -nodo del tejido cotiledóneo (desde cultivo de soyas y mucho semillas puede variar en el tiempo de desarrollo de una descripción de la etapa de germinación es más preciso que un tiempo específico de germinación) .

Para la inoculación de plantas de semillero enteras (Procedimiento A, véase el ejemplo 3.3.1 y 3.3.2) o explantes de hoja (Método B, véase el ejemplo 3.3.3), las plántulas fueron entonces listo para la transformación.

Para el método C (véase el ejemplo 3.3.4), el hipocotilo y uno y medio o parte de los dos cotiledones fueron retirados de cada plántula. Las plantas de semillero se pusieron luego en medio de propagación durante 2 a 4 semanas. Las plantas producen varios brotes ramificados, para obtener explantes de. La mayoría de los explantes se originó a partir de la plántula que crece de la yema apical. Estos explantes se utilizan preferiblemente como tejido objetivo. 3.2 - Crecimiento y preparación del cultivo de Agrobacterium Cultivos de Agrobacterium se prepararon mediante rayas Agrobacterium (por ejemplo, A. tumefaciens o A. rhizogenes) que porta el vector binario deseado (por ejemplo, H. Klee Horsch R. y S. Rogers 1987 transformación mediada por Agrobacterium de plantas y sus Aplicaciones adicionales a Biología Vegetal.; Review Anual de Fisiología Vegetal Vol 38: 467-486) en el medio de crecimiento sólido YEP, medio YEP: 10 g de extracto de levadura. 10 g de Bacto peptona. 5 g de NaCl. Ajustar el pH a 7.0, y llevar el volumen final a 1 litro con H20, para placas de YEP agar añadir Agar 20 g, autoclave) e incubando a 25 °C hasta que aparecieron las colonias (aproximadamente 2 días) . Dependiendo de los genes marcadores seleccionables presentes en el plásmido Ti o Ri, el vector binario y los cromosomas bacterianos, diferentes compuestos de selección se puede utilizar para A. tumefaciens y la selección de rizogenes en los medios sólidos y líquidos YEP. Varias cepas de Agrobacterium se pueden utilizar para el método de transformación.

Después de aproximadamente dos días, una sola colonia (con un palillo de dientes estéril) se recogió y 50 mi de YEP líquido fue inoculado con antibióticos y se agitó a 175 rpm (25. Grado. C.) hasta una OD. sub.600 entre 0.8-1.0 se alcanza (aproximadamente 2 d) . El trabajo de materias primas de glicerol (15%) para la transformación se preparan y 1 mi de caldo de Agrobacterium en alícuotas en tubos Eppendorf de 1.5 mi y luego se almacenaron a -80 °C.

El día antes de la inoculación del explante, 200 mi de YEP se inocularon con 5. mu.l a 3 mi de solución de trabajo de Agrobacterium en un matraz Erienmeyer de 500 ral. El matraz se agitó durante la noche a 25°C. hasta el OD. sub.600 era entre 0.8 y 1.0. Antes de preparar las explantes de soya, las agrobacterias se sedimentaron por centrifugación durante 10 min a 5.500. veces, g en 20°C. Las pellas se resuspendieron en CCM líquido a la densidad deseada (Od. sub.600 0.5 a 0.8) y se colocaron a temperatura ambiente por lo menos 30 min antes de su uso. 3.3 - Preparación del explante y Cultivo Co- (inoculación) 3.3.1 Método A Preparación del explante en el Día de la Transformación.

Las plantas de semillero en este momento había alargado epicotilos de por lo menos 0.5 cm, pero en general entre 0,5 y 2 cm. Epicotilos alargados hasta 4 cm de largo había sido empleado con éxito. Los explantes se prepararon a continuación, con: i) con o sin algunas raíces, ii) con una parcial, o ambos cotiledones, todas las hojas preformadas se eliminaron incluyendo meristemo apical, y el nodo situado en el primer conjunto de hojas se lesionó con varios cortes utilizando un bisturí.

