CN102149818A - 具有改变的根构造的植物、涉及编码蛋白磷酸酶2c(pp2c)多肽及其同源物的基因的相关构建体和方法 - Google Patents

Abstract

本发明公开了尤其可用于改变植物的根结构的分离的多核苷酸和多肽以及重组DNA构建体、包含这些重组DNA构建体的组分(例如植物或种子)、以及利用这些重组DNA构建体的方法。所述重组DNA构建体包含可操作地连接在植物中有功能的启动子的多核苷酸，其中所述多核苷酸编码可用于改变植物根构造的多肽。

Description

具有改变的根构造的植物、涉及编码蛋白磷酸酶2C(PP2C)多肽及其同源物的基因的相关构建体和方法

相关申请的交叉引用

本专利申请要求提交于2008年8月15日的美国临时申请61/089,285的权益，该申请的全部内容以引用方式并入本文。

发明领域

本发明领域涉及植物育种和基因学，并且具体地讲涉及用于改变植物根构造的重组DNA构建体。

背景技术

在除了非常少的几个之外的所有其他自然生态系统中，水和营养物质的可用性限制了植物生长。它们在大多数农业生态系统中限制产量。植物根部起到重要作用，如水和营养物质摄取、在土壤中固定植物、以及在根围建立生物相互作用。因此，阐明植物根发育和功能的基因调控是农学和生态学中相当受关注的课题。

根系发源于在胚胎形成期间发育的初生根。初生根产生次生根，次生根继而产生三生根。所有次生、三生、四生以及更进一步分生的根均被称为侧根。包括玉米在内的许多植物也可从连续的地下节位(冠根)或地上节位(支柱根)处产生不定根。有三个主要过程影响根系的总体构造。第一个是在初生根分裂组织中的细胞分裂过程，该过程通过加入新生细胞到根中使得根不定生长。第二个是侧根形成过程，该过程增加根系的探索能力。第三个是根毛形成过程，该过程增加初生根和侧根的总表面(Lopez-Bucio等人，Current Opinion in Plant Biology(2003)6：280-287)。在已经分离出的玉米突变体中仅仅缺少根型的一个亚型。已经鉴定了拟南芥属的根形态基因突变体如SHORTROOT和SCARECROW，它显示初生根和侧根的发育缺陷(J.E.Malamy，Plant，Cell and Environment(2005)28：67-77)。

已经鉴定了许多特异性影响根发育的玉米突变体(Hochholdinger等人，2004，Annals of Botany 93：359-368)。隐性突变体rtcs和rt1不形成冠根和支柱根或仅形成较少的冠根和支柱根，然而初生根和侧根不受影响。在隐性突变体des21中，缺失侧生种子根和根毛。隐性突变体rthl-3缺失根毛。突变体lrt1和rum1在侧根开始产生之前受影响，而突变体slr1和slr2的侧根伸长能力受到削弱。决定根系构造的内源响应途径包括激素、细胞循环调节子和调节基因。水分胁迫和营养物质可用性属于决定根系构造的环境响应途径。

提交于2005年2月14日的美国专利申请2005-57473(美国专利公开公布2005/223429A1，公布于2005年10月6日)涉及使用拟南芥属(Arabidopsis)细胞分裂素氧化酶基因改变植物中的细胞分裂素含量并刺激根生长。

美国专利公开6,344,601(公布于2002年2月5日)涉及在植物细胞中低表达或超表达肌动蛋白抑制蛋白(profilin)以改变植物生长习性，例如减少根系或根毛系统会使花期推迟。

WO2004/US16432(提交于2004年5月21日(WO2004/106531，公布于2004年12月9日)涉及使用超表达顺式-异戊烯基转移酶的方法来操纵生长速率和/或产量和/或构造。

提交于2004年9月30日的美国专利申请2004/489500(美国专利公开公布2005/059154A1，公布于2005年3月13日)涉及使用在植物中超表达转录因子E2F的方法改变细胞数量、构造和产量。

可利用激活标记来鉴定能影响性状的基因。已经在模型植物拟南芥中使用该方法(Weigel等人，2000，Plant Physiol.122：1003-1013)。

插入转录增强子元件能够显著激活和/或提高附近内源基因的表达。

发明概述

本发明包括：

在一个实施方案中，分离的多核苷酸包含编码PP2C或PP2C样多肽的核酸序列，所述多肽的氨基酸序列基于Clustal V比对方法在与SEQ ID NO：25进行比较时具有至少80％的序列同一性，或者在与SEQ ID NO：23进行比较时具有至少85％的序列同一性，或者在与SEQ ID NO：21进行比较时具有至少90％的序列同一性，或所述核酸序列的全长互补序列。所述多肽可包含SEQ ID NO：21、23或25的氨基酸序列。

在另一个实施方案中，本发明涉及包含本发明任何分离的多核苷酸的重组DNA构建体，所述分离的多核苷酸可操作地连接至至少一个调控序列，并且本发明涉及包含所述重组DNA构建体的细胞、植物和种子。所述细胞可为真核细胞，例如酵母、昆虫或植物细胞，或者可为原核细胞，例如细菌。

在另一个实施方案中，在基因组中包含重组DNA构建体的植物，所述重组DNA构建体包含可操作地连接至少一种调控元件的多核苷酸，其中所述多核苷酸编码多肽，所述多肽的氨基酸序列基于Clustal V比对方法在与SEQ ID NO：15、17、19、21、23、25、27、29或31进行比较时具有至少50％的序列同一性，并且其中所述植物在与不包含所述重组DNA构建体的对照植物进行比较时表现出改变的根构造。

在另一个实施方案中，在基因组中包含重组DNA构建体的植物，所述重组DNA构建体包含可操作地连接至少一种调控元件的多核苷酸，其中所述多核苷酸编码多肽，所述多肽的氨基酸序列基于Clustal V比对方法在与SEQ ID NO：15、17、19、21、23、25、27、29或31进行比较时具有至少50％的序列同一性，并且其中所述植物在与不包含所述重组DNA构建体的对照植物进行比较时表现出至少一种农学特性的改变。任选地，所述植物在不同环境条件下与不包含所述重组DNA构建体的所述对照植物进行比较时表现出至少一种农学特性的改变，其中所述不同环境条件是选自干旱、氮或病害的至少一种条件。

在另一个实施方案中，本发明包括本发明的任何植物，其中所述植物选自：玉米、大豆、卡诺拉、稻、小麦、大麦和高粱。

在另一个实施方案中，本发明包括本发明任何植物的种子，其中所述种子在其基因组中包含重组DNA构建体，所述重组DNA构建体包含可操作地连接至少一种调控元件的多核苷酸，其中所述多核苷酸编码多肽，所述多肽的氨基酸序列基于Clustal V比对方法在与SEQ ID NO：15、17、19、21、23、25、27、29或31进行比较时具有至少50％的序列同一性，并且其中所述种子产生的植物在与不包含所述重组DNA构建体的对照植物进行比较时显示具有改变的根构造或至少一种农学特性的改变，或者两者。

在另一个实施方案中，改变植物根构造的方法，该方法包括：(a)将重组DNA构建体引入到可再生的植物细胞中，该重组DNA构建体包含可操作地连接至少一个调控序列的多核苷酸，其中该多核苷酸编码多肽，该多肽的氨基酸序列基于Clustal V比对方法在与SEQ ID NO：15、17、19、21、23、25、27、29或31进行比较时具有至少50％的序列同一性；(b)在步骤(a)之后从该可再生植物细胞再生出转基因植物，其中该转基因植物在其基因组中包含该重组DNA构建体；以及(c)获得源自步骤(b)的所述转基因植物的子代植物，其中所述子代植物在其基因组中包含所述重组DNA构建体，并且当与未包含所述重组DNA构建体的对照植物比较时，所述子代植物表现出改变的根构造。

在另一个实施方案中，评价具有改变的根构造的植物的方法包括：(a)获取转基因植物，其中所述转基因植物在其基因组中包含重组DNA构建体，所述重组DNA构建体包含可操作地连接至少一种调控元件的多核苷酸，其中所述多核苷酸编码多肽，所述多肽的氨基酸序列基于Clustal V比对方法在与SEQ ID NO：15、17、19、21、23、25、27、29或31进行比较时具有至少50％的序列同一性；(b)获得源自该转基因植物的子代植物，其中该子代植物在其基因组中包含该重组DNA构建体；以及(c)评价该子代植物在与未包含该重组DNA构建体的对照植物比较时改变的根构造。

在另一个实施方案中，测定植物中至少一种农学特性改变的方法包括：(a)获取转基因植物，其中所述转基因植物在其基因组中包含重组DNA构建体，所述重组DNA构建体包含可操作地连接至少一种调控元件的多核苷酸，其中所述多核苷酸编码多肽，所述多肽的氨基酸序列基于Clustal V比对方法在与SEQ ID NO：15、17、19、21、23、25、27、29或31进行比较时具有至少50％的序列同一性，其中所述转基因植物在其基因组中包含所述重组DNA构建体；(c)获得源自该转基因植物的子代植物，其中所述子代植物在其基因组中包含所述重组DNA构建体；以及(d)包括测定所述转基因植物在水限制条件下与不包含所述重组DNA构建体的对照植物进行比较时是否表现出至少一种农学特性的改变。

在另一个实施方案中，本发明包括本发明的任何方法，其中所述植物选自：玉米、大豆、卡诺拉、稻、小麦、大麦和高粱。

附图以及序列表的说明

根据以下的详细描述和附图以及序列表，可更全面地理解本发明，以下的详细描述和附图以及序列表形成本申请的一部分。

图1示出pHSbarENDs2激活标记构建体(SEQ ID NO：1)的图谱，该构建体用于制备拟南芥属种群。

图2A-2R示出SEQ ID No：15、17、19、21、23、25、27和29以及SEQ ID NO：30、31、32和33的PP2C同源物的全长氨基酸序列的多重比对。阴影显示的是与共有序列完全匹配的残基。将共有序列显示于每个比对上部。共有残基通过直接取多数来测定。

图3示出图2A至2R中示出的PP2C同源物的每对氨基酸序列的序列同一性百分比和趋异值图表。

图4是实施例18中用于半水耕玉米生长的培养基。

图5是列出实施例18中与不同硝酸盐浓度对Gaspe Bay Flint衍生的玉米系生长和发育的影响相关的数据的图表。

序列描述以及所附序列表遵循如37C.F.R.§1.821-1.825所列出的关于专利申请中核苷酸和/或氨基酸序列公开的规定。

序列表包含用于核苷酸序列字符的单字母码和用于氨基酸的三字母码，如遵照IUPACIUBMB标准所定义的，该标准在Nucleic Acids Res.13：3021-3030(1985)以及在Biochemical J.219(2)：345-373(1984)中有所描述，这两篇文献以引用的方式并入本文。用于核苷酸和氨基酸序列数据的符号和格式遵循在37C.F.R.§1.822中所列出的规定。

SEQ ID NO：1pHSbarENDs2

SEQ ID NO：2pDONR^TM/Zeo

SEQ ID NO：3pDONR^TM221

SEQ ID NO：4pBC-yellow

SEQ ID NO：5PHP27840

SEQ ID NO：6PHP23236

SEQ ID NO：7PHP10523

SEQ ID NO：8PHP23235

SEQ ID NO：9PHP20234

SEQ ID NO：10PHP28529

SEQ ID NO：11PHP28408

SEQ ID NO：12PHP22020

SEQ ID NO：13PHP29635

表1列出了本文所述的多肽、包含编码多肽全部或其主要部分的核酸片段的cDNA克隆的命名、以及在所附序列表中使用的对应标识符(SEQ ID NO：)。

表1

蛋白磷酸酶2C蛋白(PP2C)

SEQ ID NO：30对应于NCBI GI NO：21537109

SEQ ID NO：31对应于NCBI GI No：18390789(AT1G07630)

SEQ ID NO：32对应于NCBI GI No：125588428

SEQ ID NO：33对应于NCBI GI No：125544056

SEQ ID NO：34对应于NCBI GI No：56784477

SEQ ID NO：35是拟南芥蛋白磷酸酶2C(PP2C)(AT1G07630)(编码如SEQ ID NO：31所示的氨基酸序列，NCBI通用标识符18390789)的核苷酸序列

SEQ ID NO：36是实施例4中用于引入attB1序列的正向引物。

SEQ ID NO：37是实施例4中用于引入attB2序列的反向引物。

SEQ ID NO：38是attB1序列。

SEQ ID NO：39是attB2序列。

SEQ ID NO：40是实施例8中使用的正向引物。

SEQ ID NO：41是实施例8中使用的反向引物。

SEQ ID NO：42是实施例5中的正向引物VC062。

SEQ ID NO：43是实施例5中的反向引物VC063。

SEQ ID NO：44PIIOXS2a-FRT87(ni)m。

SEQ ID NO：45是玉米NAS2启动子。

SEQ ID NO：46是GOS2启动子。

SEQ ID NO：47是泛素启动子。

SEQ ID NO：48是S2A启动子。

SEQ ID NO：49是PINII终止子。

优选实施方案的详细描述

本文中所列出的每篇参考文献的公开内容的全文以引用的方式并入本文。

如本文所用的并在所附的权利要求书中的单数形式“一个”和“所述”包括复数涵义，除非上下文中清楚地另有指明。因此，例如，“一株植物”的涵义包括多株该类植物。“一个细胞”的涵义包括一个或多个细胞及其本领域的技术人员已知的等同物，等等。

术语“根构造”指构成根的不同部分的布置方式。术语“根构造”、“根结构”、“根系”或“根系构造”在这里可互换使用。

一般来讲，植物由胚发育成的第一种根称为初生根。在大多数双子叶植物中，初生根被称为主根。这种主根向下生长并产生分枝根(侧根)。在单子叶植物中，植物的初生根发生分枝，生成须根系。

术语“改变的根构造”指与参照植株或对照植株比较，在其不同发育阶段构成根系的不同部分的改变状况。应当理解，改变的根构造涵盖了一种或多种可测量参数(包括但不限于一个或多个根系部分的直径、长度、数目、角度或表面)的改变，所述根系部分包括但不限于初生根、侧根或分枝根、不定根和根毛，所有这些均在本发明的范围内。这些改变可导致根所占的面积或空间的整体改变。参照植株或对照植株在其基因组中不含重组DNA构建体或异源构建体。

“农学特性”是可测量的参数，包括但不限于绿度、产量、生长速率、生物量、成熟时的鲜重、成熟时的干重、果实产量、种子产量、总植物含氮量、果实含氮量、种子含氮量、营养组织含氮量、总植物游离氨基酸含量、果实游离氨基酸含量、种子游离氨基酸含量、营养组织游离氨基酸含量、总植物蛋白质含量、果实蛋白质含量、种子蛋白质含量、营养组织蛋白质含量、耐旱性、氮摄取、根倒伏、茎倒伏、植株高度、穗高、穗长和收获指数。

术语“V”阶段是指玉米植物的叶片生长阶段；例如V4＝四片、V5＝五片具有可见叶颈的叶片。叶颈是浅色领状“带”，位于暴露的叶片底部，靠近叶片接触植物茎部的区域。进行叶片计数，开始时计数最底下的、短的、圆顶真叶，最后计数具有可见叶颈的最上面的叶片。

“pp2c”和“at-pp2c”在本文中可互换使用，指拟南芥基因座At1g07630(SEQ ID NO：35)。

PP2C指由AT1G07630(SEQ ID NO：35)编码的蛋白(SEQ ID NO：31)。

“pp2c样”指拟南芥“pp2c”位点AT1G07630(SEQ ID NO：35)的来自不同物种的核苷酸同源物，如玉米和大豆，并且不受限制地包括任何以下核苷酸序列：SEQ ID NO：14、16、18、20、22、24、26和28。

“PP2C样”指拟南芥“PP2C”(SEQ ID NO：31)的来自不同物种的蛋白同源物，如玉米和大豆，并且不受限制地包括任何以下氨基酸序列：SEQ ID NO：15、17、19、21、23、25、27和29。

“环境条件”指植物生长的条件，例如水的可用性、营养物质(例如氮)的可用性或者病害的存在。

“转基因”指其基因组因异源核酸(如重组DNA构建体)的存在而发生改变的任何细胞、细胞系、愈伤组织、组织、植物部分或植物，包括那些最初的转基因事件以及从最初的转基因事件通过有性杂交或无性生殖而产生的那些。如本文所用的术语“转基因”不涵盖通过常规植物育种方法或通过诸如随机异花受精、非重组病毒感染、非重组细菌转化、非重组转座或自发突变之类的自然发生事件导致的基因组(染色体基因组或染色体外基因组)改变。

“基因组”在用于植物细胞时不仅涵盖存在于细胞核中的染色体DNA，而且还包括存在于细胞的亚细胞组分(如线粒体、质粒)中的细胞器DNA。

“植物”包括整个植株、植物器官、植物组织、种子和植物细胞以及同一植株的子代。植物细胞包括但不限于得自下列物质的细胞：种子、悬浮培养物、胚、分生区域、愈伤组织、叶、根、芽、配子体、孢子体、花粉和小孢子。

“子代”包括植物的任何后续世代。

“转基因”指其基因组因异源核酸(如重组DNA构建体)的存在而发生改变的任何细胞、细胞系、愈伤组织、组织、植物部分或植物，包括那些最初的转基因事件以及从最初的转基因事件通过有性杂交或无性生殖而产生的那些。如本文所用的术语“转基因”不涵盖通过常规植物育种方法或通过诸如随机异花受精、非重组病毒感染、非重组细菌转化、非重组转座或自发突变之类的自然发生事件导致的基因组(染色体基因组或染色体外基因组)改变。

“转基因植物”包括在其基因组内包含异源多核苷酸的植物。优选的是，异源多核苷酸被稳定地整合进基因组中，使得该多核苷酸传递至连续的世代。异源多核苷酸可单独地或作为重组DNA构建体的部分整合进基因组中。

针对序列而言的“异源”意指来自外来物种的序列，或者如果来自相同物种，则指通过蓄意的人为干预而从其天然形式发生了组成和/或基因座的显著改变的序列。

“多核苷酸”、“核酸序列”、“核苷酸序列”或“核酸片段”可互换使用并且是任选含有合成的、非天然的或改变的核苷酸碱基的单链或双链RNA或DNA聚合物。核苷酸(通常以它们的5′-单磷酸形式存在)通过它们的单字母命名指代如下：“A”指腺苷酸或脱氧腺苷酸(分别用于RNA或DNA)，“C”指胞苷酸或脱氧胞苷酸，“G”指鸟苷酸或脱氧鸟苷酸，“U”指尿苷酸，“T”指脱氧胸苷酸，“R”指嘌呤(A或G)，“Y”指嘧啶(C或T)，“K”指G或T，“H”指A或C或T，“I”指肌苷，“N”指任何核苷酸。

“多肽”、“肽”、“氨基酸序列”和“蛋白质”在本文中可互换使用，指氨基酸残基的聚合物。该术语适用于其中一个或多个氨基酸残基是相应的天然存在的氨基酸的人工化学类似物的氨基酸聚合物，以及适用于天然存在的氨基酸聚合物。术语“多肽”、“肽”、“氨基酸序列”和“蛋白质”还可包括修饰，包括但不限于糖基化、脂质连接、硫酸盐化、谷氨酸残基的γ羧化、羟化和ADP-核糖基化。

“信使RNA(mRNA)”指无内含子并且可通过细胞翻译成蛋白质的RNA。

“cDNA”指与mRNA模板互补并且利用逆转录酶从mRNA模板合成的DNA。cDNA可为单链的或者可用DNA聚合成酶I的Klenow片段转化成双链形式。

“成熟”蛋白质指经翻译后加工的多肽；即已经去除了存在于初级翻译产物中的任何前肽或原肽的多肽。

“前体”蛋白质指mRNA的翻译初级产物；即具有仍然存在的前肽和原肽。前肽和原肽可为并且不限于细胞内定位信号。

“分离的”指物质，例如核酸和/或蛋白质，该物质基本上不含在天然存在的环境中通常伴随该物质或与其反应的组分，或者说是该物质被从所述组分移出。分离的多核苷酸可从它们天然存在于其中的宿主细胞纯化。技术人员已知的常规核酸纯化方法可用于获得分离的多核苷酸。该术语也涵盖重组多核苷酸和化学合成的多核苷酸。

“重组”指两个分离的不同序列片段的人工组合，例如通过基因工程技术化学合成或通过操纵分离的核酸片段合成。“重组体”也包括细胞或载体，它们已经通过引入异源核酸进行了修改，或者来源于进行如此修改的细胞，但是不涵盖由自然发生事件(例如自发突变、自然转化/转导/转座)改变的细胞或载体，例如那些无蓄意的人为干预产生的细胞或载体。

“重组DNA构建体”指在自然界中通常不会一起存在的核酸片段的组合。因此，重组DNA构建体可包含源于不同来源的调控序列和编码序列，或源于相同来源但以不同于通常天然存在的方式排列的调控序列和编码序列。

