CN101622355B - 线虫可诱导的植物MtN3-样基因启动子和调节元件 - Google Patents

Abstract

本发明提供了启动子多核苷酸，其是根优选的和/或被寄生线虫诱导。本发明的启动子多核苷酸可用于控制植物根中目的核酸的表达。

Description

线虫可诱导的植物MtN3-样基因启动子和调节元件

相关申请的参考

本申请要求2007年2月6日提交的美国临时申请序号60/899714的优先权。

发明领域

本申请涉及启动子和调节元件序列，其调节类似于MtN3-样基因的基因的转录。本发明的MtN3样基因的启动子可用于控制任一目的核酸在植物根中的转录。尤其，本发明的启动子可以用来控制编码物质的核酸转录，其中所述的物质破坏采食部位的形成或维持、破坏植物寄生线虫的生长和/或繁殖，赋予或改善植物对植物寄生线虫的抗性或毒害植物寄生线虫以减少作物破坏。

发明背景

线虫是以超过2,000种行栽作物、蔬菜、水果和观赏植物的根、叶及茎为食，造成世界范围估计一千亿美元作物损失的微小线虫。多种寄生线虫物种感染作物植物，包括根癌线虫(RKN)、形成胞囊及形成损伤的线虫。以造成采食部位处根瘿形成为特征的根癌线虫具有相对广泛的宿主范围并且因此对种类繁多的作物物种致病。形成胞囊和形成损伤的线虫物种具有更有限的宿主范围，不过依旧在易感作物中造成巨大损失。

致病性线虫存在于美国各地，在南部和西部的温暖湿润地区及在沙壤土中密度最大。大豆植物的最严重病虫-大豆胞囊线虫(Heterodera glycines)在1954年首次于美国的北卡莱罗纳州发现。某些地区严重遭受大豆胞囊线虫(SCN)侵染，以至于不采用控制措施，则大豆生产不再可能是经济的。尽管大豆是受SCN侵袭的主要经济作物，然而SCN寄生总计约50种宿主，包括大田作物、蔬菜、观赏植物和杂草。

线虫损伤的迹象包括在炎热时期矮化与叶子发黄及植物萎蔫。然而，线虫侵染可以引起严重产量损失，而无任何明显的地上部分发病症状。产量减少的主要原因归咎于地下的根损伤。受SCN感染的根矮缩或矮化。线虫侵染也可以减少根上固氮结节的数目，并且可以使根更易受其他土源性植物病原体侵袭。

线虫的生命周期具有三个主要阶段：卵、幼体和成体。该生命周期在线虫物种之间不同。例如，SCN的生命周期在最适条件下通常可以于24-30日内完成，而其他物种可能经过长达一年或更长时间以完成生命周期。当温度和湿度水平在春季变得适宜时，蠕虫形状的幼体在土壤中从卵孵化出来。仅幼体发育阶段的线虫能够感染大豆根。

SCN的生命周期已经成为众多研究的主题，并且因此是理解线虫生命周期的有用实例。在穿透大豆根后，SCN幼体通过根移动直至它们接触维管组织，此时SCN幼体停止迁移并开始采食。借助口针，线虫注射了调节某些根细胞并将它们转化成特化采食部位的分泌物。这些根细胞在形态学上转化成巨大的多核合胞体(或在RKN情况中为巨大细胞)，这种合胞体被用作线虫的营养物来源。主动采食的线虫因此从植物窃取重要的营养物，导致产量损失。当雌性线虫采食时，它们膨胀并逐渐变得如此巨大，以至于它们的身体突破根组织并暴露在根的表面。

在采食一段时间后，作为成体不膨胀的雄性SCN线虫从根迁移至土壤内并使膨大的雌性成体受精。雄性线虫随后死亡，而雌性线虫仍与根系统附着并继续采食。膨大雌性线虫中的卵开始发育，最初在身体外的团块或卵囊(a mass or egg sac)中并随后在线虫体腔内发育。雌性成体的整个体腔最终充满卵，并且雌线虫死亡。正是充满卵的死亡雌线虫身体才称作胞囊。胞囊逐渐释放并游离存在于土壤中。胞囊的璧变得极坚韧，从而为胞囊内所含大约200-400粒卵提供良好的保护作用。SCN卵在胞囊内存活直至适宜的孵化条件出现。尽管众多的卵可以在头一年中孵化，然而很多卵也会在保护性胞囊内存活几年。

线虫可以依赖其自身力量在土壤中每年穿行仅几英寸。然而，线虫侵染可以在多种方式下传播相当远的距离。可以移动受侵染土壤的任何事物，包括农场机械、车辆和工具、风、水、动物和农场工人，能够传播这种侵染。种子大小的土壤颗粒往往污染收获的种子。因此，当来自受侵染田地的污染种子在非侵染田地中播种时，可以传播线虫侵染。存在某些线虫可以通过鸟类传播的证据。仅可以预防这些病因中的某些病因。

防治线虫侵染的常规方法包括：在线虫侵染的土地中保持合理的土壤养分和土壤pH水平；控制其他的植物疾病以及昆虫与杂草病害；使用消毒措施，如仅在处理线虫非侵染田地后才翻耕、播种和中耕线虫侵染的田地；在侵染的田地中工作后用高压水或蒸汽彻底清洁设备；不使用在侵染田地中生长的种子播种非侵染田地，除非这种种子已经得到正确地清洁；轮作受侵染田地并且用非宿主作物替换宿主作物；使用杀线虫剂；和播种抗性植物品种。

已经提出方法用于遗传转化植物以便赋予增加的植物寄生线虫抗性。美国专利号5,589,622和5,824,876涉及线虫附着后在植物采食部位内或其附近特异性表达的植物基因的鉴定。美国专利号5,589,622和5,824,876披露了从马铃薯金线虫(Globodera rostochiensis)感染的马铃薯根分离的8种启动子；没有披露来自其他植物物种的线虫诱导型启动子。据称这些启动子可用于指导有毒蛋白或酶特异性表达或指导针对靶基因或针对一般细胞基因的反义RNA的表达。

美国专利号5,023,179披露命名为ASF-1的分离自CaMV启动子的启动子增强元件，据称其增强植物基因在根中的表达。

美国专利号5,750,386披露烟草(Nicotiana tabacum)RB7根特异性启动子的缺失片段，据称其具有线虫应答性。

美国专利号5,837,876披露从烟草分离并命名为TobRD2的根皮层特异性基因启动子。

美国专利号5,866,777披露了推迟线虫采食结构形成的双基因方法。第一个基因-芽孢杆菌RNA酶基因处于驱动至少在采食结构中表达的启动子控制下。第二个基因-芽孢杆菌RNA酶抑制剂基因处于驱动在除所述采食结构之外的全部植物细胞中表达的启动子控制下。美国专利号5,866,777中披露的采食部位特异性启动子包括截短形式的Δ0.3TobRB7和rolC启动子。

美国专利号5,955,646披露了基于源自根癌农杆菌(Agrobacteriumtumefaciens)甘露氨酸合酶基因和章鱼碱合酶基因的启动子的嵌合调节区，据称其具有线虫诱导性。

美国专利号6,005,092披露了烟草内切-1，4-β-葡聚糖酶(Ntce17)启动子。

美国专利号6,262,344和6,395,963披露了从拟南芥分离的启动子，据称其具有线虫诱导性。

美国专利号6,448,471披露了来自拟南芥的启动子，其对线虫采食部位是特异性的。

美国专利号6,703,541披露了玉米过氧化物酶P7×基因及其启动子的克隆与分离，所述启动子据称是线虫诱导型的。

美国专利号6,593,513披露了用拟南芥内切-1，4-β-葡聚糖酶基因(cel1)启动子控制下的芽孢杆菌RNA酶转化植物以产生能够破坏线虫侵袭的植物。

美国专利号6,906,241披露了与编码杀线虫或杀昆虫蛋白质的异源核酸组合的Ntce17启动子。

美国专利号7,078,589披露大豆Pyk20基因和启动子的克隆与分离，所述启动子据称将受SCN感染诱导并在维管组织中显示强烈活性。

美国专利申请公开号2003/0167507披露了大豆异黄酮合酶I启动子，据称其是根特异性的并且在寄生虫侵袭的营养组织中可诱导。

美国专利申请公开号2004/0078841披露拟南芥TUB-1、RPL16A及ARSK1启动子和来自豌豆(Pisum sativum)的PSMT_A启动子的启动子区，所述全部启动子区据称是根特异性的。

美国专利申请公开号2004/0029167披露了来自烟草的II类咖啡酸O-甲基转移酶基因的启动子序列，据称所述启动子序列可应答于机械性或化学性损伤或应答于致病体入侵而诱导。

美国专利申请公开号2005/0262585披露了大豆磷酸核糖甲酰甘氨脒核糖核苷酸合酶的启动子及其缺失片段，据称它们应答于线虫感染。

WO 94/10320披露了来自烟草的Δ0.3TobRB7启动子片段及其与多种基因一起用于线虫采食细胞特异性表达。

WO 03/033651披露了命名为SCP1、UCP3和SUP的合成的线虫调节型启动子序列。

WO 2004/029222及其美国同族专利-美国专利申请公开号2005/0070697披露了来自大豆腺苷-5′-磷酸脱氨酶和肌醇-5-磷酸酶基因的调节区，用于提高植物中的线虫抗性。

上文提及的根特异性或采食部位特异性启动子目前均未用在含有抗线虫转基因的商品种子中。虽然对这类产品的需求久已承认，然而迄今无人成功通过重组DNA技术开发抗线虫植物。持续需求根特异性和/或线虫采食部位特异性启动子以与编码毒害植物寄生线虫物质的转基因组合。

发明概述

本发明提供了启动子多核苷酸，其适于用于在易受线虫侵袭的植物根中驱动核酸的表达。本发明的启动子尤其可用于制备抗线虫侵袭的农作物植物。

在另一实施方案中，本发明提供了启动子，其包含能够介导根特异性和/或线虫诱导型表达的启动子多核苷酸，其中该启动子多核苷酸选自如下多核苷酸组成的组：a)具有如SEQ ID NO：1、2或3中所示序列的多核苷酸；b)包含具有如SEQ ID NO：1中所示序列的多核苷酸的核苷酸748到998，或核苷酸500到998，或核苷酸573到922的多核苷酸；c)包含具有如SEQ ID NO：2中所示序列的多核苷酸的核苷酸1637到1989的多核苷酸；d)包含具有如SEQ ID NO：3中所示序列的多核苷酸的核苷酸400到609，或核苷酸260到609，或核苷酸200到609的多核苷酸；e)与a)到d)的多核苷酸的任一个有至少70％序列同一性的多核苷酸；f)在严格条件下与a)到d)的多核苷酸的任一个杂交的多核苷酸；和g)包含具有如SEQID NO：1、2或3中所示序列的多核苷酸的至少50个连续核苷酸、或至少100个连续核苷酸、或至少200个连续核苷酸的片段的多核苷酸；h)从基因组片段得到或可得到的多核苷酸，该基因组片段包含与a)到d)的任一多核苷酸有至少30％同一性的启动子多核苷酸，并且包含编码与如SEQ IDNO：5、SEQ ID NO：6或SEQ ID NO：7所述的序列有至少80％同一性的多肽序列并且与a)到d)的任一多核苷酸有至少30％同一性的启动子多核苷酸功能地连接的多核苷酸，或i)多核苷酸，其是a)到f)的任一多核苷酸的等同片段。

在另一实施方案中，本发明提供了下调对于线虫进食位点、合胞体或巨细胞的发育和维持必需的基因的方法，其通过使用本领域技术人员公知的方法如反义或者RNAi序列破坏本发明的启动子功能来实现。

本发明也涉及包含本发明启动子多核苷酸的表达盒和转基因植物，并涉及控制作物中寄生线虫侵染的方法，其中所述方法使用了重组核酸构建体，其包含与编码物质的核酸有效连接的本发明启动子，其中所述物质破坏植物寄生线虫的代谢、生长和/或繁殖，所述构建体赋予或改善植物的植物寄生线虫抗性或毒害植物寄生线虫以减少植物破坏。

附图简述

图1：拟南芥基因座At1g21460(pWT128)的启动子区的序列(SEQ IDNO：1，TATA盒碱基830-836为粗体)。

图2：拟南芥基因座At5g53190启动子区的序列(SEQ ID NO：2)。

图3：对应于pAW222qcz中所含cDNA克隆47116125(p-47116125)的基因的大豆启动子区的序列(SEQ ID NO：3；TATA盒碱基513-519为粗体)。

图4：大豆cDNA克隆47116125的序列(SEQ ID NO：4)。从碱基23-25的Orf起始密码子为粗体。从碱基785-787的orf终止密码子为粗斜体。整个orf跨越碱基23-787。

图5：大豆cDNA克隆47116125的氨基酸序列(SEQ ID NO：5)、拟南芥基因座At1g21460的氨基酸序列(SEQ ID NO：6)和拟南芥基因座At5g53190的氨基酸序列(SEQ ID NO：7)的序列比对。

图6：pAW127基因组步查得到的序列(SEQ ID NO：8)。47116125的编码序列的起始密码子以粗体标记并且位于碱基660-662。在相同框内该起始密码子上游为终止密码子，其用粗斜体标记。克隆到pAW222qcz中的启动子多核苷酸序列通过51到659位的核苷酸表示。

图7a-b：大豆cDNA克隆47116125(SEQ ID NO：4)和靶定cDNA克隆47116125的pAW127中所含的基因组步查来源的大豆序列的序列比对。大豆cDNA克隆47116125(SEQ ID NO：4)的ATG起始密码子在pAW127序列的核苷酸位置660处开始。609bp的启动子多核苷酸由SEQ ID NO：3描述并且来自pAW127序列的核苷酸位置51到659(SEQ ID NO：8)。

图8：在实施例3内所述的大豆发根测定法中双元载体pAW222qcz和pWT128的β-葡糖醛酸糖苷酶表达模式。使大豆胞囊线虫感染的发根和非感染对照发根在SCN接种12日后染色。使用以下评分指标：“-”，无GUS染色；“+”，GUS弱染色；“++”，GUS强染色。

图9：实施例5中所述的大豆发根测定法中双元载体pWT128和启动子多核苷酸缺失构建体RTJ113和RTJ114的β-葡糖醛酸糖苷酶表达模式。使大豆胞囊线虫感染的发根和非感染对照发根在SCN接种12日后染色。使用以下评分指标：“-”，无GUS染色；“+”，GUS弱染色；“++”，GUS强染色。