Este corte en el nodo no sólo indujo la infección por Agrobacterium, pero también se distribuyen las células meristemáticas axilares y dañado preformadas brotes. Después de herir y preparación, los explantes se dejaron de lado en una placa de Petri y posteriormente co-cultivadas con la mezcla de CCM líquido/Agrobacterium durante 30 minutos. Los explantes se retiraron entonces del medio líquido y se sembraron en la parte superior de un papel de filtro estéril en placas Petri 15. x 100 mra con una co-cultivo mediano sólido. Los tejidos objetivo heridos fueron colocados de tal manera que están en contacto directo con el medio. 3.3.2 Método Modificado A Preparación del explante de epicótilo Los segmentos de epicótilo de soya preparados a partir de plántulas de 4 a 8 días de edad se usaron como explantes para la regeneración y transformación. Las semillas de soyacv L00106CN, 131 93-41 y Jack se germinaron en sales 1/10 MS o un medio similar composición con o sin citoquininas durante 4 ~ 8 d. Los explantes de epicótilos se prepararon eliminando el nodo y el nodo de esqueje cotiledonar de la sección de esqueje. El epicótilo fue cortado en 2 a 5 segmentos. Especialmente preferidos son los segmentos unidos al nodo principal o superior que comprende tejido meristemático axilar.

Los explantes se utilizaron para la infección por Agrobacterium. AGL1 de Agrobacterium que alberga un plásmido con el gen marcador GUS y las AHAS, gen bar o dsdA marcador seleccionable se cultivó en medio LB con los antibióticos apropiados durante la noche, se recogieron y se resuspendieron en un medio de inoculación con acetosiringona . Recién preparados segmentos epicótilo se empaparon en la suspensión de Agrobacterium durante 30 a 60 minutos y después los explantes se transfirieron en seco sobre papeles de filtro estériles. Los explantes inoculados se cultivaron entonces en un medio de co-cultivo con L-cisteina y productos químicos de TTD y otros, tales como acetosiringona para el incremento de T-ADN entrega de 2 a 4 d. Los explantes epicótilo infectados se colocaron entonces en un medio de inducción de brotes con agentes de selección, tales como imazapir (por AHAS gen) , glufosinato (para el gen bar) , o D-serina (para dsdA gen) . Los brotes regenerados se subcultivaron en medio de alargamiento con el agente selectivo .

Para la regeneración de plantas transgénicas de los segmentos se cultivaron entonces en un medio con citoquininas tales como BAP, TDZ y/o cinetina para la inducción. Después de 4 a 8 semanas, los tejidos cultivados se transfirieron a un medio con baja concentración de la citoquinina de elongación de los brotes. Brotes alargados fueron transferidos a un medio con auxina para el enraizamiento y desarrollo de la planta. Múltiples brotes se regeneraron.

Muchos sectores estables transformados que muestran fuerte expresión GUS fueron recuperados. Las plantas de soya se regeneraron a partir de explantes epicótilo. El suministro eficiente del ADN-T y sectores transformados estables se demostraron . 3.3.3 Método B: explantes de hojas Para la preparación de la explante de hoja del cotiledón fue retirado del hipocotilo. Los cotiledones se separaron el uno del otro y el epicótilo se elimina. Las hojas primarias, que consisten en la lámina, el peciolo, y las estipulas, se retiraron de la epicótilo cuidadosamente cortando en la base de las estipulas tales que los meristemos axilares se incluyeron en el explante. La herida del explante, asi como para estimular la formación de nuevos brotes, todo brote de pre-formadas se eliminaron y el área entre las estipulas se cortó con un escalpelo afilado 3 a 5 veces .

Los explantes son o bien completamente sumergido o el final peciolo heridos sumerge en la suspensión de Agrobacterium inmediatamente después de la preparación del explante. Después de la inoculación, los explantes se transfirieron a papel de filtro estéril para eliminar el exceso de cultivo de Agrobacterium y los explantes lugar con la herida del costado en contacto con una ronda de 7 cm de papel Whatman superponiendo el medio CP sólido (véase más arriba) . Este papel de filtro evita sobrecrecimiento de A. tumefaciens sobre los explantes de soya. Envuelva las cinco placas con Parafilm.TM. "M" (American National Can, Chicago, III., EE.UU.) y se incuba durante tres a cinco dias en la oscuridad o la luz a los 25°C. 3.3.4 Método C: Meristemos axilares propagados Para la preparación del explante de meristema axilar propagado se usaron plántulas propagadas de 3-4 semanas de edad. Explantes meristemáticos axilares puede estar preparado a partir de la primera a la cuarta nodo. Un promedio de tres a cuatro explantes se podría obtener de cada plántula. Los explantes se prepararon a partir de plántulas mediante la reducción de 0.5 a 1.0 cm por debajo del nodo axilar en el entrenudo y retirar el pecíolo y la hoja del explante. La punta donde se cortó la mentira meristemos axilares con un bisturí para inducir el crecimiento de brote nuevo y permitir el acceso de las células objetivo para el Agrobacterium. Por lo tanto, un explante de 0.5 cm incluye el esqueje y un brote.