术语“入门克隆”和“入门载体”本文可互换使用。

“调控序列”指位于编码序列的上游(5′非编码序列)、中间或下游(3′非编码序列)，并且影响相关编码序列的转录、RNA加工或稳定性或者翻译的核苷酸序列。调控序列可包括但不限于启动子、翻译前导序列、内含子和多腺苷酸化识别序列。

“启动子”指能够控制另一核酸片段转录的核酸片段。

“在植物中有功能的启动子”指能够控制植物细胞中的转录的启动子，无论其是否来源于植物细胞。

“组织特异性启动子”和“组织优选启动子”可互换使用，并且指主要但非必须专一地在一种组织或器官中表达，而是也可在一种特定细胞中表达的启动子。

“发育调控启动子”指其活性由发育事件决定的启动子。

术语“可操作地连接”指核酸片段联合成单一片段，使得其中一个核酸片段的功能受到另一个核酸片段的调控。例如，在启动子能够调节核酸片段的转录时，该启动子与该核酸片段进行了可操作地连接。

“表达”指功能产物的产生。因此，核酸片段的表达可指核酸片段的转录(如生成mRNA或功能RNA的转录)和/或RNA翻译成前体或成熟蛋白质。

“表型”意指细胞或生物体的可检测的特征。

有关将核酸片段(例如重组DNA构建体)插入细胞内的“引入”意指“转染”或“转化”或“转导”，并且包括指将核酸片段整合进真核或原核细胞中，在该细胞中核酸片段可整合进细胞的基因组(如染色体、质粒、质体或线粒体DNA)内，转变成自主的复制子或瞬时表达(如转染的mRNA)。

“转化细胞”是将核酸片段(如重组DNA构建体)引入其中的任何细胞。

在此所用的“转化”指稳定转化和瞬时转化两者。

“稳定转化”指将核酸片段引入宿主生物体的基因组中，导致基因稳定遗传。一旦稳定转化，核酸片段稳定地整合进宿主生物体和任何连续世代的基因组中。

“瞬时转化”指将核酸片段引入宿主生物体的核中或包含DNA的细胞器中，引起基因表达而没有基因稳定遗传。

“等位基因”是占据染色体上给定位点的基因的几种供选择形式的其中一种。当二倍体植物中一对同源染色体上给定基因座上存在的等位基因相同时，该植物在该基因座处是纯合的。如果二倍体植物中一对同源染色体上给定基因座上存在的等位基因不同，则该植物在该基因座处是杂合的。如果转基因存在于二倍体植物中一对同源染色体中的其中之一上，则该植物在该基因座处是半合子的。

序列比对和同一性百分比可用设计用于检测同源序列的多种比较方法来测定，这些方法包括但不限于LASERGENE

生物信息计算包(DNASTARInc.，Madison，WI)的Megalign

程序。除非另外说明，本文提供的序列的多重比对用Clustal V比对方法(Higgins和Sharp，1989，CABIOS.5：151-153)采用默认参数(空位罚分＝10，空位长度罚分＝10)执行。成对比对和使用Clustal V方法的蛋白序列百分比计算的默认参数为KTUPLE＝1，空位罚分＝3，窗口＝5，DIAGONALS SAVED＝5。就核酸而言，这些参数为KTUPLE＝2，空位罚分＝5，窗口＝4，DIAGONALS SAVED＝4。在序列比对后，使用Clustal V程序，通过参阅相同程序上的“序列距离”表可能获得“百分比同一性”和“趋异度”值；除非另外说明，本文提供的和申明的同一性百分比和趋异度是以该方式计算。

本文使用的标准重组DNA和分子克隆技术是本领域所熟知的并且在如下文献中有更全面的描述：Sambrook，J.，Fritsch，E.F.和Maniatis，T.Molecular Cloning：A Laboratory Manual；Cold Spring Harbor Laboratory Press：Cold Spring Harbor，1989(下文称为“Sambrook”)。

现在来看优选的实施方案：

优选的实施方案包括分离的多核苷酸和多肽、重组DNA构建体、包含这些重组DNA构建体的组分(例如植株或种子)以及利用这些重组DNA构建体的方法。

优选的分离的多核苷酸和多肽

本发明包括如下优选的分离的多核苷酸和多肽：

分离的多核苷酸包含：(i)编码多肽的核酸序列，所述多肽的氨基酸序列基于Clustal V比对方法在与SEQ ID NO：15、17、19、21、23、25、27、29或31进行比较时具有至少50％、51％、52％、53％、54％、55％、56％、57％、58％、59％、60％、56％、62％、63％、64％、65％、66％、67％、68％、69％、70％、71％、72％、73％、74％、75％、76％、77％、78％、79％、80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％的序列同一性；或(ii)所述(i)的核酸序列的全长互补序列；任一上述分离的多核苷酸可用于本发明的任何重组DNA构建体(包括抑制DNA构建体)。所述多肽优选地是PP2C或PP2C样蛋白。

分离的多肽，所述多肽的氨基酸序列基于Clustal V比对方法在与SEQ ID NO：15、17、19、21、23、25、27、29或31进行比较时具有至少50％、51％、52％、53％、54％、55％、56％、57％、58％、59％、60％、56％、62％、63％、64％、65％、66％、67％、68％、69％、70％、71％、72％、73％、74％、75％、76％、77％、78％、79％、80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％的序列同一性。所述多肽优选地是PP2C或PP2C样蛋白。

分离的多核苷酸包含(i)基于Clustal V比对方法在与SEQ ID NO：14、16、18、20、22、24、26、28或35进行比较时具有至少50％、51％、52％、53％、54％、55％、56％、57％、58％、59％、60％、56％、62％、63％、64％、65％、66％、67％、68％、69％、70％、71％、72％、73％、74％、75％、76％、77％、78％、79％、80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％的序列同一性的核酸序列；或(ii)(i)的核酸序列的全长互补序列。任一上述分离的多核苷酸可用于本发明的任何重组DNA构建体(包括抑制DNA构建体)。该分离的多核苷酸编码PP2C或PP2C样蛋白。

优选的重组DNA构建体和抑制DNA构建体。

在一个方面，本发明包括重组DNA构建体(包括抑制DNA构建体)。

在一个优选的实施方案中，重组DNA构建体包含可操作地连接至少一种调控序列(如，在植物中有功能的启动子)的多核苷酸，其中该多核苷酸包含(i)编码氨基酸序列的核酸序列，所述氨基酸序列基于Clustal V比对方法在与SEQ ID NO：15、17、19、21、23、25、27、29或31进行比较时具有至少50％、51％、52％、53％、54％、55％、56％、57％、58％、59％、60％、56％、62％、63％、64％、65％、66％、67％、68％、69％、70％、71％、72％、73％、74％、75％、76％、77％、78％、79％、80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％的序列同一性，或(ii)(i)的核酸序列的全长互补序列。

在另一个优选的实施方案中，重组DNA构建体包含可操作地连接至少一种调控序列(如在植物中有功能的启动子)的多核苷酸，其中所述多核苷酸包含(i)核酸序列，所述核酸序列在与SEQ ID NO：14、16、18、20、22、24、26、28或35进行比较时具有至少50％、51％、52％、53％、54％、55％、56％、57％、58％、59％、60％、56％、62％、63％、64％、65％、66％、67％、68％、69％、70％、71％、72％、73％、74％、75％、76％、77％、78％、79％、80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％的序列同一性，或(ii)(i)的核酸序列的全长互补序列。

图2A至2R示出以下全长氨基酸序列的多重比对：SEQ ID NO：15、17、19、21、23、25、27和29以及SEQ ID NO：30、31、32和33。所述序列的多重比对使用LASERGENE

生物信息学计算软件包的Megalign

程序进行(DNASTAR

Inc.，Madison，WI)；具体地讲，使用Clustal V比对方法(Higgins和Sharp(1989)CABIOS.5：151-153)，多重比对预设参数为空位罚分＝10，空位长度罚分＝10，成对比对预设参数为KTUPLE＝1，空位罚分＝3，窗口＝5以及DIAGONALS SAVED＝5。

图3显示图2A至2R中显示的每对氨基酸序列的序列同一性百分比和趋异值。

在另一个优选的实施方案中，重组DNA构建体包含可操作地连接至少一个调控序列(如，在植物中有功能的启动子)的多核苷酸，其中所述多核苷酸编码PP2C或PP2C样蛋白。

在另一方面，本发明包括抑制DNA构建体。

抑制DNA构建体优选包含至少一种调控序列(优选在植物中有功能的启动子)，该调控序列可操作地连接至：(a)以下序列的全部或部分：(i)编码多肽的核酸序列，所述多肽的氨基酸序列基于Clustal V比对方法在与SEQ ID NO：15、17、19、21、23、25、27、29或31进行比较时具有至少50％、51％、52％、53％、54％、55％、56％、57％、58％、59％、60％、56％、62％、63％、64％、65％、66％、67％、68％、69％、70％、71％、72％、73％、74％、75％、76％、77％、78％、79％、80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％的序列同一性，或(ii)所述(a)(i)的核酸序列的全长互补序列；或者(b)源自所关注的靶基因的有义链或反义链的区域，当与所述区域所来源的有义链或反义链的全部或部分比较时，基于Clustal V比对方法，所述区域的核酸序列具有至少50％、51％、52％、53％、54％、55％、56％、57％、58％、59％、60％、56％、62％、63％、64％、65％、66％、67％、68％、69％、70％、71％、72％、73％、74％、75％、76％、77％、78％、79％、80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％的序列同一性，并且其中所述所关注的靶基因编码PP2C或PP2C样蛋白；或(c)以下序列的全部或部分：(i)核酸序列，所述核酸序列基于Clustal V比对方法在与SEQ ID NO：14、16、18、20、22、24、26、28或35进行比较时具有至少50％、51％、52％、53％、54％、55％、56％、57％、58％、59％、60％、56％、62％、63％、64％、65％、66％、67％、68％、69％、70％、71％、72％、73％、74％、75％、76％、77％、78％、79％、80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％的序列同一性，或(ii)所述(c)(i)的核酸序列的全长互补序列。该抑制DNA构建体优选包含共抑制构建体、反义构建体、病毒抑制构建体、发夹抑制构建体、茎环抑制构建体、产生双链RNA的构建体、RNAi构建体或小RNA构建体(如，siRNA构建体或miRNA构建体)。

应当理解(正如本领域技术人员将会理解的)，本发明不仅仅涵盖这些具体的示例性序列。导致给定位点处产生化学上等价的氨基酸但不影响所编码多肽的功能特性的核酸片段中的改变是本领域众所周知的。因此，氨基酸丙氨酸(一种疏水性氨基酸)的密码子可被编码另一个疏水性较弱的残基(例如甘氨酸)或疏水性较强的残基(例如缬氨酸、亮氨酸或异亮氨酸)的密码子取代。类似地，导致一个带负电荷的残基替换为另一个带负电荷的残基(例如，天冬氨酸替代谷氨酸)或者一个带正电荷的残基替换为另一个带正电荷的残基(例如，赖氨酸替换精氨酸)的改变也可预期产生功能上等价的产物。导致多肽分子的N末端和C末端部分改变的核苷酸变化也将预计不会改变多肽的活性。所提出的修饰中的每一种均完全在本领域常规技术内，如测定所编码的产物的生物活性的保留。

“抑制DNA构建体”是在转化或稳定整合进植物基因组时，导致该植物中的靶基因“沉默”的重组DNA构建体。靶基因可为植物内源基因或植物转基因。如本文针对靶基因所使用的，“沉默”通常指在由靶基因表达的mRNA或蛋白质/酶的水平上的抑制，和/或在酶活性或蛋白质功能性的水平上的抑制。术语“抑制”包括降低、减少、减小、抑制、消除或阻止。“沉默”或“基因沉默”不具体指定机制并且包括且不限于反义、共抑制、病毒抑制、发夹抑制、茎环抑制、基于RNAi的方法、以及基于小RNA的方法。

抑制DNA构建体可包含源自所关注的靶基因的区域并且可包含所关注的靶基因的有义链(或反义链)的核酸序列的全部或部分。取决于所要利用的方法，该区域可与所关注基因的有义链(或反义链)的全部或部分100％相同或者具有少于100％同一性的同一性(如，具有至少50％、51％、52％、53％、54％、55％、56％、57％、58％、59％、60％、56％、62％、63％、64％、65％、66％、67％、68％、69％、70％、71％、72％、73％、74％、75％、76％、77％、78％、79％、80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％的同一性)。

抑制DNA构建体是本领域所熟知的，一旦选定所关注的靶基因就很容易构建，并且包括但不限于共抑制构建体、反义构建体、病毒抑制构建体、发夹抑制构建体、茎环抑制构建体、产生双链RNA的构建体，以及更通常的是，RNAi(RNA干扰)构建体和小RNA构建体，例如siRNA(短干扰RNA)构建体和miRNA(微RNA)构建体。

“反义抑制”指产生能够抑制靶蛋白表达的反义RNA转录物。

“反义RNA”指与靶初级转录物或mRNA的全部或部分互补，并阻断分离的靶核酸片段表达的RNA转录物(美国专利5,107,065)。反义RNA可与特定基因转录物的任何部分，即5′非编码序列、3′非编码序列、内含子或编码序列互补。

“共抑制”指产生能够抑制靶蛋白表达的有义RNA转录物。“有义”RNA指包括mRNA的RNA转录物，它能够在细胞内或体外被翻译成蛋白。此前，已通过着眼于以有义方向过表达与内源mRNA具有同源性的核酸序列(其导致与过表达的序列具有同源性的所有RNA减少)设计出了植物中的共抑制构建体(参见Vaucheret等人，1998，Plant J.，16：651-659；以及Gura，2000 Nature 404：804-808)。

另一种变型描述了将植物病毒序列用于引导对近端mRNA编码序列的抑制(于1998年8月20日公开的PCT专利公开WO 98/36083)。

此前描述的是“发夹”结构的利用，该结构以互补方向整合mRNA编码序列的全部或部分，导致已表达的RNA形成潜在的“茎环”结构(于1999年10月21日公开的PCT专利公开WO99/53050)。在这种情况下，茎由对应相对于启动子以有义或反义方向插入的相关基因的多核苷酸形成，并且环由一些相关基因的多核苷酸形成，在构建体中该多核苷酸不具有互补序列。这增加了获得的转基因植物中的共抑制或沉默频率。发夹抑制参见Wesley，S.V.等人(2003)，Methods in Molecular Biology，Plant Functional Genomics：Methods and Protocols236：273-286。

其中茎由至少30个来自待抑制基因的核苷酸形成而环由任何的核苷酸序列形成的构建体也已经有效地用于抑制(于1999年12月2日公开的PCT专利公开WO 99/61632)。

使用聚-T和聚-A序列产生茎环结构中的茎已经有所描述(于2002年1月3日公开的PCT专利公开WO 02/00894)。

然而另一种变型涉及使用合成的重复序列来促进茎环结构中的茎的形成。用这种重组DNA片段产生的转基因生物体已经显示由形成茎环结构的核苷酸片段编码的蛋白质的水平降低，如于2002年1月3日公开的PCT专利公开WO 02/00904中所述。

RNA干扰是指由短干扰性RNA(siRNA)介导的动物中序列特异性转录后基因沉默的过程(Fire等人，Nature 391：8061998)。在植物中的对应过程通常称为转录后基因沉默(PTGS)或RNA沉默，并且在真菌中也称为阻抑作用(quelling)。据信转录后基因沉默过程是用于防止外来基因表达的进化保守的细胞防御机制，并且通常由不同植物区系和门所共享(Fire等人，Trends Genet.15：3581999)。这种防止外来基因表达的保护作用可能是通过特异性破坏病毒基因组RNA的同源单链RNA的细胞反应，响应源自病毒感染或源自转座因子随机整合到宿主基因组内的双链RNA(dsRNA)的生成而进化而来。dsRNA在细胞中的存在通过还没有完全表征的机制引发了RNAi反应。

细胞中长dsRNA的存在刺激了称为dicer的核糖核酸酶III的活性。Dicer涉及使dsRNA加工成称为短干扰RNA(siRNA)的短dsRNA片段(Berstein等人，Nature 409：3632001)。源自dicer活性的短干扰RNA的长度通常是约21至约23个核苷酸，并且包含约19个碱基对的双链体(Elbashir等人，Genes Dev.15：188 2001)。Dicer还涉及从保守结构的前体RNA上切下21个和22个核苷酸的小时序RNA(stRNA)，该小时序RNA参与翻译控制(Hutvagner等人，2001，Science 293：834)。RNAi响应还涉及内切核酸酶复合物，通常称为RNA诱导沉默复合物(RISC)，其介导具有与siRNA双链体的反义链互补的序列的单链RNA的裂解。靶RNA的裂解在与siRNA双链体的反义链互补的区域中间发生(Elbashir等人，Genes Dev.15：188 2001)。此外，RNA干扰还涉及小RNA(如miRNA)介导的基因沉默，可推定是通过调节染色质结构并由此防止靶基因序列转录的细胞机制(参见例如Allshire，Science 297：1818-1819 2002；Volpe等人，Science 297：1833-1837 2002；Jenuwein，Science 297：2215-2218 2002；和Hall等人，Science 297：2232-2237 2002)。这样，本发明的miRNA分子可用于通过与RNA转录物相互作用或者作为另一种选择通过与特定基因序列相互作用来介导基因沉默，其中这样的相互作用导致在转录或转录后水平上的基因沉默。

已经在多种系统中研究了RNAi。Fire等人(Nature 391：806 1998)首次在秀丽隐杆线虫(C.elegans)中观察到RNAi。Wianny和Goetz(Nature Cell Biol.2：70 1999)描述了小鼠胚胎中由dsRNA介导的RNAi。Hammond等人(Nature 404：293 2000)描述了在用dsRNA转染的果蝇(Drosophila)细胞中的RNAi。Elbashir等人(Nature 411：494 2001)描述了通过将合成的21-核苷酸RNA的双链体引入包括人胚肾和HeLa细胞在内的培养的哺乳动物细胞中而诱导的RNAi。

小RNA在控制基因表达中起重要作用。很多发育过程(包括开花)的调节是由小RNA控制的。现在有可能通过使用在植物中产生小RNA的转基因构建体来以工程手段改变植物基因的基因表达。

小RNA似乎是通过与互补RNA或DNA靶序列碱基配对来行使功能的。当与RNA结合时，小RNA或者引发靶序列的RNA裂解或者引发翻译抑制。当与DNA靶序列结合时，据信小RNA可介导靶序列的DNA甲基化。无论具体机制是什么，这些事件的后果是基因表达受到抑制。

据认为，小RNA和它们的RNA靶标之间的序列互补性有助于测定采用了哪种机制(RNA裂解或翻译抑制)。据信，优选与它们的靶标互补的siRNA通过RNA裂解起作用。一些miRNA与它们的靶基因具有完全或几乎完全的互补性，并且对于至少一些这样的miRNA，已经证实了RNA裂解。其他miRNA与它们的靶标具有若干错配，并且在翻译水平上明显抑制了它们的靶标。同样，无需坚持特定的作用机理，出现了这样一种一般规律：完全或几乎完全的互补性引起RNA裂解，而当miRNA/靶标双链体含有许多错配时倾向于翻译抑制。对于此规律的一个明显例外是植物中微RNA 172(miR172)。miR172的其中一个靶标是APETALA2(AP2)，尽管miR172与AP2具有几乎完全的互补性，但其表现出引起AP2的翻译抑制而不是引起RNA裂解。

微RNA(miRNA)是长度为约19至约24个核苷酸(nt)的已经在动物和植物中鉴定出的非编码RNA(Lagos-Quintana等人，Science294：853-858 2001，Lagos-Quintana等人，Curr.Biol.12：735-739 2002；Lau等人，Science 294：858-862 2001；Lee和Ambros，Science 294：862-864 2001；Llave等人，Plant Cell 14：1605-1619 2002；Mourelatos等人，Genes.Dev.16：720-728 2002；Park等人，Curr.Biol.12：1484-1495 2002；Reinhart等人，Genes.Dev.16：1616-1626 2002)。它们是由大小为大约70至200nt的较长的前体转录物加工生成的，并且这些前体转录物能够形成稳定的发夹结构。在动物中，涉及加工miRNA前体的酶称为Dicer，这是一种类核糖核酸酶Ⅲ蛋白(Grishok等人，Cell106：23-34 2001；Hutvagner等人，Science 293：834-838 2001；Ketting等人，Genes.Dev.15：2654-2659 2001)。植物也具有Dicer样酶，即DCL1(以前称为CARPEL FACTORY/SHORT INTEGUMENTS1/SUSPENSOR1)，并且最近有证据表明，其像Dicer一样，也涉及发夹前体的加工以产生成熟miRNA(Park等人，Curr.Biol.12：1484-1495 2002；Reinhart等人，Genes.Dev.16：1616-1626 2002)。此外，最近的研究已经清楚地表明，至少某些miRNA发夹前体最初是作为较长的聚腺苷酸化转录物存在，并且在单个转录物中可以存在几种不同的miRNA以及相关发夹(Lagos-Quintana等人，Science 294：853-8582001；Lee等人，EMBO J 21：4663-4670 2002)。最近的研究还检验了miRNA链从dsRNA产物的选择，所述dsRNA产物是通过DICER加工发夹而产生的(Schwartz等人，2003，Cell 115：199-208)。看起来似乎经加工的dsRNA的两端的稳定性(即G:C vs.A:U含量，和/或错配)影响链选择，低稳定性末端更易于通过解旋酶解旋。低稳定性末端的5′末端链被整合至RISC复合物内，而另一条链被降解。

