CN101617050A

CN101617050A - 利用海藻糖酶基因赋予植物线虫抗性

Info

Publication number: CN101617050A
Application number: CN200880003733A
Authority: CN
Inventors: A·威格; 黄翔; S·乔杜里
Original assignee: BASF Plant Science GmbH
Current assignee: BASF Plant Science GmbH
Priority date: 2007-02-08
Filing date: 2008-02-05
Publication date: 2009-12-30
Also published as: CA2675255A1; WO2008095919A1; AR065281A1; MX2009007565A; EP2111456A1; BRPI0806995A2; US20100115664A1

Abstract

本发明提供了通过在线虫诱导的合胞体中过量表达编码海藻糖酶的基因而显示对线虫感染抗性提高的转基因植物。也提供了包含编码海藻糖酶的多核苷酸的表达载体和使用此类载体提高植物的线虫抗性的方法。

Description

利用海藻糖酶基因赋予植物线虫抗性

相关申请的交互参照

本申请要求2007年2月8日提交的美国临时申请编号60/900,136的优先权权益。

发明领域

本发明涉及线虫的控制，具体地本发明涉及大豆胞囊线虫的控制。本申请公开了产生具有提高的线虫抗性的转基因植物的方法、包含编码功能蛋白的多核苷酸的表达载体、和转基因植物及由所述植物产生的种子。

发明背景

线虫是以多于2000种蔬菜、水果和装饰植物的根、叶和茎为食的显微镜可见的蠕虫样动物，引起世界范围内据估计一千亿美元的作物损失。线虫的一种常见类型是根结线虫(RKN)，其摄食引起大范围植物物种的根上特征性的虫瘿。其它的摄食根的线虫是胞囊类型和根腐类型，它们是更宿主特异的。

在全美国均存在线虫，但主要在南部和西部温暖、潮湿的地区和在沙质土壤地区造成问题。1954年首次于美国北卡罗莱纳发现大豆胞囊线虫(SCN)-Heterodera glycines。它是大豆植物的最严重害虫。一些地区被SCN如此严重地感染，以至于在没有控制措施时大豆生产不再是经济上可行的。虽然大豆是被SCN侵害的主要经济作物，但SCN寄生于总共大约50种宿主，包括田地作物、蔬菜、装饰植物和杂草。

线虫损害的迹象包括叶的矮缩和黄化、在热的期间植物萎蔫。但是，包括SCN在内的线虫能引起显著的产量损失而无明显的地上症状。此外，受SCN感染的根矮化或矮缩。线虫感染能够降低根上的固氮根瘤数量，并且可使得根较易受其它土传植物病原体的攻击。

线虫的生活周期有三个主要阶段：卵、幼虫和成虫。在线虫的种之间生活周期是变化的。例如，SCN的生活周期在最佳条件下通常在24至30天完成，而其它种需要长达一年或更长的时间来完成生活周期。当温度和湿度水平在春天变得充分时，蠕虫形状的幼虫从土壤中的卵孵化出来。这些幼虫是线虫能感染大豆根的唯一生活阶段。

SCN的生活周期是许多研究的对象，并且因此可用作了解线虫生活周期的一个例子。SCN幼虫在进入大豆根后，在根中移动直至它们接触到维管组织，它们停止在维管组织并开始摄食。线虫注入改变某些根细胞的分泌物，并将根细胞转化为特化的摄食部位。根细胞在形态上转化为大的多核合胞体(或在RKN的情形为巨细胞)，其用作线虫的营养物源。活跃摄食的线虫由此从植物偷取了必需的营养物，导致了植物的产量损失。随着线虫摄食，它们变胖并最终雌性线虫变得如此的大，以至于它们透过根组织并暴露于根的表面。

雄性SCN线虫在成体时不变胖，它们移出根，进入土壤并对柠檬形状的成体雌性受精。然后雄性线虫死去，而雌性线虫仍附着在根系统并继续摄食。在胖的雌性线虫中的卵开始发育，开始是在体外成团或卵囊，然后在体腔内。最后成体雌性的整个体腔充填着卵，并且雌性线虫死去。死去的雌性线虫充填着卵的身体称为胞囊。胞囊最终脱离并发现游离于土壤中。胞囊壁变得非常结实，为其中含有的约200至400枚卵提供了极好的保护。SCN卵在胞囊中存活直至出现合适的孵化条件。虽然许多卵可以在第一年孵化，但是许多卵也可以仍然在胞囊中存活数年。

线虫以它自身的能力每年仅能在土壤中移动若干英寸。但是线虫感染能以多种方式传播相当大的距离。任何能够移动受感染的土壤的事物都能传播感染，包括农业机械、交通工具和用具、风、水、动物，以及农业工作者。土壤的种子大小的颗粒通常污染收获的种子。结果是，当来自受感染田地的被污染的种子种植在未受感染的田地时，可传播线虫感染。甚至有证据表明某些线虫物种能够通过鸟传播。这些起因中仅有一些可被防止。

管理线虫感染的常规实践包括：在线虫感染的土地中维持合适的土壤营养物和土壤pH水平；控制其它植物疾病以及昆虫和杂草害虫；使用环境卫生实践，如仅在操作了未感染田地后再耕地、种植、培育线虫感染的田地；在受感染田地工作后用高压水或蒸汽彻底清洁设备；不使用生长在受感染土地的种子来种植未感染田地，除非所述种子已经完全地清洁过了；轮作被感染田地并用非宿主作物替代宿主作物；使用杀线虫剂；以及种植抗性植物品种。

已经提议了用于遗传转化植物以赋予对植物寄生的线虫提高的抗性的方法。美国专利5,589,622号和5,824,876号涉及鉴定线虫攻击后在植物的摄食部位或附近特异表达的植物基因。

已经表征了海藻糖为植物中的胁迫应答糖，作为渗透压保护物起作用。已知在稻中，较高的海藻糖浓度导致对干旱和盐胁迫提高的抗性。参与海藻糖代谢的酶之一为海藻糖酶，其催化海藻糖转化为D-葡萄糖。

尽管如前所述，仍需要鉴定安全且有效的组合物和方法用于控制植物寄生的线虫，和用于产生具有对植物寄生的线虫提高的抗性的植物。

发明概述

本发明人发现，在植物的根中海藻糖酶基因的过量表达提高了植物抗线虫感染的能力。本发明因此提供了转基因植物和种子、以及方法来克服或至少减轻线虫对有价值农业作物的感染。

因此，在第一个实施方案中，本发明提供了用表达载体转化的转基因植物，其中所述表达载体包含分离的编码海藻糖酶的多核苷酸，其中多核苷酸的表达赋予植物提高的线虫抗性。

本发明的另一实施方案提供了由用表达载体转化的转基因植物产生的种子，其中所述表达载体包含编码能够在植物的根中过量表达海藻糖酶的多核苷酸。种子对于编码海藻糖酶的多核苷酸而言是纯合的。

本发明的另一实施方案涉及表达载体，所述表达载体包含有效连接至编码海藻糖酶的多核苷酸的转录调节元件，其中所述多核苷酸的表达赋予转基因植物线虫抗性，并且其中所述多核苷酸选自：(a)具有SEQ IDNO：11所示序列的多核苷酸；(b)编码具有SEQ ID NO：1、2、3、4、5、6、7、8、9、10或12所示序列的多肽的多核苷酸；(c)与具有SEQ ID NO：11所示序列的多核苷酸具有至少70％序列同一性的多核苷酸；(d)编码与具有SEQ ID NO：1、2、3、4、5、6、7、8、9、10或12所示序列的多肽具有至少70％序列同一性的多肽的多核苷酸；(e)多核苷酸，其在严格条件下杂交至具有SEQ ID NO：11所示序列的多核苷酸；和(f)多核苷酸，其在严格条件下杂交至编码具有SEQ ID NO：1、2、3、4、5、6、7、8、9、10或12所示序列的多肽的多核苷酸。

在一个优选的实施方案中，编码海藻糖酶的多核苷酸在这样的启动子的调节性控制下，所述启动子能够指导在受线虫感染的植物中存在的合胞体中表达。

本发明的另一实施方案涉及在植物中提高线虫抗性的方法，其中所述方法包括以下步骤：将表达载体导入植物，所述表达载体包含有效连接至编码海藻糖酶的多核苷酸的转录调节元件，其中多核苷酸的表达赋予植物提高的线虫抗性；和选择线虫抗性提高了的转基因植物。

附图简述：

图1显示了大豆克隆GM59678499的全长cDNA序列(SEQ ID NO：11，Genbank登录号AF124148)。ATG起始于用粗体标记的第111位碱基。终止密码子起始于第1782位碱基。可读框跨越第111至1784位碱基。在相同读框的起始密码子的上游起始于第39位碱基处有一个终止密码子，表明始于第111位碱基的ATG是可读框的第一个ATG。

图2显示了在图1所述的GM59678499(SEQ ID NO：11)中含有的可读框的氨基酸序列(SEQ ID NO：12，Genbank登录号AAD22970)。

图3显示了已知的海藻糖酶同源物(homologs)与GM59678499的氨基酸序列(SEQ ID NO：12)的总体氨基酸同一性百分数。

图4显示了合胞体优选的大豆MTN3启动子(p-47116125)SEQ IDNO：13。

优选实施方案的详细描述

通过参阅本文所包括的下列详细描述的本发明实施方案和实施例可以较容易地理解本发明。应理解文中所用的术语仅用于描述特定实施方案的目的而不是用于限制。除非另外指出，文中所用的术语由相关领域普通技术人员按照常规使用理解。文中和后附权利要求中所使用的单数形式“一”、“一个”或“该”包括复数形式，除非上下文中明确指出并非如此。文中所使用的“或”是指特定名单的任一成员并且也包括该名单的成员的任一组合。

在本申请中引用了多篇专利和科学出版物。所有这些出版物和在这些出版物中引用的那些参考文献的公开以全文并入本申请作为参考，以更充分地描述本发明所属领域的状态。缩写和术语，当应用时，认为在所述领域是标准的并在专业期刊如文中引用的那些期刊中常规使用。

文中使用的术语“约”是指大约、大概、大致或在某个区间。当术语“约”用在与数字范围结合时，它通过将界限延伸到高于和低于所示数值而修饰范围。通常，文中使用的术语“约”以10％的偏离向上或向下(更高或更低)修饰数值高于和低于所示值。

如文中所使用，单词“核酸”、“核苷酸”或“多核苷酸”旨在包括DNA分子(如cDNA或基因组DNA)、RNA分子(如mRNA)、天然存在的、突变的、合成的DNA或RNA分子、和使用核苷酸类似物产生的DNA或RNA的类似物。可以是单链或双链。此类核酸或多核苷酸包括但不限于结构基因的编码序列、反义序列、和不编码mRNA或蛋白产物的非编码性调节序列。多核苷酸可编码农业上有价值的特性或表型特性。

如文中所使用，“分离的”多核苷酸是当重组技术产生时基本上没有其它细胞材料或培养基，或当化学合成产生时基本上没有化学前体。

术语“基因”广义地用来指与生物功能相关的核酸的任一节段。因此，基因包括在基因组序列中的内含子和外显子、或在cDNA中的仅为编码序列、和/或对它们的表达所需的调节序列。例如，基因指表达mRNA或功能RNA、或编码特定蛋白质的核酸片段，并且其包括调节序列。

术语“多肽”和“蛋白质”在文中互换地使用，指连续氨基酸残基的聚合物。

文中使用的术语“有效连接的”或“功能性连接的”指在单一核酸片段上多个核酸序列的关系，从而一个核酸序列的功能受另一个核酸序列的影响。例如，如果两个DNA这样排列以至于调节性DNA影响编码DNA的表达则称调节性DNA“有效连接至”表达RNA或编码多肽的DNA。

文中使用的术语“特异的表达”指限于一个或一些植物组织(特别限制)和/或一个或一些植物发育阶段(时间上的限制)的基因产物的表达。已知的是：启动子活性的确切特异性(true specificity)是稀有的：启动子似乎优选地在一些组织打开(switch on)，而在其它组织中没有或仅有小的活性。该现象称为渗漏表达(leaky expression)。但是，文中定义的特异的表达包括在一个或一些植物组织或在植物的特定部位表达。

文中使用的术语“启动子”指这样的DNA序列，当所述DNA序列连接至目的核苷酸序列时，其能控制目的核苷酸序列转录为mRNA。启动子通常，但不是必需地，位于目的核苷酸的5’(如上游)(如邻近结构基因的转录起始位点)，所述启动子控制目的核苷酸转录为mRNA，并提供了用于特异性被RNA聚合酶和用于起始转录的其它转录因子结合的部位。

文中使用的术语“转录调节元件”指能够调节有效连接的多核苷酸转录的多核苷酸。它包括但不限于启动子、增强子、内含子、5’UTR、和3’UTR。

如文中使用的，术语“载体”指能够运输与其连接的其它核酸的核酸分子。一种类型的载体是“质粒”，其指额外的DNA节段可连接于其中的环状双链DNA环。在本说明书中，“质粒”和“载体”可互换地使用，因为质粒是最经常使用的载体形式。载体可以是双元载体或T-DNA，其包含左边界和右边界并且可包括位于左边界和右边界之间的目的基因。文中使用的术语“表达载体”是指能够指导特定的核苷酸在合适的宿主细胞中表达的载体。表达载体包含有效连接至目的核酸的调节性核酸元件，其中所述目的核酸任选地有效连接至终止信号和/或其它调节性元件。

文中使用的术语“同源物(homologs)”指与由共同的祖先DNA序列下来的第二基因相关的基因。术语“同源物”可应用于通过物种形成事件分离的基因(如直向同源物(orthologs))之间的关系，或可应用于通过遗传复制事件分离的基因(如旁系同源物(paralogs))之间的关系。

如文中使用的，术语“直向同源物”指来自不同物种但自共同的祖先基因通过物种形成进化的基因。直向同源物在进化过程中保留相同的功能。直向同源物编码具有相同或相似功能的蛋白质。如文中使用的，术语“旁系同源物”指在基因组中通过复制而相关的基因。旁系同源物通常具有不同的功能或新的功能，但这些功能可以是相关的。