Una vez cortados, los explantes se colocaron inmediatamente en la suspensión de Agrobacterium durante 20 a 30 minutos. Después de la inoculación, los explantes se transfirieron a papel de filtro estéril para eliminar el exceso de cultivo de Agrobacterium coloca entonces casi completamente sumergido en CCM sólido o en la parte superior de una ronda de 7 cm de papel de filtro que cubre la MCP sólido, dependiendo de la cepa de Agrobacterium. Este papel de filtro evita el crecimiento excesivo de Agrobacterium en las explantes de soya. Las placas se envolvieron con Parafilm.TM. "M" (American National Can, Chicago, III., USA) y se incubaron durante dos a tres días en la oscuridad a 25°C. 3.4 - Inducción de brotes Después de 3 a 5 días de cocultivo en la oscuridad a 25°C, los explantes se lavaron en medio liquido SIM (para eliminar el exceso de Agrobacterium) (SIM, ver Olhoft et al. 2007 A novel Agrobacterium rhizogenes mediada método de transformación de soya usando explantes de nodo primario de plantas de semillero In Vitro Cell Dev. Biol.: - Plant (2007) 43:536-549; para eliminar el exceso de Agrobacterium) o medio Modwash (IX sales de B5 principales, IX sales de B5 menores, IX MSIII de hierro, 3% de sacarosa, vitaminas B5 IX, 30 mM MES, 350 mg/L Timentin™ pH 5.6, WO 2005/121345) y se secaron sobre papel de filtro estéril (para evitar daños especialmente en la lámina) antes de la puesta en el medio sólido SIM. Los aproximadamente 5 explantes (Método A) o explantes 10 a 20 (métodos B y C) se colocaron de tal manera que el tejido objetivo estaba en contacto directo con el medio. Durante las primeras 2 semanas, los explantes pueden ser cultivados con o sin medio selectivo. Preferiblemente, los explantes se transfirieron a SIM sin selección durante una semana.

Para explantes de hoja (Método B) , el explante se debe colocar en el medio de tal manera que es perpendicular a la superficie del medio con el peciolo incrustada en el medio y la lámina fuera del medio.

Para propaga meristema axilar (Método C) , el explante se coloca en el medio tal que es paralela a la superficie del medio (basipetal) con el explante parcialmente incrustado en el medio.

Envolver las placas con cinta adhesiva de ventilación 394 (3M, St. Paul, Minnesota, USA) se colocaron en una cámara de crecimiento durante dos semanas, con una temperatura promedio de 25. grado. C en 18 h luz/6 h oscuridad ciclo a 70-100 . mu . E/m. sup .2s . Los explantes se mantuvieron en el medio de SIM con o sin selección hasta que el crecimiento de brote nuevo ocurrió a la zona objetivo (por ejemplo, meristemos axilares en el primer nodo por encima del epicótilo) . Las transferencias a medio fresco pueden ocurrir durante este tiempo. Los explantes se transfieren desde el SIM con o sin selección a la tarjeta SIM con la selección después de aproximadamente una semana. En este momento, no había considerable desarrollo de brote nuevo en la base de los pecíolos de los explantes de hojas en una variedad de SIM (Método B) , en el nodo primario para los explantes de plántulas (Método A) , y se propaga en los ganglios axilares de explantes (Método C) .

Preferiblemente, todos los brotes formados antes de la transformación se separaron hasta 2 semanas después del co-cultivo para estimular el nuevo crecimiento de los meristemos. Esto ayudó a reducir el quimerismo en el transformante primario y aumentar la amplificación de transgénicos células meristemáticas . Durante este tiempo el explante puede o no puede ser cortado en trozos más pequeños (es decir, separando el nodo del explante mediante la reducción de la epicótilo) . 3.5 - elongación de los brotes Después de 2 a 4 semanas (o hasta que una masa de los brotes se formó) sobre medio SIM (preferiblemente con selección) , los explantes se transfirieron a medio de SEM medio (medio de elongación de los brotes, ver Olhoft et al. 2007 A novel Agrobacterium rhizogenes mediada método de transformación de soyusing primaria explantes de ganglios seedlingsln Vitro Cell Dev Biol. - Plant (2007) 43:536-549) que estimula la elongación de los brotes de los primordios rodaje. Este medio puede o no puede contener un compuesto de selección .