微RNA看起来通过与位于由这些基因产生的转录物中的互补序列结合来调节靶基因。就lin-4和let-7而言，靶位点位于靶mRNA的3′非翻译区中(Lee等人，Cell 75：843-854 1993；Wightman等人，Cell 75：855-862 1993；Reinhart等人，Nature 403：901-906 2000；Slack等人，Mol.Cell 5：659-669 2000)，并且在lin-4和let-7miRNA与其靶位点之间有几个错配。lin-4或let-7miRNA的结合看起来引起了由靶mRNA编码的蛋白质的稳态水平下调，而不影响转录物自身(Olsen和Ambros，Dev.Biol.216：671-680 1999)。另一方面，最近有证据表明，在某些情况下，miRNA可以引起靶转录物在靶位点内特异性RNA裂解，并且该裂解步骤看起来需要miRNA与靶转录物之间具有100％的互补性(Hutvagner和Zamore，Science 297：2056-2060 2002；Llave等人，Plant Cell 14：1605-1619 2002)。看起来有可能miRNA可进入至少两条靶基因调控途径：当靶互补性＜100％时，蛋白下调，当靶互补性是100％时，RNA裂解。进入RNA裂解途径的微RNA与在动物中RNA干扰(RNAi)期间以及在植物中转录后基因沉默(PTGS)期间产生的21-25nt短干扰RNA(siRNA)类似(Hamilton和Baulcombe1999；Hammond等人，2000；Zamore等人，2000；Elbashir等人，2001)，并且可能整合进与在RNAi情况中观察到的复合物类似或相同的RNA-诱导的沉默复合物(RISC)内。

用生物信息学鉴定miRNA的靶标在动物中没有成功，这可能是因为动物miRNA与它们的靶标具有低水平的互补性。另一方面，生物信息学方法已经成功地用于预测植物miRNA的靶标(Llave等人，Plant Cell 14：1605-1619 2002；Park等人，Curr.Biol.12：1484-14952002；Rhoades等人，Cell 110：513-520 2002)，因此，似乎植物miRNA与其推定靶的整个互补性高于动物miRNA。植物miRNA的这些预测靶标中的大部分编码涉及植物发育模式或细胞分化的转录因子家族的成员。

本发明的重组DNA构建体(包括抑制DNA构建体)优选包含至少一种调控序列。

优选的调控序列是启动子。

多种启动子可用于本发明的重组DNA构建体(及抑制DNA构建体)中。可根据所需结果来选择启动子，并且可包括用于在宿主生物体中表达的组成型启动子、组织特异性启动子、细胞特异性启动子、诱导型启动子或其他启动子。

虽然候选基因当通过组成型启动子驱动表达时可预测其效应，但候选基因在35S或UBI启动子控制下的高水平、组成型表达可具有多重效应。

使用组织特异表达和/或胁迫特异表达可消除不需要的效应但保留改变根构造的能力。在拟南芥中已经观察到了该效应(Kasuga等人(1999)Nature Biotechnol.17：287-291)。

适用于植物宿主细胞的组成型启动子包括例如Rsyn7启动子的核心启动子和在WO 99/43838和美国专利6,072,050中公开的其他组成型启动子；CaMV 35S核心启动子(Odell等人，Nature 313：810-812(1985))；稻肌动蛋白(McElroy等人，Plant Cell 2：163-171(1990))；泛素(UBI)(Christensen等人，Plant Mol.Biol.12：619-632(1989)，以及Christensen等人，Plant Mol.Biol.18：675-689(1992))；pEMU(Last等人，Theor.Appl.Genet.81：581-588(1991))；MAS(Velten等人，EMBO J.3：2723-2730(1984))；ALS启动子(美国专利公开5,659,026)、玉米GOS2启动子(WO0020571A2，公布于2000年4月1日)等。其他组成型启动子包括例如在美国专利5,608,149、5,608,144、5,604,121、5,569,597、5,466,785、5,399,680、5,268,463、5,608,142和6,177,611中公开的那些启动子。

在选择启动子用于本发明方法时，可能有利的是使用组织特异性启动子或发育调控启动子。

优选的组织特异性启动子或发育调控启动子是这样的DNA序列，该序列调节DNA序列选择性地在对雄穗发育、结籽或两者重要的植物细胞/组织中的表达，并限制这种DNA序列只在植物的雄穗发育或种子成熟期间表达。任何引起所需时空表达的可鉴定启动子均可用于本发明的方法中。

种子或胚特异性的并且可用于本发明的启动子包括大豆Kunitz胰蛋白酶抑制剂(Kti3，Jofuku和Goldberg，Plant Cell 1：1079-1093(1989))、马铃薯块茎特异蛋白(patatin)(马铃薯块茎)(Rocha-Sosa，M.等人，1989，EMBO J.8：23-29)、convicilin、豌豆球蛋白和豆球蛋白(豌豆子叶)(Rerie，W.G.等人，1991，Mol.Gen.Genet.259：149-157；Newbigin，E.J.等人，1990，Planta 180：461-470；Higgins，T.J.V.等人，1988，Plant.Biol.11：683-695)、玉米蛋白启动子(玉米胚乳)(Schemthaner，J.P.等人，1988，EMBO J.7：1249-1255)、菜豆蛋白启动子(菜豆子叶)(Segupta-Gopalan，C.等人，1985，Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.82：3320-3324)、植物血球凝集素(菜豆子叶)(Voelker，T.等人(1987)，EMBO J.6：3571-3577)、B-伴球蛋白(conglycinin)和大豆球蛋白(大豆子叶)(Chen、Z-L等人，(1988)EMBO J.7：297-302)、谷蛋白(水稻胚乳)、大麦醇溶蛋白(大麦胚乳)(Marris，C.等人(1988)Plant Mol.Biol.10：359-366)、麦谷蛋白启动子和醇溶蛋白启动子(小麦胚乳)(Colot，V.等人，1987，EMBO J.6：3559-3564)和sporamin启动子(甘薯块根)(Hattori，T.等人，1990，Plant Mol.Biol.14：595-604)。可操作地连接至嵌合基因构建体异源编码区的种子特异性基因的启动子在转基因植物中保持它们的时空表达模式。此类实例包括在拟南芥和甘蓝型油菜种子中表达脑啡肽的拟南芥2S种子贮藏蛋白基因启动子(Vanderkerckhove等人，Bio/Technology 7：L929-932(1989))、表达荧光素酶的菜豆凝集素和菜豆β-菜豆素启动子(Riggs等人，Plant Sci.63：47-57(1989))、以及表达氯霉素乙酰转移酶(Colot等人，EMBO J 6：3559-3564(1987))的小麦谷蛋白启动子。

可诱导启动子响应内源性或外源性刺激的存在，例如，通过化合物(化学诱导剂)，或响应环境、激素、化学信号和/或发育信号而选择性表达可操作地连接的DNA序列。可诱导的或受调控的启动子包括例如受光、热、胁迫、水涝或干旱、植物激素、创伤或诸如乙醇、茉莉酮酸酯、水杨酸或安全剂之类的化学品调控的启动子。

优选的启动子包括以下启动子：1)胁迫诱导型RD29A启动子(Kasuga等人，Nature Biotechnol.17：287-91(1999))；2)大麦启动子B22E；B22E的表达是发育中的玉米籽粒中的柄所特异性的(“Primary Structure of a Novel Barley Gene Differentially Expressed in Immature Aleurone Layers(在未成熟糊粉层中差异表达的新大麦基因的一级结构)”。Klemsdal，S.S.等人，Mol.Gen.Genet.228(1/2)：9-16(1991))；和3)玉米启动子，Zag2(“Identification and molecular characterization of ZAG1，the maize homolog of the Arabidopsis floral homeotic gene AGAMOUS”，Schmidt，R.J.等人，Plant Cell 5(7)：729-737(1993))。”Structural characterization，chromosomal localization and phylogenetic evaluation of two pairs of AGAMOUS样MADS-box genes from maize”，Theissen等人，Gene 156(2)：155-166(1995)；NCBI GenBank Accession X80206))。Zag2转录物可在授粉前5天至授粉后(DAP)7至8天被检测到，并且引导Ciml在发育中的雌花序心皮中表达，Ciml对发育中的玉米籽粒的籽仁而言是特异性的。Ciml转录物在授粉前4至5天至授粉后6至8天被检测到。其他可用的启动子包括可源自其表达与发育中的雌小花母系相关的基因的任何启动子。

用于在植物中调节本发明的核苷酸序列表达的其他优选启动子是维管元件特异性启动子或茎优选启动子。这种茎优选启动子包括苜蓿S2A启动子(GenBank登录号：EF030816；Abrahams等人，Plant Mol.Biol.27：513-528(1995))和S2B启动子(GenBank登记号：EF030817)等等，将这些文献以引用的方式并入本文。

启动子可整个源于天然基因，或者由源于天然存在的不同启动子的不同元件构成，或者甚至包含合成的DNA片段。本领域内的技术人员应当理解，不同的启动子可在不同的组织或细胞类型中，或者在不同的发育阶段，或者响应不同的环境条件而引导基因的表达。还应认识到，由于在大多数情况下还不能完全测定调控序列的确切范围，一些变型的DNA片段可能具有相同的启动子活性。在多数情况下引起基因在大多数细胞型中表达的启动子通常称为“组成型启动子”。目前不断在发现可用于植物细胞中的不同类型的新启动子；多个实例可存在于Okamuro，J.K.和Goldberg，R.B.，Biochemistry of Plants15：1-82(1989)的文献中。(将其与其他组成型启动子的描述放在一起。)

优选的启动子可包括：RIP2、mLIP15、ZmCOR1、Rab17、CaMV35S、RD29A、B22E、Zag2、SAM合成酶启动子、泛素启动子(SEQ ID NO：47)、CaMV 19S、nos、Adh、蔗糖合成酶启动子、R-等位基因启动子、根细胞启动子、维管组织特异性启动子S2A(Genbank登录号EF030816；SEQ ID NO：48)和S2B(Genbank登录号EF030817)及来自玉米的组成型启动子GOS2(SEQ ID NO：46)。其他优选的启动子包括根优选的启动子，例如玉米NAS2启动子(SEQ ID NO：45)、玉米Cyclo启动子(US 2006/0156439，公开于2006年7月13日)、玉米ROTMET2启动子(WO05063998，公开于2005年7月14日)、CR1BIO启动子(WO06055487，公开于2006年5月26日)、CRWAQ81(WO05035770，公开于2005年4月21日)和玉米ZRP2.47启动子(NCBI登录号：U38790，gi：1063664)。

核苷酸序列的“主要部分”包含的核苷酸序列足以提供其包含的启动子的推定鉴定。核苷酸序列可由本领域技术人员来人工评价，或使用基于计算机的序列比较和鉴定工具进行评价，所述工具使用算法如BLAST(Basic Local Alignment Search Tool；Altschul等人(1993)J.Biol.215：403-410)。一般来讲，为了推定鉴定启动子核酸序列是否与已知启动子同源，包含三十或更多个邻接核苷酸的序列是必需的。具有如本文报道序列的有益效果，技术人员现在可使用全部公布序列或它们的主要部分用于本领域技术人员已知的目的。因此，本发明包括在附随序列表中报道的完全序列，以及那些上述序列的主要部分。

本发明的重组DNA构建体(及抑制DNA构建体)也可包括其他调控序列，包括但不限于翻译前导序列、内含子和多腺苷酸化识别序列。在本发明的另一个优选的实施方案中，本发明的重组DNA构建体还包括增强子或沉默子。

内含子序列可加入到部分编码序列的5’非翻译区或编码序列以增加积聚在胞浆中的成熟信息的量。已经显示，在植物和动物两者的表达构建体的转录单位中包含可剪接内含子可使基因表达在mRNA和蛋白质水平上均增强高达1000倍。参见Buchman和Berg，Mol.Cell Biol.8：4395-4405(1988)；Callis等人，Genes Dev.1：1183-1200(1987))。这种内含子对基因表达的增强通常在将其设置接近转录单位的5’端时为最大。玉米内含子Adh1-S内含子1、2和6、Bronze-1内含子的使用是本领域已知的。通常参见The Maize Handbook，第116章，Freeling和Walbot(编辑)，Springer，纽约(1994)。

如果期望进行多肽表达，则通常希望在多核苷酸编码区的3′-端处包含有多腺苷酸化区。该多腺苷酸化区可源自天然基因，源自多种其他植物基因或源自T-DNA。要加入的3′端序列可源自例如胭脂碱合成酶或章鱼碱合成酶基因，或作为选择源自另外的植物基因，或较不优选的是源自任何其他真核基因。

“翻译前导序列”指位于基因启动子序列和编码序列之间的DNA序列。翻译前导序列存在于翻译起始序列的经完全加工后的mRNA上游。翻译前导序列可影响mRNA的初级转录过程、mRNA稳定性或翻译效率。已经描述了翻译前导序列的实例(Turner，R.和Foster，G.D.Molecular Biotechnology 3：225(1995))。

在本发明的另一个优选的实施方案中，本发明的重组DNA构建体还包括增强子或沉默子。

任何植物均可选择用来鉴定将用于产生本发明重组DNA构建体和抑制DNA构建体的调控序列和基因。适用于分离基因和调控序列的靶植物的实例应该包括但不限于苜蓿、苹果、杏、拟南芥属、洋蓟、芝麻菜、芦笋、鳄梨、香蕉、大麦、豆类、甜菜、黑莓、蓝莓、西兰花、抱子甘蓝、卷心菜、卡诺拉、香瓜、胡萝卜、木薯、蓖麻、菜花、芹菜、樱桃、菊苣、芫荽、柑桔类、克莱门氏小柑橘类、三叶草、椰子、咖啡、玉米、棉、蔓越莓、黄瓜、花旗松、茄子、菊苣、茅菜、桉树、茴香、无花果、大蒜、葫芦、葡萄、柚子树、白兰瓜、豆薯、猕猴桃、生菜、韭葱、柠檬、酸橙、火炬松、亚麻子、芒果、甜瓜、蘑菇、油桃、坚果、燕麦、油棕、油菜、秋葵、橄榄树、洋葱、橙、观赏植物、棕榈、木瓜树、欧芹、欧洲防风草、豌豆、桃树、花生、梨树、胡椒、柿树、松树、菠萝、大蕉、李树、石榴树、白杨、马铃薯、南瓜、温柏、辐射松、红菊苣、萝卜、油菜、树莓、稻、黑麦、高粱、南方松、大豆、菠菜、南瓜、草莓、甜菜、甘蔗、向日葵、甘薯、枫香树、柑橘、茶、烟草、蕃茄、黑小麦、草皮草、芜菁、葡萄树、西瓜、小麦、薯蓣和西葫芦。用于鉴定调控序列的特别优选的植物是拟南芥属植物、玉米、小麦、大豆和棉。

优选的组合物

本发明的优选组合物是其基因组中包含本发明的任何重组DNA构建体(包括任何抑制DNA构建体)(例如上面所讨论的那些优选构建体)的植物。优选的组合物也包括任何植物的子代，以及获取自植物或其子代的任何种子，其中所述子代或种子在其基因组中包含重组DNA构建体(或抑制DNA构建体)。子代包括通过植物的自花授粉或异型杂交而获得的连续世代。子代也包括杂交种和近交系。

优选地，在杂交种子繁殖的农作物中，成熟的转基因植物可自花授粉而产生纯合的近交系植物。该近交系植物产生含有新引入的重组DNA构建体(或抑制DNA构建体)的种子。这些种子可生长而产生将会表现出改变的根(或植物)构造，或者可用于育种程序以产生杂交种子，这些杂交种子可生长而产生将会表现出改变的根(或植物)构造的植物。优选地，种子是玉米。

优选地，植物是单子叶植物或双子叶植物，更优选地，是玉米或大豆植物，甚至更优选的是玉米植物，例如玉米杂交种植物或玉米近交系植物。植物还可以是向日葵、高梁、蓖麻、葡萄、卡诺拉、小麦、苜蓿、棉、稻、大麦或小米。

优选地，重组DNA构建体稳定地整合进植物的基因组中。

尤其优选的实施方案包括但不限于如下优选的实施方案：

1.在基因组中包含重组DNA构建体的植物(优选玉米或大豆植物)，该重组DNA构建体包含可操作地连接至少一种调控序列的多核苷酸，其中所述多核苷酸编码多肽，所述多肽的氨基酸序列基于Clustal V比对方法在与SEQ ID NO：15、17、19、21、23、25、27、29或31进行比较时具有至少50％、51％、52％、53％、54％、55％、56％、57％、58％、59％、60％、56％、62％、63％、64％、65％、66％、67％、68％、69％、70％、71％、72％、73％、74％、75％、76％、77％、78％、79％、80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％的序列同一性，并且其中所述植物在与未包含所述重组DNA构建体的对照植物进行比较时表现出改变的根构造。优选地，在与该对照植物比较时，该植物还表现出至少一种农学特性的改变。

2.植物(优选地玉米或大豆植物)，所述植物在其基因组中包含：

重组DNA构建体，所述重组DNA构建体包含：

(a)可操作地连接至少一种调控元件的多核苷酸，其中所述多核苷酸编码多肽，所述多肽的氨基酸序列基于Clustal V比对方法在与SEQ ID NO：15、17、19、21、23、25、27、29或31进行比较时具有至少50％的序列同一性；或

(b)抑制DNA构建体，所述抑制DNA构建体包含至少一种调控元件，所述调控元件可操作地连接至：

(i)以下序列的全部或部分：(A)编码多肽的核酸序列，所述多肽的氨基酸序列基于Clustal V比对方法在与SEQ ID NO：15、17、19、21、23、25、27、29或31进行比较时具有至少50％的序列同一性，或(B)核酸序列(b)(i)(A)的全长互补序列；或

(ii)源自所关注的靶基因的有义链或反义链的全部或部分的区域，当与所述区域所来源的有义链或反义链的全部或部分比较时，基于Clustal V比对方法，所述区域的核酸序列具有至少50％的序列同一性，并且其中所述所关注的靶基因编码PP2C或PP2C样多肽，并且其中在与未包含所述重组构建体的对照植物比较时，所述植物表现出至少一种农学特性的改变。

3.在基因组中包含重组DNA构建体的植物(优选玉米或大豆植物)，该重组DNA构建体包含可操作地连接至少一种调控序列的多核苷酸，其中所述多核苷酸编码PP2C或PP2C样蛋白，并且其中在与未包含所述重组DNA构建体的对照植物比较时，所述植物表现出改变的根构造。优选地，该植物还表现出至少一种农学特性的改变。

优选地，该PP2C蛋白来自拟南芥(Arabidopsis thaliana)、玉米(Zea mays)、大豆(Glycine max)、烟豆(Glycine tabacina)、野大豆(Glycine soja)或短绒野大豆(Glycine tomentella)。

4.在基因组中包含抑制DNA构建体的植物(优选玉米或大豆植物)，该抑制DNA构建体包含至少一个可操作地连接至源自所关注的靶基因的有义链或反义链的全部或部分的区域的调控元件，当与所述区域所来源的有义链或反义链的全部或部分比较时，基于Clustal V比对方法，所述区域的核酸序列具有至少50％、51％、52％、53％、54％、55％、56％、57％、58％、59％、60％、56％、62％、63％、64％、65％、66％、67％、68％、69％、70％、71％、72％、73％、74％、75％、76％、77％、78％、79％、80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％的序列同一性，并且其中所述所关注的靶基因编码PP2C或PP2C样蛋白，并且其中在与未包含所述重组DNA构建体的对照植物比较时所述植物表现出至少一种农学特性的改变。

5.在基因组中包含抑制DNA构建体的植物(优选玉米或大豆植物)，该抑制DNA构建体包含至少一个可操作地连接至以下序列的全部或部分的调控元件：(a)编码多肽的核酸序列，在与SEQ ID NO：15、17、19、21、23、25、27、29或31进行比较时，基于Clustal V比对方法，该多肽的氨基酸序列具有至少50％、51％、52％、53％、54％、55％、56％、57％、58％、59％、60％、56％、62％、63％、64％、65％、66％、67％、68％、69％、70％、71％、72％、73％、74％、75％、76％、77％、78％、79％、80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％的序列同一性，或(b)(a)的核酸序列的全长互补序列，并且其中在与未包含所述重组构建体的对照植物比较时，所述植物表现出至少一种农学特性的改变。