在两个核酸或多肽序列的上下文中术语“序列同一性”或“同一性”是指对特定的比较窗口例如在总体比对中对全长序列或在局部比对中对相似性的区域比对最大相应性时在两个序列中相同的残基。当谈及蛋白质时使用序列同一性百分数，意识到不相同的残基位置往往通过保守氨基酸替换而不同，其中将氨基酸残基用具有相似化学特性(如电荷或疏水性)的其它氨基酸残基替换并因此不改变该分子的功能特性。当序列在保守性替换上不同时，可调整百分序列同一性来校正替换的保守本质。通过此类保守性替换而不同的序列称为具有“序列相似性”或“相似性”。用于进行这种调整的方式为本领域技术人员熟知。通常这涉及到将保守性替换评分为部分失配而不是完全失配，由此提高序列相似性百分数。

如文中使用的，“序列同一性的百分数”或“序列同一性百分数”是指通过对比较窗口整体或局部地比较两个最佳比对的序列而确定的值，其中在比较窗口中序列的部分可包含用于最佳比对两个序列的缺口。原则上，如下计算所述百分数：通过确定在两个序列中均出现相同核酸碱基或氨基酸残基的位置数以产生匹配的位置数，将匹配的位置数除以比较窗口中的总位置数，并将结果乘以100来产生序列同一性百分数。蛋白质序列的“序列相似性百分数”可使用相同的原则计算，其中将保守性替换计算为部分失配而非完全失配。因此，例如当相同的氨基酸给分值1且非保守性替换给分值0时，则对保守性替换给在0和1之间的分值。可从本领域已知的氨基酸矩阵例如Blosum或PAM矩阵获得保守性替换的评分。

比对用于比较的序列的方法在本领域中是熟知的。可使用数学算法进行在两个序列之间确定百分同一性或百分相似性(对蛋白质)。此类数学算法的优选非限制性例子是Myers和Miller的算法(Optimal alignments inlinear space，Bioinformatics，4(1)：11-17，1988)、Needleman-Wunsch总体比对(可应用于搜索两个蛋白质的氨基酸序列中相似性的通用方法(Ageneral method applicable the search for similarities in the amino acidsequence of two proteins)，J Mol Biol.48(3)：443-53，1970)、Smith-Waterm局部比对(鉴定共有的分子子序列(Identification of Common MolecularSubsequences)，Journal of Molecular Biology，147：195-197，1981)、Pearson和Lipman的检索相似性方法(生物学序列比较的改进的工具(Improved tools for biological seq uence comparison)，PNAS，85(8)：2444-2448，1988)、Karlin和Altschul的算法(Altschul等人，基本局部比对搜索工具(Basic local alignment search tool)，J.Mol.Biol.，215(3)：403-410，1990，对于分子序列中多个高分值片段的应用学和统计学(Applications and statistics for multiple high-scoring segments inmolecular sequences)，PNAS，90：5873-5877，1993)。可应用计算机执行这些数学算法用于比较序列来确定序列同一性或鉴定同源物。此类执行包括但不限于下述程序。

文中使用的术语“保守的区域”或“保守的结构域”指在异源多核苷酸或多肽序列中的如下区域，所述区域为在不同序列之间有相当高程度序列同一性的区域。“保守的区域”可以例如使用Clustal W算法自多重序列比对鉴定。

文中使用的术语“细胞”或“植物细胞”指单个细胞，并且也包括细胞群。所述群可以是包含一种细胞类型的纯的群体。同样，所述群可以包含多于一种细胞类型。在本发明意义内的植物细胞可以是分离的(如在悬浮培养物中)或包含在植物组织、植物器官中或在任一发育阶段的植物中。

关于植物的术语“组织”(或“植物组织”)是指多个植物细胞的排布，包括植物的分化和未分化组织。植物组织可构成植物器官的部分(如植物叶的表皮)，但也可构成肿瘤组织(如愈伤组织)和培养中的多种细胞类型(如单细胞、原生质体、胚、愈伤组织、原胚体样体等)。植物组织可在植物原位、在器官培养物中、在组织培养物中或在细胞培养物中。

关于植物的术语“器官”(或“植物器官”)是指植物的部分，并且可包括但不限于例如根、果实、枝条、茎、叶、下胚轴、子叶、花药、萼片、花瓣、花粉、种子等。

文中使用的术语“植物”根据上下文理解为是指整株植物、植物细胞、植物器官、植物种子、及其后代。单词“植物”也指任一植物，特别地指种子植物，并且可包括但不限于作物植物。植物部分包括但不限于茎、根、枝条、果实、胚珠、雄蕊、叶、胚、分生组织区、愈伤组织、配子、孢子体、花粉、小孢子、下胚轴、子叶、花药、萼片、花瓣、花粉、种子等。可用于本发明方法的植物的分类总体上如适用于转化技术的高等植物和低等植物那么广，包括被子植物(单子叶和双子叶植物)、裸子植物、蕨类植物、木贼属(horsetails)、草原植物、苔藓植物和多细胞藻类。

文中使用的术语“转基因的”意指含有转基因的细胞和/或植物，或其基因组已通过导入转基因而改变，或已经掺入了外源基因或多核苷酸。转基因细胞、组织、器官和植物可通过几种方法产生，包括通过人类干预如通过本文描述的方法将包含多核苷酸(通常是DNA)的“转基因”导入靶细胞或将转基因整合入靶细胞的染色体。

文中使用的术语“纯合的(true breeding)”指对于特定特性的植物品种，如果它对所述特性在遗传上纯合到如下程度：当该不分离品种自身授粉时，在后代之间没有观察到对该特性而言显著量的独立分离。

文中使用的术语“野生型”是指未经遗传修饰或未经实验意义上处理的植物细胞、种子、植物组分、植物组织、植物器官或完整植物。

文中使用的术语“对照植物”或“野生型植物”是指用于针对转基因的或遗传修饰的植物进行比较的植物细胞、外植体、种子、植物组分、植物组织、植物器官、或完整植物，目的在于鉴定转基因的或遗传修饰的植物中增强的表型或所希望的特性。“对照植物”在一些情况下可以是下述转基因植物品系，所述转基因植物品系包含空载体或标记基因但不含有在所评价的转基因的或遗传修饰的植物中存在的重组目的多核苷酸。对照植物可以与所测试的转基因的或遗传修饰的植物是相同品系或品种的植物，或可以是其它品系或品种，如已知具有特定表型、特征或已知基因型的植物。合适的对照植物包括亲本品系的遗传上未改变的或非转基因植物，用于产生文中的转基因植物。

文中使用的术语“抗线虫感染”或“具有线虫抗性的植物”指植物避免被线虫感染、杀线虫或抑制、降低或停止线虫发育、生长或繁殖的能力。这可通过主动的方法达到，如通过产生损害线虫的物质；或通过被动的方法达到，如对线虫具有降低的营养价值或不发育出被线虫摄食部位诱导的结构如合胞体或巨细胞。可通过多种方式确定植物的线虫抗性水平，如通过计数能够在植物上建立寄生的线虫，或测定线虫的发育时间、雄性和雌性线虫的比例、或胞囊数或产生的线虫卵数。对线虫感染具有提高的抗性的植物是这样的植物，与具有相似的或优选地相同的基因型但缺乏赋予对线虫提高的抗性的一个基因或多个基因的其它植物如对照植物或野生型植物相比较，其更抗线虫感染。

术语“摄食部位”或“合胞体部位”互换使用并在文中指线虫感染后在植物的根形成的摄食部位。该部位用作线虫的营养物源。合胞体是胞囊线虫的摄食部位，且巨细胞是根结线虫的摄食部位。

在一个实施方案中，本发明提供了用包含分离的编码海藻糖酶的多核苷酸的表达载体转化的转基因植物。示例性的编码海藻糖酶的多核苷酸选自：

a)具有SEQ ID NO：11所示序列的多核苷酸；

b)编码具有SEQ ID NO：12所示序列的多肽的多核苷酸；

c)多核苷酸，其与具有SEQ ID NO：11所示序列的多核苷酸具有70％的序列同一性；

d)多核苷酸，其编码的多肽与具有SEQ ID NO：1、2、3、4、5、6、7、8、9、10或12所示序列的多肽具有70％的序列同一性；

e)多核苷酸，其在严格条件下杂交至具有SEQ ID NO：11所示序列的多核苷酸；和

f)多核苷酸，其在严格条件下杂交至编码具有SEQ ID NO：1、2、3、4、5、6、7、8、9、10或12所示序列的多肽的多核苷酸；

其中与相同品种的野生型植物相比较，经转化植物显示出对线虫感染提高的抗性。

具有SEQ ID NO：1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11或12所示序列的编码海藻糖酶的多核苷酸的同源物、直向同源物、旁系同源物和等位基因变体也可用于本发明中。如文中使用的，术语“等位基因变体”指这样的多核苷酸，其含有导致由该核苷酸编码的蛋白质的氨基酸序列改变的多态性，和在天然群体中存在(如植物物种或品种)。此类天然等位基因变化一般导致编码蛋白质的多核苷酸1-5％的变异、或编码的蛋白质中1-5％的变异。可通过在许多不同植物中测定目的核酸的序列而鉴定等位基因变体，这易于通过使用例如杂交探针来鉴定同一基因在那些植物中的基因座而实施。在多核苷酸中的任一和所有此类核酸变异、以及所导致的蛋白质的氨基酸多态性或变异意在包括在本发明的范围内，其中所述蛋白质的氨基酸多态性或变异是天然等位基因变异所致并且不改变所编码的蛋白质的功能活性。对于克隆本发明多核苷酸的等位基因变体或同源物，可以使用文中提供的序列信息。例如可使用由SEQ ID NO：14和15所示的引物来克隆等位基因变体或同源物。

此外，本发明可应用这样的分离的核酸，所述分离的核酸在严格条件下杂交至SEQ ID NO：11所示的多核苷酸或杂交至编码SEQ ID NO：1、2、3、4、5、6、7、8、9、10或12中所示的多肽的多核苷酸。如文中使用的，术语“在严格条件下杂交”用来描述杂交和洗涤条件，在所述条件下相互间至少60％相似或同一的核苷酸序列一般仍相互杂交。在一个其它实施方案中，杂交条件是使得相互间至少约65％、或至少约70％、或至少约75％或更高地相似或同一的序列一般仍相互杂交。此类严格条件为本领域技术人员已知并描述如下。严格条件的一个优选的非限制性例子是在约45℃于6X氯化钠/柠檬酸钠(SSC)中杂交，然后在50-65℃于0.2X SSC、0.1％SDS中洗涤一次或多次。

本发明也提供了对编码海藻糖酶的多核苷酸而言是纯合的转基因种子、和包含编码海藻糖酶的多核苷酸的转基因植物的部分、和来自此类植物的后代植物，包括杂交体和近交系。本发明也提供了植物育种的方法，如用来制备杂交的能育转基因植物。所述方法包括将包含本发明的特定表达载体的能育转基因植物与其自身或与第二种植物杂交，其中所述第二种植物如缺乏特定表达载体的植物，以制备包含特定表达载体的杂交的能育转基因植物的种子。然后种植种子以获得杂交的能育转基因植物。植物可以是单子叶植物。杂交的能育转基因植物可具有通过雌性亲本或通过雄性亲本遗传的特定表达载体。所述第二种植物可以是近交系植物。杂交的能育转基因植物可以是杂交体。任一这些杂交的能育转基因植物的种子也包括在本发明中。

本发明的另一实施方案涉及包含有效连接至本发明多核苷酸的转录调节元件的表达盒和表达载体，其中多核苷酸的表达赋予转基因植物提高的线虫抗性，并且其中多核苷酸选自：

a)具有SEQ ID NO：11所示序列的多核苷酸；

b)编码具有SEQ ID NO：1、2、3、4、5、6、7、8、9、10或12所示序列的多肽的多核苷酸；

d)编码具有SEQ ID NO：1、2、3、4、5、6、7、8、9、10或12所示序列的多肽的多核苷酸；

f)多核苷酸，其在严格条件下杂交至编码具有SEQ ID NO：1、2、3、4、5、6、7、8、9、10或12所示序列的多肽的多核苷酸。

在一个实施方案中，转录调节元件是能够调节有效连接的编码海藻糖酶的多核苷酸组成型表达的启动子。“组成型启动子”指能够表达可读框的启动子或在全部或几乎全部植物组织中于植物发育的所有或几乎所有阶段控制的调节性元件。组成型启动子包括但不限于来自植物病毒的35SCaMV启动子(Franck等人，1980 Cell 21：285-294)、Nos启动子(An G.等人，The Plant Cell 3：225-233，1990)、遍在蛋白启动子(Christensen等人，Plant Mol.Biol.12：619-632(1992)和18：581-8(1991))、MAS启动子(Velten等人，EMBO J.3：2723-30(1984))、玉米H3组蛋白启动子(Lepetit等人，Mol Gen.Genet 231：276-85(1992))、ALS启动子(WO96/30530)、19S CaMV启动子(US 5,352,605)、超启动子(US 5,955,646)、玄参花叶病毒(figwortmosaic virus)启动子(US 6,051,753)、稻肌动蛋白启动子(US 5,641,876)、和核酮糖二磷酸羧化酶-加氧酶小亚单位启动子(US 4,962,028)。

在另一实施方案中，转录调节元件是可调节型启动子。“可调节型启动子”指不是组成型地指导基因表达而是以时间上和/或空间上的方式指导基因表达的启动子，并且包括组织特异的启动子和可诱导的启动子。不同的启动子可指导基因或调节性元件在不同组织或细胞类型中、或在不同的发育阶段、或应答不同的环境条件表达。

“组织特异的启动子”指不在所有植物细胞而仅在特定器官(如叶或种子)、特定组织(如胚或子叶)的一种或多种细胞类型中、或在特定细胞类型(如叶薄壁组织或种子贮藏细胞)中表达的可调节型启动子。这些也包括时间上如在早期或晚期胚发生中、在发育的种子或果实的果实成熟期间、在充分分化的叶中、或在顺序的起始处受调节的启动子。合适的启动子包括来自油菜籽的油菜籽蛋白基因启动子(US 5,608,152)、来自蚕豆(Vicia faba)的USP启动子(Baeumlein等人，1991 Mol Gen Genet.225(3)：459-67)、来自拟南芥属(Arabidopsis)的油质蛋白启动子(WO 98/45461)、来自菜豆(Phaseolus vulgaris)的菜豆蛋白启动子(US 5,504,200)、来自芸苔属(Brassica)的Bce4-启动子(WO 91/13980)或豆球蛋白B4启动子(LeB4；Baeumlein等人，1992Plant Journal，2(2)：233-9)、以及单子叶植物如玉米、大麦、小麦、黑麦、稻等中赋予种子特异性表达的启动子。需注意的合适启动子是来自大麦的lpt2或lpt1-基因启动子(WO 95/15389和WO95/23230)或在WO 99/16890中描述的那些启动子(来自大麦的大麦醇溶蛋白基因、稻的谷蛋白基因、稻的水稻素基因、稻的谷醇溶蛋白基因、小麦的麦醇溶蛋白基因、小麦的谷蛋白基因、玉米的玉米醇溶蛋白基因、燕麦的谷蛋白基因、高梁kasirin基因和黑麦的黑麦碱基因的启动子)。适用于在植物根组织中优选表达的启动子包括例如源自谷物的烟酰胺合酶基因的启动子(US 20030131377)和稻RCC3启动子(US 11/075,113)。在植物绿色组织中优选表达的合适启动子包括来自如玉米醛缩酶基因FDA的启动子(US20040216189)、醛缩酶和丙酮酸正磷酸盐双激酶(PPDK)基因的启动子(Taniguchi等人，Plant Cell Physiol.41(1)：42-48，2000)。