图10：实施例5中所述的大豆发根测定法中双元载体pAW222qcz和启动子多核苷酸缺失构建体RTJ117和RTJ118的β-葡糖醛酸糖苷酶表达模式。大豆孢囊线虫感染的发根和对照未感染的发根在SCN接种后12天染色。使用下面的评分指标：“-”，无GUS染色；“+”，GUS弱染色；“++”，GUS强染色。

图11：用于得到SEQ ID NO：1、SEQ ID NO：2、SEQ ID NO：3的启动子多核苷酸、基因座At1g21460的拟南芥启动子(SEQ ID NO：1)的500bp缺失、基因座At1g21460的拟南芥启动子(SEQ ID NO：1)的251bp缺失、大豆启动子p-47116125(SEQ ID NO：3)的410bp缺失，和大豆启动子p-47116125(SEQ ID NO：3)的210bp缺失的PCR引物。

图12：表，其显示了在最小启动子多核苷酸片段中鉴定的序列元件的序列通式(式1和式2)。

图13：拟南芥基因座At1g21460(pWT128)的启动子区的最小启动子多核苷酸片段的一般序列(SEQ ID NO：43)，和显示了在SEQ ID NO.43中所含的16个序列元件的表格。

图14：拟南芥基因座At5g53190的启动子区的最小启动子多核苷酸片段的一般序列(SEQ ID NO：44)，和显示了在SEQ ID NO.44中所含的9个序列元件的表格。

图15：对应于cDNA克隆47116125的基因的大豆启动子区的最小启动子多核苷酸片段的一般序列(SEQ ID NO：45)，和显示了在SEQ ID NO.45中所含的7个序列元件的表格。

优选实施方案的详述

本发明可以通过参考以下详细描述的本发明优选实施方案及其中所包含实施例而更容易地理解。除非另外说明，本文中所用术语将根据相关领域技术人员的习惯用法加以理解。除了下文提供的术语定义外，分子生物学中常用术语的定义也可以在Rieger等，1991 Glossary of genetics：classical and molecular，第五版，Berlin：Springer-Verlag；和在Currentprotocols in Molecular Biology，F.M.Ausubel等编者，Current Protocols，Greene Publishing Associates，Inc.与John Wiley & Sons，Inc.(1998附录)中找到。

应当理解如本说明书及在权利要求书中所用，“一种(a)”或“一个(an)”可以意指一个或多个，这取决于该冠词所用的上下文。因此，对“一种细胞”的称谓可以可以意指可以使用至少一种细胞。应当理解本发明不限于具体核酸、具体细胞类型、具体宿主细胞、具体条件或具体方法等，因为这些当然可以变化，并且其中的众多修改与变化对于本领域技术人员是显而易见的。还应当理解本文中使用的术语仅仅旨在描述具体实施方案并且不意图是限制性的。

在本申请通篇范围内，参考了多种出版物。全部这些出版物及这些出版物中引用的那些参考文献的公开内容通过引用方式完整地并入本申请，旨在更充分地描述本发明涉及的本领域状态。用于克隆、DNA分离、扩增及纯化，用于涉及DNA连接酶、DNA聚合酶、限制性内切酶等酶反应的标准技术以及多种分离技术是本领域技术人员已知并且通常使用的那些技术。众多标准技术在Sambrook和Russell，2001 Molecular Cloning，第三版，Cold Spring Harbor，Plain view，New York；Sambrook等，1989Molecular Cloning，第二版，Cold Spring Harbor Laboratory，Plainview，New York；Maniatis等，1982 Molecular Cloning，Cold Spring HarborLaboratory，Plainview，New York；Wu(编辑)1993 Meth.Enzymol.218，第I部分；Wu(编辑)1979 Meth Enzymol.68；Wu等，(编辑)1983 Meth.Enzymol.100和101；Grossman和Moldave(编辑)1980 Meth.Enzymol.65；Miller(编辑)1972 Experiments in MolecuIar Genetics，Cold SpringHarbor Laboratory，Cold Spring Harbor，New York；Old和Primrose，1981 Principles of Gene Manipulation，University of California Press，Berkeley；Schleif和Wensink，1982 Practical Methods in MolecularBiology；Glover(编辑)1985 DNA Cloning第I和II卷，IRL Press，Oxford，UK；Hames和Higgins(编辑)1985 Nucleic Acid Hybridization，IRL Press，Oxford，UK以及Setlow和Hollaender 1979 Genetic Engineering：Principles and Methods，第1-4卷，Plenum Press，New York中描述。

可以提供从其天然环境分离和/或纯化的本发明核酸，它们处于基本上纯的或均匀的形式，或者不含或基本上不含所述物种来源的其他核酸。如本文中所用的“分离”核酸在通过重组技术产生时也基本上(在分离时)不含其他细胞材料或培养基，或在化学地合成时基本上不含化学前体。本发明的启动子是分离的核酸。当在本文中使用时，术语“分离的”包括全部这些可能。

术语“约”在本文中用来意指大约、大致、左右或处于......范围。术语“约”与数字范围一起使用时，它通过扩张边界高于和低于所述数值而修饰该范围。通常，术语“约”在本文中用来修饰某数值高于和低于所述值，即在该数值之上或之下(较高或较低)达10％的偏差。

如本文中所用的术语“启动子”指与目的核苷酸序列连接时能够控制该目的核苷酸序列转录成mRNA的DNA序列。启动子一般(尽管不必要)位于目的核苷酸的5′(例如上游)(例如接近结构基因的转录起始位点)，所述目的核苷酸向mRNA转录的受所述启动子的控制，并为用于启动转录的RNA聚合酶和其他转录因子提供特异性结合位点。“组成型启动子”指这样的启动子，它能够在植物整个或几乎整个发育期期间于全部或几乎全部植物组织中表达该启动子控制的可读框或调节元件。“调节型启动子”指不以组成型方式而以时间和/或空间方式指导基因表达的启动子，并且包括组织特异性启动子和诱导型启动子。不同启动子可以指导基因或调节元件在不同组织或细胞类型中或在不同发育期或在应答于不同环境条件下表达。“组织特异性启动子”指不在全部植物细胞中表达而仅在特定器官(如根或种子)、特定组织(如胚或子叶)内的一个或多个细胞类型或特定细胞类型(如叶薄壁组织或种子贮藏细胞)中表达的调节型启动子。“诱导型启动子”指可以在一个或多个细胞类型中通过外部刺激如化学、光、激素、胁迫或病原体开启的那些调节型启动子。

根据本发明，本发明的启动子多核苷酸可以与第二多核苷酸有效连接，用于所述第二多核苷酸在植物中的根特异性和/或线虫诱导性表达以改变该植物的表型。如本文中所用，术语“处于有效连接”、“有效连接的”和“与......连接”是可互换的并且意指启动子多核苷酸与第二多核苷酸在单个核酸片段上以如此方式功能性连接，使得所述第二多核苷酸的转录由该启动子多核苷酸启动并介导。通常，处于有效连接的核酸是连续的。

第二多核苷酸序列包括例如可读框、可读框的部分、编码融合蛋白的核酸、反义序列、编码双链RNA序列的序列、转基因，等等。例如，此第二多核苷酸可以编码昆虫抗性基因、抗细菌病基因、抗真菌病基因、抗病毒病基因、抗线虫病基因、抗除草剂基因、影响籽粒组成或品质的基因、养分利用基因、霉菌毒素降低基因、雄性不育基因、选择标记基因、筛选标记基因、负选择标记基因、正选择标记基因、影响植物农学特征(如产量)的基因、环境胁迫抗性基因(例如赋予对干旱、热、寒冷、冰冻、过度潮湿、盐胁迫或氧化胁迫抗性或耐受性的基因)、改善淀粉特性或品质、油数量和质量、氨基酸或蛋白质组成等的基因。在本发明的启动子用于豆科植物中用于介导根瘤中的表达的情况下，第二核酸可以是影响植物农学特征基因，所述农学特征如氮固定、氮运输、植物蛋白质含量或者种子蛋白质含量等等。

优选地，所述第二多核苷酸编码双链RNA(dsRNA)或反义多核苷酸，其与形成或维持线虫采食部位所需的完整或部分植物基因基本上同一或同源。所述第二多核苷酸可以备选地编码破坏植物寄生线虫生长和/或繁殖、赋予或改善针对植物寄生线虫的植物抗性或毒害植物寄生线虫以减少作物破坏的物质。根据本发明，可以使用编码如此物质的任一多核苷酸，其中所述的物质破坏植物寄生线虫生长和/或繁殖、赋予或改善针对植物寄生线虫的植物抗性或毒害植物寄生线虫。例如，所述第二多核苷酸可以编码与植物寄生线虫的靶基因基本上同一的双链RNA，其中所述的靶基因对该线虫代谢、存活、变态或繁殖是必需的。所述第二多核苷酸可以编码双链RNA，其与植物根的采食部位中对该线虫存活必需的植物靶基因本上同一。如本文中所用，考虑到比较RNA和DNA序列时尿嘧啶替换胸腺嘧啶，术语“基本上同一”和“对应于”意指dsRNA的一条链的核苷酸序列与靶基因的20个或更多个连续核苷酸至少约80％-90％同一，更优选地，与靶基因的20个或更多个连续核苷酸至少约90-95％同一并且最优选与靶基因的20个或更多个连续核苷酸至少约95-99％同一或完全同一。示例性植物寄生线虫靶基因例如在通过引用方式并入本文的共同待决的美国专利申请号2005/188438中描述。

或者，对于线虫控制，与本发明的启动子有效连接的第二多核苷酸可以编码线虫毒性蛋白。例如，编码微生物毒素或其片段、来自昆虫的毒素或其片段(例如在美国专利号5,457,178；5,695,954；5,763,568；5,959,182等中所述的那些毒素或其片段)的多核苷酸可用于本发明的这个实施方案中。

备选地，使用本领域技术人员已知的方法，如反义或者RNAi序列，通过破坏本发明的启动子的功能，使用下调线虫进食部位、合胞体或巨细胞的发育和维持必需的基因的方法，破坏或消除进食部位、合胞体或者巨细胞，可以控制线虫。

作物植物和相应的致病线虫在《美国植物疾病索引》(美国农业部手册第165号，1960)；《北美洲植物寄生线虫物种分布》(线虫学家学会，1985)和《美国植物及植物产品上的真菌》(美国植物病理学会，1989)中列出。例如，本发明所针对的植物寄生线虫包括而不限于，胞囊线虫和根癌线虫。本发明所靶向的具体植物寄生线虫包括而不限于大豆异皮线虫、甜菜异皮线虫(Heterodera schachtii)、燕麦异皮线虫(Heterodera avenae)、水稻异皮线虫(Heterodera oryzae)、木豆异皮线虫(Heterodera cajani)、车轴草异皮线虫(Heterodera trifolii)、马铃薯白线虫(Globodera pallida)、马铃薯金线虫(G.rostochiensis)或烟草球异皮线虫(Globodera tabacum)、南方根结线虫(Meloidogyne incognita)、花生根结线虫(M.arenaria)、北方根结线虫(M.hapla)、爪哇根结线虫(M.javanica)、纳西根结线虫(M.naasi)、短小根结线虫(M.exigua)、起绒草茎线虫(Ditylenchus dipsaci)、窄小茎线虫(Ditylenchus angustus)、相似穿孔线虫(Radopholus similis)、柑橘穿孔线虫(Radopholus citrophilus)、多带螺旋线虫(Helicotylenchus multicinctus)、咖啡短体线虫(Pratylenchus coffeae)、最短尾短体线虫(Pratylenchusbrachyurus)、伤残短体线虫(Pratylenchus vulnus)、弯曲短体线虫(Paratylenchus curvitatus)、玉米短体线虫(Paratylenchus zeae)、肾形小盘旋线虫(Rotylenchulus reniformis)、银莲花拟毛刺线虫(Paratrichodorusanemones)、较小拟毛刺线虫(Paratrichodorus minor)、Paratrichodoruschristiei、麦粒鳗线虫(Anguina tritici)、Bidera avenae、小麦根瘿线虫(Subanguina radicicola)、塞氏纽带线虫(Hoplolaimus seinhorsti)、哥伦比亚纽带线虫(Hoplolaimus Columbus)、帽状纽带线虫(Hoplolaimusgaleatus)、半穿刺小垫刃线虫(Tylenchulus semipenetrans)、花生鞘线虫(Hemicycliophora arenaria)、椰子细杆刃线虫(Rhadinaphelenchuscocophilus)、水平对刺线虫(Belonolaimus longicaudatus)、原始毛刺线虫(Trichodorus primitivus)、异常珍珠线虫(Nacobbus aberrans)、贝氏滑刃线虫(Aphelenchoides besseyi)、卡纳亚拟鞘线虫(Hemicriconemoideskanayaensis)、克莱顿矮化线虫(Tylenchorhynchus claytoni)、美洲剑线虫(Xiphinema americanum)、瘟疫坏死线虫(Cacopaurus pestis)等。

在一个实施方案中，被靶定的线虫属于诱导巨细胞或合胞体细胞的线虫科。诱导巨细胞或合胞体细胞的线虫属于长针线虫科(Longidoridae)、毛刺线虫科(Trichodoridae)、异皮线虫科(Heterodidae)、根结线虫科(Meloidogynidae)、短体线虫科(Pratylenchidae)或小垫刃线虫科(Tylenchulidae)。具体地，它们属于异皮线虫科或根结线虫科。

因此，在另一个实施方案中，目标线虫属于选自由伪根瘤线虫属(Naccobus)、仙人掌胞囊线虫属(Cactodera)、长形胞囊线虫属(Dolichodera)、球异皮线虫属(Globodera)、异皮线虫属(Heterodera)、Punctodera、长针线虫线虫属(Longidorus)或根结线虫属(Meloidogyne)组成的组中的一个或多个属。在优选的实施方案中，目标线虫属于选自由伪根瘤线虫属、仙人掌胞囊线虫属、长形胞囊线虫属、球异皮线虫属、异皮线虫属、Punctodera或根结线虫属组成的组中的一个或多个属。在更优选的实施方案中，目标线虫属于选自由球异皮线虫属、异皮线虫属或根结线虫属组成的组中的一个或多个属。在甚至更优选的实施方案，目的线虫属于选自由球异皮线虫属或异皮线虫属组成的组中的一个或两个属。在另一个实施方案中，目标线虫属于根结线虫属。