Después de cada 2 a 3 semanas, los explantes fueron transferidos a medio fresco SEM (que contiene preferiblemente de selección) después de una cuidadosa eliminación de tejido muerto. Los explantes deben mantenerse unida y no fragmentar en pedazos y retener algo saludable. Los explantes se continuaron hasta ser transferido hasta la muerte del explante o brotes alargados. Brotes alargados> 3 cm y se colocaron en medio RM durante aproximadamente 1 semana (Método A y B) , o de 2 a 4 semanas, dependiendo de la variedad de cultivo (método C) en el que las raices de tiempo comenzó a formarse. En el caso de los explantes con raices, se transfirieron directamente en el suelo. Brotes enraizados se transfirieron al suelo y se endurece en una cámara de crecimiento durante 2 a 3 semanas antes de la transferencia al invernadero. Plantas regeneradas obtenidas con este método fueron fértiles y produjo en promedio 500 semillas por planta .

La expresión transitoria de GUS después de 5 días de co-cultivo con Agrobacterium tumefaciens fue generalizada en los explantes meristemáticos plántulas axilares especialmente en las regiones hiriendo durante la preparación del explante (Método A) . Los explantes se colocaron en medio de inducción de brotes sin selección para ver cómo el nodo primario-responde a la inducción de brotes y la regeneración. Hasta el momento, más del 70% de los explantes se formaron nuevos brotes en esta región. La expresión del gen GUS era estable después de 14 días en la SIM, lo que implica la integración del ADN-T en el soygenome. Además, los experimentos preliminares dieron como resultado la formación de brotes GUS positivos que forman después de 3 semanas en la SIM.

[Para el Método C, el tiempo de regeneración media de una plántula de soya usando el protocolo propaga meristema axilar fue de 14 semanas de la inoculación del explante. Por lo tanto, este método tiene un tiempo de regeneración rápida que conduce a plantas de soya fértiles, sanas.

Ejemplo 4: ensayo de patógenos 4.1. Recuperación de clones Clones por 2-3 al evento estaban en maceta en pequeñas macetas 6cm. Para la recuperación de los clones se mantuvieron durante 12-18 días en el Phytochamber (se cultivaron a un ritmo 16 h en el día 8 h de noche a una temperatura de 16° a 22 °C y humedad del 75%) . 4.2 Inoculación El hongo de la roya es un aislado silvestre de Brasil. Las plantas se inocularon con P. pachyrhizi.

Con el fin de obtener un material adecuado para la inoculación de esporas, hojas de soya que habían sido infectadas con roya 15-20 días, se tomaron 2-3 días antes de la inoculación y se transfirieron a placas de agar (1% de agar en H20) . Las hojas se colocaron con su lado superior sobre el agar, que permite que el hongo crezca a través del tejido y de producir esporas muy jóvenes. Para la solución de inoculación, las esporas fueron eliminadas de las hojas y se añadieron a una solución de Tween-H20. El conteo de esporas se realizó bajo un microscopio de luz por medio de una cámara de recuento Thoma. Para la inoculación de las plantas, la suspensión de esporas se añadió a un matraz de pulverización de aire comprimido accionada y aplicarse de manera uniforme sobre las plantas o las hojas hasta que la superficie de la hoja es bien humectada. Para los ensayos macroscópicas se utilizó una densidad de esporas de 1.5xl05 esporas/ml. Para la microscopía, una densidad de >5 x 105 esporas/ml se utiliza. Las plantas inoculadas se colocaron durante 24 horas en una cámara de invernadero con un promedio de 22 °C y >90% de humedad del aire. El cultivo se realizó el siguiente en una cámara con una media de 25°C y 70% de humedad del aire.

Ejemplo 5 Tamizado microscópico: Para la evaluación del desarrollo de patógenos, las hojas inoculadas de las plantas se tiñeron con azul de anilina 48 horas después de la infección.