“诱导型启动子”指可在一种或多种细胞类型中通过外部刺激物打开的那些可调节型启动子，其中所述外部刺激物例如化学品、光、激素、胁迫或病原体如线虫。如果想让基因表达以时间特异性方式出现，则化学诱导型启动子是尤其合适的。此类启动子的例子是水杨酸诱导型启动子(WO95/19443)、四环素诱导型启动子(Gatz等人.，1992 Plant J.2：397-404)、来自核酮糖-1，5-二磷酸羧化酶小亚单位(ssRUBISCO)的光诱导型启动子、和乙醇诱导型启动子(WO 93/21334)。另外，对生物性或非生物性胁迫条件应答的合适启动子是那些如病原体诱导型PRP1基因启动子(Ward等人，1993 Plant.Mol.Biol.22：361-366)、来自番茄的热诱导型hsp80启动子(US5187267)、来自马铃薯的冷诱导型α-淀粉酶启动子(WO 96/12814)、玉米的干旱诱导型启动子(Busk等人，Plant J.11：1285-1295，1997)、来自马铃薯的冷、干旱和高盐诱导型启动子(Kirch，Plant Mol.Biol.33：897-909，1997)或来自拟南芥属的RD29A启动子(Yamaguchi-Shinozalei等人，Mol.Gen.Genet.236：331-340，1993)、许多冷诱导型启动子如来自拟南芥属的cor15a启动子(Genbank登录号U01377)、来自大麦的blt101和blt4.8(Genbank登录号AJ310994和U63993)、来自小麦的wcs120(Genbank登录号AF031235)、来自谷物的mlip15(Genbank登录号D26563)、来自芸苔属的bn115(Genbank登录号U01377)、和创伤诱导型pinII启动子(欧洲专利第375091号)。

优选的启动子是根特异的、摄食部位特异的、病原体诱导型或线虫诱导型启动子。

已知多种将多核苷酸导入植物基因组的方法和用于从植物组织或植物细胞再生植物的方法，所述方法在例如Plant Molecular Biology andBiotechnology一书中(CRC出版社，Boca Raton，Florida)、第6/7章，第71-119页(1993)；White FF(1993)Vectors for Gene Transfer in HigherPlants；Transgenic Plants，第1卷，Engineering and Utilization，Kung和Wu R编著，Academic Press，15-38；Jenes B等人，(1993)Techniques forGene Transfer；Transgenic Plants，第1卷，Engineering and Utilization，Kung和R.Wu编著，Academic Press，第128-143页；Potrykus(1991)AnnuRev Plant Physiol Plant Molec Biol 42：205-225；Halford NG，Shewry PR(2000)Br Med Bull 56(1)：62-73。

转化方法可包括转化的直接方法和间接方法。合适的直接方法包括聚乙二醇诱导的DNA摄入、脂质体介导的转化(US 4,536,475)、使用基因枪的生物弹射击法(“粒子轰击”，Fromm ME等人，(1990)Bio/Technology.8(9)：833-9；Gordon-Kamm等人，(1990)Plant Cell 2：603)、电穿孔、在包含DNA的溶液中孵育干燥胚、和显微注射。在这些直接转化法中，所使用的质粒无需满足任一特别的要求。可以使用简单的质粒，如那些pUC系列、pBR322、M13mp系列、pACYC184等。如果欲从经转化的细胞产生完整的植物，优选地在质粒上定位有额外的可选择标记基因。直接转化技术对于双子叶和单子叶植物同样适用。

也可以借助农杆菌(Agrobacterium)通过细菌感染(例如 EP 0 116718)、借助于病毒载体通过病毒感染(EP 0 067 553；US 4,407,956；WO95/34668；WO 93/03161)或借助于花粉(EP 0 270 356；WO 85/01856；US4,684,611)实施转化。基于农杆菌的转化技术(尤其对于双子叶植物)在本领域是熟知的。农杆菌菌株(如根癌农杆菌(Agrobacterium tumefaciens)或发根农杆菌(Agrobacterium rhizogenes))包含质粒(Ti或Ri质粒)和T-DNA元件，其在用农杆菌感染植物后转移至植物。T-DNA(转化DNA)整合入植物细胞的基因组。T-DNA可定位于Ri-或Ti-质粒上或分开地包含在所谓的双元载体中。对于农杆菌介导的转化方法描述在例如Horsch RB等人，(1985)Science 225：1229f中。农杆菌介导的转化最适用于双子叶植物，但也可应用于单子叶植物。在例如White FF，Vectors for Gene Transfer in HigherPlants，Transgenic Plants，第1卷，Engineering and Utilization，S.D.Kung和R.Wu编著，Academic Press，1993，第15-38页；Jenes B等人，Techniques for Gene Transfer，Transgenic Plants，第1卷，Engineering andUtilization，S.D.Kung和R.Wu编著，Academic Press，1993，第128-143页；Potrykus(1991)Annu Rev Plant Physiol Plant Molec Biol 42：205-225中描述了通过农杆菌转化植物。

转化可导致瞬时的或稳定的转化和表达。虽然编码海藻糖酶的多核苷酸可插入落在本发明的这些广泛类型范围内的任一植物和植物细胞中，它特别地用在作物植物细胞中。

可将编码海藻糖酶的多核苷酸直接转化入质体基因组。质体表达利用了多于核表达基因的许多拷贝数来允许高的表达水平，其中在质体表达中基因通过同源重组插入每一植物细胞中存在的几千个拷贝的环状质体基因组。在一个实施方案中，将核苷酸插入靶向质体的载体，并转化入目的植物宿主的质体基因组。获得了对含有所述核苷酸序列的质体基因组而言是同质的植物，并且其优选地能够高表达所述核苷酸。

质体转化技术例如深入地描述于美国专利号5,451,513、5,545,817、5,545,818和5,877,462、WO 95/16783和WO 97/32977、以及McBride等人，(1994)Proc.Natl.Acad.Sci.USA 91，7301-7305中，所述文献均全文并入本文作为参考。用于质体转化的基本技术涉及将在选择标记侧翼的经克隆质体DNA的区域和核苷酸序列导入合适的靶组织，如使用生物弹射击法或原生质体转化(如氯化钙或PEG介导的转化)。称为靶向序列的1至1.5kb的侧翼区有利于与质体基因组的同源重组，并因此允许替换或改变质体基因组的特定区域。起初，叶绿体16S rRNA和rps12基因中赋予壮观霉素和/或链霉素抗性的点突变用作转化的选择标记(Svab等人.(1990)Proc.Natl.Acad.Sci.USA 87，8526-8530；Staub等人，(1992)Plant Cell 4，39-45)。在这些标记之间存在的克隆位点允许产生用于导入外源基因的质体靶向载体(Staub等人，(1993)EMBO J.12，601-606)。通过用显性选择标记-编码壮观霉素解毒酶氨基糖苷-3′-腺嘌呤基转移酶的细菌aadA基因替换隐性rRNA或r-蛋白质抗生素抗性基因获得实质提高的转化频率(Svab等人，(1993)Proc.Natl.Acad.Sc.USA 90，913-917)。本领域已知用于质体转化的其它选择标记并包括在本发明的范围内。

植物或转基因植物可以是任一植物，例如但不限于树、切花、装饰植物、蔬菜植物或作物植物。植物可来自选自以下的属：苜蓿属(Medicago)、番茄属(Lycopersicon)、芸苔属(Brassica)、黄瓜属(Cucumis)、茄属(Solanum)、核桃属(Juglans)、棉属(Gossypium)、苹果属(Malus)、葡萄属(Vitis)、金鱼草属(Antirrhinum)、杨属(Populus)、草霉属(Fragaria)、拟南芥属(Arabidopsis)、云杉属(Picea)、辣椒属(Capsicum)、藜属(Chenopodium)、菊花属(Dendranthema)、牵牛花属(Pharbitis)、松属(Pinus)、豌豆属(Pisum)、稻属(Oryza)、玉米属(Zea)、小麦属(Triticum)、黑小麦属(Triticale)、黑麦属(Secale)、黑麦草属(Lolium)、大麦属(Hordeum)、大豆属(Glycine)、花旗松属(Pseudotsuga)、Kalanchoe、甜菜属(Beta)、向日葵属(Helianthus)、烟草属(Nicotiana)、南瓜属(Cucurbita)、蔷薇属(Rosa)、草霉属(Fragaria)、百脉根属(Lotus)、苜蓿属(Medicago)、驴食豆属(Onobrychis)、车轴草属(Trifolium)、胡卢巴属(Trigonella)、豇豆属(Vigna)、柑桔属(Citrus)、亚麻属(Linum)、老鹳草属(Geranium)、木薯属(Manihot)、胡萝卜属(Daucus)、萝卜属(Raphanus)、白芥属(Sinapis)、颠茄属(Atropa)、、曼佗罗属(Datura)、天仙子属(Hyoscyamus)、烟草属(Nicotiana)、碧冬茄属(Petunia)、毛地黄属(Digitalis)、马郁兰属(Majorana)、菊苣属(Ciahorium)、莴苣属(Lactuca)、雀麦属(Bromus)、天门冬属(Asparagus)、金鱼草属(Antirrhinum)、Heterocallis、Nemesis、天竺葵属(Pelargonium)、稷属(Panicum)、狼尾草属(Pennisetum)、毛莨属(Ranunculus)、千里光属(Senecio)、喇叭舌属(Salpiglossis)、Browaalia、菜豆属(Phaseolus)、燕麦属(Avena)和葱芹属(Allium)，或者植物可选自谷类物种(cereals)，包括小麦、大麦、高粱、黑麦、黑小麦(triticale)、玉米、稻、甘蔗；以及树类植物，包括苹果树、梨树、榅桲树(quince)、李树、樱桃树、桃树、油桃树、杏树、番木瓜树、芒果树、白杨、松树、美洲杉、雪松和橡树。文中所用的术语“植物”可以是双子叶农作物植物例如豌豆、苜蓿、大豆、胡萝卜、芹菜、马铃薯、番茄、棉花、烟草、辣椒、油籽油菜(oilseed rape)、甜菜、甘蓝、花椰菜、绿花椰菜、莴苣(lettuce)和拟南芥(Arabidopsis thaliana)。在一个实施方案中，植物是单子叶植物或双子叶植物。

优选地，植物是作物植物。作物植物是所有在农业中使用的植物。因此，在一个实施方案中，植物是单子叶植物，优选地是禾本科(Poaceae)、芭蕉科(Musaceae)、百合科(Liliaceae)或凤梨科(Bromeliaceae)的植物，优选地是禾本科的植物。因此，又在另一个实施方案中，植物是禾本科植物中的玉米属(Zea)、小麦属(Triticum)、稻属(Oryza)、大麦属(Hordeum)、黑麦属(Secale)、燕麦属(Avena)、蔗属(Saccharum)、高粱属(Sorghum)、狼尾草属(Pennisetum)、狗尾草属(Setaria)、黍属(Panicum)、蟋蟀草属(Eleusine)、芒属(Miscanthus)、短柄草属(Brachypodium)、狐茅属(Festuca)或黑麦草属(Lolium)。当植物为玉米属(Zea)植物时，优选的种是玉米(Z.mays)。当植物为小麦属(Triticum)植物时，优选的种是普通小麦(T.aestivum)、斯佩尔特小麦(T.speltae)或硬粒小麦(T.durum)。当植物是稻属植物时，优选的种是稻(O.sativa)。当植物为大麦属(Hordeum)植物时，优选的种是大麦(H.vulgare)。当植物为黑麦属(Secale)植物时，优选的种是黑麦(S.cereale)。当植物为燕麦属(Avena)植物时，优选的种是A.sativa)。当植物为蔗属(Saccharum)植物时，优选的种是甘蔗(S.officinarum.)。当植物为高粱属(Sorghum)植物时，优选的种是高粱(S.vulgare)，两色蜀黍(S.bicolor)或苏丹草(S.sudanense)。当植物为狼尾草属(Pennisetum)植物时，优选的种是P.glaucum)。当植物为狗尾草属(Setaria)植物时，优选的种是谷子(S.italica)。当植物为黍属(Panicum)植物时，优选的种是稷(P.miliaceum)或柳枝稷(P.virgatum)。当植物为蟋蟀草属(Eleusine)植物时，优选的种是穇子(E.coracana)。当植物为芒属(Miscanthus)植物时，优选的种是芒(M.sinensis.)。当植物为狐茅属(Festuca)植物时，优选的种是苇状狐茅(F.arundinaria)、红狐茅(F.rubra)或高株狐茅(F.pratensis.)。当植物为黑麦草属(Lolium)植物时，优选的种是黑麦草(L.perenne)或多花黑麦草(L.multiflorum)。备选地，植物可以是小黑麦属(Triticosecale)。