当靶向的线虫是球形胞囊线虫属(Globodera)时，靶向的物种可选自：蕃草属球异皮线虫(G.achilleae)、蒿球异皮线虫(G.artemisiae)、G.hypolysi、G.mexicana、G.millefolii、苹果球异皮线虫(G.mali)、马铃薯白线虫(G.pallida)、马铃薯金线虫(G.rostochiensis)、烟草异皮线虫(G.Tabacum)和G.virginiae。在一个优选的实施方案中，靶向的球形胞囊线虫属(Globodera)线虫包括至少物种马铃薯白线虫(G.pallida)、烟草异皮线虫(G.Tabacum)或马铃薯金线虫(G.rostochiensis)之一。当靶向的线虫是胞囊线虫属(Heterodera)时，物种可选自燕麦异皮线虫(H.avenae)、胡萝卜异皮线虫(H.carotae)、鹰嘴豆异皮线虫(H.ciceri)、十字花科异皮线虫(H.cruciferae)、H.delvii、褐藻异皮线虫(H.elachista)、菲力普异皮线虫(H.filipjevi)、H.gambiensis、大豆异皮线虫、豌豆异皮线虫(H.goettingiana)、荞麦异皮线虫(H.graduni)、蛇麻异皮线虫(H.humuli)、大麦异皮线虫(H.hordecalis)、小麦异皮线虫(H.latipons)、燕麦异皮线虫(H.major)、苜蓿异皮线虫(H.medicaginis)、水稻异皮线虫(H.oryzicola)、巴基斯坦异皮线虫(H.pakistanensis)、酸模异皮线虫(H.rosii)、甘蔗异皮线虫(H.sacchari)、甜菜异皮线虫、高粱异皮线虫(H.sorghi)、车轴草异皮线虫、荨麻异皮线虫(H.urticae)、豇豆异皮线虫(H.vigni)和玉米异皮线虫(H.zeae)。在一个优选的实施方案中，靶向的胞囊线虫属线虫包括至少物种大豆异皮线虫、燕麦异皮线虫、木豆异皮线虫、豌豆异皮线虫、车轴草异皮线虫、玉米异皮线虫或甜菜异皮线虫之一。在一个更优选的实施方案中，靶向的线虫包括至少物种大豆异皮线虫或甜菜异皮线虫之一。在一个最优选的实施方案中，靶向的线虫是物种大豆异皮线虫。

当靶向的线虫是根结线虫属(Meloidogyne)时，靶向的线虫可选自高粱根结线虫(M.acronea)、M.arabica、花生根结线虫(M.arenaria)、甘蓝根结线虫(M.artiellia)、短尾根结线虫(M.brevicauda)、山茶根结线虫(M.camelliae)、哥伦比亚根结线虫(M.chitwoodi)、咖啡根结线虫(M.cofeicola)、短小根结线虫(M.esigua)、禾草根结线虫(M.graminicola)、北方根结线虫(M.hapla)、南方根结线虫、印度根结线虫(M.indica)、海滨根结线虫(M.inornata)、爪哇根结线虫(M.javanica)、林氏根结线虫(M.lini)、苹果根结线虫(M.mali)、小头根结线虫(M.microcephala)、小突根结线虫(M.microtyla)、纳西根结线虫(M.naasi)、萨拉斯根结线虫(M.salasi)和泰晤士根结线虫(M.thamesi)。在一个优选的实施方案中，靶向的线虫包括至少爪哇根结线虫、南方根结线虫、北方根结线虫、花生根结线虫或哥伦比亚根结线虫。

可用本发明的启动子多核苷酸转化任何植物物种。例如，可用含本发明启动子多核苷酸的核酸构建体转化的植物包括但不仅限于来自以下属的植物，所述属选自苜蓿属(Medicago)、番茄属(Lycopersicon)、芸苔属(Brassica)、香瓜属(Cucumis)、茄属(Solanum)、核桃属(Juglans)、棉属(Gossypium)、苹果属(Malus)、葡萄属(Vitis)、金鱼草属(Antirrhinum)、杨属(Populus)、草莓属(Fragaria)、拟南芥属、云杉属(Picea)、辣椒属(Capsicum)、藜属(Chenopodium)、菊属(Dendranthema)、牵牛属(Pharbitis)、松属(Pinus)、豌豆属(Pisum)、稻属(Oryza)、玉蜀黍属(Zea)、小麦属(Triticum)、小黑麦属(Triticale)、黑麦属(Secale)、黑麦草属(Lolium)、大麦属(Hordeum)、大豆属(Glycine)、黄杉属(Pseudotsuga)、伽蓝菜属(Kalanchoe)、甜菜属(Beta)、向日葵属(Helianthus)、烟草属(Nicotiana)、南瓜属(Cucurbita)、蔷薇属(Rosa)、草莓属、百脉根属(Lotus)、苜蓿属、驴食草属(Onobrychis)、车轴草属(trifolium)、胡卢巴属(Trigonella)、豇豆属(Vigna)、橘属(Citrus)、亚麻属(Linum)、老鹳草属(Geranium)、木薯属(Manihot)、胡芦巴属(Daucus)、萝卜属(Raphanus)、白芥属(Sinapis)、颠茄属(Atropa)、曼陀罗属(Datura)、天仙子属(Hyoscyamus)、烟草属、碧冬茄属(Petunia)、毛地黄属(Digitalis)、Majorana、菊苣属(Ciahorium)、莴苣属(Lactuca)、雀麦属(Bromus)、天门冬属(Asparagus)、金鱼草属、萱草属(Heterocallis)、水仙属(Nemesis)、天竺葵属(Pelargonium)、稷属(Panieum)、狼尾草属(Pennisetum)、毛莨属(Ranunculus)、千里光属(Senecio)、喇叭舌属(Salpiglossis)、蓝英花属(Browaalia)、菜豆属(Phaseolus)、燕麦属(Avena)和葱属(Allium)。

所述启动子多核苷酸的衍生物和变体可以优选地用在特定的植物进化枝、科、属或植物种中。可以从一个植物物种中分离的所述启动子多核苷酸的衍生物和变体优选地用在这样的植物中，其中所述的植物与用于分离所述启动子多核苷酸的衍生物和变体的植物属于相同的进化枝、科、属或种。因此，在一个实施方案中，所述植物是单子叶植物，优选是禾本科(Poaceae)、芭蕉科(Musaceae)、百合科(Liliaceae)或凤梨科(Bromeliaceae)植物，优选是禾本科植物。因此，在又一个实施方案中，所述植物是禾本科玉蜀黍属、小麦属、稻属、大麦属、黑麦属、燕麦属、甘蔗属(Saccharum)、高粱属(Sorghum)、狼尾草属、狗尾草属(Setaria)、稷属、蟋蟀草属(Eleusine)、芒属(Miscanthus)、短柄草属(Brachypodium)、羊茅属(Festuca)或黑麦草属植物。当植物是玉蜀黍属(Zea)时，优选的物种是玉米(Z.mays)。当植物是小麦属(Triticum)时，优选的物种是普通小麦(T.aestivum)、斯佩尔特小麦(T.speltae)或硬粒小麦(T.durum)。当植物是稻属(Oryza)时，优选的物种是稻(O.sativa)。当植物是大麦属(Hordeum)时，优选的物种是大麦(H.vulgare)。当植物是黑麦属(Secale)时，优选的物种是黑麦(S.cereale)。当植物是燕麦属(Avena)时，优选的物种是燕麦(A.sativa)。当植物是甘蔗属(Saccharum)时，优选的物种是甘蔗(S.officinarum)。当植物是高梁属(Sorghum)时，优选的物种是蜀黍(S.vulgare)、两色蜀黍(S.bicolor)或苏丹草(S.sudanense)。当植物是狼尾草属(Pennisetum)时，优选的物种是御谷(P.glaucum)。当植物是狗尾草属(Setaria)时，优选的物种是谷子(S.italica)。当植物是黍属(Panicum)时，优选的物种是野生稷(P.miliaceum)或柳枝稷(P.virgatum)。当植物是穇属(Eleusine)时，优选的物种是穇子(E.coracana)。当植物是芒属(Miscanthus)时，优选的物种是芒(M.sinensis)。当植物是短柄草属(Brachypodium)时，优选的物种是二穗短柄草(B.distachyon)。当植物是羊茅属(Festuca)时，优选的物种是苇状羊茅(F.arundinaria)、紫羊茅(F.rubra)或草甸羊茅(F.pratensis)。当植物是黑麦草属(Lolium)时，优选的物种是多年生黑麦草(L.perenne)或多花黑麦草(L.multiflorum)。或者植物可以是小黑麦属(Triticosecale)。

或者，在一个实施方案中，植物是双子叶植物，优选地是豆科(Fabaceae)、茄科(Solanaceae)、芸苔科(Brassicaceae)、藜科(Chenopodiaceae)、菊科(Asteraceae)、锦葵科(Malvaceae)、亚麻科(Linaceae)、大戟科(Euphorbiaceae)、旋花科(Convolvulaceae)、蔷薇科(Rosaceae)、葫芦科(Cucurbitaceae)、山茶科(Theaceae)、茜草科(Rubiaceae)、梧桐科(Sterculiaceae)或柑橘(Citrus)科的植物。在一个实施方案中，植物是豆科(Fabaceae)、茄科(Solanaceae)或芸苔科(Brassicaceae)的植物。因此，在一个实施方案中，植物是豆科(Fabaceae)，优选地是大豆属(Glycine)、豌豆属(Pisum)、落花生属(Arachis)、鹰嘴豆属(Cicer)、蚕豆属(Vicia)、菜豆属(Phaseolus)、羽扇豆属(Lupinus)、苜蓿属(Medicago)或兵豆属(Lens)。优选的豆科(Fabaceae)物种是截形苜蓿(M.truncatula)、紫苜蓿(M.sativa)、大豆(G.max)、豌豆(P.sativum)、花生(A.hypogea)、鹰嘴豆(C.arietinum)、蚕豆(V.faba)、菜豆(P.vulgaris)、白羽扇豆(Lupinus albus)、黄羽扇豆(Lupinus luteus)、狭叶羽扇豆(Lupinus angustifolius)或兵豆(Lensculinaris)。更优选的是大豆(G.max)和花生(A.hypogea)、紫苜蓿(M.sativa)物种。最优选的是大豆(G.max)。当植物是茄科(Solanaceae)时，优选的属是茄属(Solanum)、番茄属(Lycopersicon)、烟草属(Nicotiana)或辣椒属(Capsicum)。优选的茄科物种是马铃薯(S.tuberosum)、番茄(L.esculentum)、烟草(N.tabaccum)或黄灯笼辣椒(C.chinense)。更优选的是马铃薯(S.tuberosum)。因此，在一个实施方案中，植物是十字花科(Brassicaceae)，优选的是拟南芥属(Arabidopsis)、芸苔(Brassica)或萝卜属(Raphanus)。优选的十字花科(Brassicaceae)物种是拟南芥(A.thaliana)、欧洲油菜(B.napus)、甘蓝(B.oleracea)、芥菜(B.juncea)或芜青(B.rapa)物种。更优选的是欧洲油菜(B.napus)物种。当植物是藜科(Chenopodiaceae)时，优选的属是甜菜属(Beta)，优选的物种是甜菜(B.vulgaris)。当植物是菊科(Asteraceae)时，优选的属是向目葵属(Helianthus)，优选的物种是向日葵(H.annuus)。当植物是锦葵科(Malvaceae)时，优选的属是棉属(Gossypium)或秋葵属(Abelmoschus)。当属是棉属(Gossypium)时，优选的物种是陆地棉(G.hirsutum)或海岛棉(G.barbadense)，最优选的物种是陆地棉(G.hirsutum)。秋葵属(Abelmoschus)的优选的物种是咖啡黄葵(A.esculentus)。当植物是亚麻科(Linaceae)时，优选的属是亚麻属(Linum)，优选的物种是亚麻(L.usitatissimum)。当植物是大戟科(Euphorbiaceae)时，优选的属是木薯属(Manihot)、麻风树属(Jatropa)或蓖麻属(Ricinus)，优选的物种是木薯(M.esculenta)、麻风树(J.curcas)或蓖麻(R.comunis)。当植物是旋花科(Convolvulaceae)时，优选的属是番薯属(Ipomea)，优选的物种是I.batatas。当植物是蔷薇科(Rosaceae)时，优选的属是蔷薇属(Rosa)、苹果属(Malus)、梨属(Pyrus)、李属(Prunus)、悬钩子属(Rubus)、茶藨子属(Ribes)、越橘属(Vaccinium)或草莓属(Fragaria)，优选的物种是杂种荷兰草莓(Fragaria xananassa)。当植物是葫芦科(Cucurbitaceae)时，优选的属是黄瓜属(Cucumis)、西瓜属(Citrullus)或南瓜属(Cucurbita)，优选的物种是黄瓜(Cucumis sativus)、西瓜(Citrullus lanatus)或西葫芦(Cucurbita pepo)。当植物是山茶科(Theaceae)时，优选的属是山茶属(Camellia)，优选的物种是茶(Camellia sinensis)。当植物是茜草科(Rubiaceae)时，优选的属是咖啡属(Coffea)，优选的物种是小果咖啡(C.arabica)或中果咖啡(C.canephora)。当植物是梧桐科(Sterculiaceae)时，优选的属是可可树属(Theobroma)，优选的物种是可可树(T.cacao)。当植物是柑橘属(Citrus)时，优选的物种是甜橙(C.sinensis)、柠檬(C.limon)、桔(C.reticulata)、柚(C.maxima)和柑橘物种的杂种等等。

本发明的拟南芥启动子多核苷酸(SEQ ID NO：1和SEQ ID NO：2)代表大豆cDNA克隆47116125(SEQ ID NO：4)的拟南芥同源物的启动子区，编码序列注解为蒺藜苜蓿(Medicago truncatula)结瘤蛋白3-样(MtN3-样)基因。拟南芥启动子多核苷酸分离自拟南芥基因组DNA，如实施例2中公开。本发明的大豆MtN3-样启动子多核苷酸(SEQ ID NO：3)分离自大豆基因组DNA，如实施例1中公开。如实施例3中阐明，当将本发明的拟南芥和大豆启动子多核苷酸置于与GUS报道基因有效连接时，GUS基因的表达在受到线虫感染的大豆发根中被上调。