6.上述优选实施方案1-5中的植物的任何子代、上述优选实施方案1-5中的植物的任何种子、上述优选实施方案1-5中的植物的子代的任何种子以及来自上述优选实施方案1-5中的植物以及它们的子代的细胞。

在上述优选的实施方案1-6或本发明的任何其他实施方案中的任一项中，重组DNA构建体(或抑制DNA构建体)优选包含至少一种在植物中有功能的启动子作为优选的调控序列。

在上述优选的实施方案1-6或本发明的任意其他实施方案中的任一项中，至少一种农学特性的改变是增加或减少，优选增加。

在任一前述的优选实施方案1-6或本发明的任何其他实施方案中，至少一种农学特性优选选自：绿度、产量、生长速率、生物量、成熟时的鲜重、成熟时的干重、果实产量、种子产量、总植物含氮量、果实含氮量、种子含氮量、营养组织中的含氮量、总植物游离氨基酸含量、果实游离氨基酸含量、种子游离氨基酸含量、营养组织游离氨基酸含量、总植物蛋白质含量、果实蛋白质含量、种子蛋白质含量、营养组织蛋白质含量、抗涝性、氮摄取、根倒伏、茎倒伏、植株高度、穗长以及收获指数；产量、绿度、生物量和根倒伏是尤其优选进行改变的农学特性(优选增加)。

在任一前述的优选实施方案1-6或本发明的任何其他实施方案中，在与对照植物比较时，植物优选表现出至少一种与环境条件例如水和营养物质的可用性无关的农学特性的改变。

本领域的普通技术人员熟悉测定植物根构造改变的规程。例如，可检测分析转基因玉米植物的根构造在幼苗期、花期或成熟期的改变。根构造的改变可通过统计温室培育的植物顶部第3或第4节的节根数目或根带的宽度来测定。“根带”指成熟期植物在花盆底部的根丛宽度。植物根构造变化的其他量度包括但不限于侧根的数量、节根的平均根直径、侧根的平均根直径、根毛的数量和长度。侧根分枝的程度(如侧根数量、侧根长度)可通过这样确定：从完整的根系进行二次取样，将样本用平面扫描器或数码相机成像并用WinRHIZO^TM软件(Regent Instruments Inc.)分析。

对提取的有关根表型的数据进行统计分析(通常为t检验)，以将转基因根与非转基因姊妹株植株的根进行比较。在多个事件和/或构建体涉及该分析的情况下，还可使用单因素方差分析。

下面的实施例描述了一些用于检测根构造改变的代表性规程和技术。

也可通过在田间测试中，在相同条件下比较植物与对照或参照植物提高产量的能力，来评价植物根构造的改变。

也可通过在田间测试中比较植物在胁迫条件下(例如营养物质过剩或受限、水过剩或受限、存在病害)保持基本产量(优选地至少75％、76％、77％、78％、79％、80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％产量)的能力，与非胁迫条件下的对照或参照植物的产量，来评价根构造改变。

根构造的改变可通过测定转基因植物较于参照植物或对照植物的抗根倒伏性来测量。

在评估或测量其中利用了对照或参照植物的本发明任何实施方案(如，如本文描述的组合物或方法)中的转基因植物的农学特性或表型时，本领域的普通技术人员将很容易认识到要利用的合适对照或参照植物。例如，通过如下非限制性示例来说明：

1.转化过的植物的子代，该转化过的植物对于重组DNA构建体(或抑制DNA构建体)来说是半合子的，使得该子代分离成包含或不包含该DNA构建体(或抑制DNA构建体)的植株：包含该重组DNA构建体(或抑制DNA构建体)的子代将通常相对于未包含该重组DNA构建体(或抑制DNA构建体)的子代来进行测量(即，未包含该重组DNA构建体(或抑制DNA构建体)的子代是对照或参照植株)。

2.重组DNA构建体(或抑制DNA构建体)基因渗入至近交系中，例如在玉米中，或基因渗入进变种中，例如在大豆中：基因渗入品系将通常相对于亲本近交系或变种品系进行测量(即，亲本近交系或品种品系是对照或参照植物)。

3.双杂交系，其中第一杂交系由两个亲本近交系产生，而第二杂交系由相同的两个亲本近交系产生，不同的是其中一个亲本近交系含有重组DNA构建体(或抑制DNA构建体)：第二杂交系通常将相对于第一杂交系进行测量(即亲本近交系或变种品系为对照植物或参照植物)。

4.包含重组DNA构建体(或抑制DNA构建体)的植株：该植株可相对于这样的对照植株进行评估或测量，该对照植株不包含重组DNA构建体(或抑制DNA构建体)，但具有与该植株相当的遗传背景(例如，与包含重组DNA构建体(或抑制DNA构建体)的植株相比较，核遗传物质具有至少90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％的序列同一性)。存在许多可用于分析、比较和表征植物遗传背景的基于实验室的技术；其中这些技术是同工酶电泳、限制性片段长度多态性(RFLP)、随机扩增多态性DNA(RAPD)、任何引物聚合成酶链反应(AP-PCR)、DNA扩增指纹(DAF)、序列特异扩增区域(SCAR)、扩增片段长度多态性(AFLP

)和也称为微卫星的简单序列重复(SSR)。

此外，本领域的普通技术人员将容易认识到，评估或测量转基因植物的农学特性或表型时合适的对照或参照植物将不包括先前已经针对所需的农学特性或表型，通过诱变或转化而选择的植物。

优选的方法

优选的方法包括但不限于用于改变植物根构造的方法、用于评价植物根构造改变的方法、用于改变植物农学特性的方法、用于测定植物农学特性改变的方法以及用于产生种子的方法。优选地，植物是单子叶植物或双子叶植物，更优选地，是玉米或大豆植物，甚至更优选地，是玉米植物。植物还可以是向日葵、高梁、蓖麻、卡诺拉、小麦、苜蓿、棉、稻、大麦或小米。种子优选的是玉米或大豆种子，更优选的是玉米种子，并且甚至更优选的是玉米杂交种种子或玉米近交系种子。

特别优选的方法包括但不限于如下方法：

改变植物根构造的方法，所述方法包括：(a)将重组DNA构建体引入到可再生的植物细胞中，该重组DNA构建体包含可操作地连接至少一种调控序列(优选在植物中有功能的启动子)的多核苷酸，其中所述多核苷酸编码多肽，所述多肽的氨基酸序列基于Clustal V比对方法在与SEQ ID NO：15、17、19、21、23、25、27、29或31进行比较时具有至少50％、51％、52％、53％、54％、55％、56％、57％、58％、59％、60％、56％、62％、63％、64％、65％、66％、67％、68％、69％、70％、71％、72％、73％、74％、75％、76％、77％、78％、79％、80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％的序列同一性；以及(b)在步骤(a)之后从该可再生的植物细胞再生出转基因植物，其中该转基因植物在其基因组中包含该重组DNA构建体并且在与未包含该重组DNA构建体的对照植物比较时表现出改变的根构造。所述方法可进一步包括(c)获得源自该转基因植物的子代植物，其中所述子代植物在其基因组中包含该重组DNA构建体并且在与未包含该重组DNA构建体的对照植物比较时表现出改变的根构造。

改变植物根构造的方法，所述方法包括：(a)将包含至少一种调控序列(优选在植物中有功能的启动子)的抑制DNA构建体引入可再生的植物细胞中，该调控序列可操作地连接至：

(i)以下序列的全部或部分：(A)编码多肽的核酸序列，在与SEQ ID NO：15、17、19、21、23、25、27、29或31进行比较时，基于Clustal V比对方法，该多肽的氨基酸序列具有至少50％、51％、52％、53％、54％、55％、56％、57％、58％、59％、60％、56％、62％、63％、64％、65％、66％、67％、68％、69％、70％、71％、72％、73％、74％、75％、76％、77％、78％、79％、80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％的序列同一性，或(B)(a)(i)(A)的核酸序列的全长互补序列；或

(ii)源自所关注的靶基因的有义链或反义链的区域，当与所述区域所来源的有义链或反义链的全部或部分比较时，基于Clustal V比对方法，所述区域的核酸序列具有至少50％、51％、52％、53％、54％、55％、56％、57％、58％、59％、60％、56％、62％、63％、64％、65％、66％、67％、68％、69％、70％、71％、72％、73％、74％、75％、76％、77％、78％、79％、80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％的序列同一性，并且其中所述所关注的靶基因编码PP2C或PP2C样多肽；并且

(b)在步骤(a)之后从该可再生的植物细胞再生出转基因植物，其中该转基因植物在其基因组中包含该重组DNA构建体并且在与未包含该抑制DNA构建体的对照植物比较时表现出改变的根构造。所述方法可进一步包括(c)获得源自该转基因植物的子代植物，其中所述子代植物在其基因组中包含该重组DNA构建体并且在与未包含该抑制DNA构建体的对照植物比较时表现出改变的根构造。

评价植物根构造改变的方法，该方法包括：(a)将重组DNA构建体引入到可再生的植物细胞中，该重组DNA构建体包含可操作地连接至少一种调控序列(优选在植物中有功能的启动子)的多核苷酸，其中所述多核苷酸编码多肽，所述多肽的氨基酸序列基于Clustal V比对方法在与SEQ ID NO：15、17、19、21、23、25、27、29或31进行比较时具有至少50％、51％、52％、53％、54％、55％、56％、57％、58％、59％、60％、56％、62％、63％、64％、65％、66％、67％、68％、69％、70％、71％、72％、73％、74％、75％、76％、77％、78％、79％、80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％的序列同一性，或(b)在步骤(a)之后从该可再生植物细胞再生出转基因植物，其中该转基因植物在其基因组中包含该重组DNA构建体；以及(c)评价与未包含该重组DNA构建体的对照植物比较时该转基因植物的根构造；该方法还可包括：(d)获得源自该转基因植物的子代植物，其中该子代植物在其基因组中包含该重组DNA构建体；以及(e)评价与未包含该重组DNA构建体的对照植物比较时该子代植物的根构造。

评价植物根构造改变的方法，所述方法包括：(a)将包含至少一种调控序列(优选在植物中有功能的启动子)的抑制DNA构建体引入可再生的植物细胞中，该调控序列可操作地连接至：

(i)以下序列的全部或部分：(A)编码多肽的核酸序列，在与SEQID NO：15、17、19、21、23、25、27、29或31进行比较时，基于Clustal V比对方法，该多肽的氨基酸序列具有至少50％、51％、52％、53％、54％、55％、56％、57％、58％、59％、60％、56％、62％、63％、64％、65％、66％、67％、68％、69％、70％、71％、72％、73％、74％、75％、76％、77％、78％、79％、80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％的序列同一性，或(B)(a)(i)(A)的核酸序列的全长互补序列；或(ii)源自所关注的靶基因的有义链或反义链的区域，当与所述区域所来源的有义链或反义链的全部或部分比较时，基于Clustal V比对方法，所述区域的核酸序列具有至少50％、51％、52％、53％、54％、55％、56％、57％、58％、59％、60％、56％、62％、63％、64％、65％、66％、67％、68％、69％、70％、71％、72％、73％、74％、75％、76％、77％、78％、79％、80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％的序列同一性，并且其中所述所关注的靶基因编码PP2C或PP2C样多肽；并且

(b)在步骤(a)之后，从所述可再生的植物细胞再生出转基因植物，其中所述转基因植物在其基因组中包含所述抑制DNA构建体；以及(c)评价该转基因植物在与未包含该抑制DNA构建体的对照植物比较时改变的根构造。该方法可另外包括：(d)获得源自该转基因植物的子代植物，其中该子代植物在其基因组中包含该抑制DNA构建体；以及(e)评价该子代植物在与未包含该抑制DNA构建体的对照植物比较时改变的根构造。

评价植物根构造改变的方法，该方法包括：(a)将重组DNA构建体引入到可再生的植物细胞中，该重组DNA构建体包含可操作地连接至少一种调控序列(优选在植物中有功能的启动子)的多核苷酸，其中所述多核苷酸编码多肽，所述多肽的氨基酸序列基于Clustal V比对方法在与SEQ ID NO：15、17、19、21、23、25、27、29或31进行比较时具有至少50％、51％、52％、53％、54％、55％、56％、57％、58％、59％、60％、56％、62％、63％、64％、65％、66％、67％、68％、69％、70％、71％、72％、73％、74％、75％、76％、77％、78％、79％、80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％的序列同一性，在步骤(a)之后，从该可再生的植物细胞再生出转基因植物，其中该转基因植物在其基因组中包含该重组DNA构建体；(c)从所述转基因植物获取子代植物，其中所述子代植物在其基因组中包含所述重组DNA构建体；以及(d)评价该子代植物在与未包含该重组DNA构建体的对照植物比较时改变的根构造。

评价植物根构造的方法，所述方法包括：

(a)将抑制DNA构建体引入到可再生的植物细胞，该抑制DNA构建体包含至少一个调控元件，该调控元件可操作地连接至：(i)以下序列的全部或部分：(A)编码多肽的核酸序列，在与SEQ ID NO：15、17、19、21、23、25、27、29或31比较时，基于Clustal V比对方法，所述多肽的氨基酸序列具有至少50％、51％、52％、53％、54％、55％、56％、57％、58％、59％、60％、56％、62％、63％、64％、65％、66％、67％、68％、69％、70％、71％、72％、73％、74％、75％、76％、77％、78％、79％、80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％的序列同一性，或(B)(a)(i)(A)的核酸序列的全长互补序列；或(ii)来源于所关注的靶基因的有义链或反义链的全部或部分的区域，当基于Clustal V比对方法与所述区域所来源的有义链或反义链的全部或部分进行比较时，所述区域的核酸序列具有至少50％、51％、52％、53％、54％、55％、56％、57％、58％、59％、60％、56％、62％、63％、64％、65％、66％、67％、68％、69％、70％、71％、72％、73％、74％、75％、76％、77％、78％、79％、80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％的序列同一性，并且其中所述所关注的靶基因编码PP2C或PP2C样多肽；(b)在步骤(a)之后，从该可再生的植物细胞再生出转基因植物，其中该转基因植物在其基因组中包含抑制DNA构建体；

(c)获得源自所述转基因植物的子代植物，其中所述子代植物在其基因组中包含所述抑制DNA构建体；以及(d)评价与未包含该抑制DNA构建体的对照植物比较时该子代植物的根构造。

测定植物农学特性改变的方法，该方法包括：(a)将重组DNA构建体引入到可再生的植物细胞中，该重组DNA构建体包含可操作地连接至少一种调控序列(优选在植物中有功能的启动子)的多核苷酸，其中所述多核苷酸编码多肽，在与SEQ ID NO：15、17、19、21、23、25、27、29或31或45比较时，基于Clustal V比对方法，该多肽的氨基酸序列具有至少50％、51％、52％、53％、54％、55％、56％、57％、58％、59％、60％、56％、62％、63％、64％、65％、66％、67％、68％、69％、70％、71％、72％、73％、74％、75％、76％、77％、78％、79％、80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％的序列同一性，(b)在步骤(a)后，从可再生植物细胞中再生转基因植物，其中所述转基因植物在其基因组中包含所述重组DNA构建体；以及(c)测定该转基因植物在与未包含该重组DNA构建体的对照植物比较时是否表现出至少一种农学特性的改变。该方法还可包括：(d)获得源自该转基因植物的子代植物，其中该子代植物在其基因组中包含该重组DNA构建体；以及(e)测定该子代植物在与未包含该重组DNA构建体的对照植物比较时是否表现出至少一种农学特性的改变。

测定植物农学特性改变的方法，该方法包括：(a)将抑制DNA构建体引入到可再生的植物细胞中，该抑制DNA构建体包含至少一种调控序列(优选在植物中有功能的启动子)，所述调控序列可操作地连接以下序列的全部或部分：(i)核酸序列，该核酸序列编码多肽，该多肽的氨基酸序列基于Clustal V比对方法在与SEQ ID NO：15、17、19、21、23、25、27、29或31进行比较时具有至少50％、51％、52％、53％、54％、55％、56％、57％、58％、59％、60％、56％、62％、63％、64％、65％、66％、67％、68％、69％、70％、71％、72％、73％、74％、75％、76％、77％、78％、79％、80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％的序列同一性，或(ii)(i)的核酸序列的全场互补序列；(b)在步骤(a)之后，从该可再生的植物细胞再生出转基因植物，其中所述转基因植物在其基因组中包含所述抑制DNA构建体；以及(c)测定该转基因植物在与未包含该抑制DNA构建体的对照植物比较时是否表现出至少一种农学特性的改变。该方法可另外包括：(d)获得源自该转基因植物的子代植物，其中该子代植物在其基因组中包含该抑制DNA构建体；以及(e)测定该子代植物在与未包含该抑制DNA构建体的对照植物比较时是否表现出至少一种农学特性的改变。

测定植物农学特性改变的方法，该方法包括：(a)将重组DNA构建体引入到可再生的植物细胞中，该重组DNA构建体包含可操作地连接至少一种调控序列(优选在植物中有功能的启动子)的多核苷酸，其中所述多核苷酸编码多肽，在与SEQ ID NO：15、17、19、21、23、25、27、29或31比较时，基于Clustal V比对方法，该多肽的氨基酸序列具有至少50％、51％、52％、53％、54％、55％、56％、57％、58％、59％、60％、56％、62％、63％、64％、65％、66％、67％、68％、69％、70％、71％、72％、73％、74％、75％、76％、77％、78％、79％、80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％的序列同一性，在步骤(a)之后，从该可再生的植物细胞再生出转基因植物，其中该转基因植物在其基因组中包含所述重组DNA构建体；(c)从所述转基因植物获取子代植物，其中所述子代植物在其基因组中包含所述重组DNA构建体；以及(d)测定该子代植物在与未包含该重组DNA构建体的对照植物比较时是否表现出至少一种农学特性的改变。测定植物中农学特性改变的方法可进一步包括：测定所述转基因植物在不同的环境条件下与未包含所述重组DNA构建体的对照植物比较时是否表现出至少一种农学特性的改变。

测定植物农学特性改变的方法，该方法包括：(a)将抑制DNA构建体引入到可再生的植物细胞中，该抑制DNA构建体包含至少一种调控序列(优选在植物中有功能的启动子)，所述调控序列可操作地连接以下序列的全部或部分：(i)核酸序列，该核酸序列编码多肽，该多肽的氨基酸序列基于Clustal V比对方法在与SEQ ID NO：15、17、19、21、23、25、27、29或31进行比较时具有至少50％、51％、52％、53％、54％、55％、56％、57％、58％、59％、60％、56％、62％、63％、64％、65％、66％、67％、68％、69％、70％、71％、72％、73％、74％、75％、76％、77％、78％、79％、80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％的序列同一性，或者(ii)(i)的核酸序列的全长互补序列；

(b)在步骤(a)之后，从该可再生的植物细胞再生出转基因植物，其中该转基因植物在其基因组中包含该抑制DNA构建体；(c)从所述转基因植物获取子代植物，其中所述子代植物在其基因组中包含所述抑制DNA构建体；以及(d)测定该子代植物在与未包含该重组DNA构建体的对照植物比较时是否表现出至少一种农学特性的改变。

测定植物农学特性改变的方法，所述方法包括：(a)将抑制DNA构建体引入到可再生的植物细胞中，该抑制DNA构建体包含至少一种调控元件，该调控元件可操作地连接至来源于所关注的靶基因的有义链或反义链的全部或部分的区域，当基于Clustal V比对方法与所述区域所来源的有义链或反义链的全部或部分进行比较时，所述区域的核酸序列具有至少50％、51％、52％、53％、54％、55％、56％、57％、58％、59％、60％、56％、62％、63％、64％、65％、66％、67％、68％、69％、70％、71％、72％、73％、74％、75％、76％、77％、78％、79％、80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％的序列同一性，并且其中所述所关注的靶基因编码PP2C或PP2C样多肽；(b)在步骤(a)之后，从该可再生的植物细胞再生出转基因植物，其中该转基因植物在其基因组中包含抑制DNA构建体；以及(c)测定所述转基因植物在与未包含所述抑制DNA构建体的对照植物比较时是否表现出至少一种农学特性的改变。该方法可另外包括：(d)获得源自该转基因植物的子代植物，其中该子代植物在其基因组中包含该抑制DNA构建体；以及(e)确定该子代植物在与未包含该抑制DNA构建体的对照植物比较时是否表现出至少一种农学特性的改变。

测定植物农学特性改变的方法，所述方法包括：(a)将抑制DNA构建体引入到可再生的植物细胞中，该抑制DNA构建体包含至少一种调控元件，该调控元件可操作地连接至来源于所关注的靶基因的有义链或反义链的全部或部分的区域，当基于Clustal V比对方法与所述区域所来源的有义链或反义链的全部或部分进行比较时，所述区域的核酸序列具有至少50％、51％、52％、53％、54％、55％、56％、57％、58％、59％、60％、56％、62％、63％、64％、65％、66％、67％、68％、69％、70％、71％、72％、73％、74％、75％、76％、77％、78％、79％、80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％的序列同一性，并且其中所述所关注的靶基因编码PP2C或PP2C样多肽；(b)在步骤(a)之后，从该可再生的植物细胞再生出转基因植物，其中该转基因植物在其基因组中包含抑制DNA构建体；(c)获取来源于所述转基因植物的子代植物，其中所述子代植物在其基因组中包含所述抑制DNA构建体；以及(d)测定该子代植物在与未包含该抑制DNA构建体的对照植物比较时是否表现出至少一种农学特性的改变。