备选地，在一个实施方案中，植物是双子叶植物，优选地是豆科(Fabaceae)、茄科(Solanaceae)、芸苔科(Brassicaceae)、藜科(Chenopodiaceae)、菊科(Asteraceae)、锦葵科(Malvaceae)、亚麻科(Linacea)、大戟科(Euphorbiaceae)、旋花科(Convolvulaceae)、蔷薇科(Rosaceae)、葫芦科(Cucurbitaceae)、山茶科(Theaceae)、茜草科Rubiaceae)、梧桐科(Sterculiaceae)或柑桔属(Citrus)的植物。在一个实施方案中，植物是豆科、茄科或芸苔科的植物。因此，在一个实施方案中，植物是豆科植物，优选地大豆属(Glycine)、豌豆属(Pisum)、落花生属(Arachis)、鹰嘴豆属(Cicer)、野豌豆属(Vicia)、菜豆属(Phaseolus)、羽扇豆属(Lupinus)、苜蓿属(Medicago)或兵豆属(Lens)植物。豆科优选的种是蒺藜苜蓿(M.truncatula)、紫苜蓿(M.sativa)、大豆(G.max)、豌豆(P.sativum)、落花生(A.hypogea)、鹰嘴豆(C.arietinum)、蚕豆(V.faba)、菜豆(P.vulgaris)、白羽扇豆(Lupinus albus)、黄羽扇豆(Lupinus luteus)、狭叶羽扇豆(Lupinus angustifolius)或兵豆(Lens culinaris)。更优选的种是大豆、落花生和紫苜蓿。最优选的种是大豆。当植物是茄科时，优选的属是茄属(Solanum)、番茄属(Lycopersicon)、烟草属(Nicotiana)或辣椒属(Capsicum)。茄科优选的种是马铃薯(S.tuberosum)、番茄(L.esculentum)、烟草(N.tabaccum)或青辣椒(C.chinense)。更优选的是马铃薯。因此，在一个实施方案中，植物芸苔科植物，优选地是芸苔属(Brassica)或萝卜属(Raphanus)的植物。芸苔科植物优选的种是欧洲油菜(B.napus)、甘蓝(B.oleracea)、雪里蕻(B.juncea)或芜青(B.rapa)。更优选的种是欧洲油菜。当植物是藜科植物时，优选的属是甜菜属(Beta)，且优选的种是甜菜(B.vulgaris)。当植物是菊科植物时，优选的属是向日葵属(Helianthus)，且优选的种是向日葵(H.annuus)。当植物是锦葵科植物时，优选的属是棉属(Gossypium)或秋葵属(Abelmoschus)。当是棉属植物时，优选的种是陆地棉(G.hirsutum)或海岛棉(G.barbadense)，且优选的种是陆地棉。秋葵属优选的种是咖啡黄葵(A.esculentus)。当植物是亚麻科植物时，优选的属是亚麻属(Linum)，且优选的种是亚麻(L.usitatissimum)。当植物是大戟科植物时，优选的属是木薯属(Manihot)、Jatropa或Rhizinus，且优选的种是木薯(M.esculenta)、J.curcas或R.comunis。当植物是旋花科植物时，优选的属是番薯属(Ipomea)，且优选的种是番薯(I.batatas)。当植物是蔷薇科植物时，优选的属是蔷薇属(Rosa)、苹果属(Malus)、梨属(Pyrus)、桃属(Prunus)、悬钩子属(Rubus)、茶藨子属(Ribes)、越桔属(Vaccinium)或草莓属(Fragaria)，且优选的种是草莓属x凤梨属(ananassa)的杂交体。当植物是葫芦科植物时，优选的属是黄瓜属(Cucumis)、西瓜属(Citrullus)或南瓜属(Cucurbita)，且优选的种是黄瓜(Cucumis sativus)、西瓜(Citrullus lanatus)或西葫芦(Cucurbitapepo)。当植物是山茶科植物时，优选的属是茶属(Camellia)，且优选的种是大叶茶(C.sinensis)。当植物是茜草科植物时，优选的属咖啡属(Coffea)，且优选的种是小果咖啡(C.arabica)或卡尼福拉咖啡(C.canephora)。当植物是梧桐科植物时，优选的属是可可树属(Theobroma)，且优选的种是可可树(T.cacao)。当植物为柑桔属植物时，优选的种是甜橙(C.sinensis)、柠檬(C.limon)、桔(C.reticulata)、大橙(C.maxima)和柑桔属物种的杂交体等，在本发明的一个优选的实施方案中，植物是大豆、马铃薯或谷物(corn)植物。

本发明的转基因植物可用于控制作物被植物寄生的线虫感染的方法中，所述方法包括以下步骤：从包含下述表达盒的种子生长所述作物，其中所述表达盒包含有效连接至编码海藻糖酶的多核苷酸的转录调节元件，其中所述表达盒稳定地整合入种子的基因组中并且所述植物具有提高的线虫抗性。

本发明也提供了赋予植物线虫抗性的方法，所述方法包括以下步骤：a)用本发明的表达盒转化植物细胞，b)从所述细胞再生植物，和c)选择线虫抗性植物。更具体地，用于在植物中提高线虫抗性的方法包括以下步骤：

a)将包含有效连接至本发明多核苷酸的转录调节元件的表达载体导入植物，其中多核苷酸的表达赋予所述植物提高的线虫抗性，且其中所述多核苷酸选自：

(i)具有SEQ ID NO：11所示序列的多核苷酸；

(ii)编码具有SEQ ID NO：1、2、3、4、5、6、7、8、9、10或12所示序列的多肽的多核苷酸；

(iii)多核苷酸，其与具有SEQ ID NO：11所示序列的多核苷酸具有70％的序列同一性；

(iv)多核苷酸，其编码的多肽与具有SEQ ID NO：1、2、3、4、5、6、7、8、9、10或12所示序列的多肽具有70％的序列同一性；

(v)多核苷酸，其在严格条件下杂交至具有SEQ ID NO：11所示序列的多核苷酸；和

(vi)多核苷酸，其在严格条件下杂交至编码具有SEQ ID NO：1、2、3、4、5、6、7、8、9、10或12所示序列的多肽的多核苷酸；和

b)选择提高了线虫抗性的转基因植物。

本发明可用于降低植物寄生的线虫对作物的破坏或赋予植物线虫抗性。所述线虫可为植物寄生的任一线虫，如长针科(Longidoridae)、毛刺科(Trichodoridae)、滑刃科(Aphelenchoidida)、粒科(Anguinidae)、刺科(Belonolaimidae)、环线虫科(Criconematidae)、异皮线虫科(Heterodidae)、纽带线虫科(Hoplolaimidae)、根结线虫科(Meloidogynidae)、异盘旋线虫科(Paratylenchidae)、短体科(Pratylenchidae)、小垫刃科(Tylenchulidae)、垫刃科(Tylenchidae)等科的线虫。优选地，寄生的线虫属于诱导巨细胞或合胞体细胞的线虫科。在长针科、毛刺科、异皮线虫科、根结线虫科、短体科或小垫刃科中发现了诱导巨细胞或合胞体细胞的线虫。特别地在异皮线虫科和根结线虫科中发现了诱导巨细胞或合胞体细胞的线虫。

因此，被本发明靶向的寄生的线虫属于选自以下的一个或多个属：珍珠线虫属(Naccobus)、棘皮线虫属(Cactodera)、长异皮线虫属(Dolichodera)、球胞囊线虫属(Globodera)、胞囊线虫属(Heterodera)、斑皮线虫属(Punctodera)、长针线虫属(Longidorus)或根结线虫属(Meloidogyne)。在一个优选的实施方案中，寄生的线虫属于选自以下的一个或多个属：珍珠线虫属、棘皮线虫属、长异皮线虫属、球胞囊线虫属、胞囊线虫属、斑皮线虫属或根结线虫属。在一个更优选的实施方案中，寄生的线虫属于选自以下的一个或多个属：球胞囊线虫属、胞囊线虫属或根结线虫属。在一个甚至更优选的实施方案中，寄生的线虫属于选自球胞囊线虫属或胞囊线虫属中的一个或两个属。在另一个实施方案中，寄生的线虫属于根结线虫属。

当寄生的线虫属于球胞囊线虫属时，种优选地来自蓍草球胞囊线虫(G.achilleae)、蒿球胞囊线虫(G.artemisiae)、枸杞球胞囊线虫(G.hypolysi)、墨西哥球胞囊线虫(G.mexicana)、欧蓍草球胞囊线虫(G.millefolii)、苹果球胞囊线虫(G.mali)、马铃薯白线虫(G.pallida)、马铃薯金线虫(G.rostochiensis)、茄球胞囊线虫(G.tabacum)和弗吉尼亚球胞囊线虫(G.virginiae)，在另一优选的实施方案中，寄生的球胞囊线虫属线虫包括马铃薯白线虫、茄球胞囊线虫或马铃薯金线虫中的至少一个种。当寄生的线虫属于胞囊线虫属时，种优选地来自燕麦胞囊线虫(H.avenae)、胡萝卜胞囊线虫(H.carotae)、鹰嘴豆胞囊线虫(H.ciceri)、十字花科胞囊线虫(H.cruciferae)、龙爪稷胞囊线虫(H.delvii)、微褐藻胞囊线虫(H.elachista)、菲氏胞囊线虫(H.filipjevi)、冈比亚胞囊线虫(H.gambiensis)、大豆胞囊线虫(H.glycines)、豌豆胞囊线虫(H.goettingiana)、荞麦胞囊线虫(H.graduni)、啤酒花胞囊线虫(H.humuli)、大麦胞囊线虫(H.hordecalis)、麦类胞囊线虫(H.latipons)、主胞囊线虫(H.major)、苜蓿胞囊线虫(H.medicaginis)、水稻同居胞囊线虫(H.oryzicola)、巴基斯坦胞囊线虫(H.pakistanensis)、玫瑰胞囊线虫(H.rosii)、甘蔗胞囊线虫(H.sacchari)、甜菜胞囊线虫(H.schachtii)、蜀黍胞囊线虫(H.sorghi)、三叶草胞囊线虫(H.trifolii)、荨麻胞囊线虫(H.urticae)、木豆胞囊线虫(H.vigni)和玉米胞囊线虫(H.zeae)。在另一优选的实施方案中，寄生的胞囊线虫属线虫包括大豆胞囊线虫、燕麦胞囊线虫、木豆胞囊线虫(H.cajani)、豌豆胞囊线虫、三叶草胞囊线虫、玉米胞囊线虫或甜菜胞囊线虫中的至少一个种。在一个更优选的实施方案中，寄生的线虫包括大豆胞囊线虫或甜菜胞囊线虫中的至少一个种。在一个最优选的实施方案中，寄生的线虫是大豆胞囊线虫种。

当寄生的线虫属于根结线虫属时，寄生的线虫可选自高梁根结线虫(M.acronea)、小果根结线虫(M.arabica)、花生根结线虫(M.arenaria)、甘蓝根结线虫(M.artiellia)、短尾根根结线虫(M.brevicauda)、山茶根结线虫(M.camelliae)、奇氏根结线虫(M.chitwoodi)、咖啡根结线虫(M.cofeicola)、短小根结线虫(M.esigua)、禾草根结线虫(M.graminicola)、北方根结线虫(M.hapla)、南方根结线虫(M.incognita)、印度根结线虫(M.indica)、M.inornata、爪哇根结线虫(M.javanica)、M.lini、苹果根结线虫(M.mali)、小头根结线虫(M.microcephala)、小突根结线虫(M.microtyla)、纳西根结线虫(M.naasi)、萨拉斯根结线虫(M.salasi)和花生根结线虫(M.thamesi)。在一个优选的实施方案中，寄生的线虫包括爪哇根结线虫、南方根结线虫、北方根结线虫、花生根结线虫或奇氏根结线虫中的至少一个种。

实施例

实施例1：鉴定特异在合胞体中表达的基因

微阵列分析激光切除的用大豆胞囊线虫(Heterodera glycines)race3的第二阶段幼虫(J2)接种的大豆根的合胞体细胞导致了鉴定在合胞体中特异地或差异地表达的基因。一个此种基因(52015943)称为海藻糖酶样蛋白质。表1总结了通过cDNA微阵列分析所有三种细胞/组织样本：合胞体、SCN感染的非合胞体和未处理的对照根组织测定的表达数据。基因表达的相对水平表示为上述的归一化信号强度(±标准差)。

表1.海藻糖酶样基因的表达

基因名称	合胞体#1(N)	合胞体#2(N)	非合胞体	对照根
基因名称	合胞体#1(N)	合胞体#2(N)	非合胞体	对照根	52015943^＊	698±259(4)	525±75(5)	122±38	126±60

(N)cDNA微阵列测定的数目

如表1所示，鉴定了大豆cDNA克隆52015943在SCN感染的大豆根的合胞体中被上调。

实施例2：大豆海藻糖酶基因的克隆

使用标准PCR扩增方案扩增GM59678499可读框。用于PCR扩增海藻糖酶样序列的引物示于表2并且是基于GM59678499可读框的序列设计的。GW59678499F所示的引物序列(SEQ ID NO：14)含有用于使克隆容易实施的AscI限制性位点。SEQ ID NO：15所示的引物序列含有用于使克隆容易实施的XhoI。由SEQ ID NO：14和SEQ ID NO：15(GW59678499F和GW59678499R)所示的引物序列用于扩增来自SEQ ID NO：11的第111至1784位碱基的1674bp可读框(GM59678499的全部cDNA序列)。

通过标准的琼脂糖凝胶电泳证实所扩增的DNA PCR产物并将从凝胶提取的DNA使用TOPO TA克隆试剂盒按照制造商的说明(Invitrogen)TOPO克隆入pCR2.1。将克隆的片段使用Applied Biosystem 373A(Applied Biosystems，美国加利福利亚Foster市)的自动测序仪测定序列并通过使用来自序列分析工具Vector NTI(Informax，Frederick，美国马里兰)的序列比对程序ClustalW(European Bioinformatics Institute，英国剑桥)证实预期的序列。来自SEQ ID NO：11第111至1784位碱基的1674bp可读框(GM59678499的全部cDNA序列)示于图1。在引物中导入的便于克隆的限制性位点不包括在所命名的序列中。

表2用于克隆GM59678499cDNA的引物

引物名称	序列	目的	SEQ IDNO：
引物名称	序列	目的	SEQ IDNO：	GM52015943F	GGCGCGCCACCATGGCATCACACTGTGTAATG	正向	14
GM52015943R	CTCGAGTCAGCATTCTATGTTCCGATC	反向	15	GM52015943F	GGCGCGCCACCATGGCATCACACTGTGTAATG	正向	14

实施例2：用于转化的载体构建和产生转基因根

测序在实施例1中产生的全长GM59678499 cDNA并克隆入包含合胞体优选的(线虫诱导的)大豆MTN3启动子(p-47116125)SEQ ID NO：13(USSN 60/899,714，其内容文中使用作为参考)的表达载体。用于转化的选择标记是赋予除草剂ARSENAL(咪唑烟酸(imazepyr)，BASFCorporation，Mount Olive，NJ)抗性的来自拟南芥(Arabidopsis thaliana)的突变乙酰羟酸合酶(AHAS)基因。突变AHAS的表达受拟南芥肌动蛋白2启动子驱动。