本发明从而体现了启动子，其包含具有如SEQ ID NO：1、SEQ ID NO：2或SEQ ID NO：3中所示序列的分离的启动子多核苷酸，或者来自具有如SEQ ID NO：1、SEQ ID NO：2或SEQ ID NO：3中所示序列的分离的启动子多核苷酸的最小启动子多核苷酸片段，其能够驱动第二多核苷酸的根特异性和/或线虫诱导型表达。本文公开的方法可以用于分离SEQ ID NO：1、SEQ ID NO：2或SEQ ID NO：3的额外的最小启动子多核苷酸片段，其能够介导第二多核苷酸的根特异性和/或线虫诱导型表达。

备选地，本发明的启动子包含分离的启动子多核苷酸，其在严格条件下与具有如SEQ ID NO：1、SEQ ID NO：2或SEQ ID NO：3中所示序列的核酸杂交，或者来自具有如SEQ ID NO：1、SEQ ID NO：2或SEQ ID NO：3中所示序列的分离的启动子多核苷酸的最小启动子多核苷酸片段。如本文所用的严格杂交条件是公知的，包括例如，400mM NaCl，40mM PIPESpH6.4，1mM EDTA，60℃杂交12-16小时；随后在0.1％SDS，0.1％SSC中于大约65℃洗涤约15-60分钟。本发明也体现在这样的分离的启动子多核苷酸中，所述启动子多核苷酸能够驱动第二多核苷酸的根特异性和/或线虫诱导型表达，在严格条件下与包含如SEQ ID NO：1中所述序列的核苷酸748到998，或500到998，或573到922的启动子多核苷酸杂交；在严格条件下与包含如SEQ ID NO：2中所述序列的核苷酸1637到1986的核酸杂交；在严格条件下与包含如SEQ ID NO：3中所述序列的核苷酸400到609、或260到609、或200到609的核酸杂交，其中所述的启动子多核苷酸在植物根中受植物寄生线虫诱导。

本发明的启动子还包含分离的启动子多核苷酸，所述启动子多核苷酸能够驱动第二多核苷酸的根特异性和/或线虫诱导型表达，与具有如SEQID NO；1、2或3中所述序列的核酸，或者来自具有如SEQ ID NO；1、2或3中所述序列的核酸的最小启动子多核苷酸片段有至少50-60％、或至少60-70％、或至少70-80％、80-85％、85-90％、90-95％,或至少95％、96％、97％、98％、99％或更高同一性或相似性。序列比较的长度对于多核苷酸而言是至少50个连续核苷酸或至少100个连续核苷酸或至少200个连续核苷酸，或至少500个连续核苷酸，直至该序列的全长。在待比较的两个序列没有相同长度的情况下，术语“序列的全长”指较短序列的全长。

在一个实施方案中，本发明的启动子包含分离的启动子多核苷酸，其能够驱动第二多核苷酸的根特异性和/或线虫诱导型表达，与具有如SEQID NO：43、44或45中所示序列的核酸有至少70-80％、80-85％、85-90％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、95％、96％、97％、98％、99％或更高同一性或者相同。在另一实施方案中，与SEQ ID NO：43、44或45中所示序列相似的分离的启动子多核苷酸比如SEQ ID NO：43、44或45中所示序列短20、10、9、8、7、6、5、4、3、2或1个核苷酸。

在另一实施方案中，所述分离的启动子多核苷酸与具有如SEQ IDNO：43中所述序列的核酸有至少70-80％、80-85％、85-90％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、95％、96％、97％、98％、99％或更高同一性或者相同，并且比SEQ ID NO：43短20、10、9、8、7、6、5、4、3、2、1个核苷酸或者不短于SEQ ID NO：43。优选地，所述分离的启动子多核苷酸不含有如图13中所述的至少10、11、12、13、14个元件或所有元件并且位于与如图13的表中所述相同的多核苷酸链(-或+链)中。优选地，图13中的元件具有根据图12的SEQ ID NO：25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39、40、41或42所述的序列，更优选地，它们具有根据图12的SEQ ID NO：34、35、36、37、38、39、40、41或42所述的序列。

在另一实施方案中，所述分离的启动子多核苷酸与具有如SEQ IDNO：44中所述序列的核酸有至少70-80％、80-85％、85-90％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、95％、96％、97％、98％、99％或更高同一性或者相同，并且比SEQ ID NO：44短20、10、9、8、7、6、5、4、3、2、1个核苷酸或者不短于SEQ ID NO：44。优选地，所述分离的启动子多核苷酸不合有如图14中所述的至少3、4、5、6、7、8个元件或所有元件并且位于与如图14的表中所述相同的多核苷酸链(-或+链)中。优选地，图14中的元件具有根据图12的SEQ ID NO：25、26、27、28、30、32、33、34、35、36、37、39、41或42所述的序列，更优选地，它们具有根据图12的SEQ ID NO：34、35、36、37、39、41或42所述的序列。

在另一实施方案中，所述分离的启动子多核苷酸与具有如SEQ IDNO：45中所述序列的核酸有至少70-80％、80-85％、85-90％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、95％、96％、97％、98％、99％或更高同一性或者相同并且比SEQ ID NO：45短20、10、9、8、7、6、5、4、3、2、1个核苷酸或者不短于SEQ ID NO：45。优选地，所述分离的启动子多核苷酸不合有如图15中所述的至少1、2、3、4、5、6个元件或所有元件并且位于与如图15的表中所述相同的多核苷酸链(-或+链)中。优选地，图15中的元件具有根据图12的SEQ ID NO：25、26、27、28、29、31、34、35、36、37、38或40所述的序列，更优选地，它们具有根据图12的SEQ ID NO：34、35、36、37、38或40所述的序列。

术语“序列同一性”或“同一性”在两个核酸序列或多肽序列环境下指这两个序列中的这些位置，其中当所述序列在指定比较窗口范围(例如全局比对中的整个序列或在局部比对中的相似性区域)内为最大对应进行比对时，相同的符号对归集在一起。当序列同一性百分数用来指蛋白质时，可认识到的是不同一的残基位置经常因保守性氨基酸置换而不同，其中氨基酸残基被替换为具有相似化学属性(例如电荷或疏水性)的其他氨基酸残基并且因此没有改变分子的功能属性。当序列因保守性置换而不同时，序列同一性百分数可以向上调整以针对所述置换的保守性本质进行修正。将因此类保守性置换而不同的序列称为具有“序列相似性”或“相似性”。用于进行这种调整的方法是本领域技术人员熟知的。一般，这种方法包括将保守性置换判定为部分匹配而非错配，因而增加序列相似性的百分数。

如本文中所用，“序列同一性的百分数”或“序列同一性百分数”指通过如此方式确定的值，即首先在全局或局部比较窗口中的两个最佳比对序列中在每个组成位置处注明相同的核酸碱基或氨基酸残基是否在这两个序列中出现，若出现，指定为匹配，或若不出现，则指定为不匹配。由于所述比对通过优化匹配碱基数目而建立，与此同时允许在任一位置处的错配以及允许引入任一大小的空位或空白区域，如此提高所述比对的显著性及质量，因而这种计算确定了匹配条件存在的位置总数，并且随后将这个数字除以比较窗口内的位置总数，并且最后将结果乘以100以产生序列同一性百分数。可以使用相同原理对蛋白质序列计算“序列相似性百分数”，其中将保守性置换计算为部分不匹配而非完全不匹配。因此，例如，在给予相同氨基酸评分l并且给予非保守性置换评分0的情况下，给予保守性置换0-1之间的评分。对保守性置换的评分可以从本领域已知的氨基酸矩阵例如Blosum或PAM矩阵中获得。

用于比较的序列比对方法是本领域熟知的。可以使用数学算法实现两个序列之间同一性百分数或相似性百分数(对于蛋白质)的确定。此类数学算法的优选、非限制性实例是Myers和Miller算法(Bioinformatics，4(1)：11-17，1988)、Needleman-Wunsch全局比对法(J.Mol.Biol.，48(3)：443-53，1970)、Smith-Waterman局部比对法(J.Mol.Biol.，147：195-197，1981)、Pearson和Lipman相似性搜索法(PNAS，85(8)：2444-2448，1988)、Karlin和Altschul的算法(Altschul等，J.Mol.Biol.，215(3)：403-410，1990；PNAS，90：5873-5877，1993)。可以使用这些数学算法的计算机实现以比较序列来确定序列同一性或鉴定同源物。

本发明还体现了本发明启动子多核苷酸的“变体”或“衍生物”。具体启动子多核苷酸序列的衍生物及其具体要素可以包括，但不限于，序列缺失、单个或多个点突变、在特定限制性酶位点处的改变、添加功能性元件或其他分子修饰方法。这种修饰可以或不会增强或改变所述启动子多核苷酸的转录调节活性。

例如，本领域技术人员可以划定功能元件，例如，启动子元件，例如但不限于，序列内的转录因子结合位点并且缺失任何非必需的功能元件。对于任一具体的应用，功能元件可以修饰或组合以增加效用或者提高本发明的启动子多核苷酸的表达水平。

如本文所用的术语“等同片段”或者“最小启动子多核苷酸片段”指启动子多核苷酸片段，其能够介导第二多核苷酸的根特异性和/或线虫诱导型表达。本发明的启动子多核苷酸的功能等同片段也可以通过除去，例如通过缺失非必需功能元件而不缺失必需的功能元件，如转录因子结合位点而得到。所述启动子多核苷酸缩小至必需的功能元件可以在体外通过试错缺失突变或在计算机上利用启动子元件搜索途径实现。对启动子活性必需的区域常常显示为成簇的某些已知启动子元件。此类分析可以使用可获得的计算机算法如PLACE(“Plant Cis-acting Regulatory DNA Elements”；Higo1999)、BIOBASE数据库“Transfac”(Biologische Datenbanken GmbH，Braunschweig；Wingender 2001)或数据库PIantCARE(Lescot 2002)进行。尤其优选启动子多核苷酸序列的等同片段，所述等同片段通过缺失编码mRNA的5′-非翻译区的区域而获得，因此，仅提供(非转录的)启动子多核苷酸区。所述的5′-非翻译区可以通过本领域已知的方法(如5′-RACE分析)轻易确定。因此，本发明启动子多核苷酸中的某些是其他启动子多核苷酸的等同片段。本发明的特定最小启动子多核苷酸片段包括但不限于，包含如SEQ ID NO：1中所示序列的核苷酸748到998、或500到998、或573到922的多核苷酸、包含如SEQ ID NO：2中所示序列的核苷酸1637到1986的多核苷酸，或包含如SEQ ID NO：3中所示序列的核苷酸400到609、或260到609、或200到609的多核苷酸，包含具有如SEQ ID NO：1、2或3所示序列的多核苷酸的至少50个连续核苷酸、或至少100个连续核苷酸、或至少200个连续核苷酸的片段的多核苷酸。

如上所述，也可能随机制备并随后分析本发明启动子多核苷酸的缺失突变体。采用这种策略，制备了一系列构建体，每种构建体含有所述启动子多核苷酸的不同片段。然后筛选这些构建体的活性。筛选活性的适用方法是将含有启动子多核苷酸片段的启动子多核苷酸与选择标记或可筛选标记连接并且分离仅表达标记基因的那些细胞。以这种方式，鉴定到众多不同的缺失启动子多核苷酸构建体，它们仍保持想要的或甚至具有更强的活性。因而，通过比较所选的构建体而鉴定到活性所需要的最小启动子多核苷酸片段。这种启动子多核苷酸片段随后可以用于构建表达第二多核苷酸(例如编码外源基因)的载体。

用于在多核苷酸，例如启动子多核苷酸中诱变或产生缺失的方法是本领域技术人员熟知的并且在例如通过引用方式完整并入本文的US6,583,338中披露。调节性序列变体的一个实例是通过从较大启动子多核苷酸中的一个缺失或多个缺失所形成的启动子多核苷酸。有时候可以缺失启动子多核苷酸的5′部分直至接近转录起始位点附近的TATA盒而不消除启动子多核苷酸活性，如Zhu等(1995)The Plant Cell 7：1681-1689描述。除去部分多核苷酸的例行方法是使用外切核酸酶与DNA扩增的组合以产生双链DNA克隆的单向嵌套缺失。用于此目的的商业试剂盒以商标名Exo-Size^TM(New England Biolabs，Beverly，Mass.)出售。生物活性变体也包括例如具有一个或多个核苷酸置换、缺失或插入的本发明天然启动子多核苷酸。

衍生物和变体也包括来自其他物种(如但不限于细菌、真菌和植物)的同源物、旁系同源物和直向同源物。“同源物”是本领域中用来表示与参考序列具有高度序列相关性的多核苷酸或多肽序列的遗传学术语。这种相关性可以如前所述通过确定两个序列之间同一性和/或相似性的程度进行量化。属于这个遗传学术语的是术语“直向同源物”和“旁系同源物”。“旁系同源物”指在相同物种内功能上相似的多核苷酸或多肽。“直向同源物”指作为另一个物种中与所述多核苷酸或多肽功能等同的多核苷酸或多肽。直向同源基因优选地意指编码直向同源蛋白质的基因。更具体地，术语“直向同源物”指从一个物种中获得的多肽或蛋白质，其是来自不同物种的多肽或蛋白质的功能性对应物。直向同源物之间的序列差异是物种形成的结果。

一个实施方案包括能够介导根优选的和/或病原体诱导型表达的多核苷酸的等位变体，所述多核苷酸选自：a)具有如SEQ ID NO：1、2或3中所示序列的多核苷酸；b)包含具有如SEQ ID NO：1中所示序列的多核苷酸的核苷酸748到998，或核苷酸500到998，或核苷酸573到922的多核苷酸；c)包含具有如SEQ ID NO：2中所示序列的多核苷酸的核苷酸1637到1986的多核苷酸；d)包含具有如SEQ ID NO：3中所示序列的多核苷酸的核苷酸400到609，或核苷酸260到609，或核苷酸200到609的多核苷酸；e)与a)到d)的多核苷酸的任一个有至少70％序列同一性的多核苷酸；f)在严格条件下与a)到d)的多核苷酸的任一个杂交的多核苷酸；和g)包含具有如SEQ ID NO：1、2或3中所示序列的多核苷酸的至少50个连续核苷酸、或至少100个连续核苷酸、或至少200个连续核苷酸的片段的多核苷酸。如本文中所用，术语“等位变体”指这样的多核苷酸，其含有导致所述多核苷酸中核苷酸变化的多态性并且该多态性存在于天然群体中(例如植物物种或变种)。术语“等位变体”还指这样的多核苷酸，其含有导致由所述核苷酸编码的蛋白质中氨基酸变化的多态性并且该多态性存在于天然群体中(例如植物物种或变种)。此类天然等位变异一般可以导致多核苷酸中的1-5％差异或所编码蛋白质中的1-5％差异。等位变体可以通过对众多不同植物中的目的多核苷酸测序而鉴定，这可以轻易地通过使用例如杂交探针来鉴定那些植物中的相同启动子多核苷酸、基因或遗传基因座而实施。多核苷酸中任一及全部此类核酸变异是天然等位变异的结果，并且不改变所述多核苷酸的功能性活性，任一和所有此类氨基酸多态性或变异意在本发明的范围内。基因的等位变体或直向同源物可以用于克隆本发明的启动子多核苷酸的变体。