产生种子(优选可作为提供改变的根构造的产品销售的种子)的方法，该方法包括任一上述的优选方法，并且还包括从所述子代植物获得种子，其中所述种子在其基因组中包含所述重组DNA构建体(或抑制DNA构建体)。

在任一前述的优选方法或本发明方法的任何其他实施方案中，测定转基因植物中农学特性改变的步骤(如果适用的话)可优选地包括测定在改变的环境条件下与不包含重组DNA构建体的对照植物进行比较时该转基因植物是否表现出至少一种农学特性的改变。

在任一前述的优选方法或本发明方法的任何其他实施方案中，测定子代植物中农学特性改变的步骤(如果适用的话)可优选地包括测定在改变的环境条件下与不包含重组DNA构建体的对照植物进行比较时该子代植物是否表现出至少一种农学特性的改变。

在任何前述的优选方法或本发明方法的任何其他实施方案中，在所述引入步骤中所述可再生的植物细胞优选地包括愈伤组织细胞(优选胚胎)、配子细胞、分生细胞或未成熟胚芽细胞。可再生的植物细胞优选来自近交系玉米植物。

在任一前述优选方法或本发明方法的任一其他实施方案中，所述再生步骤优选地包括：(i)在包含促胚发生激素的培养基中培养所述转化的植物细胞，直至观察到愈伤组织；(ii)将步骤(i)的所述转化植物细胞转移到第一培养基中，所述培养基包括促组织形成激素；以及(iii)在第二培养基上传代培养步骤(ii)后的所述转化的植物细胞，以允许嫩芽伸长、根发育或这两者同时发生。

在任一前述的优选方法或本发明方法的任何其他实施方案中，存在供选择的替代方案用于将包含可操作地连接至少一种调控序列上的多核苷酸的重组DNA构建体引入可再生的植物细胞。例如，可将调控序列(例如一种或多种增强子、优选地作为转位因子的部件)引入可再生的植物细胞，然后筛选其中将所述调控序列可操作地连接至编码本发明多肽的内源基因的事件。

将本发明的重组DNA构建体引入植物可通过任何合适的技术来进行，这些技术包括但不限于引导DNA摄取、化学处理、电穿孔、显微注射、细胞融合、感染、载体介导的DNA转移、轰击或农杆菌介导转化。

在任一上述的优选方法或本发明方法的任何其他实施方案中，至少一种农学特性优选选自：绿度、产量、生长速率、生物量、成熟时的鲜重、成熟时的干重、果实产量、种子产量、总植物含氮量、果实含氮量、种子含氮量、营养组织含氮量、总植物游离氨基酸含量、果实游离氨基酸含量、种子游离氨基酸含量、营养组织游离氨基酸含量、总植物蛋白质含量、果实蛋白质含量、种子蛋白质含量、营养组织蛋白质含量、抗涝性、氮摄取、根倒伏、茎倒伏、植株高度、穗长、茎倒伏以及收获指数。产量、绿度、生物量和根倒伏是尤其优选进行改变的农学特性(优选增加)。

在任一上述的优选方法或本发明方法的任何其他实施方案中，在与对照植物比较时，植物优选表现出至少一种与环境条件无关的农学特性的改变。

将本发明的重组DNA构建体引入植物可通过任何合适的技术来进行，这些技术包括但不限于引导DNA摄取、化学处理、电穿孔、显微注射、细胞融合、感染、载体介导的DNA转移、轰击或农杆菌介导转化。

优选的技术如下文实施例所示，用于转化玉米植物细胞和大豆植物细胞。

用于转化双子叶植物(主要通过利用根瘤农杆菌(Agrobacterium tumefaciens))以及获得转基因植物的其他优选方法包括公开的用于棉花的那些(美国专利5,004,863、美国专利5,159,135、美国专利5,518,908)；用于大豆的那些(美国专利5,569,834、美国专利5,416,011，McCabe等人Bio/Technology 6：923(1988)，Christou等人，Plant Physiol.87：671 674(1988))；用于芸苔属的那些(美国专利5,463,174)；用于花生的那些(Cheng等人，Plant Cell Rep.15：653 657(1996)，McKently等人，Plant Cell Rep.14：699 703(1995))；用于番木瓜的那些；以及用于豌豆的那些(Grant等人，Plant Cell Rep.15：254 258(1995))。

用电穿孔、粒子轰击和农杆菌转化单子叶植物也已有报道并且作为优选的方法包括例如如在天门冬属(asparagus)中实现的转化和植物再生(Bytebier等人，Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.84：5354，(1987))；大麦(Wan and Lemaux，Plant Physiol 104：37(1994))；在玉米中实现的转化和植物再生(Rhodes等人，Science 240：204(1988)；Gordon-Kamm等人，Plant Cell2：603 618(1990)；Fromm等人，Bio/Technology 8：833(1990)；Koziel等人，Bio/Technology 11：194，(1993)；Armstrong等人，Crop Science 35：550-557(1995))；在燕麦中实现的转化和植物再生(Somers等人，Bio/Technology 10：1589(1992))；在鸭茅中实现的转化和植物再生(Horn等人，Plant Cell Rep.7：469(1988))；在稻中实现的转化和植物再生(Toriyama等人，Theor.Appl.Genet.205：34(1986)；Part等人，Plant Mol.Biol.32：1135 1148，(1996)；Abedinia等人，Aust.J.Plant Physiol.24：133141(1997)；Zhang和Wu，Theor.Appl.Genet.76：835(1988)；Zhang等人，Plant Cell Rep.7：379，(1988)；Battraw和Hall，Plant Sci.86：191202(1992)；Christou等人，Bio/Technology 9：957(1991))；裸麦(De la Pena等人，Nature 325：274(1987))；甘蔗(Bower和Birch，Plant J.2：409(1992))；在高羊茅(tall fescue)中实现的转化和植物再生(Wang等人，Bio/Technology 10：691(1992))和在小麦中实现的转化和植物再生(Vasil等人，Bio/Technology 10：667(1992)；美国专利5,631,152)。

存在多种用于从植物组织再生植物的方法。再生的具体方法将取决于起始植物组织以及待再生的具体植物物种。

从单植物原生质体转化体或从多种经转化的外植体再生、发育和培育植物是本领域所熟知的(Weissbach和Weissbach(编辑)，载于：Methods for Plant Molecular Biology，Academic Press，Inc.San Diego，CA，(1988))。该再生和生长方法通常包括如下步骤：选择转化的细胞、培养这些单独化的细胞通过胚发育的通常阶段以及通过生根小植株阶段。转基因胚以及种子以类似的方式再生。随后将所得的转基因的生根小苗种植在诸如土壤之类的合适植物生长培养基中。

含有编码所关注蛋白质的外来的外源性分离核酸片段的植物的发育或再生是本领域所熟知的。优选地，将再生的植物进行自花授粉以产生纯合的转基因植物。或者，将得自再生植物的花粉与农学上重要的品系的产生种子的植株进行杂交。相反，将来自这些重要品系植物的花粉用于给再生植物授粉。利用本领域技术人员所熟知的方法培育含有所需多肽的本发明的转基因植物。

实施例

本发明将在下面的实施例中进一步说明，其中份数和百分比是以重量计并且度数是摄氏度，除非另外说明。应该理解，尽管这些实施例说明了本发明的优选实施方案，但仅是以例证的方式给出的。根据上面的论述和这些实施例，本领域的技术人员可以确定本发明的基本特征，并在不脱离本发明的精神和范围的情况下，可对本发明做出多种改变和修饰，以使其适用于多种用法和条件。因此，除了那些本文所示和描述的那些之外，根据前文所述，本发明的各种修改形式对本领域的技术人员来说将是显而易见的。这些修改形式也旨在属于附加的权利要求书的范围内。

实施例1

制备具有激活标记基因的拟南芥种群

制备18.5kb的基于T-DNA的二元构建体pHSbarENDs2(图1；SEQ ID NO：l；)，它包含四个来源于花椰菜花叶病毒35S启动子的多聚增强子元件，对应于序列-341至-64，如Odell等人所述(1985)Nature 313：810-812。该构建体也包含载体序列(pUC9)以进行质粒拯救、转座子序列(Ds)以再动员T-DNA、以及bar基因以进行转基因植物的草胺磷选择。仅将从右边界(RB)至左边界(LB)包含的10.8kb片段转移到寄主植物基因组中。因为增强子元件位于靠近RB处，它们可诱导T-DNA整合后的基因组位点顺式激活。

将pHSbarENDs2构建体转化到根癌农杆菌菌株C58中，该菌株在LB培养基中，在25℃生长至OD600～1.0。然后将细胞离心沉淀并重悬在相同体积的5％蔗糖/0.05％Silwet L-77(OSI Specialties，Inc)中。在早期抽薹时，培育拟南芥属生态型Col-0的土壤使用农杆菌悬浮液进行顶部灌溉。一周后，相同植株再次用在蔗糖/Silwet中的相同农杆菌菌株进行顶部灌溉。然后将该植物的种子设为标准。所得T₁种子在土壤中播种，通过喷洒草胺磷(Finale

；AgrEvo；BayerEnvironmental Science)选择转基因幼苗。从大约35,000个单个草胺磷抗性T₁植株中收集T₂种子。培养T₂植株并收集来自96个分离T₂品系的相同体积的T₃种子。这组成了360个亚群。

选择了总计100,000个草胺磷抗性T₁幼苗。分开保存来自每个品系的T₂种子。

实施例2

筛选以鉴定具有改变的根构造的品系

在与早期发育期间来自如实施例1所述的种群的对照幼苗进行比较时，分析在不限制氮条件下培养的具有激活标记的拟南芥幼苗的根系构造。

每96,000个分离的T1激活标记品系中，用氯气对十个T2种子进行灭菌并将它们种植在包含以下培养基的培养平板上：0.5x N-Free Hoagland’s，60mM KNO₃，0.1％蔗糖，1mM MES和1％Phytagel^TM。通常将10个培养皿至于一个架子中。平板在4℃下保存三天以使种子分层，然后在22℃光照和20℃黑暗垂直保持11天。光周期为16h；8h黑暗，平均光强度为～180μmol/m²/s。架子(通常每个装有10个平板)在每个搁板中每日旋转。在第14天，评价平板的幼苗状态，拍摄整个平板的数字图像并分析根面积。将平板随机分成10个水平区域。在板上10个水平区域的每个区域中的根面积以总面积百分比表示。仅仅使用区域3至9的面积进行品系根总面积计算。ICORIA开发Rootbot图像分析工具(专有)以评估根面积。根总面积以mm²表示。

期望具有增加的根生长特性的品系位于根分布区域的上端。假定架子有最多两个异常值，可使用滑动窗方法评估给定架子的根区域的变化。包括生长培养基、温度和湿度在内的多个因素的环境变量可引起根生长的显著改变，尤其是在播种期间更是如此。因此根据播种日期和搁板来将所述品系分组以用于数据分析。然后通过平均根面积来拣选特定播种日期/搁板组中的架子。通过将架子r_i的数据与来自下一个最低架子(r_i-1，以及下一个最高平均根面积，r_i+1)的数据进行合并来执行滑动窗根面积分布然后使用Grubbs型方法(Barnett等人，Outliers in Statistical Data，John Wiley & Sons，第3版(1994)来分析组合分布的变量以鉴定ri中的异常值。

将通过上文所述方法测定的具有显著增加的根生长的品系命名为Phase 1hits。在相同分析条件下进行Phase 1hits的重复试样再筛选。当任一个或两个Phase 2重复试样显示与平均值的显著差异时，认为该品系是经过验证的根构造品系。

Phase 2中在至少一个平板中再次发现为异常值的那些品系经过室内进行的phase 3筛选以确认phase 1和phase 2中获得的结果。所述结果在phase 3中使用Rootboot图像分析(如上所述)和如下所述的WinRHIZO

进行确认。在第一轮筛选中进行相同方式的确认。T2种子用50％家用漂白剂，0.01％triton X-100溶液灭菌，并以10颗种子/平板的密度置于与第一轮筛选所述的相同平板培养基上。在4℃下保存平板三天以使种子分层，并在与首次实验相同的温度和光周期下培养种子，光照强度为～160μmol/m²/s。将平板垂直放入10平板架的八个中心位置，第一个和最后一个位置放空白平板。每隔一天旋转架子和架子中的平板。每隔平板拍摄两组照片。第一组在14-16天拍摄，此时大多数品系的初生根已经到达平板底部，第二组照片在发育出更多侧根两天后拍摄。通常用后面的一组照片进行数据分析。用软件WinRHIZO(Regent Instruments Inc)分析在垂直平板上生长的这些幼苗的根生长，该软件是特别设计的一种进行根测量的图像分析系统。WinRHIZO

利用像素对照来从较暗的背景辨别出根构造。为了在不去除背景的情况下确定根的最大量，像素级别为150-170并且使用滤光器部件以移除长宽比小于10.0的目标。平板上分析的面积为从植物叶片边缘至距平板底部约1cm处。使用完全相同的WinRHIZO

设置和分析面积分析一批的所有平板。WinRHIZO

给出的一个平板的总根长度得分除以已经萌发并沿平板生长一半的植物数目。每个品系培养三个平板，取它们的得分均值。然后将该平均值与同时培养的包含野生型种子的三个平板的平均值比较。

然后使用通过与野生型相比具有更高根生长数值进行再确认的拟南芥激活标记品系，用于分子鉴定侧接T-DNA插入序列的DNA。

实施例3

鉴定激活标记基因

使用以下两种标准方法鉴定在具有改变的根构造的品系中侧接T-DNA插入序列的基因：(1)热不对称交错(TAIL)PCR(Liu等人，(1995)，Plant J.8：457-63)；以及(2)SAIFF PCR(Siebert等人，(1995)Nucleic Acids Res.23：1087-1088)。至于复杂的多聚T-DNA插入序列，TAIL PCR和SAIFF PCR可能均不足以鉴定候选基因。在这些情况下，可使用包括反式PCR、质粒拯救和/或基因组文库构建在内的其他程序。

成功的结果是其中单个TAIL或SAIFF PCR片段包含T-DNA边界序列和拟南芥属基因组序列。

一旦获取侧接T-DNA插入序列的基因组序列标记，通过与公开可用的拟南芥属基因组的序列比对来鉴定候选基因。

具体地讲，最靠近35S增强子元件/T-DNA RB的注释基因是激活的基因的候选基因。

为了验证鉴定的基因真的靠近T-DNA并排除TAIL/SAIFF片段是嵌合伪克隆的可能性，用一个T-DNA中的寡核苷酸和一个候选基因特异性的寡核苷酸进行对基因组DNA的诊断PCR。将提供PCR产品的基因组DNA样本理解为表示T-DNA插入序列。该分析也验证了其中一种以上的插入事件发生在相同品系中的情况，例如，在TAIL和/或SAIFF PCR分析中鉴定是否有多个不同基因组片段。

实施例4

鉴定激活标记pp2c基因

进一步分析显示具有改变的根构造的一个品系。提取来自品系的DNA，使用T-DNA左边界内的引物通过连接介导PCR(Siebert等人，(1995)Nucleic Acids Res.23：1087-1088)建立T-DNA插入序列。一旦获取侧接T-DNA插入序列的基因组序列标记，通过与完全拟南芥属基因组的序列比对来鉴定候选基因。将其中一个鉴定的插入位点鉴定为嵌合插入；左边界的T-DNA序列经测定位于T-DNA插入序列的两端。这仍然是可能的：位于靠近T-DNA右边界的增强子元件足够靠近以对附近的候选基因产生效应。在这种情况下，假定右边界位置位于插入位点，并将侧接插入位点的两个基因选作候选基因。最接近嵌合插入序列的35S增强子的其中一个基因是AT1G07630(SEQ IDNO：35；NCBI GI NO：18390789；拟南芥蛋白磷酸酶2C)，它编码PP2C蛋白(SEQ ID NO：31)。

实施例5A

验证候选拟南芥属基因(AT1G07630)经由转化到拟南芥属中增 强植物根构造的能力

可将候选基因转化到拟南芥属中并在35S启动子作用下过表达。如果在转基因品系中观察到与亲本激活标记品系相同或相似的表型，则将该候选基因认为是拟南芥属中验证过的“前导基因”。

可直接测试拟南芥属AT1G07630基因促进拟南芥属中的根构造的能力。

拟南芥AT1G07630cDNA用寡核苷酸进行PCR扩增，寡核苷酸引入attB1序列，其上游为ATG起始密码子的共有起始序列(CAACA)和AT1G07630cDNA(SEQ ID NO：36)的蛋白编码区的前23个核苷酸，以及attB2序列和包括所述cDNA终止密码子的蛋白编码区的最后21个核苷酸(SEQ ID NO：37)。使用Invitrogen^TM Gateway

技术，用pDONR^TM/Zeo(Invitrogen^TM，SEQ ID NO：2)进行MultiSite Gateway

BP重组反应。这种方法将细菌致死ccdB基因以及氯霉素抗性基因(CAM)从pDONR^TM/Zeo移除并定向地克隆了该在旁侧具有attB1(SEQ ID NO：38)和attB2(SEQ ID NO：39)位点的PCR产物而得到入门克隆PHP28733。

用紧接Invitrogen^TM Gateway

C1转化插入序列上游的1.3-kb35S启动子构建称为pBC-yellow(SEQ ID NO：4)的16.8-kb T-DNA基的二元载体，所述插入序列包含侧接attR1和attR2序列的ccdB基因和氯霉素抗性基因(CAM)。该载体也包含在Rd29a启动子控制下的YFP标记用于选择转化过的种子。

使用Invitrogen^TM Gateway

技术，对包含定向克隆PCR产物和pBC-yellow的入门克隆进行MultiSite GatewayLR重组反应。这使得能够迅速地和定向地克隆pBC-yellow中在35S启动子后的AT1G07630基因。

使用如实施例1所述的相同农杆菌介导的转化程序将35S-AT1G07630基因构建体引入野生型拟南芥属生态型Col-0中。

通过存在的荧光YFP标记选择转基因T1种子。按照如实施例2A所述的程序对荧光种子进行根构造检测分析。每个构建体使用6个平板对转基因T1种子进行再筛选。包含从荧光种子中分选出的未转化的Columbia种子的两个平板(每个架子)作为对照。

每个构建体有六个平板进行统计学分析，并检测平板上生长的植物数量和它们的平均WinRHIZO

得分之间的趋势。WinRHIZO

得分进行趋势归一化处理，对应于构建体的根得分除以野生型根得分。

实施例5B

在氮限制条件下筛选候选基因

也可筛选如上文实施例5A所述通过存在的荧光标记YFP选择的转基因T1种子在氮限制条件下生长的抗性。为此目的，32个转基因个体可在一个有0.4mM KNO₃或60mM KNO₃的平板上紧邻着32个野生型个体生长。如果一个品系显示与对照的统计意义上的显著差异，可认为该品系是经验证的氮缺乏抗性品系。在掩蔽该平板图像以去除背景颜色后，每个个体收集两个不同的测量数据：总罗赛塔面积和进入绿色区的颜色百分比。使用色调、饱和度和强度数据(HIS)，绿色区由色调50-66组成。总罗赛塔面积用作植物生物量的量度，而绿色区通过剂量-响应研究已经显示指示氮同化作用。

实施例5C

验证候选拟南芥属基因(AT1G07630)经由转化进入拟南芥属后 改善植物氮利用率的能力

如实施例5B所述来筛选能够在氮限制条件下生长的转基因种子。

在第10、11、12和13天评价植物。与野生型植物相比，表达拟南芥属候选基因(AT1G07630)的转基因个体当在包含有限浓度的氮(0.4mM KNO3)的培养基上生长时，被验证为氮缺乏抗性植物。在不限制氮条件下(60mM KNO₃)未观察到转基因植物和野生型植物之间的显著差异。

实施例5D

筛选以鉴定具有改善的硝酸盐摄取的品系

就每个过表达品系而言，将十二个T2植物种植于96孔微滴定板上，该板包含2mM MgSO₄，0.5mM KH₂PO₄，1mM CaCl₂，2.5mM KCl，0.15mM Sprint 330，0.06mM FeSO₄，1μM MnCl₂·4H₂O，1μM ZnSO₄·7H₂O，3μM H₃BO₃，0.1μM NaMoO₄，0.1μM CuSO₄·5H₂O，0.8mM硝酸钾，0.1％蔗糖，1mM MES，200μM溴酚红和0.40％Phytagel^TM(pH测定培养基)。培养基pH使得溴酚呈红色，pH指示染料是黄色的。