表3.包含SEQ ID NO：11的第111至1784位碱基的表达载体

载体	表达载体的组分(启动子::TLNCP)
载体	表达载体的组分(启动子::TLNCP)	pAW322	MTN3::TLNCP基因

使用转基因毛根(hairy root)研究过量表达海藻糖酶样基因赋予胞囊线虫抗性的作用。通过电穿孔将载体pAW322转化入发根农杆菌K599菌株。所转化的农杆菌菌株用于使用已知的方法诱导大豆毛根形成。通过使用未转化的发根农杆菌也产生来自大豆栽培品种Williams 82(SCN易感)和Jack(SCN抗性)的非转基因毛根作为在本测试法中的线虫生长对照。

对用载体转化的转基因毛根和作为对照的来自Williams 82和Jack的非转基因毛根实施测试线虫抗性的生物测试法。从每一双元载体转化产生了几个独立的毛根品系，并将所述品系用于生物测试法。线虫接种后四周，计数每一孔的胞囊数。

构建体pAW322的多个生物重复样本的生物测试法结果显示了在多个转基因品系中胞囊计数的统计学显著性减少(p值＜0.05)和在所测试的大多数转基因品系中减少的胞囊计数的总趋势。

本领域技术人员认识到或将能够确认使用常规实验能够获得文中所述的本发明特定实施方案的许多等同方案。此类等同方案也意在包括于下述权利要求中。

序列表

<110>巴斯福植物科学有限公司

<120>利用海藻糖酶基因赋予植物线虫抗性

<130>PF 58857

<160>15

<170>PatentIn版本3.4

<210>1

<211>557

<212>PRT

<213>大豆(Glycine max)

<400>1

Met Ala Ser His Cys Val Met Ala Val Thr Pro Ser Thr Pro Leu Leu

1 5 10 15

Ser Phe Leu Glu Arg Leu Gln Glu Thr Ala Phe Glu Thr Phe Ala His

20 25 30

Ser Asn Phe Asp Pro Lys Thr Tyr Val Asp Met Pro Leu Lys Ser Ala

35 40 45

Leu Thr Ile Thr Glu Asp Ala Phe Gln Lys Leu Pro Arg Asn Ala Asn

50 55 60

Gly Ser Val Pro Val Glu Asp Leu Lys Arg Phe Ile Glu Ala Tyr Phe

65 70 75 80

Glu Gly Ala Gly Asp Asp Leu Val Tyr Arg Asp Pro Gln Asp Phe Val

85 90 95

Pro Glu Pro Glu Gly Phe Leu Pro Lys Val Asn His Pro Gln Val Arg

100 105 110

Ala Trp Ala Leu Gln Val His Ser Leu Trp Lys Asn Leu Ser Arg Lys

115 120 125

Ile Ser Gly Ala Val Lys Ala Gln Pro Asp Leu His Thr Leu Leu Pro

130 135 140

Leu Pro Gly Ser Val Val Ile Pro Gly Ser Arg Phe Arg Glu Val Tyr

145 150 155 160

Tyr Trp Asp Ser Tyr Trp Val Ile Arg Gly Leu Leu Ala Ser Gln Met

165 170 175

His Asp Thr Ala Lys Ala Ile Val Thr Asn Leu Ile Ser Leu Ile Asp

180 185 190

Lys Tyr Gly Phe Val Leu Asn Gly Ala Arg Ala Tyr Tyr Thr Asn Arg

195 200 205

Ser Gln Pro Pro Leu Leu Ser Ala Met Ile Tyr Glu Ile Tyr Asn Ser

210 215 220

Thr Gly Asp Val Glu Leu Val Lys Arg Ser Leu Pro Ala Leu Leu Lys

225 230 235 240

Glu Tyr Glu Phe Trp Asn Ser Asp Ile His Lys Leu Thr Ile Leu Asp

245 250 255

Ala Gln Gly Cys Thr His Thr Leu Asn Arg Tyr Tyr Ala Lys Trp Asp

260 265 270

Lys Pro Arg Pro Glu Ser Ser Ile Met Asp Lys Ala Ser Ala Ser Asn

275 280 285

Phe Ser Ser Val Ser Glu Lys Gln Gln Phe Tyr Arg Glu Leu Ala Ser

290 295 300

Ala Ala Glu Ser Gly Trp Asp Phe Ser Thr Arg Trp Met Arg Asn Pro

305 310 315 320

Pro Asn Phe Thr Thr Leu Ala Thr Thr Ser Val Ile Pro Val Asp Leu

325 330 335

Asn Ala Phe Leu Leu Gly Met Glu Leu Asn Ile Ala Leu Phe Ala Lys

340 345 350

Val Thr Gly Asp Asn Ser Thr Ala Glu Arg Phe Leu Glu Asn Ser Asp

355 360 365

Leu Arg Lys Lys Ala Met Asp Ser Ile Phe Trp Asn Ala Asn Lys Lys

370 375 380

Gln Trp Leu Asp Tyr Trp Leu Ser Ser Thr Cys Glu Glu Val His Val

385 390 395 400

Trp Lys Asn Glu His Gln Asn Gln Asn Val Phe Ala Ser Asn Phe Val

405 410 415

Pro Leu Trp Met Lys Pro Phe Tyr Ser Asp Thr Ser Leu Val Ser Ser

420 425 430

Val Val Glu Ser Leu Lys Thr Ser Gly Leu Leu Arg Asp Ala Gly Val

435 440 445

Ala Thr Ser Leu Thr Asp Ser Gly Gln Gln Trp Asp Phe Pro Asn Gly

450 455 460

Trp Ala Pro Leu Gln His Met Leu Val Glu Gly Leu Leu Lys Ser Gly

465 470 475 480

Leu Lys Glu Ala Arg Leu Leu Ala Glu Glu Ile Ala Ile Arg Trp Val

485 490 495

Thr Thr Asn Tyr Ile Val Tyr Lys Lys Thr Gly Val Met His Glu Lys

500 505 510

Phe Asp Val Glu His Cys Gly Glu Phe Gly Gly Gly Gly Glu Tyr Val

515 520 525

Pro Gln Thr Gly Phe Gly Trp Ser Asn Gly Val Val Leu Ala Phe Leu

530 535 540

Glu Glu Phe Gly Trp Pro Glu Asp Arg Asn Ile Glu Cys

545 550 555

<210>2

<211>565

<212>PRT

<213>葡萄(Vitis vinifera)

<400>2

Met Ala Val Thr Glu Ala Ser Ser Gln Cys Ser Pro Val Lys Pro Thr

1 5 10 15

Thr Pro Leu Val Thr Phe Leu Asp Arg Leu Gln Glu Thr Ala Phe Lys

20 25 30

Thr Tyr Gly Asn Ser Asp Phe Asp Pro Lys Leu Tyr Val Asp Leu Ser

35 40 45

Leu Lys Phe Asn Leu Ser Asp Thr Glu Glu Ala Phe Lys Lys Leu Pro

50 55 60

Arg Ser Glu Asn Gly Ser Val Ser Val Glu Ile Leu Glu Gly Phe Met

65 70 75 80

Gly Glu Tyr Met Arg Gly Ala Gly Glu Asp Leu Val Glu Val Val Pro

85 90 95

Glu Asp Tyr Val Pro Glu Pro Thr Gly Phe Leu Pro Lys Val Glu Ser

100 105 110

Pro Glu Val Arg Ala Trp Ala Leu Glu Val His Ser Leu Trp Lys Asn

115 120 125

Leu Ser Arg Lys Val Ser Asn Gly Val Arg Asp Arg Pro Asp Leu His

130 135 140

Thr Leu Leu Pro Leu Pro Asn Pro Val Val Ile Pro Gly Ser Arg Phe

145 150 155 160

Arg Glu Val Tyr Tyr Trp Asp Ser Tyr Trp Val Ile Arg Gly Leu Leu

165 170 175

Ala Ser Lys Met His Glu Thr Ala Lys Ala Ile Val Ala Asn Leu Ile

180 185 190

Ser Leu Ile Asp Glu Tyr Gly Tyr Val Leu Asn Gly Ala Arg Ala Tyr

195 200 205

Tyr Ser Asn Arg Ser Gln Pro Pro Leu Leu Ser Ser Met Ile Tyr Glu

210 215 220

Ile Tyr Lys Arg Thr Gly Asp Lys Glu Met Val Arg Lys Ser Leu Pro

225 230 235 240

Ala Leu Leu Lys Glu His Gln Phe Trp Asn Ser Gly Lys His Lys Met

245 250 255

Thr Ile Gln Asp Asp Gln Ala Cys Asn His Thr Leu Ser Arg Tyr Tyr

260 265 270

Ala Met Trp Asp Lys Pro Arg Pro Glu Ser Ser Thr Asn Asp Lys Glu

275 280 285

Ser Ala Ser Lys Ile Leu Asp Ala Ser Glu Lys Gln Gln Phe Tyr Arg

290 295 300

Glu Leu Ala Ser Thr Ala Glu Ser Gly Trp Asp Phe Ser Thr Arg Trp

305 310 315 320

Met Arg Asn Ser Ser Asp Phe Thr Thr Leu Ala Thr Thr Ser Ile Leu

325 330 335

Pro Val Asp Leu Asn Ala Phe Ile Leu Lys Met Glu Leu Asp Ile Ala

340 345 350

Ser Leu Ala Lys Val Ile Gly Glu Asn Thr Ile Ser Glu Arg Phe Val

355 360 365

Glu Ala Ser Gln Gly Arg Lys Lys Ala Met Asp Ser Val Phe Trp Asn

370 375 380

Ala Lys Met Gly Gln Trp Val Asp Tyr Trp Leu Gly Asp Asn Ser Thr

385 390 395 400

Ser Cys Lys Glu Val His Lys Leu Glu Ala Ser Asn Gln Asn Glu Asn

405 410 415

Val Phe Ala Ser Asn Phe Val Pro Leu Trp Ile Glu Leu Phe Asn Ser

420 425 430

Asp Ala Ser Val Val Glu Lys Val Met Glu Ser Phe Gln Ser Ser Gly

435 440 445

Leu Leu Cys Ser Ala Gly Ile Ala Thr Ser Leu Thr Asn Ser Gly Gln

450 455 460

Gln Trp Asp Phe Pro Asn Gly Trp Ala Pro Ile Gln His Met Ile Val

465 470 475 480

Glu Gly Leu Val Arg Ser Gly Leu Lys Glu Ala Arg Leu Met Ala Glu

485 490 495

Asp Ile Ala Met Arg Trp Ile Arg Thr Asn Tyr Ala Ala Tyr Lys Asn

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Thr Ser Thr Met Leu Glu Lys Tyr Asp Val Glu Glu Cys Gly Lys Ile

515 520 525

Gly Gly Gly Gly Glu Tyr Ile Pro Gln Thr Gly Phe Gly Trp Thr Asn

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Gly Val Val Leu Ala Phe Leu Glu Glu Phe Gly Trp Thr Lys Asp Gln

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Lys Leu Asp Cys Gln

565

<210>3

<211>626

<212>PRT

<213>拟南芥(Arabidopsis thaliana)

<400>3

Met Lys Ser Tyr Lys Leu Asn Asn Pro Asn Leu Leu Ile Ser Thr His

1 5 10 15

Thr His Asn Lys Leu Phe Leu Ser Ser Ser Pro Phe Asn Leu Leu Phe

20 25 30

Ser Phe Pro Ser Phe Ile Tyr Leu Lys Gln Gln Arg Ser Leu Phe Phe

35 40 45

Phe Phe Phe Phe Phe Leu Cys Phe Ser Phe Thr Thr Ser Met Leu Asp

50 55 60

Ser Asp Thr Asp Thr Asp Ser Gly Pro Val Val Ala Thr Thr Lys Leu

65 70 75 80

Val Thr Phe Leu Gln Arg Val Gln His Thr Ala Leu Arg Ser Tyr Pro

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Lys Lys Gln Thr Pro Asp Pro Lys Ser Tyr Ile Asp Leu Ser Leu Lys

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Arg Pro Tyr Ser Leu Ser Thr Ile Glu Ser Ala Phe Asp Asp Leu Thr

115 120 125

Ser Glu Ser His Asp Gln Pro Val Pro Val Glu Thr Leu Glu Lys Phe

130 135 140

Val Lys Glu Tyr Phe Asp Gly Ala Gly Glu Asp Leu Leu His His Glu

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Pro Val Asp Phe Val Ser Asp Pro Ser Gly Phe Leu Ser Asn Val Glu

165 170 175

Asn Glu Glu Val Arg Glu Trp Ala Arg Glu Val His Gly Leu Trp Arg

180 185 190

Asn Leu Ser Cys Arg Val Ser Asp Ser Val Arg Glu Ser Ala Asp Arg

195 200 205

His Thr Leu Leu Pro Leu Pro Glu Pro Val Ile Ile Pro Gly Ser Arg

210 215 220

Phe Arg Glu Val Tyr Tyr Trp Asp Ser Tyr Trp Val Ile Lys Gly Leu

225 230 235 240

Met Thr Ser Gln Met Phe Thr Thr Ala Lys Gly Leu Val Thr Asn Leu

245 250 255

Met Ser Leu Val Glu Thr Tyr Gly Tyr Ala Leu Asn Gly Ala Arg Ala

260 265 270

Tyr Tyr Thr Asn Arg Ser Gln Pro Pro Leu Leu Ser Ser Met Val Tyr

275 280 285

Glu Ile Tyr Asn Val Thr Lys Asp Glu Glu Leu Val Arg Lys Ala Ile

290 295 300

Pro Leu Leu Leu Lys Glu Tyr Glu Phe Trp Asn Ser Gly Lys His Lys

305 310 315 320

Val Val Ile Arg Asp Ala Asn Gly Tyr Asp His Val Leu Ser Arg Tyr

325 330 335

Tyr Ala Met Trp Asn Lys Pro Arg Pro Glu Ser Ser Val Phe Asp Glu

340 345 350

Glu Ser Ala Ser Gly Phe Ser Thr Met Leu Glu Lys Gln Arg Phe His

355 360 365

Arg Asp Ile Ala Thr Ala Ala Glu Ser Gly Cys Asp Phe Ser Thr Arg

370 375 380

Trp Met Arg Asp Pro Pro Asn Phe Thr Thr Met Ala Thr Thr Ser Val

385 390 395 400

Val Pro Val Asp Leu Asn Val Phe Leu Leu Lys Met Glu Leu Asp Ile

405 410 415

Ala Phe Met Met Lys Val Ser Gly Asp Gln Asn Gly Ser Asp Arg Phe

420 425 430

Val Lys Ala Ser Lys Ala Arg Glu Lys Ala Phe Gln Thr Val Phe Trp

435 440 445

Asn Glu Lys Ala Gly Gln Trp Leu Asp Tyr Trp Leu Ser Ser Ser Gly

450 455 460

Glu Glu Ser Glu Thr Trp Lys Ala Glu Asn Gln Asn Thr Asn Val Phe

465 470 475 480

Ala Ser Asn Phe Ala Pro Ile Trp Ile Asn Ser Ile Asn Ser Asp Glu

485 490 495

Asn Leu Val Lys Lys Val Val Thr Ala Leu Lys Asn Ser Gly Leu Ile

500 505 510

Ala Pro Ala Gly Ile Leu Thr Ser Leu Thr Asn Ser Gly Gln Gln Trp

515 520 525

Asp Ser Pro Asn Gly Trp Ala Pro Gln Gln Glu Met Ile Val Thr Gly

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Leu Gly Arg Ser Ser Val Lys Glu Ala Lys Glu Met Ala Glu Asp Ile