因此，在一个实施方案中，本发明的启动子多核苷酸得自基因组片段，该基因组片段包含与如SEQ ID NO：1、2或3所述的序列有至少30％、40％、50％、60％、70％、80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％、99％或100％同一性的启动子多核苷酸；或者包含具有如SEQ ID NO：1中所示序列的多核苷酸的核苷酸748到998，或核苷酸500到998，或核苷酸573到922的多核苷酸；或者包含具有如SEQ ID NO：2中所示序列的多核苷酸的核苷酸1637到1986的多核苷酸；或者包含具有如SEQ ID NO：3中所示序列的多核苷酸的核苷酸400到609，或核苷酸260到609，或核苷酸200到609的多核苷酸，其与编码多肽序列的多核苷酸功能地连接，所述多肽序列与如SEQ ID NO：5、SEQ ID NO：6或SEQ ID NO：7所述的序列有至少80％到85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％同一性或者100％同一性。在优选实施方案中，基因组片段为植物的基因组片段。此类植物可以为任何植物，例如单子叶植物或者双子叶植物，优选来自双子叶植物，更优选来自属于十字花科(Brassicaceae)或豆科(Fabaceae)的植物。在甚至更优选的实施方案中，它来自属于拟南芥属或者大豆属的植物，最优选地，它来自拟南芥或者大豆。因此，基因组片段的启动子多核苷酸介导多肽序列的根特异性和/或线虫诱导型表达，所述多肽序列如SEQ ID NO：5、SEQ ID NO：6或SEQ ID NO：7所述的序列有至少80％到85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％同一性或者100％同一性。优选地，与如SEQ IDNO：5、SEQ ID NO：6或SEQ ID NO：7所述的序列有至少80％到85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％同一性或者100％同一性的多肽序列在被暴露于线虫刺激的植物的根中被诱导。优选地，启动子多核苷酸与功能连接的编码多肽序列的多核苷酸之间的距离不长于3000bp、2000bp、1000bp，更优选不长于900bp、800bp、700bp、600bp，甚至更优选不长于500bp、400bp、300bp、200bp、100bp、50bp或0bp，所述多肽序列与如SEQ ID NO：5、SEQ ID NO：6或SEQ IDNO：7所述的序列有至少80％到85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％同一性或者100％同一性。

在另一实施方案中，本发明的启动子多核苷酸在暴露于线虫刺激的植物的根中被诱导。当植物被植物寄生线虫感染或者在变得被植物寄生线虫感染的过程中时，可以存在线虫刺激。介导应答线虫刺激而表达的启动子多核苷酸也被称作线虫诱导型启动子多核苷酸。关于本发明启动子、启动子多核苷酸、分离的核酸或多核苷酸，术语根优选的表达指主要在根组织中，尤其在根维管组织中表达。主要在根组织中表达指在特定量的根组织中在本发明启动子多核苷酸控制下产生的mRNA的量与在相同量的其他组织如叶子、茎干或花组织中产生的mRNA的量相比高至少10倍、50倍、100倍或200倍。

关于本发明启动子、启动子多核苷酸、分离的核酸或多核苷酸，术语根优选的表达指主要在根组织中，尤其在根维管组织中表达。主要在根组织中表达指在特定量的根组织中在本发明启动子多核苷酸控制下产生的mRNA的量与在相同量的其他组织如叶子、茎干或花组织中产生的mRNA的量相比高至少10倍、50倍、100倍或200倍。在豆科植物的情况下，也可以指在根瘤中表达。在另一实施方案中，启动子在豆科植物的根瘤，例如，大豆的根瘤中被诱导。

如本文所用的术语“线虫抗性”指植物能够避免被线虫感染，杀死线虫或者阻碍、减少或中止线虫的发育、生长或增殖。这可以通过主动过程，例如通过产生对线虫有害的物质，或者通过被动过程，像对于线虫的营养价值减少，或者不发育被线虫诱导的结构，如合胞体或巨细胞来实现。植物的线虫抗性水平可以通过多种方法测定，例如，通过计数能够在该植物上建立寄生状态的线虫，或者测量线虫发育时间、雄性和雌性线虫的比例或者所产生的线虫卵的数目。

本发明还体现在包含本发明启动子多核苷酸的表达盒中。“表达盒”在这里应当广义地理解为包括表达盒中所含可以影响目的核酸转录及根据需要影响其翻译的全部序列。除了本发明的启动子多核苷酸之外，本发明的表达盒还可以包含改善启动子多核苷酸功能的调节元件、允许在原核和/或真核生物中转录和/或翻译的遗传元件，和(在3′方向上)下游调节元件如转录终止序列和多聚腺苷酸化序列。本发明表达盒的多种成分顺序地并有效地连接在一起。因此，本发明的表达盒可以包含能够介导根优选的和/或线虫诱导型表达的启动子多核苷酸，所述的启动子多核苷酸选自由以下多核苷酸组成的组：a)具有如SEQ ID NO：1、2或3中所示序列的多核苷酸；b)包含具有如SEQ ID NO：1中所示序列的多核苷酸的核苷酸748到998，或核苷酸500到998，或核苷酸573到922的多核苷酸；c)包含具有如SEQ ID NO：2中所示序列的多核苷酸的核苷酸1637到1986的多核苷酸；d)包含具有如SEQ ID NO：3中所示序列的多核苷酸的核苷酸400到609，或核苷酸260到609，或核苷酸200到609的多核苷酸；e)与a)到d)的多核苷酸的任一个有至少70％序列同一性的多核苷酸；f)在严格条件下与a)到d)的多核苷酸的任一个杂交的多核苷酸；和g)包含具有如SEQID NO：1、2或3中所示序列的多核苷酸的至少50个连续核苷酸、或至少100个连续核苷酸、或至少200个连续核苷酸的片段的多核苷酸；h)从基因组片段得到或可得到的多核苷酸，该基因组片段包含与a)到d)的任一多核苷酸有至少30％同一性的启动子多核苷酸，并且包含编码与如SEQ IDNO：5、SEQ ID NO：6或SEQ ID NO：7所述的序列有至少80％同一性的多肽序列并且与a)到d)的任一多核苷酸有至少30％同一性的启动子多核苷酸功能地连接的多核苷酸，或i)多核苷酸，其是a)到f)的任一多核苷酸的等同片段。在另一实施方案中，所述启动子在被植物寄生线虫感染的植物的根中被诱导。

可以任选地在本发明表达盒中包括的具体遗传元件包括而不限于允许在细菌中复制的复制起点，例如来自pBR322或P15A ori的ORI区；或农杆菌T-DNA转移所需要的元件例如，T-DNA的左边界和/或右边界。本发明表达盒的其他成分可以包括而不限于，额外的调节元件，例如增强子、内含子、多接头、多克隆位点、操纵基因、阻遏物结合位点、转录因子结合位点等。示例性增强子包括来自CaMV 35S启动子、章鱼碱合酶基因(Ellis等，1987)、稻肌动蛋白I基因、玉米醇脱氢酶基因(Callis，1987)、玉米矮缩I基因(Vasil 1989)、TMV Ω元件(Gallie，1989)和非植物性真核生物(例如酵母；Ma 1988)的启动子的元件。示例性行植物内含子序列包括来自Adh 1、bronze 1、肌动蛋白1、肌动蛋白2(WO 00/760067)的内含子或蔗糖合酶内含子；见：The Maize Handbook，第116章，Freeling和Walbot编辑，Springer，New York(1994)。

病毒前导序列也可以增强本发明表达盒转录目的核酸。例如，来自烟草花叶病毒(TMV)、玉米褪绿斑点病毒(MCMV)和苜蓿花叶病毒(AMV)的前导序列已经证明有效增强表达。本领域已知的其他前导序列包括，但不限于：小RNA病毒前导序列，例如脑脊髓炎病毒(EMCV)前导序列；马铃薯Y病毒属前导序列、烟草蚀纹病毒(TEV)前导序列；MDMV(玉米矮花叶病毒)前导序列；人免疫球蛋白重链结合蛋白(BiP)前导序列、来自苜蓿花叶病毒衣壳蛋白mRNA(AMV RNA 4)的非翻译前导序列。

本发明的表达盒也包含转录终止元件或多聚腺苷酸化信号，示例性转录终止元件包括来自根癌农杆菌胭脂碱合酶基因的那些转录终止元件(Bevan，1983)、来自根癌农杆菌章鱼碱合酶基因的T7转录物的终止子以及来自马铃薯或番茄的蛋白酶抑制物I或Il基因的3′末端。

将待转录成RNA并且任选地表达为蛋白质的第二多核苷酸插入本发明的表达盒以转化至生物内。根据本发明，所述第二多核苷酸置于与此第二多核苷酸共价连接的本发明启动子多核苷酸的下游(即按照3′方向)和转录终止元件的上游。优选地，所述第二核酸序列与本发明启动子多核苷酸之间的距离不超过200碱基对，更优选地不超过100碱基对，最优选地不超过50碱基对。

本发明的表达盒也可以通过将本发明的启动子多核苷酸插入植物基因组进行装配。此类插入会导致与对于所述基因组为天然的目的核酸序列有效连接。由于本发明启动子多核苷酸的转录调节特性，此类插入使得在线虫诱导后目的核酸在根组织中偏好性地表达或过量表达。这种插入可以是定向的或随机的。优选地，这种插入是定向的并且例如通过同源重组实现。通过这个过程，天然启动子可以由本发明的启动子多核苷酸完全或部分替换，因而修饰内源基因的表达谱。

本发明的表达盒可以插入重组载体、质粒、粘粒、YAC(酵母人工染色体)、BAC(细菌人工染色体)或适于转化至宿主细胞内的任何其他载体。优选的宿主细胞是细菌细胞，尤其用于克隆和保存多核苷酸或者用于转化植物细胞，如但不限于大肠杆菌(Escherichia coli)、根癌农杆菌和发根农杆菌细胞和植物细胞。当宿主细胞是植物细胞时，所述表达盒或载体可以插入转化植物细胞的基因组内。或者，所述表达盒或载体可以在染色体外维持。本发明的表达盒或载体可以存在于植物细胞的细胞核、叶绿体、线粒体和/或质体内。优选地，本发明的表达盒或载体插入植物细胞细胞核的染色体DNA内。

可以将本发明的表达盒转化到植物中以通过转基因植物，该植物包含与本发明的启动子多核苷酸有效连接的一个或多个多核苷酸。表达盒可以包含本发明的任一启动子核苷酸并且可以包含或不包含第二多核苷酸。在一个实施方案中，转基因植物包含启动子，该启动子包含如SEQ ID NO：1、SEQ ID NO：2或SEQ ID NO：3中所示的启动子多核苷酸、SEQ ID NO：1的最小启动子多核苷酸片段、SEQ ID NO：2的最小启动子多核苷酸片段、或SEQ ID NO：3的最小启动子多核苷酸片段。备选地，本发明的转基因植物包含能够介导根优选地和/或线虫诱导型表达的启动子多核苷酸，其在严格条件下与具有如SEQ ID NO：1、SEQ ID NO：2或SEQ ID NO：3中所示序列的启动子多核苷酸、SEQ ID NO：1的最小启动子多核苷酸片段、SEQID NO：2的最小启动子多核苷酸片段、或SEQ ID NO：3的最小启动子多核苷酸片段杂交。此外，本发明的转基因植物包含能够介导根优选的和/或线虫诱导型表达的启动子多核苷酸，其与具有如SEQ ID NO：1、SEQ ID NO：2或SEQ ID NO：3中所示序列的多核苷酸、SEQ ID NO：1的最小启动子片段、SEQ ID NO：2的最小启动子片段、或SEQ ID NO：3的最小启动子片段有至少70％的序列同一性。

使用植物生物技术领域技术人员已知的转化方法产生本发明的转基因植物。任一方法可以用来转化重组表达载体至植物细胞内，以产生本发明的转基因植物。用于转化或转染宿主细胞(包括植物细胞)的合适方法可以在例如WO2006/024509(PCT/EP2005/009366；USSN60/6060789)中并Sambrook等(同上)以及在其他实验手册如Methodss in Molecular Biology，1995，第44卷，Agrobacterium Protocols，Gartland和Davey编辑，Humana Press，Totowa，New Jersey中找到。

用于转化双子叶植物的一般方法也被披露，例如在美国专利号4,940,838；5,464,763等中。用于转化特定双子叶植物例如棉花的方法在美国专利号5,004,863；5,159,135和5,846,797中描述。大豆转化方法在美国专利号4,992,375；5,416,011；5,569,834；5,824,877；6,384,301和在EP0301749B1中描述。其他植物转化方法在例如美国专利号4,945,050；5,188,958；5,596,131；5,981,840等中披露。