将四个品系种植于每个平板中，每个平板上包含12个野生型个体和来自某一已经显示具有改善的硝酸盐摄取(阳性对照)的品系的12个个体，在每个96孔微滴定板上总计有72个个体。可使用基于网络的随机序列发生器测定每个平板上的品系顺序。不将种子种植在96孔微滴定板上的Row A或Row H中。每个实验使用四个平板，使得每个品系分析最多48株植物。在暗处、4℃条件下保持平板三天以使种子分层，然后在22℃，光照和黑暗交替条件下水平放置六天。光周期为十六小时光照；八小时黑暗，平均光照强度为～200mmol/m²/s。旋转并振动每个架子中的平板。在第八或第九天(生长五天或六天)，通过记录培养基颜色为粉红色、桃色、黄色或无发芽来评价幼苗状态。然后移除每孔上的植物和/或种子。将每个培养基块状物转移到1.2mL微滴定管中，并置于96孔深微滴定板中的相应孔中。将包含2μM荧光素的等体积水加入到每个1.2mL微滴定管中。用土壤覆盖平板并用液体循环高压灭菌。将每个管充分混合，从每个管中取出等分试样并分析培养基中保留的硝酸盐的量。如果t检验显示某个品系与野生型对照具有显著差异(p＜0.05)，则可认为所述品系是验证过的具有改善的硝酸盐摄取品系。

实施例5E

验证包含候选拟南芥属基因(AT1G07630)的转基因品系氮摄取 增加。

如实施例5D所述筛选氮摄取增加的转基因种子。

与不过表达拟南芥候选基因(AT1G076300)的野生型植物相比，过表达拟南芥候选基因(AT1G07630)的转基因个体经验证为具有改善的硝酸盐摄取品系。

实施例6

cDNA文库的组成；

cDNA克隆的分离和测序

制备提供来自Canna edulis(美人蕉)、Momordica charantia(苦瓜)、Brassica(芸苔)、Cyamopsis tetragonoloba(瓜耳)、Zea mays(玉米)、Oryza sativa(大米)、Glycine max(大豆)、Helianthus annuus(向日葵)和Triticum aestivum(小麦)的不同组织的mRNA的cDNA文库。下面描述了对该文库的特征。

表2

来自美人蕉、苦瓜、芸苔、瓜耳、玉米、大米、大豆、向日葵和 小麦的cDNA文库

cDNA文库可通过许多可用的方法中的任一种制备。例如，通过首先根据生产商的说明书(Stratagene Cloning Systems，La Jolla，CA)制备UNI-ZAP^TM XR载体中的cDNA文库，可将cDNA引入质粒载体中。根据Stratagene提供的说明书，将Uni-ZAP^TMXR文库转换成质粒文库。转换后，cDNA插入序列将会包含在质粒载体pBluescript中。此外，可用T4DNA连接酶(New England Biolabs)将cDNA直接引入预切的Bluescript II SK(+)载体(Stratagene)中，然后根据生产商的说明书(GIBCO BRL Products)将其转染进DH10B细胞中。一旦cDNA插入序列处于质粒载体中，从随机选取的含重组pBluescript质粒的细菌菌落制备质粒DNA，或者用对插入的cDNA序列旁侧的载体序列特异性的引物，通过聚合酶链式反应来扩增插入的cDNA序列。将扩增的DNA插入序列或质粒DNA在引物标记法测序反应(dye-primer sequencing reaction)中进行测序，以产生部分cDNA序列(表达序列标记或“EST”；参见Adams等人，1991，Science252：1651-1656)。用Perkin Elmer Model 377荧光测序仪分析所得的EST。“EST”是得自cDNA文库的DNA序列，并且因此是已经被转录的序列。EST通常通过cDNA插入序列单程测序获取。将完整的cDNA插入序列称为“全长插入序列”(“FIS”)。“重叠群”序列是由选自，但不限于EST、FIS和PCR序列的两个或更多个序列装配成的序列。将编码完整或功能性蛋白的序列称为“完全基因序列”(“CGS”)，该序列能得自FIS或重叠群。

用改进的转座规程产生全长插入序列(FIS)数据。从归档的甘油原种作为单一菌落回收确定了FIS的克隆，并通过碱性裂解分离质粒DNA。将分离的DNA模板在基于PCR的测序反应中与载体引物M13正向和反向寡核苷酸反应并上样至自动化的测序仪上。通过与对其进行FIS查询的初始EST序列进行序列比对来确认克隆鉴定。

将确认的模板通过基于酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)Ty1转座因子(Devine和Boeke，1994，Nucleic Acids Res.22：3765-3772)的Primer Island转座试剂盒(PE Applied Biosystems，Foster City，CA)进行转座。该体外转座系统在整个一组大DNA分子中随机地放入独特的结合位点。随后将转座的DNA用于通过电穿孔转化DH10B电感受态细胞(GIBCO BRL/Life Technologies，Rockville，MD)。转座因子含有另外的可选标记(称为DHFR；Fling和Richards，1983，Nucleic Acids Res.11：5147-5158)，使得能在琼脂平板上仅双重筛选含有整合的转座子的那些亚克隆。从每次转座反应随机地选择多个亚克隆，通过碱性裂解制备质粒DNA，并用对转座子内的结合位点特异性的独特引物从转座事件位点向外进行测序(ABI PRISM dyeterminator ReadyReaction mix)。

收集序列数据(ABI Prism Collections)并用Phred和Phrap(Ewing，等人，1998，Genome Res.8：175-185；Ewing和Green，1998，Genome Res.8：186-194)进行装配。Phred是一种公用软件程序，该程序再次读取ABI序列数据，再次调出(recall)碱基，赋质量值，并将碱基序列(base call)和质量值写入可编辑的输出文件中。Phrap序列组装程序使用这些质量值来增加组装的序列重叠群的准确度。通过Consed序列编辑器(Gordon等人，1998，Genome Res.8：195-202)检查装配序列。

在一些克隆中，cDNA片段对应基因的3’端的一部分并且不会涵盖整个开放阅读框。为了获得上游信息，使用两种不同规程中的一者。这两种方法中的第一种方法导致产生含有所需基因序列的部分的DNA片段，而第二种方法导致产生含有整个开放阅读框的片段。这两种方法均使用两轮PCR扩增以从一个或多个文库获得片段。有时基于以前的知识(特定的基因应该存在于某些组织中)选择文库，有时则进行随机地选择。获得相同基因的反应可平行地在若干文库中进行，或者在文库池中进行。文库池通常用3至5个不同的文库制备并且使其归一化而成为一致的稀释度。在第一轮扩增中，两种方法均使用载体特异性的(正向)引物，同时还使用基因特异性的(反向)引物，该正向引物对应位于克隆5’端处的载体的一部分。第一种方法使用与已知基因序列的一部分互补的序列，而第二种方法使用与3’非翻译区(也称为UTR)的一部分互补的基因特异性引物。在第二轮扩增中，两种方法均使用套式引物组。按照生产商的说明书，用市售试剂盒将所得DNA片段连接进pBluescript载体中。该试剂盒选自可得自包括Invitrogen^TM(Carlsbad，CA)、Promega Biotech(Madison，WI)和Gibco-BRL(Gaithersburg，MD)在内的一些供应商的许多试剂盒。如上所述，将质粒DNA通过碱性裂解方法分离并进行测序和用Phred/Phrap进行装配。

实施例7

cDNA克隆的鉴定

编码PP2C样多肽的cDNA克隆通过这样鉴定：进行BLAST(基本的局部比对搜索工具)；Altschul等人(1993)J.Mol.Biol.215：403-410；还可参见国立卫生研究院国家医学图书馆的国家生物技术信息中心的万维网址上对BLAST算法的解释)进行鉴定，寻找与BLAST“nr”数据库中所包含序列(包括所有非冗余GenBank CDS翻译序列、源自3维结构Brookhaven蛋白质数据库(Protein Data Bank)、SWISSPROT蛋白质序列数据库的最新的主要版本、EMBL和DDBJ数据库的序列)的相似性。采用国家生物技术信息中心(NCBI)提供的BLASTN算法，分析如实施例6中获得的cDNA序列与包含在“nr”数据库中的所有可公开获得的DNA序列的相似性。在所有的阅读框中翻译DNA并用NCBI提供的BLASTX算法(Gish和States，1993，Nat.Genet.3：266-272)比较与包含在“nr”数据库中的所有可公开获得的氨基酸序列的相似性。为方便起见，通过BLAST计算仅仅偶然观察到cDNA序列与所搜索的数据库中所包含序列的匹配的P值(概率)在本文报导为“pLog”值，它代表所报导的P值的负对数。因此，pLog值越大，cDNA序列和BLAST的“命中序列”代表同源蛋白的可能性就越大。

将受分析的EST与上述Genbank数据库进行比较。通过使用BLASTn算法(Altschul等人，1997，Nucleic Acids Res.25：3389-3402.)对杜邦专利数据库比较具有序列同源共有区域或重叠区域的核苷酸序列，可找到含更5′端或3′端序列的EST。在两个或更多个核酸片段之间存在共有或重叠序列时，该序列可装配成单一的连续核苷酸序列，从而使最初的片段在5′或3′初始方向上延伸。一旦确定了最5′的EST后，可以如实施例6所述，通过全长插入序列来确定其完整的序列。可用tBLASTn算法，通过将已知基因(来自专有来源或公开数据库的已知基因)的氨基酸序列对EST数据库进行比较，可找到属于不同物种的同源基因。tBLASTn算法对所有6个阅读框都翻译了的核苷酸数据库进行氨基酸查询的搜索。该搜索允许不同物种之间的核苷酸密码子使用的差异，并且允许密码子简并。

实施例8

表征编码

PP2C样多肽

使用表1列出的EST序列进行的BLASTX揭示cDNA编码的多肽与表3所示的来自水稻(GI No.125588428、125544056和56784477，分别对应于SEQ ID NO：32、33和34)和拟南芥(GI No.21537109和18390789，分别对应于SEQ ID NO：30和31)的PP2C样多肽的相似性，表3显示的是每个EST(“EST”)、包含指示cDNA克隆(“FIS”)的整个cDNA插入序列、两个或更多个EST装配的重叠群序列、FIS或PCR序列(“重叠群”)或编码来源于FIS或重叠群(“CGS”)的整个和功能蛋白的序列的BLAST结果：

表3

编码PP2C样多肽同源物的多肽序列的BLAST结果和同一性百分 比

¹通过对来自玉米品系的初生根cDNA库进行PCR重新获得cen3n.pk0051.b12：fis(SEQ ID NO：20)的全长cDNA(SEQ ID NO：22)，所述玉米品系分离自诱变的F2家族，该家族由自交的F1在近交品系B73和活性Mutator库之间杂交产生。将该品系命名为B73-Mu。用于扩增的正向和反向引物分别如SEQ ID NO：40和SEQ ID NO：41所示。将PCR产物克隆到PCR4blunt TOPO载体(Invitrogen^TM)中、测序并用于FASTCORN转化。

图2A-2R给出了如SEQ ID NO：15、17、19、21、23、25、27和29所示的全长氨基酸序列与来自拟南芥(GI No.21537109和18390789，分别对应于SEQ ID NO：30和31)和水稻(GI No.125588428和125544056，分别对应于SEQ ID NO：32和33)的PP2C多肽的氨基酸序列的比对。图3给出图2A-2R中给出的每对序列的序列同一性百分比和趋异值。

用LASERGENE生物信息计算包(DNASTAR Inc.，Madison，WI)的Megalign程序进行序列比对和同一性百分比计算。用带默认参数(空位罚分＝10，空位长度罚分＝10)的Clustal比对方法(Higgins和Sharp(1989)，CABIOS.5：151-153)进行序列的多重比对。使用Clustal方法的成对比对的默认参数为KTUPLE 1，空位罚分＝3，窗口＝5，DIAGONALS SAVED＝5。

序列比对和BLAST打分以及概率显示包含本发明cDNA克隆的核酸片段编码PP2C样多肽。

表4

编码与PP2C和PP2C样多肽同源的多肽的序列的BLAST结果

实施例9

制备含有

拟南芥前导基因(AT1G07630)同源物的植物表达载体

可使用诸如BLAST(基本的局部比对搜索工具(Basic Local Alignment Search Tool)；Altschul等人，J.Mol.Biol.215：403-410(1993)；也参见美国国家卫生研究院(National Institutes of Health)国立医学图书馆(National Library of Medicine)的国家生物技术信息中心(National Center for Biotechnology Information)的万维网网址上对BLAST算法的解释)之类的序列比较算法，鉴定与先导pp2c基因同源的序列。同源pp2c样序列，如实施例8所述的序列，可通过任何一种以下方法进行PCR扩增。

方法1(基于RNA的方法)：如果PP2C同源物的蛋白编码区域的5’和3’序列信息是可用的，可如实施例5所述设计基因特异性引物。可将RT-PCR用于植物RNA来获得含有PP2C蛋白编码区的核酸片段，该蛋白编码区旁侧为attB1(SEQ ID NO：38)和attB2(SEQ ID NO：39)序列。引物可含有起始密码子上游的共有Kozak序列(CAACA)。

方法2(基于DNA的方法)：作为另外一种选择，如果编码PP2C多肽同源物的基因的cDNA克隆是可用的，可以PCR扩增完整cDNA插入序列(含有5′和3′非编码区)。可设计正向引物和反向引物，使它们分别或者含有attB1序列和在该cDNA插入序列前面的载体特异性序列或者含有attB2序列和在该cDNA插入序列后面的载体特异性序列。对于克隆进载体pBluescript SK+中的cDNA插入序列，可使用正向引物VC062(SEQ ID NO：42)和反向引物VC063(SEQ ID NO：43)。

方法1和方法2可根据本领域技术人员已知的步骤进行修改。例如，方法1的引物可含有限制性酶切位点而不是attB1和attB2位点，用于后来将PCR产物克隆进含有attB1和attB2位点的载体内。另外，方法2可涉及从cDNA克隆、λ克隆、BAC克隆或基因组DNA扩增。

可以利用BP重组反应将通过任一种上述方法获得的PCR产物与Gateway

供体载体(例如pDONR^TM/Zeo(Invitrogen^TM，SEQ ID NO：2)或pDONR^TM221(Invitrogen^TM，SEQ ID NO：3)组合。这种方法将细菌致死ccdB基因以及氯霉素抗性基因(CAM)从pDONR^TM221移除并定向地克隆了该在旁侧具有attB1和attB2位点的PCR产物而得到入门克隆(entry clone)。使用Invitrogen^TM Gateway

Clonase^TM技术，然后可将来自入门克隆的同源pp2c样基因转移到合适的目的载体中以获得植物表达载体，所述载体用于拟南芥、玉米和大豆，如pBC-Yellow(SEQ ID NO：4)、PHP27840(SEQ ID NO：5)或PHP23236(SEQ ID NO：6)，以获取植物表达载体，分别用于拟南芥、大豆和玉米。

作为另外一种选择，可进行多个入门克隆和合适的目的载体之间的MultiSite Gateway

LR重组反应以产生表达载体。该程序的一个实例在实施例14A中有所描述，该实施例描述了用于转化玉米品系的玉米表达载体的构建。

实施例10

用验证过的拟南芥属前导基因及其同源物制备大豆表达载体并 转化大豆

为了检查所得表型，可将大豆植株转化以过表达验证过的拟南芥基因(AT1G07630)和来自不同物种的对应同源物。

可以将实施例5和9中所述的入门克隆用于将每个基因定向克隆进PHP27840载体(SEQ ID NO：5)中，使得该基因的表达处于SCP1启动子的控制下。

然后可用包含编码本多肽的序列的表达载体转化大豆胚。

为了诱导体细胞胚，可以将子叶(长度为3-5mm，从大豆品种A2872的表面灭菌的未成熟种子解剖出来)于26℃在光下或黑暗下培养6-10周。然后切取体细胞胚(其产生次生胚)并将其置于合适的液体培养基内。在重复选择增殖为早期球形阶段胚的体细胞胚的簇后，按下面的描述保持该悬浮液。

可以将大豆胚发生悬浮培养物在26℃下在摇床(150rpm)上的35mL液体培养基中保持，荧光光照采用16∶8小时(白天/黑夜)的时间表。通过将大约35mg组织移植进35ml液体培养基中，每两周将培养物进行传代培养。

然后可通过基因枪轰击方法(Klein等人(1987)，Nature(London)327：70-73；美国专利4,945,050)转化大豆胚发生悬浮培养物。杜邦公司的Biolistic^TM PDS1000/HE仪器(氦气改进型)可以用于这些转化。

可用于帮助大豆转化的可选标记基因是由来自花椰菜花叶病毒的35S启动子(Odell等人(1985)，Nature 313：810-812)、来自质粒pJR225(来自大肠杆菌；Gritz等人，Gene 25：179-188(1983))的潮霉素磷酸转移酶基因以及胭脂碱合成酶基因的3′区构成的嵌合基因，该胭脂碱合成酶基因来自根癌农杆菌(Agrobacterium tumefaciens)Ti质粒的T-DNA。可用于帮助大豆转化的另一种可选标记基因是来自大豆或拟南芥的除草剂抗性乙酰乳酸合成酶(ALS)基因。ALS是支链氨基酸缬氨酸、亮氨酸和异亮氨酸的生物合成中的第一共用酶。已经鉴定出ALS中的突变导致对三类ALS抑制剂中的某些或全部具有抗性(美国专利5,013,659；其全部内容以引用的方式并入本文)。除草剂抗性ALS基因的表达可处于SAM合成酶启动子(美国专利申请US-2003-0226166-A1；其全部内容以引用方式并入本文)的控制下。

将如下物质(依次)加入50μL 60mg/mL的1μm金颗粒悬浮液：5μL DNA(1μg/μL)，20μL亚精胺(0.1M)，和50μL CaCl₂(2.5M)。然后搅拌该颗粒制备物三分钟，在微量离心机(microfuge)中离心10秒并除去上清液。然后将DNA包覆的颗粒在400μL 70％乙醇中洗涤一次并再悬浮于40μL无水乙醇中。可将DNA/颗粒悬浮液用超声波处理三次，每次一秒钟。然后将五μL该DNA-包覆的金颗粒装载至每个宏载体盘上。

将大约300-400mg两周大的悬浮培养物置于60×15mm的空培养皿中并用吸管将残留的液体从组织移除。对于每次转化实验，大约5-10板的组织受到正常轰击。膜破裂压力设定为1100psi并将腔室抽成28英寸汞柱的真空。将组织置于离阻挡网大约3.5英寸的地方并轰击三次。轰击后，可将组织分成两份并放回液体培养基中，如上所述进行培养。

轰击后五至七天，用新鲜培养基更换该液体培养基，并在轰击后七至十二天，用含有50mg/mL潮霉素的新鲜培养基更换。可每周更换这种选择培养基。轰击后七至八周，可观察到绿色的转化组织从未转化的坏死的胚芽发生簇长出来。移出分离的绿色组织并将其移植进单独的烧瓶中以产生新的、无性繁殖的、转化的胚发生悬浮培养物。可将每一新品系当成是独立的转化事件。然后可将这些悬浮培养物作为未成熟胚进行传代培养和维持，或者通过使单独体细胞胚成熟并萌发而再生成整株植株。

可通过在土壤中培养植物并在用WinRHIZO

分析总根质量前洗涤根部来测量大豆增大的根构造。

然后可分析用验证过的基因转化大豆植株以研究相对于对照或参照植株的农学特性。例如，在多种环境条件(如氮限制条件、干旱等)下的氮利用效率、产量增强和/或稳定性。

实施例11

使用颗粒轰击用验证过的拟南芥属前导基因转化玉米

为了检查所得表型，可将大豆植株转化以过表达验证过的拟南芥属前导基因或来自不同物种的对应同源物。

可以将实施例5中所述的Gateway

入门克隆用于将每种基因定向克隆进玉米转化载体中。玉米基因的表达可处于组成型启动子的控制下，例如玉米泛素启动子(Christensen等人，Plant Mol.Biol.12：619-632(1989)，以及Christensen等人，Plant Mol.Biol.18：675-689(1992))

然后可通过下面的方法将上述重组DNA构建体引入玉米细胞中。可从源于近交玉米系H99和LH132杂交的发育中的颖果切取未成熟的玉米胚。在授粉后十至十一天分离胚，这时它们长为1.0至1.5mm。然后将胚以轴线侧朝下放置并与琼脂糖硬化的N6培养基(Chu等人，Sci.Sin.Peking 18：659-668(1975))接触。将胚在27℃下保持在黑暗中。从这些未成熟胚的胚鳞增生出易脆的胚发生愈伤组织，该愈伤组织由未分化的细胞块构成，在胚柄结构上长有体细胞原胚状体和胚状体。可将从该原外植体分离的胚发生愈伤组织在N6培养基上培养，并每两至三周在这种培养基上进行传代培养。