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Ala Arg Arg Trp Ile Lys Ser Asn Tyr Leu Val Tyr Lys Lys Ser Gly

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Gly Gly Glu Tyr Met Pro Gln Thr Gly Phe Gly Trp Ser Asn Gly Val

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Glu Ala

625

<210>4

<211>566

<212>PRT

<213>拟南芥

<400>4

Met Leu Asp Ser Asp Thr Asp Thr Asp Ser Gly Pro Val Val Ala Thr

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Thr Lys Leu Val Thr Phe Leu Gln Arg Val Gln His Thr Ala Leu Arg

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Ser Tyr Pro Lys Lys Gln Thr Pro Asp Pro Lys Ser Tyr Ile Asp Leu

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Ser Leu Lys Arg Pro Tyr Ser Leu Ser Thr Ile Glu Ser Ala Phe Asp

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Gly Ser Arg Phe Arg Glu Val Tyr Tyr Trp Asp Ser Tyr Trp Val Ile

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Met Val Tyr Glu Ile Tyr Asn Val Thr Lys Asp Glu Glu Leu Val Arg

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Lys Ala Ile Pro Leu Leu Leu Lys Glu Tyr Glu Phe Trp Asn Ser Gly

245 250 255

Lys His Lys Val Val Ile Arg Asp Ala Asn Gly Tyr Asp His Val Leu

260 265 270

Ser Arg Tyr Tyr Ala Met Trp Asn Lys Pro Arg Pro Glu Ser Ser Val

275 280 285

Phe Asp Glu Glu Ser Ala Ser Gly Phe Ser Thr Met Leu Glu Lys Gln

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Leu Asp Ile Ala Phe Met Met Lys Val Ser Gly Asp Gln Asn Gly Ser

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Ile Val Thr Gly Leu Gly Arg Ser Ser Val Lys Glu Ala Lys Glu Met

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Lys Lys Ser Gly Thr Ile His Glu Lys Leu Lys Val Thr Glu Leu Gly

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Glu Tyr Gly Gly Gly Gly Glu Tyr Met Pro Gln Thr Gly Phe Gly Trp

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Ser Asn Gly Val Ile Leu Ala Phe Leu Glu Glu Tyr Gly Trp Pro Ser

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His Leu Ser Ile Glu Ala

565

<210>5

<211557

<212PRT

<213>拟南芥

<400>5

Met Leu Asp Ser Asp Thr Asp Thr Asp Ser Gly Pro Val Val Ala Thr

1 5 10 15

Thr Lys Leu Val Thr Phe Leu Gln Arg Val Gln His Thr Ala Leu Arg

20 25 30

Ser Tyr Pro Lys Lys Gln Thr Pro Asp Pro Lys Ser Tyr Ile Asp Leu

35 40 45

Ser Leu Lys Arg Pro Tyr Ser Leu Ser Thr Ile Glu Ser Ala Phe Asp

50 55 60

Asp Leu Thr Ser Glu Ser His Asp Gln Pro Val Pro Val Glu Thr Leu

65 70 75 80

Glu Lys Phe Val Lys Glu Tyr Phe Asp Gly Ala Gly Glu Asp Leu Leu

85 90 95

His His Glu Pro Val Asp Phe Val Ser Asp Pro Ser Gly Phe Leu Ser

100 105 110

Asn Val Glu Asn Glu Glu Val Arg Glu Trp Ala Arg Glu Val His Gly

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Leu Trp Arg Asn Leu Ser Cys Arg Val Ser Asp Ser Val Arg Glu Ser

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Ala Asp Arg His Thr Leu Leu Pro Leu Pro Glu Pro Val Ile Ile Pro

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Gly Ser Arg Phe Arg Glu Val Tyr Tyr Trp Asp Ser Tyr Trp Val Ile

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Thr Asn Leu Met Ser Leu Val Glu Thr Tyr Gly Tyr Ala Leu Asn Gly

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Phe Asp Glu Glu Ser Ala Ser Gly Phe Ser Thr Met Leu Glu Lys Gln

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Arg Phe His Arg Asp Ile Ala Thr Ala Ala Glu Ser Gly Cys Asp Phe

305 310 315 320

Ser Thr Arg Trp Met Arg Asp Pro Pro Asn Phe Thr Thr Met Ala Thr

325 330 335

Thr Ser Val Val Pro Val Asp Leu Asn Val Phe Leu Leu Lys Met Glu

340 345 350

Leu Asp Ile Ala Phe Met Met Lys Val Ser Gly Asp Gln Asn Gly Ser

355 360 365

Asp Arg Phe Val Lys Ala Ser Lys Ala Arg Glu Lys Ala Phe Gln Thr

370 375 380

Val Phe Trp Asn Glu Lys Ala Gly Gln Trp Leu Asp Tyr Trp Leu Ser

385 390 395 400

Ser Ser Gly Glu Asn Gln Asn Thr Asn Val Phe Ala Ser Asn Phe Ala

405 410 415

Pro Ile Trp Ile Asn Ser Ile Asn Ser Asp Glu Asn Leu Val Lys Lys

420 425 430

Val Val Thr Ala Leu Lys Asn Ser Gly Leu Ile Ala Pro Ala Gly Ile

435 440 445

Leu Thr Ser Leu Thr Asn Ser Gly Gln Gln Trp Asp Ser Pro Asn Gly

450 455 460

Trp Ala Pro Gln Gln Glu Met Ile Val Thr Gly Leu Gly Arg Ser Ser

465 470 475 480

Val Lys Glu Ala Lys Glu Met Ala Glu Asp Ile Ala Arg Arg Trp Ile

485 490 495

Lys Ser Asn Tyr Leu Val Tyr Lys Lys Ser Gly Thr Ile His Glu Lys

500 505 510

Leu Lys Val Thr Glu Leu Gly Glu Tyr Gly Gly Gly Gly Glu Tyr Met

515 520 525

Pro Gln Thr Gly Phe Gly Trp Ser Asn Gly Val Ile Leu Ala Phe Leu

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Glu Glu Tyr Gly Trp Pro Ser His Leu Ser Ile Glu Ala

545 550 555

<210>6

<211>563

<212>PRT

<213>稻(粳型栽培品种组)(Oryza sativa(japonica cultivar-group))

<400>6

Met Ala Pro Thr Ala Ala Val Ala Gly Gly Gly Val Glu Ala Glu Ala

1 5 10 15

Leu Leu Gly Leu Leu Gln Arg Val Gln Ser Glu Ala Leu Arg Ala Phe

20 25 30

Gly Pro Asn Asp Phe Asp Pro Lys Leu Tyr Val Asp Leu Pro Leu Ala

35 40 45

Ala Asp Ala Ser Ala Ala Ala Ala Leu Ala Ser Leu Pro Arg Ala Ala

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65 70 75 80

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130 135 140

Pro Gly Arg Val Val Val Pro Gly Ser Arg Phe Arg Glu Val Tyr Tyr

145 150 155 160

Trp Asp Ser Tyr Trp Val Val Arg Gly Leu Leu Val Ser Lys Met Tyr

165 170 175

Glu Thr Ala Lys Asp Ile Val Leu Asn Leu Val Tyr Leu Val Glu Lys

180 185 190

Tyr Gly Phe Val Leu Asn Gly Ala Arg Ser Tyr Tyr Thr Asn Arg Ser

195 200 205

Gln Pro Pro Leu Leu Ser Ser Met Val Leu Asp Ile Tyr Met Ala Thr

210 215 220

Gly Asp Met Ala Phe Val Arg Arg Val Phe Pro Ser Leu Leu Lys Glu

225 230 235 240

His Ser Phe Trp Met Ser Glu Val His Asn Val Ala Val Met Asp Asn

245 250 255

His Gly Arg Val His Asn Leu Ser Arg Tyr Glu Ala Met Trp Asn Lys

260 265 270

Pro Arg Pro Glu Ser Ala Thr Ile Asp Glu Glu Phe Ala Ser Lys Leu

275 280 285

Ser Thr Ala Ala Lys Glu Lys Phe Tyr His Gln Val Ala Ser Thr Ala

290 295 300

Glu Thr Gly Trp Asp Phe Ser Ser Arg Trp Met Arg Asp Ser Thr Asp

305 310 315 320

Met Thr Thr Leu Thr Thr Ser Cys Ile Ile Pro Val Asp Leu Asn Thr

325 330 335

Phe Ile Leu Lys Met Glu Gln Asp Ile Ala Phe Phe Ala Lys Leu Ile

340 345 350

Gly Glu Ser Thr Thr Ser Glu Ile Phe Ser Glu Ala Ser Lys Ala Arg

355 360 365

His Asn Ala Ile Asp Ser Val Leu Trp Asn Ala Asp Met Glu Gln Trp

370 375 380

Leu Asp Tyr Trp Leu Pro Thr Asp Gly Asn Cys Gln Gly Val Tyr Gln

385 390 395 400

Trp Lys Ser Ile Ser Gln Asn Arg Ala Ile Phe Ala Ser Asn Phe Val

405 410 415

Pro Leu Trp Leu Asn Ala Gln His Ser Gly Leu Glu Gln Phe Val Asp

420 425 430

Glu Ala Lys Ser Val Arg Val Met Arg Ser Leu Gln Lys Ser Gly Leu

435 440 445

Leu Gln Pro Ala Gly Ile Ala Thr Ser Leu Ser Asn Thr Gly Gln Gln

450 455 460

Trp Asp Phe Pro Asn Gly Trp Ala Pro Leu Gln His Leu Ile Val Glu

465 470 475 480

Gly Leu Leu Arg Ser Gly Ser Gly Glu Ala Arg Glu Leu Ala Glu Asp

485 490 495

Ile Ala Thr Arg Trp Val Arg Thr Asn Tyr Asp Ala Tyr Lys Ala Thr

500 505 510

Gly Ala Met His Glu Lys Tyr Asp Val Val Thr Cys Gly Lys Ser Gly

515 520 525

Gly Gly Gly Glu Tyr Lys Pro Gln Thr Gly Phe Gly Trp Ser Asn Gly

530 535 540

Val Ile Leu Ser Phe Leu Asp Glu Phe Gly Trp Pro Gln Asp Lys Lys

545 550 555 560

Ile Asp Cys

<210>7

<211>545

<212>PRT

<213>稻(粳型栽培品种组)

<400>7

Met Ala Pro Thr Ala Ala Val Ala Gly Gly Gly Val Glu Ala Glu Ala

1 5 10 15

Leu Leu Gly Leu Leu Gln Arg Val Gln Ser Glu Ala Leu Arg Ala Phe

20 25 30

Gly Pro Asn Asp Phe Asp Pro Lys Leu Tyr Val Asp Leu Pro Leu Ala

35 40 45

Ala Asp Ala Ser Ala Ala Ala Ala Leu Ala Ser Leu Pro Arg Ala Ala

50 55 60

Pro Ser Arg Gly Glu Met Glu Ala Tyr Ile Ser Arg Tyr Phe Ala Leu

65 70 75 80

Ala Gly Ser Asp Leu Val Ala Ala Ala Asp Pro Pro Asp Phe Glu Arg

85 90 95

Asp Pro Pro Gly Phe Leu Pro Arg Val Glu Arg Ala Glu Ala Arg Ala

100 105 110

Trp Ala Leu Glu Val His Ala Leu Trp Lys Asp Leu Thr Arg Arg Val

115 120 125

Ala Pro Ala Val Ala Ala Arg Pro Asp Arg His Thr Leu Leu Pro Leu

130 135 140

Pro Gly Arg Val Val Val Pro Gly Ser Arg Phe Arg Glu ValT yr Tyr

145 150 155 160

Trp Asp Ser Tyr Trp Val Val Arg Gly Leu Leu Val Ser Lys Met Tyr

165 170 175

Glu Thr Ala Lys Asp Ile Val Leu Asn Leu Val Tyr Leu Val Glu Lys

180 185 190

Tyr Gly Phe Val Leu Asn Gly Ala Arg Ser Tyr Tyr Thr Asn Arg Ser

195 200 205

Gln Pro Pro Leu Leu Ser Ser Met Val Leu Asp Ile Tyr Met Ala Thr

210 215 220

Gly Asp Met Ala Phe Val Arg Arg Val Phe Pro Ser Leu Leu Lys Glu

225 230 235 240

His Ser Phe Trp Met Ser Glu Val His Asn Val Ala Val Met Asp Asn

245 250 255

His Gly Arg Val His Asn Leu Ser Arg Tyr Gln Ala Met Trp Asn Lys

260 265 270

Pro Arg Pro Glu Ser Ala Thr Ile Asp Glu Glu Phe Ala Ser Lys Leu

275 280 285

Ser Thr Ala Ala Lys Glu Lys Phe Tyr His Gln Val Ala Ser Thr Ala

290 295 300

Glu Thr Gly Trp Asp Phe Ser Ser Arg Trp Met Arg Asp Ser Thr Asp

305 310 315 320

Met Thr Thr Leu Thr Thr Ser Cys Ile Ile Pro Val Asp Leu Asn Thr

325 330 335

Phe Ile Leu Lys Met Glu Gln Asp Ile Ala Phe Phe Ala Lys Leu Ile

340 345 350

Gly Glu Ser Thr Thr Ser Glu Ile Phe Ser Glu Ala Ser Lys Ala Arg

355 360 365

His Asn Ala Ile Asp Ser Val Leu Trp Asn Ala Asp Met Glu Gln Trp

370 375 380

Leu Asp Tyr Trp Leu Pro Thr Asp Gly Asn Cys Gln Gly Val Tyr Gln

385 390 395 400

Trp Lys Ser Ile Ser Gln Asn Arg Ala Ile Phe Ala Ser Asn Phe Val

405 410 415

Pro Leu Trp Leu Asn Ala Gln His Ser Gly Leu Glu Gln Phe Val Asp

420 425 430

Glu Ala Lys Ser Val Arg Val Met Arg Ser Leu Gln Lys Ser Gly Leu

435 440 445

Leu Gln Pro Ala Gly Ile Ala Thr Ser Leu Ser Asn Thr Gly Gln Gln

450 455 460

Trp Asp Phe Pro Asn Gly Trp Ala Pro Leu Gln His Leu Ile Val Glu

465 470 475 480

Gly Leu Leu Arg Ser Gly Ser Gly Glu Ala Arg Glu Leu Ala Glu Asp

485 490 495

Ile Ala Thr Arg Trp Val Arg Thr Asn Tyr Asp Ala Tyr Lys Ala Thr

500 505 510

Gly Ala Met His Glu Lys Tyr Asp Val Val Thr Cys Gly Lys Ser Gly

515 520 525

Gly Gly Gly Glu Tyr Lys Pro Gln Val Trp Leu Phe Ser Ser Lys Phe

530 535 540

Lys

545

<210>8

<211>571

<212>PRT

<213>展叶剑叶藓展叶亚种(Physcomitrella patens subsp.patens)