如本文中所用，术语“植物”根据上下文可以理解为意指完整植株、植物细胞、植物器官、收获的种子及其子代。词汇“植物”也指任一植物，尤其种子植物，并且可以包括，但不限于作物植物。植物部分包括，但不限于茎、根、嫩枝、果实、胚珠、雄蕊、叶、胚、分生组织区、愈伤组织、配子体、孢子体、花粉、微孢子、下胚轴、子叶、花药、萼片、花粉、未收获的种子等。术语“收获的种子”指从产生种子的植物取下的种子，而术语“未收获的种子”指与产生种子的植物仍然连接的种子，例如处于生长或成熟阶段。植物可以是单子叶植物或双子叶植物。所述植物可以源于选自由玉米、小麦、大麦、高粱、黑麦、黑小麦、稻、甘蔗、柑桔树、菠萝、椰子、香蕉、咖啡、茶、烟草、向日葵、豌豆、苜蓿、大豆、胡萝卜、芹菜、番茄、马铃薯、棉花、烟草、茄子、胡椒、油菜(oilseed rape)、芸苔、甜菜、卷心菜、花椰菜、绿花椰菜、莴苣、百脉根属物种(Lotus sp.)、蒺藜苜蓿(Medicago truncatula)、多年生草、黑麦草和拟南芥组成的组中的属。在另一个实施方案中，所述植物可以源于选自由柑桔树、菠萝、咖啡、茶、烟草、向日葵、豌豆、苜蓿、大豆、胡萝卜、芹菜、番茄、马铃薯、棉花、烟草、茄子、胡椒、油菜、芸苔、甜菜、卷心菜、花椰菜、绿花椰菜、莴苣、百脉根属物种、蒺藜苜蓿和拟南芥组成的组中的属。在另一个实施方案中，所述植物可以源于选自由烟草、向日葵、豌豆、苜蓿、大豆、番茄、马铃薯、棉花、烟草、茄子、胡椒、油菜、芸苔、甜菜、卷心菜、花椰菜、绿花椰菜、莴苣、百脉根属物种、蒺藜苜蓿和拟南芥组成的组中的属。在另一个实施方案中，所述植物来自选自由柑桔树、菠萝、咖啡、茶、烟草、向日葵、豌豆、苜蓿、大豆、胡萝卜、芹菜、番茄、马铃薯、棉花、烟草、茄子、胡椒、油菜、芸苔、甜菜、卷心菜、花椰菜、绿花椰菜、莴苣、百脉根属物种、蒺藜苜蓿、和拟南芥组成的组中的属。在另一个实施方案中，所述植物来自选自由烟草、向日葵、豌豆、苜蓿、大豆、番茄、马铃薯、棉花、烟草、茄子、胡椒、油菜、芸苔、甜菜、卷心菜、花椰菜、绿花椰菜、莴苣、百脉根属物种、蒺藜苜蓿和拟南芥组成的组中的属。在另一个实施方案中，所述植物来自选自由玉米、小麦、大麦、高粱、黑麦、黑小麦、稻、甘蔗、菠萝、椰子、香蕉、多年生草和黑麦草组成的组的属。

本发明的转基因植物可以利用已知的植物育种方法与相似的转基因植物或与缺少本发明启动子多核苷酸及第二多核苷酸的转基因植物或者与非转基因植物杂交，以制备种子。本发明转基因植物可以包含与本发明启动子多核苷酸或与另一种启动子有效连接的一个或多个不同目的基因，或者可以与包含如此目的基因的另一种转基因植物杂交，从而在该植物和/或其子代中产生转基因“垛叠”。随后播种种子以获得包含目的核酸和本发明启动子多核苷酸的杂交的能育转基因植物。杂交的能育转基因植物可以具有通过雌性亲本或通过雄性亲本遗传的特定表达盒。第二种植物可以是近交植物。杂交的能育转基因植物可以是杂交种。本发明还包括这些杂交的能育转基因植物任一种的种子。本发明的种子可以从能育转基因植物收获并且用来培育本发明的转化植物的子孙世代(包括包含所述DNA构建体的杂交植物系)。

“基因垛叠”也可以通过将两个或多个基因借助植物转化转移至细胞核而实现。多个基因可以在转化期间依次地或一起导入细胞核。植物中或目标病原体物种中的多个基因可以通过使用靶定多个连接的部分目的序列的单个转基因借助沉默机制、尤其RNAi进行下调。在各自启动子控制下的多个垛叠基因也可以过量表达以获得想要的单个或多个表型。也可以将含有过量表达基因和受沉默靶标的基因垛叠的构建体导入植物，从而产生单个或多个农学重要的表型。在某些实施方案中，本发明的核酸序列可以与目的多核苷酸序列的任一组合垛叠以产生所需表型。所述组合可以产生具有多种性状组合的植物，所述性状组合包括，但不限于抗病性、除草剂耐受性、产量增加、耐寒性和耐旱性。这些垛叠的组合可以由任一方法产生，所述的任一方法包括，但不限于通过常规方法或通过遗传方法对植物进行杂交育种。若性状通过遗传转化进行堆叠，则目的多核苷酸序列可以按照任一顺序依次或同时组合。例如，若欲导入两个基因，则这两个序列可以包含在独立的转化盒内或位于相同的转化盒上。所述序列的表达可以由相同或不同的启动子驱动。

本发明还包括作物，所述的作物包括在农田中一起栽种的多种本发明转基因植物。

本发明的转基因植物可以用于控制作物中植物寄生线虫侵染的方法内，所述方包括以下步骤：从包含表达盒的种子培育出所述作物，其中所述的表达盒包含与编码物质的第二多核苷酸有效连接的本发明植物启动子多核苷酸，所述的物质破坏所述植物寄生线虫的代谢、生长和/或繁殖，改善植物对所述植物寄生线虫的耐受性或对所述植物寄生线虫有毒，其中所述表达盒稳定整合至植物细胞、植物和/或种子的基因组内。此类物质包括而不限于，与对于线虫存活、变态或繁殖必需的植物寄生线虫的靶基因基本上同一的双链RNA；与维持线虫采食部位所需的植物基因基本上同一的双链RNA；反义RNA、siRNA、miRNA或其前体、干扰所述线虫代谢、存活、变态或繁殖的蛋白质，微生物毒素、来自昆虫的毒素，其所述线虫代谢、存活、变态或繁殖等。

本发明的启动子包含分离的核酸，其选自：a)具有如SEQ ID NO：1、2或3中所示序列的多核苷酸；b)包含具有如SEQ ID NO：1中所示序列的多核苷酸的核苷酸748到998，或核苷酸500到998，或核苷酸573到922的多核苷酸；c)包含具有如SEQ ID NO：2中所示序列的多核苷酸的核苷酸651到1000的多核苷酸；d)包含具有如SEQ ID NO：3中所示序列的多核苷酸的核苷酸400到609，或核苷酸260到609，或核苷酸200到609的多核苷酸；e)与a)到d)的多核苷酸的任一个有至少70％序列同一性的多核苷酸；f)在严格条件下与a)到d)的多核苷酸的任一个杂交的多核苷酸；和g)包含具有如SEQ ID NO：1、2或3中所示序列的多核苷酸的至少50个连续核苷酸、或至少100个连续核苷酸、或至少200个连续核苷酸的片段的多核苷酸，其中所述启动子能够介导根特异性和/或线虫诱导型表达。在进一步的实施方案中，所述核酸包含具有如SEQ ID NO：1中所示序列的多核苷酸的核苷酸748到998，或核苷酸500到998，或核苷酸573到922。在进一步的实施方案中，所述核酸与多核苷酸有至少70％序列同一性，所述多核苷酸选自具有如SEQ ID NO：1所示序列的多核苷酸、包含SEQ IDNO：1的核苷酸748到998的多核苷酸、包含SEQ ID NO：1的核苷酸500到998的多核苷酸、包含SEQ ID NO：1的核苷酸573到922的多核苷酸。在进一步的实施方案中，所述核酸包含具有如SEQ ID NO：2所示序列的多核苷酸的核苷酸651到1000。在进一步的实施方案中，所述核酸与选自具有如SEQ ID NO：2所示序列的多核苷酸和包含SEQ ID NO：2的核苷酸651到1000的多核苷酸的多核苷酸有至少70％序列同一性。在进一步的实施方案中，所述核酸包含具有如SEQ ID NO：3中所示序列的多核苷酸的核苷酸400到609，或核苷酸260到609，或核苷酸200到609。在进一步的实施方案中，所述核酸与选自具有如SEQ ID NO：3所示序列的多核苷酸、包含SEQ ID NO：3的核苷酸400到609的多核苷酸、包含SEQ ID NO：3的核苷酸260到609的多核苷酸、和包含SEQ ID NO：3的核苷酸200到609的多核苷酸的多核苷酸有至少70％序列同一性。

此外，本发明涉及包含本发明的启动子的表达盒，其还包含一个或多个有效连接的多核苷酸。在进一步的实施方案中，所述表达盒是这样的表达盒，其中所述有效连接的多核苷酸编码破坏植物寄生线虫的代谢、生长和/或生殖、赋予或提高植物对植物寄生线虫的抗性，或对植物寄生线虫有毒的物质。

此外，本发明涉及用表达盒转化的转基因植物，其中所述表达盒包含分离的核酸，其选自：a)具有如SEQ ID NO：1、2或3中所示序列的多核苷酸；b)包含具有如SEQ ID NO：1中所示序列的多核苷酸的核苷酸748到998，或核苷酸500到998，或核苷酸573到922的多核苷酸；c)包含具有如SEQ ID NO：2中所示序列的多核苷酸的核苷酸651到1000的多核苷酸；d)包含具有如SEQ ID NO：3中所示序列的多核苷酸的核苷酸400到609，或核苷酸260到609，或核苷酸200到609的多核苷酸；e)与a)到d)的多核苷酸的任一个有至少70％序列同一性的多核苷酸；f)在严格条件下与a)到d)的多核苷酸的任一个杂交的多核苷酸；和g)包含a)到d)的任一多核苷酸的生物活性部分的多核苷酸；和h)包含具有如SEQ ID NO：1、2或3中所示序列的多核苷酸的至少50个连续核苷酸、或至少100个连续核苷酸、或至少200个连续核苷酸的片段的多核苷酸。在进一步的实施方案中，所述转基因植物包含表达盒，该表达盒包含与所述核酸有效连接的一个或多个多核苷酸。在进一步的实施方案中，所述转基因植物选自玉米、小麦、大麦、高粱、黑麦、黑小麦、稻、甘蔗、柑桔树、菠萝、椰子、香蕉、咖啡、茶、烟草、向日葵、豌豆、苜蓿、大豆、胡萝卜、芹菜、番茄、马铃薯、棉花、烟草、茄子、胡椒、油菜、芸苔、甜菜、卷心菜、花椰菜、绿花椰菜、莴苣、百脉根属物种、蒺藜苜蓿、多年生草、黑麦草和拟南芥。在进一步的实施方案中，所述转基因植物用表达盒转化，其中该表达盒包含具有如SEQ ID NO：1中所示序列的多核苷酸的核苷酸748到998，或核苷酸500到998，或核苷酸573到922。在进一步的实施方案中，所述转基因植物用表达盒转化，其中该表达盒包含与一多核苷酸有至少70％序列同一性的核酸，该多核苷酸选自具有如SEQ ID NO：1所示序列的多核苷酸、包含SEQ ID NO：1的核苷酸748到998的多核苷酸、包含SEQ ID NO：1的核苷酸500到998的多核苷酸、包含SEQ ID NO：1的核苷酸573到922的多核苷酸。在进一步的实施方案中，所述转基因植物用表达盒转化，其中该表达盒包含核酸，该核酸包含具有如SEQ ID NO：2所示序列的多核苷酸的核苷酸651到1000。在进一步的实施方案中，所述转基因植物用表达盒转化，其中该表达盒包含与一多核苷酸有至少70％序列同一性的核酸，该多核苷酸选自具有如SEQ ID NO：2所示序列的多核苷酸和包含SEQ IDNO：2的核苷酸651到1000的多核苷酸。在进一步的实施方案中，所述转基因植物用表达盒转化，其中该表达盒包含核酸，该核酸包含具有如SEQID NO：3中所示序列的多核苷酸的核苷酸400到609，或核苷酸260到609，或核苷酸200到609。在进一步的实施方案中，所述转基因植物用表达盒转化，其中该表达盒包含与一多核苷酸有至少70％序列同一性的核酸，该多核苷酸选自具有如SEQ ID NO：3所示序列的多核苷酸、包含SEQ IDNO：3的核苷酸400到609的多核苷酸、包含SEQ ID NO：3的核苷酸260到609的多核苷酸、和包含SEQ ID NO：3的核苷酸200到609的多核苷酸。

此外，本发明涉及赋予或提高植物中线虫抗性的方法，其包括a)制备包含与一个或多个多核苷酸有效连接的权利要求1的启动子的构建体，b)用a)的构建体转化植物细胞，其中该启动子应答线虫刺激而诱导植物细胞中有效连接的多核苷酸的转录；和c)再生所转化的植物细胞以产生具有线虫抗性或提高的线虫抗性的转基因植物。在进一步实施方案中，所述方法是这样的方法，其中有效连接的核酸编码破坏植物寄生线虫的代谢、生长和/或生殖、赋予或提高植物对植物寄生线虫的抗性，或对植物寄生线虫有毒的物质。在另一实施方案中，所述方法是这样的方法，其中所述启动子是根优选的和/或线虫诱导型启动子。

此外，本发明涉及赋予或提高植物中线虫抗性的方法，其包括a)制备构建体，其包含第一核酸，该第一核酸与具有权利要求1的核酸序列的第二核酸序列反义互补，b)用a)的构建体转化植物细胞，其中所述第一核苷酸序列破坏或下调第二核酸序列的调节功能；和c)再生所转化的植物细胞以产生具有线虫抗性或提高的线虫抗性的转基因植物。在另一实施方案中，所述方法是这样的方法，其中所述启动子是根优选的和/或线虫诱导型启动子。

以下实例不意图限制本发明权利要求书的范围，而是意图作为某些实施方案的示例。所例举方法中技术人员想到的任一变化将属于本发明的范围。

实施例

实施例1从大豆克隆MtN3-样基因启动子

合胞体的激光切除

使大豆栽培种Williams 82在琼脂平板上萌发三天，然后转移至萌发袋中。一天后，用大豆异皮线虫品种3的第二阶段幼虫(J2)孵育每个幼苗。接种后六天，使用已知方法将新的根组织切成1cm长的段、固定、包埋在cryomold中并切片。通过扩大的细胞尺寸、增厚的细胞壁和稠密的细胞质的特有形态识别合胞体细胞，并使用PALM显微镜(P.A.L.M.Microlaser Technologies GmbH，Bernried，德国)解剖入RNA提取缓冲液中。