可将质粒p35S/Ac(得自Peter Eckes博士，Hoechst Ag，Frankfurt，Germany)用于转化实验以便提供可选标记。该质粒含有pat基因(见欧洲专利公布0 242 236)，该基因编码草胺膦乙酰转移酶(PAT)。酶PAT赋予对除草性谷氨酰胺合成酶抑制剂例如草胺膦的抗性。p35S/Ac的pat基因处于来自花椰菜花叶病毒的35S启动子(Odell等人，Nature 313：810-812(1985))和胭脂碱合成酶基因的3′区的控制下，该胭脂碱合成酶基因来自根癌农杆菌Ti质粒的T-DNA。

可将粒子轰击方法(Klein等人，Nature 327：70-73(1987))用于将基因转移至愈伤组织培养细胞。根据该方法，利用下面的技术用DNA包覆金颗粒(直径1μm)。将十μg质粒DNA加入到50μL金颗粒悬浮液(每mL 60mg)中。将氯化钙(50μL的2.5M溶液)和亚精胺游离碱(20μL的1.0M溶液)加入到该颗粒中。在加入这些溶液过程中涡旋该悬浮液。十分钟后，将试管粗略地离心(以15,000rpm进行5秒钟)并除去上清液。将该颗粒再悬浮于200μL的无水乙醇中，再次离心并除去上清液。再次进行乙醇冲洗并将颗粒再悬浮于终体积为30μL的乙醇中。可将DNA包覆的金颗粒等分试样(5μL)置于Kapton^TM飞行圆盘(Bio-Rad Labs)的中心。然后使用Biolistic

PDS-1000/He(Bio-Rad Instruments，Hercules CA)，采用1000psi的氦气压、0.5cm的间隙距离以及1.0cm的飞行距离，将颗粒加速射入玉米组织中。

对于轰击，将胚发生组织置于琼脂糖硬化的N6培养基上的滤纸上。组织布置成薄薄一层，并覆盖直径为约5cm的圆形区域。然后可将包含组织的培养皿置于离阻挡网大约8cm的PDS-1000/He的腔室内。然后将该腔室中的空气抽出至28英寸汞柱的真空。利用在击波管中氦气压力达到1000psi时破裂的可破裂膜，宏载体被氦气冲击波加速。

轰击后七天，可将组织转移至N6培养基中，该培养基含有双丙氨磷(每升5mg)并缺少酪蛋白或脯氨酸。组织继续在这种培养基上缓慢生长。另外两周后，可将组织转移至含有bialaphos的新鲜N6培养基上。六周后，在某些装有补充了双丙氨膦的培养基的盘上，可辨别直径约1cm的区域上有活性生长的愈伤组织。当在选择培养基上传代培养时，这些愈伤组织可继续生长。

通过首先将组织簇转移到补充有0.2mg每升的2，4-D的N6培养基中，可从该转基因愈伤组织再生出植物。两周后，可将组织转移到再生培养基中(Fromm等人，Bio/Technology 8：833-839(1990))。

可再生出转基因的T0植株并按照下面的HTP步骤测定它们的表型。可收集T1种子。

可栽培T1植株并分析表型变化。利用图像分析可定量下面的参数：可收集并定量植株面积、体积、生长速率以及颜色分析。与合适的对照植物比较，导致根构造改变或上文列出的任何一种农学特性改变的表达构建体可被认为是拟南芥属前导基因在玉米中发挥功能以改变根构造或植物构造的证据。

此外，可通过直接转化或者从单独转化的品系基因渗入而将含有证实的拟南芥属基因的重组DNA构建体引入玉米品系内。

可对转基因植株(或者是近交的或者是杂交的)进行更有力的基于田间的实验来研究在多种环境条件下(如营养物质的改变和水的可利用性)的根构造或植物构造、产量提高和/或抗根倒伏性。

也可进行后续的产量分析，以测定含有验证过的拟南芥属前导基因的植物与不包含验证过的拟南芥属前导基因的对照(或参照)植物相比较时是否具有改善的产量表现。包含验证过的拟南芥属前导基因的植物相对于对照植物将具有改善的产量，优选地在不利环境条件下产量损失减少50％，或在不同环境条件下相对于对照植物将具有提高的产量。

实施例12

电穿孔根癌农杆菌LBA4404

将电穿孔感受态细胞(40μl)，例如根癌农杆菌(Agrobacterium tumefaciens)LBA4404(含有PHP10523)在冰上解冻(20至30分钟)。PHP10523含有用于T-DNA转移的VIR基因、农杆菌属的低拷贝数质粒复制起始区、四环素抗性基因以及用于体内DNA生物分子重组的cos位点。同时，将电穿孔管(electroporation cuvette)在冰上冷却。将该电穿孔仪的设置调节至2.1kV。

将DNA等分试样(0.5μL JT(US 7,087,812)亲代DNA，在低盐缓冲液或双蒸H₂O中的浓度为0.2μg至1.0μg)与解冻的农杆菌细胞混合，同时仍然保持在冰上。将混合物转移至电穿孔管的底部并静止保持在冰上1-2分钟。按下“Pulse(脉冲)”键两次(理想的是获得4.0毫秒的脉冲)对细胞进行电穿孔(Eppendorf电穿孔仪2510)。随后，将0.5ml 2xYT培养基(或SOCmedium)加至电穿孔管并转移至15ml Falcon管中。将细胞在28-30℃、200-250rpm下孵育3小时。

将250μL等分试样铺展在#30B(YM+50μg/mL奇放线菌素)平板上，并且在28-30℃孵育3天。为了提高转化体的数量，可进行两个任选步骤中的其中一个：

选择1：用30μl 15mg/ml的利福平覆盖平板。LBA4404具有针对利福平的染色体抗性基因。这种附加的选择消除了在使用较差的LBA4404感受态细胞制备物时观察到的一些污染克隆。

选择2：进行两次重复的电穿孔以补偿较差的电感受态细胞。

转化体的鉴定：

选取四个独立的克隆并划痕接种在AB基本培养基+50mg/mL奇放线菌素的平板(#12S培养基)上用于分离单个克隆。将平板在28℃下培养2-3天。

对于每个推定的共整合体，选取单个克隆并将其接种在4ml具有50mg/l的奇放线菌素的#60A中。将该混合物在28℃下摇动孵育24小时。采用Qiagen Miniprep+可选的PB洗涤，从4ml培养物分离出质粒DNA。将DNA在30μL中洗提。如上所述，将2μL的等分试样用于电穿孔20μL DH10b+20μL ddH₂O。

可任选地，可将15μL等分试样用于转化75至100μl的Invitrogen^TMLibrary Efficiency DH5α。将细胞散布在LB培养基+50mg/mL奇放线菌素的平板(#34T培养基)上并将其在37℃下孵育过夜。

对于每个推定的共整合体，选取是三至四个独立的克隆并将其接种在4ml具有50μg/ml奇放线菌素的2xYT(#60A)上。将细胞在37℃下摇晃培养过夜。

使用QIAprep

Miniprep，用任选PB洗涤液(稀释成50μl)从4mL培养物中分离质粒DNA，并且8μl质粒DNA用SalI(使用JT亲本和PHP10523作对照物)进行消化。

对于4个质粒，利用限制性内切酶BamHI、EcoRI和HindIII再进行三次消化(使用亲代DNA和PHP10523作为对照)，这4个质粒代表2种具有正确SalI消化模式的推定共整合体。推荐电凝胶(Electronic gel)用于比较。

作为另一种选择，对于高通量应用，例如针对Gaspe Bay Flint衍生的玉米品系(实施例15-17)所描述的，代替通过限制性酶切分析来评价所得的共整合载体，可将三个克隆同时用于如实施例13所述的感染步骤。

实施例13

农杆菌介导的玉米的转化

为了检查所得表型，可将大豆植株转化以过表达验证过的拟南芥属前导基因或来自不同物种的对应同源物。

农杆菌介导的玉米转化基本上按照Zhao等人，Meth.Mol.Biol.318：315-323(2006)(还参见Zhao等人，Mol.Breed.8：323-333(2001)和1999年11月9日公布的美国专利5,981,840，以引用的方式将该文献并入本文)。该转化过程涉及细菌接种、共培养、静止期、选择以及植株再生。

1.未成熟胚的制备

从颖果切取未成熟胚并置于装有2mL PHI-A培养基的2mL微型管中。

2.胚的农杆菌属细菌感染以及共培养

2.1感染步骤

用1mL微量吸移管移出PHI-A培养基并加入1mL农杆菌悬浮液。轻轻倒置该管进行混合。将该混合物在室温下培养5分钟。

2.2共培养步骤

用1mL微量吸移管将农杆菌悬浮液从感染步骤中移出。使用无菌刮刀将胚从管中刮出并转移到100×15mm培养皿中的PHI-B培养基的平板中。测定胚的朝向，使得胚轴在培养基表面上朝下。将具有胚的平板在20℃下于黑暗中培养3天。L-半胱氨酸可用于共培养阶段。采用标准二元载体，补充有100-400mg/L L-半胱氨酸的共培养培养基对于回收稳定的转基因事件是至关重要的。

3.选择推定的转基因事件

向在100×15mm培养皿中的PHI-D培养基的平板中转移10个胚芽，保持朝向，并且用parafilm将培养皿密封。将平板在黑暗中于28℃下培养。预计在6-8周将看见活性生长的推定事件(作为浅黄色胚组织)。不产生事件的胚可能是棕色和坏死的，并且几乎看不见脆性组织生长。取决于生长速率，以2-3周的间隔将推定的转基因胚组织转移到新鲜的PHI-D平板上进行传代培养。记录事件。

4.T0植株的再生

将在PHI-D培养基上增殖的胚组织转移至100×25mm培养皿中的PHI-E培养基(体细胞胚成熟培养基)进行传代培养并在28℃下，在黑暗中培养约10至18天，直至体细胞胚成熟。将具有良好限定的盾片和胚芽鞘的个体成熟体细胞胚芽转移到PHI-F胚芽发芽培养基中，并且在28℃下于光中(约80μE，来自冷光灯或同等荧光灯)培养。在7-10天，将约10cm高的再生植株盆载于园艺混合物中，并使用标准园艺方法使其受冷而变得耐寒。

用于植物转化的培养基

1.PHI-A：4g/L的CHU基础盐，1.0mL/L的1000X Eriksson维生素混合物，0.5mg/L的盐酸硫胺素，1.5mg/L的2，4-D，0.69g/L的L-脯氨酸，68.5g/L的蔗糖，36g/L的葡萄糖，pH为5.2。加入100μM乙酰丁香酮(用前过滤灭菌)。

2.PHI-B：无葡萄糖的PHI-A，2，4-D增加至2mg/L，蔗糖减少至30g/L并且补充有0.85mg/L的硝酸银(过滤灭菌)，3.0g/L的固化剂(gelrite)，100μM的乙酰丁香酮(过滤灭菌)，pH为5.8。

3.PHI-C：无固化剂和乙酰丁香酮的PHI-B，2，4-D减少至1.5mg/L并且补充有8.0g/L的琼脂，0.5g/L的Ms-吗啉乙磺酸(MES)缓冲液，100mg/L的羧苄青霉素(过滤灭菌)。

4.PHI-D：补充有3mg/L的双丙氨膦(过滤灭菌)的PHI-C。

5.PHI-E：4.3g/L的Murashige and Skoog(MS)盐(Gibco，BRL11117-074)、0.5mg/L的烟酸、0.1mg/L的盐酸硫胺素、0.5mg/L的盐酸吡哆醇、2.0mg/L的甘氨酸、0.1g/L的肌醇、0.5mg/L的玉米素(Sigma，商品目录号：Z-0164)、1mg/L的吲哚乙酸(IAA)、26.4μg/L的脱落酸(ABA)、60g/L的蔗糖、3mg/L的双丙氨膦(过滤灭菌)、100mg/L的羧苄青霉素(过滤灭菌)、8g/L的琼脂，pH为5.6。

6.PHI-F：不含玉米素、IAA、ABA的PHI-E；蔗糖减少至40g/L；用1.5g/L的固化剂代替琼脂；pH为5.6。

通过首先将组织簇转移到补充有0.2mg每升的2，4-D的N6培养基中，可从该转基因愈伤组织再生出植物。两周后，可将组织转移至再生培养基(Fromm等人，(1990)Bio/Technology 8：833-839)中。

可进行对转基因T0植株和T1植株的表型分析。

可分析T1植株表型的变化。利用图像分析，可在植株生长过程中在多个时间点，分析T1植株在植株面积、体积、生长速率方面的表型变化并且可进行颜色分析。可如实施例20中所述分析根构造的改变。

可对农学特性的改变进行后续分析，以测定含有验证过的拟南芥属前导基因的植株在与不含有验证过的拟南芥属前导基因的对照(或参照)植株比较时是否具有至少一种农学特性的改善。还可在多种环境条件下研究改变。

导致根构造显著改变的表达构建体将被认为是拟南芥属基因在玉米中发挥功能以改变根构造的证据。

实施例14A

利用农杆菌介导的转化构建具有拟南芥前导基因(AT1G07630) 的玉米表达载体

用拟南芥pp2c基因(At1G07630)在NAS2(SEQ ID NO：45和GOS 2(SEQ ID NO：46)启动子控制下制备玉米表达载体。PINII是终止子(SEQ ID NO：49)使用Invitrogen^TM Gateway技术，如实施例5所述制备的、包含拟南芥pp2c基因(At1G07630)的入门克隆PHP28740被用于独立的Gateway

LR反应：

1)组成型玉米GOS2启动子入门克隆(PHP28408，SEQ ID NO：11)和PinII终止子入门克隆(PHP20234，SEQ ID NO：9)的Gateway

LR反应，形成目的载体PHP28529(SEQ ID NO：10)。将所得载体命名为PHP28915。

2)根玉米NAS2启动子入门克隆(PHP22020，SEQ ID NO：12)和PinII终止子入门克隆(PHP20234，SEQ ID NO：9)的Gateway

LR反应，形成目的载体PHP28529(SEQ ID NO：10)。将所得载体命名为PHP28981。

目的载体PHP28529被加到每个最终载体(PHP28915和PHP28981)中，也是：

1)RD29A启动子：：黄色荧光蛋白：：PinII终止子盒，用于拟南芥属种子分选

2)泛素启动子：：moPAT/红色荧光蛋白融合基因：：PinII终止子盒，用于转化选择和玉米种子分选。

实施例14B

制备包含拟南芥属pp2c基因及其同源物的玉米表达构建体

可使用如实施例5和14A所述的程序将拟南芥pp2c基因及其来自玉米和其他物种的对应同源物(表1)转化到玉米品系中。能如实施例5和14A所述制备具有拟南芥属pp2c基因及其来自玉米和其他物种的对应同源物(表1)的玉米表达载体。除了GOS2或NAS2启动子之外，其他启动子如泛素启动子、S2A和S2B启动子、玉米ROOTMET2启动子、玉米Cyclo、CR1BIO、CRWAQ81以及玉米ZRP2.4447，可用于引导pp2c和pp2c样基因在玉米中的表达。此外，多种终止子，例如但不限于PINII终止子，可用于完成所关注基因在玉米中的表达。

实施例14C

使用农杆菌介导转化，用拟南芥属前导基因(At1G07630)和来 自其他物种的对应同源物来转化玉米品系

然后可将最终载体(玉米中表达的载体，实施例14A和B)分别电穿孔进入包含PHP10523的LBA4404农杆菌(SEQ ID NO：7，Komari等人，Plant J 10：165-174(1996)，NCBI GI：59797027)以制备共整合载体用于玉米转化。该共整合载体是通过最终载体(玉米表达载体)与PHP10523的重组(通过每个载体上含有的COS重组位点)而形成。除了实施例14A-C中所述的表达盒，该共整合载体还含有农杆菌菌株以及农杆菌介导转化所需的基因(TET、TET、TRFA、ORI终止子、CTL、ORI V、VIR C1、VIR C2、VIR G、VIR B)。转化玉米品系可如实施例13所述进行。

实施例15

用于转化Gaspe Bay Flint衍生的玉米品系的目的载体PHP23236 和PHP29635的制备

目的载体PHP23236(SEQ ID NO：6)是通过用质粒PHP23235(SEQ ID NO：8)转化包含质粒PHP10523(SEQ ID NO：7)的农杆菌菌株LBA4404并分离所得的共整合产物而获得。目的载体PHP23236可被用于如实施例16所述的与入门克隆的重组反应，以产生用于转化Gaspe Bay Flint衍生的玉米品系的玉米表达载体。所关注的基因的表达是处于泛素启动子(SEQ ID NO：47)的控制之下。

PHP29635(SEQ ID NO：13)是通过用质粒PIIOXS2a-FRT87(ni)m(SEQ ID NO：44)转化包含质粒PHP10523的农杆菌菌株LBA4404并分离所得的共整合产物而获得。目的载体PHP29635可被用于如实施例16所述的与入门克隆的重组反应，以产生用于转化Gaspe Bay Flint衍生的玉米品系的玉米表达载体。所关注的基因的表达是处于S2A启动子(SEQ ID NO：48)的控制之下。

实施例16

用于转化Gaspe Bay Flint衍生的玉米品系的质粒的制备

使用Invitrogen^TM Gateway重组技术，可如实施例5和9所述制备包含拟南芥pp2c基因(AT1G07630)或玉米pp2c样同源物的入门克隆，该克隆用于定向克隆每个基因进入目的载体PHP23236(实施例15)用于在泛素启动子下表达，或进入目的载体PHP29635(实施例15)用于在S2A启动子下表达。每一种表达载体都是用于农杆菌介导玉米转化的T-DNA二元载体。

Gaspe Bay Flint衍生的玉米品系可如实施例17中所述用表达构建体转化。

实施例17

用验证过的拟南芥属前导基因和来自其他物种的对应同源物转 化Gaspe Bay Flint衍生的玉米品系

为了检查所得表型，玉米植株可如实施例16所述进行转化以过表达拟南芥AT1G07630基因和来自其他物种的同源物，如表1列出的基因。除了如实施例16所述的启动子之外，其他启动子，例如S2A和S2B启动子、玉米ROOTMET2启动子、玉米Cyclo、CR1BIO、CRWAQ81以及玉米ZRP2.4447，可用于引导pp2c和pp2c样基因在玉米中的表达。此外，多种终止子，例如但不限于PINII终止子，可用于完成所关注基因在Gaspe Bay Flint衍生的玉米品系中的表达。

受体植株

受体植株细胞可来自具有短的生活周期(“快速循环”)、大小减少以及转化潜能高的单一玉米品系。对玉米典型的这些植株细胞是来自可公开获得的Gaspe Bay Flint(GBF)品系品种的植株细胞。一个可能的候选植物品系品种是GBF x QTM的F1杂交体(Quick Turnaround Maize，在温室条件下选择生长的Gaspe Bay Flint公开可用形式)，它公开于Tomes等人，美国专利公开申请公布2003/0221212。从该品系中获取的转基因植物尺寸减小到它们可在四英寸的罐中生长(正常尺寸的玉米植物生长所需空间的1/4)并且在小于2.5个月内成熟。(一旦转基因植物适应温室环境，传统上需要3.5个月以获取转基因T0种子。)另一合适的品系是GS3(高度可转化的品系)X Gaspe Flint的双单倍体品系。还有另一种合适的品系是携带引起较早开花、高度减小或这两者的转基因的可转化的优良近交系。

转化规程

可使用任何适用的方法将转基因引入玉米细胞，包括但不限于如实施例9所述的、使用基于农杆菌属载体的接种方法。转化可在受体(靶)植株的未成熟胚芽上进行。

精确的生长和植株跟踪

将由转化的玉米胚产生的转基因(T0)植株的事件群体在受控的温室环境中栽培，该温室使用改良的随机分块(block)设计以降低或消除环境误差。随机分块设计是这样一种植株布局，在该布局中，实验植株被分成组(如，每组三十株植株)，称为块，而每株植株随块被随机分配一个位置。

对于一组三十株植株，二十四株转化的实验植株和六株对照植株(具有设定好的表型的植株)(总起来说称为“重复组”)被置于盆中，这些盆在位于温室内的桌子上布置成阵列(也叫做重复组或块)。每株植株(对照植株或实验植株)随块被随机分配一个位置，所述的块映射一个唯一的、温室物理位置以及映射该重复组。在单次实验中多个三十株植株的重复组中的每一个可栽培在相同的温室中。应该测定重复组的布局(布置方式)以使对空间的要求最小以及温室内的环境影响最小。这样一种布局可称为压缩的温室布局。

对于加入特定的对照组的一种替代方法是鉴定不表达所关注基因的那些转基因植株。可将诸如RT-PCR之类的多种技术应用于定量评估引入基因的表达水平。可将不表达转基因的T0植株与表达转基因的那些植株进行比较。

在整个评价过程中鉴定和跟踪事件群体中的每株植株，并且从那些植株收集的数据自动与那些植株相关联，使得所搜集的数据可与由该植株携带的转基因关联。例如，每个植株容器具有机器可读的标签(例如通用货单代码(UPC)条形码)，该标签包含了关于植物身份的信息，身份信息继而又与温室位置相关，使得从植物获得的数据可自动与该植物相关联。