<400>8

Met Val Glu Glu Phe Gly Glu Asp Gly Gly Tyr Gly Glu Gly Val Tyr

1 5 10 15

Asp Asp Gly Ala Gly Glu Leu Leu Cys Phe Leu Met Asp Leu Gln Ser

20 25 30

Thr Ala Met Asp Ser Phe Gly Gly Asp Ala Glu Phe Asp Pro Lys Leu

35 40 45

Tyr Val Asp Leu Pro Leu Lys Ser Thr Leu Lys Glu Thr Val Glu Ala

50 55 60

Phe Arg Ser Leu Pro Arg Ala Pro Ile Thr Gly Ser Val Asp Arg Asp

65 70 75 80

Thr Leu Lys Thr Phe Leu Lys Asp Tyr Phe Gly Glu Thr Gly Ser Asp

85 90 95

Leu Val Pro Tyr Thr Pro Glu Asp His Leu Ala Asn Pro Pro Asp Phe

100 105 110

Leu Pro Arg Val Gln Asn Thr Asp Ala Arg Lys Trp Gly Leu Lys Val

115 120 125

His Ser Leu Trp Pro Ser Leu Thr Arg Leu Val Cys Pro Thr Val Glu

130 135 140

Arg Glu Pro Asp Arg His Thr Leu Leu Pro Leu Lys His Pro Phe Ile

145 150 155 160

Val Pro Gly Glu Arg Phe Arg Glu Val Tyr Tyr Trp Asp Ser Tyr Trp

165 170 175

Val Ile Arg Gly Leu Leu Ala Ser Lys Met Lys Lys Thr Ala Ala Gly

180 185 190

Met Ile Asp Asn Phe Leu Ala Val Val Gln Ala Tyr Gly Phe Leu Pro

195 200 205

Asn Gly Ala Arg Thr Tyr Tyr Glu Asn Arg Ser Gln Pro Pro Phe Leu

210 215 220

Ser Arg Met Val Arg Ala Ile Phe Ser Ala Thr Asp Asp Leu Lys Leu

225 230 235 240

Ala Thr Arg Ala Leu Pro Leu Leu Leu Val Glu His Asp Phe Trp Val

245 250 255

Thr Gly Ser His Val Val Thr Ile Arg Asp Ser Gln Gly Arg Asp His

260 265 270

Arg Leu Ser Arg Tyr Ser Ala His Trp Asp Gln Pro Arg Pro Glu Cys

275 280 285

Ser Thr Ile Asp Lys Cys Ile Ala Gly Gly Phe Ser Lys Leu Lys Gln

290 295 300

Gln Gln Leu Tyr His Asp Ile Ala Thr Ala Ala Glu Ser Gly Trp Asp

305 310 315 320

Phe Ser Ser Arg Trp Met Glu Asp Gln Glu Gln Leu Ser Ser Met Lys

325 330 335

Thr Ser Ser Ile Ile Pro Val Asp Leu Asn Ala Phe Leu Leu Gln Met

340 345 350

Glu Leu Asp Ile Ala Tyr Leu Ala Lys Ala Leu Asn Asn Thr Ser Val

355 360 365

Ala Lys Arg Phe Thr Arg Ala Val Asp Ala Arg Lys Arg Ala Phe Glu

370 375 380

Ala Ile Leu Trp Asn Glu Asn Lys Ser Gln Trp Leu Asp Tyr Trp Leu

385 390 395 400

Pro Leu Gln Lys Pro Lys Ile Tyr Met Trp Asp Ser Asp Arg Ala Asn

405 410 415

Gln Asn Val Tyr Ala Ser Asn Phe Val Pro Leu Trp Cys Gly Leu Leu

420 425 430

Ser Ala Ala Gly Asp Ala Lys Ile Asp Lys Val Val Glu Ala Leu Ser

435 440 445

Ser Ser Gly Leu Ile Leu Pro Gly Gly Ile Ala Thr Ser Leu Ile Lys

450 455 460

Thr Gly Gln Gln Trp Asp Phe Pro Asn Ala Trp Ala Pro Leu Gln His

465 470 475 480

Met Leu Ile Glu Gly Leu Ile Leu Ser Gly Ser Pro Lys Ala Arg Glu

485 490 495

Leu Ala Glu Ser Ile Thr Arg Ser Trp Leu Arg Ser Asn Tyr Leu Ala

500 505 510

Phe Gln Arg Phe Gly His Met Val Glu Lys Tyr Asp Ala Arg Tyr Cys

515 520 525

Gly Glu Val Gly Gly Gly Gly Glu Tyr Ile Thr Gln Thr Gly Phe Gly

530 535 540

Trp Thr Asn Gly Val Val Leu Thr Leu Leu Asn Asp Tyr Gly Trp Pro

545 550 555 560

Glu Asp Leu Pro Leu Asp Phe Asp Tyr Lys Ser

565 570

<210>9

<211>544

<212>PRT

<213>展叶剑叶藓展叶亚种

<400>9

Met Gly Ser Phe Gly Gly Gly Pro Glu Phe Asp Pro Lys Leu Tyr Val

1 5 10 15

Asp Leu Pro Leu Thr Thr Ser Leu Glu Glu Thr Glu Ala Ala Phe Gly

20 25 30

Ser Leu Pro Arg Cys Pro Thr Ser Gly Ser Val Glu Lys Asp Thr Leu

35 40 45

Lys Ala Phe Leu Lys Val Tyr Phe Ser Glu Ala Gly Ser Asp Leu Ile

50 55 60

Pro Tyr Thr Pro Val Asp His Leu Asp Asn Pro Pro Asp Phe Leu Pro

65 70 75 80

Gly Val Arg Asn Ala Asp Ala Arg Asp Trp Gly Leu Lys Val His Ser

85 90 95

Leu Trp Pro Ser Leu Thr Arg Leu Val Ser Pro Ala Val Glu Arg Glu

100 105 110

Pro Asp Gln His Thr Leu Leu Pro Leu Lys Tyr Pro Phe Leu Val Pro

115 120 125

Gly Glu Arg Phe Arg Glu Val Tyr Tyr Trp Asp Ser Tyr Trp Val Ile

130 135 140

Arg Gly Leu Leu Ala Ser Lys Met Thr Glu Thr Ala Ala Gly Met Val

145 150 155 160

Asp Asn Phe Leu Ser Ile Val Gln Ala Tyr Gly Phe Phe Pro Asn Gly

165 170 175

Thr Arg Thr Tyr Tyr Glu Asn Arg Ser Gln Pro Pro Phe Leu Ser Arg

180 185 190

Met Val Arg Ala Ile Phe Ser Glu Thr Gly Asp Leu Gly Leu Val Ala

195 200 205

Arg Ala Leu Pro Ile Leu Lys Val Glu Tyr Glu Phe Trp Thr Thr Asp

210 215 220

Ser His Ala Val Ser Ile Arg Asp Gly Gln Gly Arg Val His Arg Leu

225 230 235 240

Ser Arg Tyr Ile Ala His Trp Asp Gln Pro Arg Pro Glu Cys Ser Thr

245 250 255

Ile Asp Lys Ser Ile Ala Gly Gly Phe Ser Lys Phe Lys Gln Gln Gln

260 265 270

Ile Tyr Arg Asp Ile Ala Thr Ala Ala Glu Ser Gly Trp Asp Phe Ser

275 280 285

Ser Arg Trp Met Glu Asp Ser Glu Gln Leu Ser Ser Leu Lys Thr Ser

290 295 300

Ser Ile Val Pro Val Asp Leu Asn Ala Phe Leu Leu Gln Met Glu Leu

305 310 315 320

Asp Ile Ala Phe Leu Ala Lys Thr Leu Asn Glu Thr Gln Asp Ala Lys

325 330 335

Arg Phe Thr Arg Ala Ala Asp Ala Arg Arg Arg Ala Phe Glu Ala Ile

340 345 350

Leu Trp Asn Glu Asn Arg Cys Gln Trp Leu Asp Tyr Trp Leu Pro Ser

355 360 365

Gln Lys Ser Val Gln Gly Gly Lys Tyr Leu Tyr Met Trp Asp Ser Ser

370 375 380

Arg Ser Asn Arg Asn Thr Tyr Ala Ser Asn Phe Val Pro Leu Trp Gys

385 390 395 400

Gly Val Leu Pro Pro Gly Asp Ala Lys Ile Asp Gln Val Val Glu Ala

405 410 415

Leu Ser Gly Ser Gly Leu Val Met Pro Gly Gly Ile Ala Thr Ser Leu

420 425 430

Val Glu Thr Gly Gln Gln Trp Asp Phe Pro Asn Ala Trp Ala Pro Leu

435 440 445

Gln His Met Ile Ile Glu Gly Leu Val Leu Ser Ala Ser Pro Lys Ala

450 455 460

Lys Ala Met Ala Glu Ser Ile Thr Arg Ser Trp Leu Arg Ser Asn Tyr

465 470 475 480

Val Ala Tyr Gln Arg Val Gly His Met Val Glu Lys Tyr Asp Ala Arg

485 490 495

Tyr Cys Gly Glu Val Gly Gly Gly Gly Glu Tyr Ile Thr Gln Thr Gly

500 505 510

Phe Gly Trp Thr Asn Gly Val Val Leu Thr Leu Leu Asn Asp Tyr Gly

515 520 525

Trp Pro Glu Asp Val Pro Leu Asp Cys Asp Cys Glu Ser Leu Gln Leu

530 535 540

<210>10

<211>515

<212>PRT

<213>稻(籼型栽培品种组)(Oryza sativa(indica cultivar-group))