使用已知方法提取总细胞RNA、扩增并用荧光标记。作为对照，从“非-合胞体”和未经处理的对照根分离总RNA并进行相同的RNA扩增过程。将扩增的RNA与专有的大豆cDNA阵列杂交。表1总结了通过cDNA微阵列测量的表达数据，所述cDNA微阵列针对所有三种细胞/组织样品(合胞体、SCN感染的非-合胞体和未经处理的对照根组织)中的基因进行分析。基因表达的相对水平显示为归一化的信号强度(±标准差)。如表1中所述，大豆cDNA克隆47116125被鉴定为在SCN-感染的大豆根的合胞体中被上调。

表1.蒺藜苜蓿结瘤蛋白3-样(MtN3-样)基因的表达

基因名称	合胞体#1(N)	合胞体#2(N)	非合胞体	对照根
					47116125	3104±477(4)	2117±450(5)	99±62	191±90

(N)cDNA微阵列测量数目

如表1中阐明，将大豆cDNA克隆47116125鉴定为在SCN感染的大豆根的合胞体中被上调。图4描绘了大豆cDNA克隆47116125的序列。基于如图5所示与基因座标记At1g21460和At5g53190的拟南芥氨基酸序列的氨基酸同源性，确定47116125cDNA序列(SEQ ID NO：4)含有完整可读框序列。如图4中所示的47116125cDNA序列(SEQ ID NO：4)从碱基23到787的可读框被翻译并且通过SEQ ID NO：5和图5中标记为47116125的序列表示。

为了克隆47116125的启动子序列，根据生产商的使用说明使用通用基因组步查试剂盒(Universal Genome Walking Kit)(Clontech LaboratoriesInc.，Palo Alto，Calif.)。为此，用Qiagen DNAeasy Plant Minikit(Qiagen)提取大豆(Glycine max，Resnik)基因组DNA。该程序由两次PCR扩增组成，对于每次扩增反应使用衔接引物和基因特异性引物。用于分离本发明启动子的引物序列在图11中显示。靶定47116125(SEQ ID NO：4)的基因特异性引物是主要引物47116125GW(SEQ ID NO：15)和嵌套引物47116125GWnest(SEQ ID NO：16)。使用的衔接引物为AP1(SEQ IDNO：13)和AP2(SEQ ID NO：14)。使用该方案，分离了一些克隆并对其测序。

将最长克隆的产物鉴定为pAW127(SEQ ID NO：8)。pAW127与47116125cDNA序列(SEQ ID NO：4)的序列比对表明该克隆与图7中所示的47116125几乎相同。pAW127序列和47116125cDNA序列之间的序列错配在图7中用星号标记。比对揭示pAW127含有ATG上游的从pAW127序列的核苷酸51到659的609bp启动子序列(见图7)。该比对也揭示终止密码子在相同读框中ATG起始密码子上游bp627处开始，表明在bp660处开始的起始密码子是47116125基因序列的可读框的第一个起始密码子。使用标准PCR技术和引物47116125prF(SEQ ID NO：17)和47116125prR(SEQ ID NO：18)从pAW127克隆出该启动子区。47116125prF和47116125prR扩增了来自pAW127的609bp启动子片段，其含有限制酶位点PstI和AscI以易于定向克隆。47116125启动子和5’UTR序列(没有用于克隆的限制性位点)显示为SEQ ID NO：3。核苷酸序列1-609代表整个启动子区，核心启动子区跨越核苷酸260-609。推断的TATA信号跨越核苷酸513到519并且该mRNA的推断的5’非翻译引导序列为从核苷酸553-609。

实施例2从拟南芥克隆MtN3-样基因启动子多核苷酸

拟南芥At1g21460和At5g53190基因的启动子多核苷酸区基于它们编码的氨基酸序列(分别SEQ ID NO：6和SEQ ID NO：7)与大豆cDNA克隆47116125(SEQ ID NO：5)的氨基酸序列的相似性而被选择，如图5所示。使用Qiagen DNAeasy Plant Minikit(Qiagen，Valencia，California，US)提取拟南芥(哥伦比亚生态型)基因组DNA。使用标准PCR扩增方案克隆紧邻ATG密码子上游的998bp(SEQ ID NO：1)和1,986bp(SEQ ID NO：2)基因组DNA区(启动子多核苷酸)，包括对应于分别具有基因座标记At1g21460和At5g53190的拟南芥MtN3-样基因的5’非翻译区。用于拟南芥启动子多核苷酸的PCR扩增的引物在图11中显示并且基于拟南芥基因组序列数据库(TAIR)设计。SEQ ID NO：9所述的引物序列含有用于易于克隆的PstI限制酶位点。SEQ ID NO：11所述的引物序列含有用于易于克隆的PacI限制酶位点。SEQ ID NO：10和SEQ ID NO：12所述的引物序列含有用于易于克隆的AscI限制酶位点。SEQ ID NO：9和SEQ ID NO：10所述的引物序列用于扩增SEQ ID NO：1所述的拟南芥基因座At1g21460的启动子多核苷酸。SEQ ID NO：11和SEQ ID NO：12所述的引物序列用于扩增SEQ ID NO：2所述的拟南芥基因座At5g53190的启动子多核苷酸。

为每种PCR产物扩增的DNA片段大小通过标准琼脂糖凝胶电泳验证并提取DNA。使用TOPO TA克隆试剂盒按照生产商的使用说明(Invitrogen)将纯化的片段克隆到pCR2.1中，并使用Applied Biosystem373A(Applied Biosystems，Foster City，California，US)自动化测序仪测序。对应于At1g21460和At5g53190的启动子多核苷酸的998bp和1,986bpDNA片段如SEQ ID NO：1和SEQ ID NO：2所示。引入引物中以方便克隆的限制酶位点没有包括在序列中。

实施例3双元载体构建用于转化和产生转基因发根

为了评估所克隆的启动子多核苷酸的表达活性，将对应于SEQ IDNO：1的核苷酸1到998，SEQ ID NO：2的核苷酸1到1,986和SEQ ID NO：3的核苷酸1到609的基因片段克隆到GUS报道基因(细菌β-葡糖醛酸糖苷酶或GUS基因(Jefferson(1987)EMBO J.6，3901-3907))的上游以分别产生双元载体pWT128qcz、RCB1022和pAW222qcz。双元载体pWT128qcz和pAW222qcz中的植物选择标记是来自拟南芥的乙酰羟酸合酶(AHAS)基因的除草剂抗性形式(Sathasivan et al.，Plant Phys.97：1044-50，1991)。ARSENAL(灭草烟，BASF Corp，Florham Park，NJ)被用作选择剂。双元载体RCB1022中的植物选择标记是来自拟南芥的乙酰羟酸合酶(AHAS)基因的除草剂抗性形式，其通过组成型芹菜泛蛋白启动子驱动(Sathasivan等，Plant Phys.97：1044-50，1991；Plesch，G.；Ebneth，M.Method for thestable expression of nucleic acids in transgenic plants，controlled by aparsley ubiquitin promoter.专利申请WO 03/102198A1；2003)。

在本实施例中，通过电穿孔将双元载体pWT128和pAW222qcz转化到发根土壤杆菌K599菌株中。在发根土壤杆菌接种前，将来自大豆Williams 82(SCN-敏感的)的种子发芽，切除子叶，并将近轴侧弄伤数次。将发根土壤杆菌悬浮液接种在受伤表面上，接种的子叶近轴侧向上在25℃、16小时/天光照下培育长达3天。然后将子叶转移到含有羧苄青霉素(用于抑制发根土壤杆菌生长)和作为选择剂的1μM ARSENAL(灭草烟，BASF Corporation，Florham Park，NJ)的MS平板上。两周后从受伤部位诱导发根。收获抗ARSENAL的根并且在选择培养基上生长并转移到相同组成的新鲜选择培养基上并在25℃下黑暗中培育。两周后收获发根并将它们在选择培养基上培养，发根在含有羧苄青霉素但是没有ARSENAL的MS培养基上传代培养。

用pAW280转化产生几个独立的转基因发根株系。传代培养后约3周，将转基因发根株系用大豆异皮线虫品种3J2接种。大豆异皮线虫接种后12天(DAI)，收获发根并使用5-溴-4-氯-3-吲哚基-β-D-葡糖醛酸(x-Gluc)测定GUS基因的β-葡糖醛酸糖苷酶活性。在接种后的每个时间点，来自每个株系的未接种的对照平板也在含有GUS的溶液中染色。在显微镜下观察根以检测GUS表达。对于每种转基因株系，观察10个随机挑取的合胞体并对GUS表达的强度打分。使用下面的评分指标：“-”表示无染色，“+”表示弱染色，“++”表示强染色。用10次计数的上舍入平均值确定该株系的合胞体中的GUS表达水平。此外，也使用相同的GUS评分指数记录相同株系的其他根组织如胼胝体、根尖、维管结构、皮层和原基根中的GUS表达水平，“-”表示无染色，“-/+”表示约25％的测试株系在小于25％的所观察的根组织中显示维管GUS染色，“+”表示弱染色，“++”表示强染色。用pWT128和pAW222qcz转化的株系的结果在图8中给出。

GUS染色的结果表明对于多数测试的株系，pWT128中的启动子多核苷酸片段在12DAI在合胞体和根维管组织中显示出中等到强烈的GUS表达。相比，在其他根部分如根尖和根皮层中的GUS表达没有检测到或者非常弱。此外，GUS染色的结果表明对于多数测试的株系，pAW222qcz中的启动子多核苷酸片段在合胞体和根维管组织中在12DAI时显示出强GUS表达。相比，其他根部分如根尖和根皮层中的GUS表达没有检测到或非常弱。

实施例4At1g21460(SEQ ID NO：1)和p-47116125(SEQ ID NO：3)启动子多核苷酸的克隆检测

为了更准确定义At1g21460(SEQ ID NO：1)和p-47116125(SEQ IDNO：3)的启动子多核苷酸区，测试了上游序列的较短片段。使用Qiagen质粒小量制备试剂盒(Qiagen)从大肠杆菌提取pWT128和pAW222qcz的质粒DNA。使用标准PCR扩增方案扩增pWT128中所含的拟南芥基因座At1g21460启动子多核苷酸(SEQ ID NO：1)的499bp和251bp启动子多核苷酸缺失片段和pAW222qcz中所含的大豆cDNA克隆p-47116125(SEQID NO：3)的410bp和210bp启动子多核苷酸缺失片段。为此，将约0.1μgpWT128或pAW222qcz质粒DNA用作PCR反应中的DNA模板。用于拟南芥启动子多核苷酸的PCR扩增的引物在图11中显示并且基于pWT128中所含的拟南芥基因座At1g21460启动子多核苷酸(SEQ IDNO：1)的启动子多核苷酸序列或者pAW222qcz中所含的大豆p-47116125(SEQ ID NO：3)的启动子多核苷酸设计。SEQ ID NO：19、SEQ ID NO：20、SEQ ID NO：22和SEQ ID NO：23所述的引物序列含有用于容易克隆的PstI限制酶位点。SEQ ID NO：21所述的引物序列与pWT128中的At1g21460启动子多核苷酸的3’末端和AscI位点退火使得在扩增的片段中将含有AscI位点用于易于克隆。SEQ ID NO：24所述的引物序列与pAW222qcz中AscI位点上游的p-47116125启动子多核苷酸的3’末端退火使得AatII位点将被包含在扩增片段中以易于克隆。SEQ ID NO：19和SEQID NO：21所述的引物序列用于扩增pWT128中所含的拟南芥基因座At1g21460启动子多核苷酸的499bp启动子多核苷酸缺失区。SEQ IDNO：20和SEQ ID NO：21所述的引物序列用于扩增pWT128中所含的拟南芥基因座At1g21460启动子多核苷酸的251bp启动子多核苷酸缺失区。SEQ ID NO：22和SEQ ID NO：24所述的引物序列用于扩增pAW222qcz中所含的p-47116125的410bp启动子多核苷酸缺失区。SEQ ID NO：23和SEQ ID NO：24所述的引物序列用于扩增pAW222qcz中所含的p-47116125的210bp启动子多核苷酸缺失区。

每种PCR产物的扩增的DNA片段大小通过标准琼脂糖凝胶电泳验证并提取DNA。按照生产商的使用说明(New England Biolabs，Ipswich，Massachusetts，US)，对于从pWT128扩增的At1g21460的启动子多核苷酸缺失，纯化的片段用PstI和AscI消化，对于从pAW222qcz扩增的p-47116125的启动子多核苷酸缺失，纯化的片段用PstI和AatII消化。消化的片段用Qiagen PCR纯化试剂盒(Qiagen)纯化。使用引物SEQ IDNO：19和SEQ ID NO：21扩增的At1g21460启动子多核苷酸的499bp启动子多核苷酸缺失区通过SEQ ID NO：1的碱基500到998表示。使用引物SEQ ID NO：20和SEQ ID NO：21扩增的At1g21460启动子多核苷酸的251bp启动子多核苷酸缺失区通过SEQ ID NO：1的碱基748到998表示。使用引物SEQ ID NO：22和SEQ ID NO：24扩增的p-47116125启动子多核苷酸的410bp启动子多核苷酸缺失区通过SEQ ID NO：3的碱基200到609表示。使用引物SEQ ID NO：23和SEQ ID NO：24扩增的p-47116125启动子多核苷酸的210bp启动子多核苷酸缺失区通过SEQ ID NO：3的碱基400到609表示。引入引物用于方便克隆的限制性位点没有包括在指定的序列中。

实施例5At1g21460和p-47116125启动子多核苷酸缺失的双元载体构建用于转化和产生转基因发根

为了评估来自pWT128和pAW222qcz的克隆的启动子多核苷酸缺失的表达活性，将对应于SEQ ID NO：1的核苷酸500到998、SEQ ID NO：1的核苷酸748到998、SEQ ID NO：3的核苷酸200到609和SEQ ID No：3的核苷酸400到609的基因片段克隆在GUS报导基因(细菌β-葡糖醛酸糖苷酶或GUS基因)的上游以分别产生双元载体RTJ113、RTJ114、RTJ117和RTJ118。双元载体中的植物选择标记是从拟南芥中突变的AHAS基因(Sathasivan等，Plant Phys.97：1044-50，1991)，其赋予对除草剂ARSENAL(灭草烟，BASF Corporation，Florham Park，NJ)的耐受性。

在本实施例中，通过电穿孔将双元载体RTJ113、RTJ114、RTJ117和RTJ118转化到发根土壤杆菌K599菌株中，其又用于如实施例3所述产生转基因发根。转基因发根用于GUS染色以检测启动子多核苷酸活性，如实施例3所述。