La tinción con azul de anilina sirve para la detección de sustancias fluorescentes. Durante las reacciones de defensa en las interacciones huésped y las interacciones no huéspedes, las sustancias tales como fenoles, calosa o lignina acumulado o se produjeron y fueron incorporadas a la pared celular de forma local en papilas o en toda la célula (reacción de hipersensibilidad, HR) . Los complejos se forman en asociación con azul de anilina, que conducen por ejemplo, en el caso de calosa a fluorescencia amarilla. El material de la hoja se transfirió a tubos Falcon o platos que contienen solución decolorante II (etanol/ácido acético 6/1) y se incubó en un baño de agua a 90°C durante 10-15 minutos. La solución decolorante II se retiró inmediatamente después, y las hojas se ISHED 2x con agua. Para la tinción, las hojas se incubaron durante 1.5-2 horas en solución , de tinción II (0.05% azul de anilina = azul de metilo, 0.067 M di-hidrógeno fosfato de potasio) y se analizaron por microscopía inmediatamente después.

Los diferentes tipos de interacción se evaluaron (contaron) por microscopía. Un microscopio Olympus BX61 UV (luz incidente) y se utiliza un filtro UV LongPath (excitación: 375/15, Divisor de haz: 405 LP) . Después de la tinción anilina azul, las esporas apareció azul bajo luz UV. Las papilas pueden ser reconocidas bajo el apresorio de hongos por una coloración verde/amarillo. La reacción de hipersensibilidad (HR) se caracteriza por una fluorescencia de células enteras.

Ejemplo 6 Evaluación de la susceptibilidad a la roya de la soya La progresión de la enfermedad roya de la soya se obtuvo por la estimación de la zona enferma (zona que fue cubierta por esporulación uredinios) en la parte trasera (lado abaxial) de la hoja. Además, el color amarillo de la hoja se ha tenido en cuenta, (para el esquema véase la Figura 6) .

T0 plantas de soya que expresan ADR-1 de proteina se inocularon con esporas de Phakopsora pachyrhizi. Los síntomas de la enfermedad macroscópica de soya contra P. pachyrhizi de 22 a plantas de soya fue evaluado 14 días después de la inoculación.

La media del porcentaje del área de la hoja que muestra las colonias de hongos o color amarillento/dorado fuertes en todas las hojas se consideró como área foliar afectada. En todas soya 22 a plantas que expresan ADR-1 (revisadas expresión por RT-PCR) se evaluaron en paralelo a las plantas de control no transgénicas . Los clones de las plantas de soya no transgénicos fueron utilizados como control. La mediana del área de hoja enferma se muestra en la figura 7 para las plantas que expresan recombinantes, ADR-1 en comparación con plantas de tipo silvestre. La sobreexpresión de ADR-1 reduce fuertemente el área de la hoja enferma en comparación con las plantas testigo no transgénicas. Estos datos indican claramente que la expresión en planta de la ADR-1 vector constructo de expresión que conducen a una menor puntuación de la enfermedad de las plantas transgénicas en comparación con controles no transgénicos. Asi, la expresión de ADR-1 en la soya mejora la resistencia de la soya contra roya de la soya.

Claims (12)

REIVINDICACIONES

1. - Un método para aumentar la resistencia a la roya de soya en plantas y/o células de la planta, en donde el contenido y/o la actividad de por lo menos una proteina ADR1 se incrementa en comparación con las plantas de tipo silvestre y/o células de plantas de tipo silvestre.

2. - El método de acuerdo con la reivindicación 1, en donde la proteina ADR-1 está codificada por (i) un ácido nucleico recombinante que tiene por lo menos 60%, por lo menos 70%, por lo menos 80%, por lo menos 90%, por lo menos 95%, por lo menos 98% o 100% de identidad con la SEC ID No. 1, un fragmento funcional del mismo y/o un ácido nucleico recombinante, capaz de hibridarse con tales ácidos nucleicos de los mismos y/o por (ii) una proteina que tiene por lo menos 60%, por lo menos 70%, por lo menos 80%, por lo menos 90%, por lo menos 95%, por lo menos 98% de identidad o 100% con la SEC ID No. 2, un fragmento funcional de la misma , un ortólogo y/o uno de sus parálogo.