<400>10

Met Ala Pro Thr Ala Ala Val Ala Gly Gly Gly Val Glu Ala Glu Ala

1 5 10 15

Leu Leu Gly Leu Leu Gln Arg Val Gln Ser Glu Ala Leu Arg Ala Phe

20 25 30

Gly Pro Asn Asp Phe Asp Pro Lys Leu Tyr Val Asp Leu Pro Leu Ala

35 40 45

Ala Asp Ala Ser Ala Ala Ala Ala Leu Ala Ser Leu Pro Arg Ala Ala

50 55 60

Pro Ser Arg Gly Glu Met Glu Ala Tyr Ile Ser Arg Tyr Phe Ala Leu

65 70 75 80

Ala Gly Ser Asp Leu Val Ala Ala Ala Asp Pro Pro Asp Phe Glu Arg

85 90 95

Asp Pro Pro Gly Phe Leu Pro Arg Val Glu Arg Ala Glu Ala Arg Ala

100 105 110

Trp Ala Leu Glu Val His Ala Leu Trp Lys Asp Leu Thr Arg Arg Val

115 120 125

Ala Pro Ala Val Ala Ala Arg Pro Asp Arg His Thr Leu Leu Pro Leu

130 135 140

Pro Gly Arg Val Val Val Pro Gly Ser Arg Phe Arg Glu Val Tyr Tyr

145 150 155 160

Trp Asp Ser Tyr Trp Val Val Arg Gly Leu Leu Val Ser Lys Met Tyr

165 170 175

Glu Thr Ala Lys Asp Ile Val Leu Asn Leu Val Tyr Leu Val Glu Lys

180 185 190

Tyr Gly Phe Val Leu Asn Gly Ala Arg Ser Tyr Tyr Thr Asn Arg Ser

195 200 205

Gln Pro Pro Leu Leu Ser Ser Met Val Leu Asp Ile Tyr Met Ala Thr

210 215 220

Gly Asp Met Ala Phe Val Arg Arg Asp Glu Glu Phe Ala Ser Lys Leu

225 230 235 240

Ser Thr Ala Ala Lys Glu Lys Phe Tyr His Gln Val Ala Ser Thr Ala

245 250 255

Glu Thr Gly Trp Asp Phe Ser Ser Arg Trp Met Arg Asp Ser Thr Asp

260 265 270

Met Thr Thr Leu Thr Thr Ser Cys Ile Ile Pro Val Asp Leu Asn Thr

275 280 285

Phe Ile Leu Lys Met Glu Gln Asp Ile Ala Phe Phe Ala Lys Leu Ile

290 295 300

Gly Glu Ser Thr Thr Ser Glu Ile Phe Ser Glu Ala Ser Lys Ala Arg

305 310 315 320

His Asn Ala Ile Asp Ser Val Leu Trp Asn Ala Asp Met Glu Gln Trp

325 330 335

Leu Asp Tyr Trp Leu Pro Thr Asp Gly Asn Cys Gln Gly Val Tyr Gln

340 345 350

Trp Lys Ser Ile Ser Gln Asn Arg Ala Ile Phe Ala Ser Asn Phe Val

355 360 365

Pro Leu Trp Leu Asn Ala Gln His Ser Gly Leu Glu Gln Phe Val Asp

370 375 380

Glu Ala Lys Ser Val Arg Val Met Arg Ser Leu Gln Lys Ser Gly Leu

385 390 395 400

Leu Gln Pro Ala Gly Ile Ala Thr Ser Leu Ser Asn Thr Gly Gln Gln

405 410 415

Trp Asp Phe Pro Asn Gly Trp Ala Pro Leu Gln His Leu Ile Val Glu

420 425 430

Gly Leu Leu Arg Ser Gly Ser Gly Glu Ala Arg Glu Leu Ala Glu Asp

435 440 445

Ile Ala Thr Arg Trp Val Arg Thr Asn Tyr Asp Ala Tyr Lys Ala Thr

450 455 460

Gly Ala Met His Glu Lys Tyr Asp Val Val Thr Cys Gly Lys Ser Gly

465 470 475 480

Gly Gly Gly Glu Tyr Lys Pro Gln Thr Gly Phe Gly Trp Ser Asn Gly

485 490 495

Val Ile Leu Ser Phe Leu Asp Glu Phe Gly Trp Pro Gln Asp Lys Lys

500 505 510

Ile Asp Cys

515

<210>11

<211>2060

<212>DNA

<213>大豆

<400>11

gcaataataa accaatgaca acagagttgg ggtagaacta gaaagcatcc ctagcaaaag 60

tcaaggttgg ccccttgcgt caatcgccgg cttcgaaatc gctgtcaatt atggcatcac 120

actgtgtaat ggccgtgacg ccctcaaccc ctcttctctc cttcctcgaa cgcctccaag 180

aaacagcctt cgaaaccttc gcccattcca acttcgatcc caaaacctac gtggacatgc 240

ctctcaagtc cgccctcacg gttaccgagg acgcgttcca gaagcttccg aggaacgcca 300

acgggtccgt gccggttgag gatttgaagc gtttcataga ggcctacttt gaaggtgcag 360

gggatgatct ggtgtaccgg gacccacagg atttcgttcc cgagccggag ggtttcttgc 420

ccaaggtgaa ccaccctcag gttagggcct gggccttgca ggtccattca ctttggaaaa 480

acttgagccg gaaaatatcc ggtgcggtga aggcacagcc agacttacat acgctgctcc 540

ctctccctgg ttcggttgtc attcccgggt cgcgttttcg cgaggtttat tactgggatt 600

cctattgggt tattaggggc ctgctggcca gtcaaatgca tgacacagct aaggctattg 660

tcaccaatct catttccttg atagataaat atggctttgt tcttaatggg gctagagctt 720

actacactaa caggagccag cctccccttt taagcgccat gatttatgag atatacaata 780

gcacgggtga cgtggaatta gttaaaagat ctctacctgc cttactgaaa gaatatgaat 840

tttggaattc agatatacat aaactgacca ttttggatgc tcaaggttgc actcatacct 900

taaatcgtta ttatgcaaag tgggacaaac ccaggccgga atcgtccata atggacaagg 960

catctgcttc caacttctcc agtgtttcag aaaaacagca gttttaccgt gaactggcat 1020

cagctgctga atcaggatgg gatttcagca ccagatggat gagaaatcca cctaatttca 1080

caacattggc tacaacatct gtaatacctg ttgatttgaa cgcatttcta ctcgggatgg 1140

aacttaatat tgccttattt gcaaaagtta ctggagataa tagcactgct gaacggttcc 1200

tggaaaattc tgatcttaga aagaaggcaa tggactctat tttctggaat gcaaacaaga 1260

aacagtggct tgattactgg ctcagcagta catgtgagga ggttcatgtt tggaaaaacg 1320

agcatcagaa tcaaaatgta tttgcttcca attttgttcc tttgtggatg aagccatttt 1380

actcagatac ttcgcttgtg agtagtgttg ttgaaagtct caaaacatct ggcctgctcc 1440

gtgatgctgg agttgcaact tctttgactg attcagggca acagtgggac tttccaaatg 1500

ggtgggcgcc gcttcaacac atgctagtgg aaggactgct aaaatcagga ttgaaagaag 1560

caaggttatt ggctgaggaa attgccatca gatgggtcac aaccaattat attgtttata 1620

agaaaacagg tgtaatgcat gaaaagtttg acgtggagca ttgtggagaa tttggaggtg 1680

ggggcgaata tgtaccccag actggttttg gctggtcaaa tggagttgtg ttggcattct 1740

tggaggagtt tggatggcct gaagatcgga acatagaatg ctgatgtgcc cagagataga 1800

aaggtggaaa aaatttggta cgctgcaaga atttattcat gaaagctatt tgcatgaggg 1860

gttgaagaaa agtagttaat aaatgcgtca aaagccactt gttaaagcct ataatgaaag 1920

ttgagatgat ttgagtttat tactttattt gccatttgat gttttacttg gaagtatgtt 1980

cagaaaattc aacaaaagtg atggatgtca tcacatatca atgctttggc acaaattgat 2040

gcaaaaaaaa aaaaaaaaaa 2060

<210>12

<211>557

<212>PRT

<213>大豆

<400>12

Met Ala Ser His Cys Val Met Ala Val Thr Pro Ser Thr Pro Leu Leu

1 5 10 15

Ser Phe Leu Glu Arg Leu Gln Glu Thr Ala Phe Glu Thr Phe Ala His

20 25 30

Ser Asn Phe Asp Pro Lys Thr Tyr Val Asp Met Pro Leu Lys Ser Ala

35 40 45

Leu Thr Val Thr Glu Asp Ala Phe Gln Lys Leu Pro Arg Asn Ala Asn

50 55 60

Gly Ser Val Pro Val Glu Asp Leu Lys Arg Phe Ile Glu Ala Tyr Phe

65 70 75 80

Glu Gly Ala Gly Asp Asp Leu Val Tyr Arg Asp Pro Gln Asp Phe Val

85 90 95

Pro Glu Pro Glu Gly Phe Leu Pro Lys Val Asn His Pro Gln Val Arg

100 105 110

Ala Trp Ala Leu Gln Val His Ser Leu Trp Lys Asn Leu Ser Arg Lys

115 120 125

Ile Ser Gly Ala Val Lys Ala Gln Pro Asp Leu His Thr Leu Leu Pro

130 135 140

Leu Pro Gly Ser Val Val Ile Pro Gly Ser Arg Phe Arg Glu Val Tyr

145 150 155 160

Tyr Trp Asp Ser Tyr Trp Val Ile Arg Gly Leu Leu Ala Ser Gln Met

165 170 175

His Asp Thr Ala Lys Ala Ile Val Thr Asn Leu Ile Ser Leu Ile Asp

180 185 190

Lys Tyr Gly Phe Val Leu Asn Gly Ala Arg Ala Tyr Tyr Thr Asn Arg

195 200 205

Ser Gln Pro Pro Leu Leu Ser Ala Met Ile Tyr Glu Ile Tyr Asn Ser

210 215 220

Thr Gly Asp Val Glu Leu Val Lys Arg Ser Leu Pro Ala Leu Leu Lys

225 230 235 240

Glu Tyr Glu Phe Trp Asn Ser Asp Ile His Lys Leu Thr Ile Leu Asp

245 250 255

Ala Gln Gly Cys Thr His Thr Leu Asn Arg Tyr Tyr Ala Lys Trp Asp

260 265 270

Lys Pro Arg Pro Glu Ser Ser Ile Met Asp Lys Ala Ser Ala Ser Asn

275 280 285

Phe Ser Ser Val Ser Glu Lys Gln Gln Phe Tyr Arg Glu Leu Ala Ser

290 295 300

Ala Ala Glu Ser Gly Trp Asp Phe Ser Thr Arg Trp Met Arg Asn Pro

305 310 315 320

Pro Asn Phe Thr Thr Leu Ala Thr Thr Ser Val Ile Pro Val Asp Leu

325 330 335

Asn Ala Phe Leu Leu Gly Met Glu Leu Asn Ile Ala Leu Phe Ala Lys

340 345 350

Val Thr Gly Asp Asn Ser Thr Ala Glu Arg Phe Leu Glu Asn Ser Asp

355 360 365

Leu Arg Lys Lys Ala Met Asp Ser Ile Phe Trp Asn Ala Asn Lys Lys

370 375 380

Gln Trp Leu Asp Tyr Trp Leu Ser Ser Thr Cys Glu Glu Val His Val

385 390 395 400

Trp Lys Asn Glu His Gln Asn Gln Asn Val Phe Ala Ser Asn Phe Val

405 410 415

Pro Leu Trp Met Lys Pro Phe Tyr Ser Asp Thr Ser Leu Val Ser Ser

420 425 430

Val Val Glu Ser Leu Lys Thr Ser Gly Leu Leu Arg Asp Ala Gly Val

435 440 445

Ala Thr Ser Leu Thr Asp Ser Gly Gln Gln Trp Asp Phe Pro Asn Gly

450 455 460

Trp Ala Pro Leu Gln His Met Leu Val Glu Gly Leu Leu Lys Ser Gly

465 470 475 480

Leu Lys Glu Ala Arg Leu Leu Ala Glu Glu Ile Ala Ile Arg Trp Val

485 490 495

Thr Thr Asn Tyr Ile Val Tyr Lys Lys Thr Gly Val Met His Glu Lys

500 505 510

Phe Asp Val Glu His Cys Gly Glu Phe Gly Gly Gly Gly Glu Tyr Val

515 520 525

Pro Gln Thr Gly Phe Gly Trp Ser Asn Gly Val Val Leu Ala Phe Leu

530 535 540

Glu Glu Phe Gly Trp Pro Glu Asp Arg Asn Ile Glu Cys

545 550 555

<210>13

<211>609

<212>DNA

<213>大豆

<400>13

gaagccacgt catgaagagt atatcatttc agtaatgttt tgagacgcct ctataatgct 60

ttaccaacaa aacaaaacaa aaaaaagaac atttgaaacc atttgtatta aaaaaaaaaa 120

ggtatattag gccataatat tataggtaac atgaaatatc aaatgacacg caagagtttt 180

gtcaaaaatg aaaccatcac acatcagaga ttatggcaaa taatgttttg tgtgtctctt 240

gcttcaccca taacataagc ctctataact ggagagaaga aaaaaaaaag tggaggggct 300

agggtgggaa tttggaagaa tacagttata ttgagcattg agcaagttga tagaaagctt 360

ctcaatttgt acaaaatttg catccacatg attattaaag acgtagacag cacttcttcc 420

ttcttttttt ctataagttt cttatatatt gttcttcatg ttttaatatt attactttat 480

gtacgcgtct aacagtagtc ctcccaaact gctataaata gagcctcttc aacgcacctc 540

ttggcagtac aaaaattatt catctcttct aagttctaat tttctaagca ttcagtaaaa 600

gaac taacc 609

<210>14

<211>32

<212>DNA

<213>大豆

<400>14

ggcgcgccac catggcatca cactgtgtaa tg 32

<210>15

<211>27

<212>DNA

<213>大豆

<400>15

ctcgagtcag cattctatgt tccgatc 27

Claims

1.用表达载体转化的转基因植物，所述表达载体包含分离的编码海藻糖酶的多核苷酸，其中多核苷酸的表达赋予植物提高的线虫抗性。

2.权利要求1的植物，其中所述编码海藻糖酶的多核苷酸选自：

a)具有SEQ ID NO：11所示序列的多核苷酸；

c)与具有SEQ ID NO：11所示序列的多核苷酸具有至少70％序列同一性的多核苷酸；

d)多核苷酸，其编码的多肽与具有SEQ ID NO：1、2、3、4、5、6、7、8、9、10或12所示序列的多肽具有至少70％的序列同一性；

f)多核苷酸，其在严格条件下杂交至具有SEQ ID NO：1、2、3、4、5、6、7、8、9、10或12所示序列的多核苷酸；

其中所述经转化的植物显示出与植物的野生型品种相比较的对植物病原体线虫提高的抗性。

3.权利要求2的植物，其中所述多核苷酸具有SEQ ID NO：11所示的序列。

4.权利要求2的植物，其中所述多核苷酸编码具有SEQ ID NO：1、2、3、4、5、6、7、8、9、10或12所示序列的多肽。

5.权利要求1的植物，其进一步定义为单子叶植物。

6.权利要求1的植物，其进一步定义为双子叶植物。

7.种子，其对于包含编码海藻糖酶的多核苷酸的转基因是纯合的，其中所述多核苷酸的表达赋予从所述种子产生的植物提高的线虫抗性。

8.权利要求7的种子，其中所述多核苷酸选自：

a)具有SEQ ID NO：11所示序列的多核苷酸；

d) 编码与具有SEQ ID NO：1、2、3、4、5、6、7、8、9、10或12所示序列的多肽具有至少70％序列同一性的多肽的多核苷酸；

c)多核苷酸，其在严格条件下杂交至具有SEQ ID NO：11所示序列的多核苷酸；和

9.表达载体，其包含有效连接至选自以下多核苷酸的启动子：

a)具有SEQ ID NO：11所示序列的多核苷酸；

d)多核苷酸，其编码的多肽与SEQ ID NO：1、2、3、4、5、6、7、8、9、10或12所示的多肽序列具有至少70％的序列同一性；

10.权利要求9的表达载体，其中启动子调节所述多核苷酸的根特异性表达。

11.权利要求9的表达载体，其中启动子调节所述多核苷酸的合胞体特异性表达。

12.在植物中提高线虫抗性的方法，其中所述方法包括步骤：

a)将表达载体导入植物，所述表达载体包含能够赋予植物提高的线虫抗性的编码海藻糖酶的多核苷酸；和

b)选择具有提高的线虫抗性的转基因植物。

13.权利要求12的方法，其中所述植物是单子叶植物。

14.权利要求13的方法，其中所述植物选自玉米、小麦、稻、大麦、燕麦、黑麦、高梁、香蕉和黑麦草。

15.权利要求12的方法，其中所述植物是双子叶植物。

16.权利要求15的方法，其中所述植物选自豌豆、苜蓿、大豆、胡萝卜、芹菜、番茄、马铃薯、棉花、烟草、辣椒、油籽油菜、甜菜、甘蓝、花椰菜、绿花椰菜、莴苣和拟南芥(Arabidopsis thaliana)。

17.权利要求16的方法，其中所述植物是大豆。

18.权利要求12的方法，其中所述启动子调节编码海藻糖酶的多核苷酸的根特异性表达。

19.权利要求12的方法，其中所述启动子调节编码海藻糖酶的多核苷酸的合胞体特异性表达。

20.权利要求12的方法，其中所述多核苷酸具有SEQ ID NO：11所示的序列。

21.权利要求12的方法，其中所述多核苷酸编码具有SEQ ID NO：1、2、3、4、5、6、7、8、9、10或12所示序列的多肽。