作为另外一种选择，可使用任何有效的、机器可读的植物识别系统，例如二维矩阵代码或甚至是射频识别标签(RFID)，其中数据被接收并由射频接收器/处理器进行翻译。参见美国公布的专利申请2004/0122592，其以引用方式并入本文。

利用三维成像进行表型分析

对T0事件群体中的每株温室植株(包括任何对照植株)分析所关注的农学特性，并且以这样一种方式记录或存储每株植株的农学数据，该方式使得数据与该植株的辨识数据(见上面)相关联。可利用与上述类似的实验设计，可在T1代中完成对表型(基因效应)的确认。

在植物的整个温室生活周期中，利用定量的非破坏性成像技术在表型水平上来分析T0植株以评估所关注的性状。优选的是，将数字成像分析仪用于整株植物的自动多维分析。成像可在温室内进行。将两个摄像系统(位于顶部和侧面)和用于旋转植物的装置用于从所有侧面观察植物和成像。从每株植物的顶部、前面和侧面采集图像。所有的三个图像一起提供了足够的信息用于评价每株植物的生物量、大小和形态。

由于植物在第一片叶片从土壤显现出来时到植物处于它们发育的末期时大小的改变，最好是从顶部以较高的放大倍率记录植物发育的早期。这可通过利用完全由成像软件控制的自动变焦镜头系统来完成。

在单次成像分析操纵中，进行如下事件：(1)将植株传送至分析仪区域内，旋转360度以便其机器可读标签可被读取，并且让其保持静止直至其叶片停止移动；(2)获取侧面图像并将其输入数据库；(3)将植株旋转90度并再次让其保持静止直至其叶片停止移动，以及(4)将该植株传送出分析仪。

每二十四小时的周期让植物至少六个小时处于黑暗以便具有正常的白天/黑夜周期。

成像仪器

可使用任何合适的成像仪器，包括但不限于可从LemnaTec GmbH(Wurselen，Germany)商购获得的光谱数字成像仪。获取图像并用具有1/2″IT Progressive Scan IEE CCD成像设备的LemnaTec Scanalyzer HTS LT-0001-2进行分析。该成像照相机可配备有自动变焦、自动调节光圈和自动聚焦。可利用LemnaTec软件设定所有的照相机设置。优选的是，对于主要组成成像分析仪的仪器差异小于约5％，对于次要组成成像分析仪的仪器差异小于约10％。

软件

成像分析系统包括用于颜色和构造分析的LemnaTec HTS Bonit软件程序和用于存储约500,000次分析的数据(包括分析数据)的服务器数据库。原始图像和分析过的图像储存在一起以允许用户根据需要进行再次分析。可将数据库连接至成像硬件用于自动的数据收集和存储。可将多种市售的软件系统(如Matlab等)用于定量判读成像数据，并且这些软件系统中的任何一种均可应用于图像数据集。

传送系统

具有植物旋转装置的传送系统可用于将植物传送至成像区域并在成像过程中选择植物。例如，将最多四株植物(每株最高高度为1.5m)装上汽车，该汽车在循环的传送系统上行进并通过成像测量区域。在这种情况下，该单位(成像分析仪和传送环线)的总占有面积为约5m×5m。

可扩大传送系统以同时容纳更多植物。将植物沿传送环线传送至成像区域并对每株植物分析最多50秒。获取植物的三个视图。传送系统以及成像设备应该能够用于温室环境条件。

照明

任何合适的照明模式可用于图像采集。例如，可在暗背景上使用顶部照明。作为另外一种选择，可采用使用白色背景的顶部照明和背部照明的组合。应该将被照亮的区域围起来以确保恒定的照明条件。遮蔽物应该长于测量区域使得能保持恒定的光条件而不需要打开和关闭门。作为另一种选择，可变化照明以引起转基因(如，绿色荧光蛋白(GFP)、红色荧光蛋白(RFP))的激发或者引起内源性(如叶绿素)荧光基团的激发。

基于三维成像的生物量评价

为了更好地评价生物量，应该从至少三个轴(优选顶部视图和两个侧面(侧面1和侧面2)视图)来获取植物图像。然后分析这些图像以将植物从背景(盆和花粉控制袋(如果适用的话))分离。可通过如下计算评价植物的体积：

在上面的等式中，体积和面积的单位是“任意单位”。在该系统中，任意单位完全足以检测基因对植物大小和生长影响，因为所需的是检测与实验平均值或对照平均值的差值(正较大和负较小两者)。大小(如面积)的任意单位可以通过将物理参照加至成像过程而轻易地转化成物理量度。例如，可在顶部成像过程和侧面成像过程两者中均包括已知面积的物理参照。基于这些物理参照的面积，可测定转换因子以允许从像素转换为面积单位，例如平方厘米(cm²)。物理参照可以是或可以不是独立的样本。例如，具有已知直径和高度的盆足可用作物理参照。

颜色分类

成像技术还可用于测定植物颜色以及用于将植物颜色归为各种衍生类型。将图像颜色归属于颜色类型是LemnaTec软件的固有特色。使用其他图像分析软件系统，可通过多种计算方法测定颜色分类。

对于植物大小和生长参数的测定，一种有用的分类方案是定义一种单一颜色方案，包括绿色的两种或三种色调，此外，还有关于缺绿病、坏死和漂白(在这些条件出现时)的颜色类型。还使用了背景颜色类型，其包括图像中的非植物颜色(例如盆和土壤颜色)，并将这些像素特别地从测定大小中排除。在受控的恒定照明下分析植物，使得可以定量一株植物内随时间推移的任何改变，或者植物之间或植物不同分枝之间的任何改变(如季节差异)。

除了其在测定植物的大小、生长中的有效性以外，颜色分类还可用于评估其他产量构成性状。对于这些其他产量构成性状，可使用另外的颜色分离方案。例如，称为“保绿度(staygreen)”的性状(已经将其与产量的提高相关联)可通过颜色分类来评估，该颜色分类将绿色色调与黄色和棕色色调(其指示老化的组织)相分离。通过将这种颜色分类应用于在T0或T1植物生活周期末获取的图像，可鉴定绿色的量相对于黄色和棕色(例如，可表示为绿色/黄色比率)增加的植物。这种绿色/黄色比率具有显著差异的植物可被鉴定为携带影响这种重要农学特性的转基因。

熟练的植物学家将认识到可指示植物健康或应激反应的其他植物颜色(花青素)的出现，以及认识到其他颜色分类方案可提供对基因在与这些响应相关的性状方面的作用的进一步度量。

植物结构分析

改变植物构造参数的转基因也可用本发明鉴定，包括诸如最大高度和宽度、节间距离、叶与茎之间的角度、在节处开始的叶片数以及叶片长度。LemnaTec系统软件可如下用于测定植物构造。在第一成像步骤中将植物简化至其主要的几何构造，并且随后基于该图像可进行不同构造参数的参数化鉴定。或者是单独地或者是组合地修改任何这些构造参数的转基因可通过应用此前所述的统计方法来鉴定。

花粉脱落日期

花粉脱落日期是转基因植物中要分析的一个重要参数，并且可通过活性雄花第一次出现在植物上来测定。为了找到雄花目标，通过颜色对茎的上端进行分类以检测黄色或紫色花药。然后将这种颜色分类分析用于定义活性花，活性花继而可用于计算花粉脱落日期。

作为另外一种选择，花粉脱落日期和其他容易目测的植物属性(例如授粉日期、首次抽丝日期)可由负责进行植株管理的人员记录。为了使数据完整性和过程效率最大化，通过利用相同的由LemnaTec光谱数字分析设备利用的条形码来跟踪该数据。可将具有条形码阅读器的电脑、掌上设备或笔记本电脑用于使记录观察时间、植物标识符的数据捕捉变得容易，以及使捕捉数据的操作者感觉舒适。

植物的取向

以接近商业栽培的密度种植的成熟玉米植物通常具有平面的构造。也就是说，植物具有一可清晰分辨的宽的侧面和窄的侧面。对来自植物宽侧的图像进行测定。对于每株植物，给其赋予一个明确界定的基本取向以获得宽侧图像与窄侧(edgewise)图像之间的最大差别。将顶部图像用于测定植物的主轴，而将额外的旋转装置用于在开始主图像采集前将植物转至合适的取向。

实施例18

在氮限制条件下筛选Gaspe Bay Flint衍生的玉米品系

一些转基因植物将含有两个或三个剂量的Gaspe Flint-3与一个剂量的GS3(GS3/(Gaspe-3)2X或GS3/(Gaspe-3)3X)，并且对于显性转基因将会以1∶1分离。其他转基因植物将是常规近交系，并将被用于顶交以生成测试杂交体。将植物在Turface中栽培，每天用1mM KNO₃生长培养基和2mM KNO₃或更高的生长培养基浇洒四次(见图4)。在1mM KNO₃培养基中培养的对照植物的绿度较小，产生较少的生物量并且在开花期具有较小的穗(关于样本数据的示例请参见图5)。Gaspe衍生的品系将生长至开花期，然而常规杂交种和近交系将生长至V4和V5阶段。

用统计学确定处理株之间所观察到的差异是否真有差异。一种方法将字母放在数值后面。同一列中其后具有相同字母(不是字母组)的那些值不具有显著的差异。使用该方法，如果在一列中的值的后面没有字母，则该列中的这些值的任何之间不存在显著的差异，换句话讲，该列中的所有这些值是均等的。

与无效转基因相比较，转基因的表达将导致植物在1mM KNO₃中具有改善的植物生长。因此将在采样时收集生物量和绿度数据(Gaspe在开花期，其他在V4-V5期)并与无效转基因进行比较。此外，将在基本组织中分析植物中的总氮。在开花期的生长、绿度、氮积聚和穗大小的改善将指示氮利用效率提高。

实施例19

具有经验证的拟南芥属前导基因(AT1G07630)的玉米品系的产 量分析

可通过直接转化或者从单独转化的品系基因渗入而将含有证实的拟南芥属基因的重组DNA构建体引入玉米品系内。

可以将转基因植物(自交系或杂种)进行更强的基于田间的试验，以研究在不同环境条件(例如改变水和营养物质可利用性)下的产量增加和/或稳定性。

可对产量进行后续分析以测定含有验证过的拟南芥属前导基因的植株在与不含有验证过的拟南芥属前导基因的对照植株比较时，在不同环境条件下是否具有产量的改善。可以测得这两种植物的产量都有所减少。包含验证过的拟南芥属前导基因的植物具有相对于对照植物更少的产量损失，优选50％更少的产量损失。

实施例20

测定玉米根构造改变的测定法

测定转基因玉米植物在幼苗期、花期或成熟期的根构造改变。测量玉米植物的根构造改变的测定法包括但不限于下面概述的方法。为了便于手动或自动地测定根构造改变，可让玉米植物在透明的盆中生长。

1)根质量(干重)。让植物在Turface中生长。将烘干的根和根组织称重并计算根冠比。

2)侧根分枝的水平。侧根数量、侧根长度)通过这样确定：从完整的根系进行二次取样，将样本用平面扫描器或数码相机成像并用WinRHIZO^TM软件(Regent Instruments Inc.)分析。

3)根带宽度测量。根带是植物成熟时在温室栽培盆的底部形成的根带或根量。测量成熟时根带的厚度(以mm为单位)，作为对根量的粗略评价。

4)节生根计数。从支持培养基(support medium)(如盆栽混合物)中分离出根后，可以测定上部节位处出现的冠根数。另外，可测量冠根和/或支柱根的角度。对节生根和节生根的分枝量的数值分析形成对上述手动方法的另一种延伸。

对提取的有关根表型的所有数据进行统计分析(通常为t检验)，以将转基因根与非转基因姊妹株植株的根进行比较。在多个事件和/或构建体涉及该分析的情况下，还可使用单因素方差分析。

实施例21

包含拟南芥属pp2c基因的玉米幼苗的根与来自不包含pp2c基因 的幼苗的根的比较分析

如实施例14A所述制备包含NAS2启动子和拟南芥pp2c基因的玉米表达载体。经由如实施例14C所述的农杆菌介导转化，通过制备共整合载体(PHP29044)完成玉米的转化，并且使用如实施例20所述幼苗检测分析法测定根。在温室实验中检测来自构建体PHP29044(ZM-NAS2::AT-PP2C)的九个事件中的七个，其中每个事件有9个植株在Turface培养基中生长至V4期。种子来自T1代(来自从T0植株收集的穗)。实验中的对照是相同杂交玉米品系的植株，该植株不包含重组构建体并生长至相同阶段。使用完全随机分组设计种植种子。在种植后19天收获植株，此时它们达到V4阶段。洗涤根部并从苗中分开收集。在用分析天平称量干重之前，所有样本进行烘干。

从表6中可发现若干个事件的一些测量性状在与对照进行比较时发生改变。

进行t检验分析以显示每个转基因事件和对照之间的显著差异。显示了每种特性的p值：根干重、苗干重、以及根-苗比率。粗体字指示转基因植物具有比对照植物更高的值。具有小于0.1的p值的那些值用星号(^*)指示。

表6

转基因和对照幼苗的比较

若干个事件显示生物量的减少，同时有较高的根/苗比率。

实施例24

在田间标准氮和低氮条件下生长的转基因杂交体产量测试。

在两个田间位点进行田间实验，一个位点在California(位点1)，另一个位点在Iowa(位点2)，实验在2008年进行。九个(9)具有拟南芥pp2c基因(AT1G07630)的转基因事件以及对照植物，所述基因由玉米NAS2启动子启动表达。所述对照植物由来自所有9个事件的个体无效植物的非转基因批无效植物组成。所有植物是由常见近交系受试者生成的顶交杂交玉米品系。

用2排小块土地进行实验，其密度为每英亩32000株植物。每个位点重复4次。

在位点1，以250lb每英亩的比率施用氮肥。该实验在2008年4月26-28日种植，并且在2008年9月12-14日组合收获。

在位点2，以260lb每英亩的比率施用氮肥。该实验在2008年5月15日开始种植，并且在2008年10月18日组合收获。

该实验以蒲式耳每英亩表示的谷物产量数据在表7中以对无效对照植物的增长百分比概述。总体上有4个不同事件(事件1、4、5和6)的产量比批无效对照植物(α＝0.2，2尾分析)的产量显著增加(用星号^*表示)。

表7

在标准氮条件下转基因植物对对照植物的产量测试。

Claims (18)

1.在基因组中包含重组DNA构建体的植物，所述重组DNA构建体包含可操作地连接至少一种调控元件的多核苷酸，其中所述多核苷酸编码多肽，所述多肽的氨基酸序列基于Clustal V比对方法在与SEQ ID NO：15、17、19、21、23、25、27、29或31进行比较时具有至少50％的序列同一性，并且其中所述植物在与不包含所述重组DNA构建体的对照植物进行比较时表现出改变的根构造。

2.在基因组中包含重组DNA构建体的植物，所述重组DNA构建体包含可操作地连接至少一种调控元件的多核苷酸，其中所述多核苷酸编码多肽，所述多肽的氨基酸序列基于Clustal V比对方法在与SEQ ID NO：15、17、19、21、23、25、27、29或31进行比较时具有至少50％的序列同一性，并且其中所述植物在与不包含所述重组DNA构建体的对照植物进行比较时表现出至少一种农学特性的改变。

3.权利要求2的植物，其中所述至少一种农学特性选自：绿度、产量、生长速率、生物量、成熟时的鲜重、成熟时的干重、果实产量、种子产量、总植物含氮量、果实含氮量、种子含氮量、营养组织含氮量、总植物游离氨基酸含量、果实游离氨基酸含量、种子游离氨基酸含量、营养组织游离氨基酸含量、总植物蛋白质含量、果实蛋白质含量、种子蛋白质含量、营养组织蛋白质含量、耐旱性、氮摄取、根倒伏、茎倒伏、植株高度、穗长和收获指数。

4.权利要求2或权利要求3的植物，其中所述植物在不同环境条件下与不包含所述重组DNA构建体的所述对照植物进行比较时表现出所述至少一种农学特性的所述改变，其中所述环境条件为选自干旱、氮或病害中的至少一种。

5.权利要求2至4中任一项的植物，其中所述至少一种农学特性是产量。

6.权利要求1至5中任一项的植物，其中所述植物选自：玉米、大豆、卡诺拉、稻、小麦、大麦和高粱。

7.权利要求1至6中任一项的植物的种子，其中所述种子在其基因组中包含重组DNA构建体，所述重组DNA构建体包含可操作地连接至少一种调控元件的多核苷酸，其中所述多核苷酸编码多肽，所述多肽的氨基酸序列基于Clustal V比对方法在与SEQ ID NO：15、17、19、21、23、25、27、29或31进行比较时具有至少50％的序列同一性，并且其中所述种子产生的植物在与不包含所述重组DNA构建体的对照植物进行比较时表现出改变的根构造或至少一种农学特性的改变，或者两者。

8.改变植物根构造的方法，所述方法包括：

(a)将重组DNA构建体引入到可再生的植物细胞中，所述重组DNA构建体包含可操作地连接至少一种调控序列的多核苷酸，其中所述多核苷酸编码多肽，所述多肽的氨基酸序列基于Clustal V比对方法在与SEQ ID NO：15、17、19、21、23、25、27、29或31进行比较时具有至少50％的序列同一性；

(b)在步骤(a)之后，从所述可再生的植物细胞再生出转基因植物，其中所述转基因植物在其基因组中包含所述重组DNA构建体；以及

(c)获取源自步骤(b)的所述转基因植物的子代植物，其中所述子代植物在其基因组中包含所述重组DNA构建体，并且当与未包含所述重组DNA构建体的对照植物比较时，所述子代植物表现出改变的根构造。

9.评价植物的根构造改变的方法，所述方法包括：

(a)获取转基因植物，其中所述转基因植物在其基因组中包含重组DNA构建体，所述重组DNA构建体包含可操作地连接至少一种调控元件的多核苷酸，其中所述多核苷酸编码多肽，所述多肽的氨基酸序列基于Clustal V比对方法在与SEQ ID NO：15、17、19、21、23、25、27、29或31进行比较时具有至少50％的序列同一性；

(b)获取源自所述转基因植物的子代植物，其中所述子代植物在其基因组中包含所述重组DNA构建体；以及

(c)评价所述子代植物在与不包含所述重组DNA构建体的对照植物进行比较时根构造的改变。

10.测定植物的至少一种农学特性改变的方法，所述方法包括：

(a)获取转基因植物，其中所述转基因植物在基因组中包含重组DNA构建体，所述重组DNA构建体包含可操作地连接至少一种调控元件的多核苷酸，其中所述多核苷酸编码多肽，所述多肽的氨基酸序列基于Clustal V比对方法在与SEQ ID NO：15、17、19、21、23、25、27、29或31进行比较时具有至少50％的序列同一性；

(b)获取源自所述转基因植物的子代植物，其中所述子代植物在其基因组中包含所述重组DNA构建体；以及

(c)测定所述子代植物在与不包含所述重组DNA构建体的对照植物进行比较时是否表现出至少一种农学特性的改变。

11.权利要求10的方法，其中所述测定步骤(c)包括测定所述转基因植物在不同环境条件下与不包含所述重组DNA构建体的所述对照植物进行比较时是否表现出至少一种农学特性的改变，其中所述环境条件是选自干旱、氮或病害中的至少一种。

12.权利要求10或权利要求11的方法，其中所述至少一种农学特性选自绿度、产量、生长速率、生物量、成熟时的鲜重、成熟时的干重、果实产量、种子产量、总植物含氮量、果实含氮量、种子含氮量、营养组织含氮量、总植物游离氨基酸含量、果实游离氨基酸含量、种子游离氨基酸含量、营养组织游离氨基酸含量、总植物蛋白质含量、果实蛋白质含量、种子蛋白质含量、营养组织蛋白质含量、耐旱性、氮摄取、根倒伏、茎倒伏、植株高度、穗长和收获指数。

13.权利要求10至12中任一项的方法，其中所述至少一种农学特性是产量。

14.权利要求8至13中任一项的方法，其中所述植物选自：玉米、大豆、卡诺拉、稻、小麦、大麦和高粱。

15.分离的多核苷酸，所述分离的多核苷酸包含编码PP2C或PP2C样多肽的核酸序列，所述多肽的氨基酸序列基于Clustal V比对方法，使用成对比对默认参数KTUPLE＝1，空位罚分＝3，窗口＝5以及DIAGONALS SAVED＝5在与SEQ ID NO：25进行比较时具有至少80％的序列同一性，或者在与SEQ ID NO：23进行比较时具有至少85％的序列同一性，或者在与SEQ ID NO：21进行比较时具有至少90％的序列同一性，或所述核酸序列的全长互补序列。

16.权利要求15的多核苷酸，其中所述多肽的氨基酸序列包含SEQ ID NO：23、24或25。

17.权利要求15的多核苷酸，其中所述核苷酸序列包含SEQ ID NO：20、22或24。

18.包含重组DNA构建体的植物或种子，其中所述重组DNA构建体包含权利要求15至17中任一项的多核苷酸，所述多核苷酸可操作地连接至少一种调控序列。

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