3. - El método de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 1 o 2, que comprende (a) transformar de manera estable una célula de planta con un cásete de expresión que comprende (i) una secuencia de ácido nucleico recombinante que tiene por lo menos 60%, por lo menos 70%, por lo menos 80%, por lo menos 90% por lo menos un 95%, por lo menos 98% de identidad o 100% de identidad con la SEC ID No. 1 y/o un fragmento funcional en unión funcional con un promotor y/o (ii) un ácido nucleico recombinante que codifica para una proteina que tiene por lo menos 60%, por lo menos 70%, por lo menos 80%, por lo menos 90%, por lo menos 95%, por lo menos 98% de identidad o 100% con la SEC ID No. 2, un fragmento funcional de la misma, un ortólogo y/o uno de sus parálogo, (b) regenerar la planta a partir de la célula vegetal; y (c) expresar dicha secuencia de ácido nucleico que codifica para una proteina ADR-1 en una cantidad y durante un periodo suficiente para generar o incrementar una resistencia a la roya de la soya en dicha planta.

4.- Un vector recombinante que comprende la construcción de: (a) (i) ácido nucleico recombinante que tiene por lo menos 60%, por lo menos 70%, por lo menos 80%, por lo menos 90%, por lo menos 95%, por lo menos 98% de identidad o 100% con la SEC ID No. 1, un fragmento funcional del mismo y/o un ácido nucleico capaz de hibridar con un ácido nucleico y/o (ii) un ácido nucleico recombinante que codifica para una proteina que tiene por lo menos 60%, por lo menos 70%, por lo menos 80%, por lo menos 90%, por lo menos 95%, por lo menos 98% de identidad o 100% con la SEC ID No. 2, un fragmento funcional de la misma, un ortólogo y/o un parálogo de los mismos unida operativamente con (b) un promotor y (c) una secuencia de terminación de la transcripción .

5. - El método de acuerdo con la reivindicación 3 o la construcción de vector de acuerdo con la reivindicación 4, en donde el promotor es un promotor constitutivo, de patógenos induceable promotor y/o un mesófilo especifica de promotor .

6. - La planta transgénica de soya, parte de la planta transgénica o célula de planta transgénica transformada con una construcción de vector según las reivindicaciones 4 ó 5.

7. - El método para la producción de una planta transgénica que tiene una mayor resistencia contra la roya de la soya, que comprende (a) introducir un constructor de vector de acuerdo con la reivindicación 4 y 5 en una planta y/o célula de planta, (b) regenerar la planta a partir de la célula de la planta y (c) expresar una proteína (i) que tiene por lo menos 60%r por lo menos 70%, por lo menos 80%, por lo menos 90%, por lo menos 95%, por lo menos 98% o 100% de identidad con la SEC ID No. 2, un fragmento funcional de la misma, un ortólogo y/o de los mismos paralogo y/o (ii) codificado por un ácido nucleico que tiene por lo menos 60%, por lo menos 70%, por lo menos 80%, por lo menos 90%, por lo menos 95%, por lo menos 98% de identidad o 100% con la SEC ID No. 1, una del mismo fragmento funcional y/o un ácido nucleico capaz de hibridar con un ácido nucleico .

8. - Las partes cosechables de una planta de acuerdo con la reivindicación 6, en donde las partes cosechables son preferiblemente las semillas.

9. - El producto derivado de una planta de acuerdo con la reivindicación 6, una planta producible por el método de la reivindicación 7 y/o de las partes cosechables de la planta de acuerdo con la reivindicación 8, en el que el producto es comida preferiblemente de soya y/o aceite de soya .

10. - El método para la producción de un producto que comprende a) el cultivo de las plantas de la reivindicación 6 u obtenible por el método de la reivindicación 7 y b) la producción de dicho producto o de las plantas de la invención y/o sus partes, por ejemplo, semillas, de estas plantas.

11. - El método de las reivindicaciones 1 a 3, 5, 7 o la planta de acuerdo con la reivindicación 6, en donde la roya de la soya es Phakopsora paryhizi y/o Phakopsora meibomiae .

12. - El método de las reivindicaciones 1 a 3, 5, 7 ó 11 o la planta de acuerdo con la reivindicación 6 ó 11, en donde la planta es de soya. RESUMEN La presente invención se refiere a un método para incrementar resistencia contra roya de la soya en plantas transgénicas y/o células de plantas. En estas plantas, el contenido y/o la actividad de una proteina ADR-1 se incrementan en comparación con las plantas de tipo silvestre que no incluyen un gen de ADR-1 recombxnante.