对于每个转基因系，观察10个随机挑选的合胞体并对感染后12日(DAI)的GUS表达强度进行评定。使用以下评分指标：“-”，无染色；“+”，弱染色；“++”，强染色。使用10次计数的向上舍入平均数来确定该转基因系的合胞体中的GUS表达水平。此外，相同转基因系中其他根组织如胼胝体、根尖、维管结构、皮层和原基根内的GUS表达水平也使用相同的GUS评分指标加以记录，即“-”，无染色；“+”，弱染色；“++”，强染色。用pWT128、RTJ113和RTJ114转化的株系的结果在图9中给出。用pAW222qcz、RTJ117和RTJ118转化的株系的结果在图10中给出。

分别在RTJ113和RTJ114中含有的At1g21460启动子多核苷酸的499和251bp启动子多核苷酸片段都能够赋予在合胞体中线虫诱导的表达，表明导致线虫诱导的表达的所有需要的调节元件都包含在RTJ114中所含的251bp启动子多核苷酸中。结果表明与pWT128启动子序列相比，分别在RTJ113和RTJ114中所含的At1g21460启动子的499和251bp启动子多核苷酸片段中有更多的维管组织表达。

分别在RTJ117和RTJ118中所含的p-47116125启动子多核苷酸的410和210bp启动子多核苷酸片段都能够赋予在合胞体中线虫诱导的表达，表明导致线虫诱导的表达的所有需要的调节元件都包含在RTJ118中所含的210b启动子多核苷酸片段中。结果表明与pAW222qcz启动子序列相比，在RTJ114中所含的p-47116125启动子的210bp启动子多核苷酸片段中有更少的维管组织表达。

实施例6启动子多核苷酸的PLACE分析

PLACE(National Institute of Agrobiological Sciences，Ibaraki，Japan)分析结果指出TATA盒位于SEQ ID NO：1的核苷酸位置830到核苷酸位置836，如图1所示。根据TAIR网址信息，5’非翻译区在约核苷酸位置923处开始。SEQ ID NO：1所述的序列在紧邻ATG起始密码子之前结束。SEQ ID NO：1所述的启动子多核苷酸的潜在核心区为从核苷酸位置573到核苷酸位置9

PLACE分析结果指出没有TATA盒位于图2所示的SEQ ID NO：2的3’末端的约300bp内。预测的5’非翻译区是未知的。SEQ ID NO：2所述的序列在紧邻ATG起始密码子之前z。SEQ ID NO：2所述的启动子多核苷酸的潜在核心区为从核苷酸位置986到核苷酸位置1637。

PLACE结果表明TATA盒位于如图3所示的SEQ ID NO：3的核苷酸位置513到核苷酸位置519。因此，5’非翻译区在约核苷酸位置553处开始。SEQ ID NO：3所述的序列在紧邻ATG起始密码子之前结束。SEQ IDNO：3所述的启动子多核苷酸的潜在核心区为从核苷酸位置260到核苷酸位置609。

实施例7双元载体构建以产生具有BAR选择的完整植物启动子多核苷酸构建体

为了评估大豆根瘤杆菌(Bradyrhizobium japonicum)感染和用立枯丝核菌大豆专化型(Rhizoctonia solani forma specialis(f.sp.)glycines)和腐皮镰孢大豆专化型(Fusarium solani f.sp.Glycines)进行真菌接种后，通过SEQID NO：1的从250到998位的核苷酸和SEQ ID NO：3的从1到609位核苷酸代表的克隆的启动子多核苷酸的表达活性，将SEQ ID NO：1的从250到998位的核苷酸和SEQ ID NO：3的从1到609位核苷酸代表启动子多核苷酸克隆在GUS报道基因(细菌β-葡糖醛酸糖苷酶或GUS基因)的上游以分别产生双元载体RTJ125和RTJ129。双元载体中的植物选择标记是BAR基因(De Block，M.et.al.(1987)EMBO J.6：2513-2518)，其由组成型胭脂碱合酶基因启动子驱动(p-NOS，An G.等，The Plant Cell 3：225-233，1990)。双元载体RTJ125和RTJ129用于产生转基因根进行分析。

实施例8大豆生根的植物测定系统

该测定法可以发现于2006年12月21日提交的共同待决的申请USSN60/871,258中，将其并入本文作为参考，并且可见于下面的描述。

将来自大豆栽培种的清洁大豆种子表面消毒并萌发。所得的大豆幼苗具有长的下胚轴与可见的上胚轴。通过除去上胚轴和部分下胚轴制备外植体。外植体含有一片或两片子叶，腋生分生组织和下胚轴。除去种皮以促进子叶发育。下胚轴的切割端是转化/转染的目标。接种前3天，启动卸甲土壤杆菌培养物，例如，含有所述双元载体的卸甲发根土壤杆菌菌株K599的过夜液体培养。第二天，将培养物在含有作为选择剂的卡那霉素的LB琼脂板上涂布。将平板在28℃下培育2天。为待接种的每50个外植体制备一个平板。将制备的外植体浸入如上制备的卸甲的浓密发根土壤杆菌菌落中，使得菌落在切割端表面上可见。然后将外植体置于培养皿中1％琼脂上用于在光下共同培养6-8天。转化和共培养后，将大豆外植体转移到具有选择剂的根诱导培养基，例如S-B5-607上用于Bar基因选择(De Block等，EMBO J.6：2513-2518，1987)。S-MS-607培养基包含：0.2X MS盐和B5维生素，2％蔗糖，400mg/l泰门汀，和3mg/L草铵磷，pH5.8。外植体保持在与共培养步骤相同的条件下。选择和根诱导后2到3周，在外植体的切割末端上形成转化的根。将外植体转移到相同选择培养基(S-B5-607培养基)上用于进一步选择。转基因根在培养基中一周内良好增殖并且预备传代培养。

实施例9生根的植物测定系统根瘤诱导和根瘤中启动子多核苷酸活性的检测

如实施例7中所述，将本发明的启动子多核苷酸置于与GUS报道基因有效连接以测定表达活性。在活性染色反应中通过生色物质如5-溴-4-氯-3-吲哚基-β-D-葡糖醛酸(x-Gluc)可以检测植物中GUS基因的β-葡糖醛酸糖苷酶活性(Jefferson，如上)。

在本实施例中，通过电穿孔将双元载体RTJ125和RTJ129转化到卸甲的发根土壤杆菌K599菌株SHA017(pSB1)中。转化的土壤杆菌用于诱导大豆根形成，使用实施例8中给出的方案并使用下胚轴的切割端作为土壤杆菌转化/感染的靶标进行所述诱导。从延长培养基除去生根的外植体并用水洗涤根以除去过量培养基。将整个外植体转移到含有湿沙的4英寸花盆中。用缓冲的结瘤培养基(Ehrhardt等，1992)每两天灌溉外植体。在湿沙中2天后，外植体根用大豆根瘤杆菌接种。

为此，4ml大豆根瘤杆菌培养在YM液体培养基中开始并在28℃下摇动下生长。YM培养基每升含有：10g甘露醇，0.4g酵母提取物，1mlK₂HPO₄(10％w/v原液)，4ml KH₂PO₄(10％w/v原液)，1ml NaCl(10％w/v原液)，和2ml MgSO₄.7H₂O(10％w/v原液)。调节pH至6.8并对1升终体积的溶液高压灭菌。7天后，将600微升起始培养物转移到40ml新鲜YM液体培养基中。开始多个40ml培养。培养物在28℃下摇动下生长48小时至OD600约0.2。合并大豆根瘤杆菌培养物并用缓冲的结瘤培养基稀释6倍。含有生根外植体的每个花盆用约25ml稀释的大豆根瘤杆菌培养物接种。使用木钉在沙中产生约2英寸深的约4个孔，并用移液器将稀释的大豆根瘤杆菌培养物接种在孔中。从接种后当天开始，每两天用缓冲的结瘤培养基灌溉生根的外植体。

2周后，从4英寸花盆取出生根的外植体并用水洗涤根以除去沙子。含有根瘤的根区域用刀片解剖并置于含有X-Gluc(2mg/l)的GUS染色溶液中并转移到37℃16小时。用刀片将一些根瘤切成两半。除去GUS染色溶液并用含有相等份额的甘油、水和乙酸的溶液替换。然后观察根瘤的GUS染色。观察到构建体RTJ125中所含的SEQ ID NO：1的bp 250到998所述的启动子多核苷酸没有在根瘤中诱导GUS表达。观察到RTJ129中所含的SEQ ID NO：3所述的启动子多核苷酸在根瘤中诱导GUS表达，在一些根瘤的基部观察到低表达程度。

实施例10真菌接种的根中启动子多核苷酸活性的生根植物测定法检测

如实施例7中所述，将本发明的启动子多核苷酸与GUS报道基因有效连接放置以测定表达活性。在活性染色反应中通过生色物质如5-溴-4-氯-3-吲哚基-β-D-葡糖醛酸(x-Gluc)可以检测植物中GUS基因的β-葡糖醛酸糖苷酶活性。

在本实施例中，通过电穿孔将双元载体RTJ125和RTJ129转化到卸甲的发根土壤杆菌K599菌株SHA017(pSB1)中。使用实施例8中给出的方案，转化的土壤杆菌用于诱导大豆根形成。

为了研究接种立枯丝核菌大豆专化型或腐皮镰孢大豆专化型后SEQID NO：1的bp 250到998和SEQ ID NO：3的bp 1到609的启动子多核苷酸活性，分别从构建体RTJ125和RTJ129的转化产生几个独立的转基因株系。通过使用镊子将小量菌丝与一些根相邻放置，传代的根系用立枯丝核菌大豆专化型或腐皮镰孢大豆专化型接种。在接种后3天(DAI)，从琼脂板除去根并在含有X-Gluc(2mg/l)的GUS染色溶液中37℃下染色16小时。然后在显微镜下观察根以检测GUS表达。

对于每种转基因株系，观察根并记录感染3天后(DAI)GUS表达的强度。在立枯丝核菌大豆专化型和腐皮镰孢大豆专化型接种后，观察到构建体RTJ125中所含的SEQ ID NO：1的bp 250到998所述的启动子多核苷酸根中没有诱导GUS表达。在用立枯丝核菌大豆专化型或腐皮镰孢大豆专化型接种后观察到构建体RTJ129中所含的SEQ ID NO：3所述的启动子多核苷酸没有诱导根中的GUS表达。

实施例11用RCB1022进行生根植物测定转化用于GUS染色分析

在本实施例中，通过电穿孔将双元载体RCB1022转化到卸甲的发根土壤杆菌SHA017菌株中。使用实施例8中给出的方案，转化的土壤杆菌用于诱导大豆TRAP根形成。使用构建体RCB1022转化的卸甲土壤杆菌产生大豆TRAP根的多个株系。TRAP根系将以2000J2/平板水平接种表面消毒的SCN品种3的J2。在接种后12天(DAI)，通过从琼脂板取出收获根并更换水进行温和冲洗并在含有X-Gluc(2mg/l)的GUS染色溶液中37℃下染色16小时。来自每个株系的未接种的对照平板也在GUS染色溶液中染色。将在显微镜下观察根以检测GUS表达。

对于每个转基因株系，将观察10个随机挑取的合胞体并对感染后12天(DAI)后的GUS表达强度打分。将使用下面的评分指数：“-”表示无染色，“+”表示弱染色，“++”表示强染色。用10次计数的上舍入平均值确定该株系的合胞体中的GUS表达水平。此外，也使用相同的GUS评分指数记录相同株系的其他根组织如胼胝体、根尖、维管结构、皮层和原基根中的GUS表达水平，即“-”表示无染色，“+”表示弱染色，“++”表示强染色。

实施例12完整植物GUS染色

通过包含与GUS报道基因有效连接的启动子多核苷酸的转化构建体产生转基因大豆完整植物以表征在整个植物生命周期中，应答根和完整植物组织中线虫感染的启动子多核苷酸表达，所述启动子多核苷酸通过SEQID NO：1的250到998位的核苷酸、SEQ ID NO：1的500到998位的核苷酸、SEQ ID NO：1的748到998位的核苷酸、SEQ ID NO：3的1到609位的核苷酸、SEQ ID NO：3的200到609位的核苷酸、SEQ ID NO：3的400到609位的核苷酸或SEQ ID NO：2的1到1986位的核苷酸表示。大豆完整植株中启动子多核苷酸表征的代表性方法包括但不限于以下描述。测试转基因大豆T1种子的接合性(zygosity)，并使单拷贝事件萌发、在温室条件下培养，并针对叶、茎、花、胚和种皮组织中不同发育阶段的GUS表达进行取样。另外，在接种和未接种的对照根中，在SCN感染之前和之后的不同时间收获根组织。针对每个事件测试多种植物，以测定GUS染色分析中的一致趋势。从植物切除收获的样品并立即置于含有X-Gluc(2mg/l)的GUS染色溶液中，真空下浸润20分钟，并转移到37℃下16小时。然后观察组织并对GUS染色强度打分。

Claims (10)

1.包含分离的启动子多核苷酸的启动子，其能够介导根特异性和/或线虫诱导型表达，其中该启动子多核苷酸选自由下列多核苷酸组成的多核苷酸组：

a)如SEQ ID NO：3中所示的多核苷酸；

b)多核苷酸，其核苷酸序列为如SEQ ID NO：3中所示多核苷酸的核苷酸400到609，或核苷酸260到609，或核苷酸200到609。

2.权利要求1的启动子，其中所述分离的启动子多核苷酸的核苷酸序列为如SEQ ID NO：3所示多核苷酸的核苷酸400到609，或核苷酸260到609，或核苷酸200到609。

3.包含权利要求1的启动子多核苷酸的表达盒，其还包含一个或多个有效连接的多核苷酸。

4.权利要求3的表达盒，其中所述有效连接的多核苷酸编码一种物质，该物质破坏植物寄生线虫的代谢、生长和/或生殖，赋予或提高植物对植物寄生线虫的抗性或对植物寄生线虫有毒。

5.控制大豆中寄生线虫侵染的方法，所述方法包括使用用表达盒转化的转基因大豆，其中所述表达盒包含启动子多核苷酸，该启动子多核苷酸能够介导根特异性和/或线虫诱导型表达，其中该启动子多核苷酸选自由下列多核苷酸组成的多核苷酸组：

a)如SEQ ID NO：3中所示的多核苷酸；

b)多核苷酸，其核苷酸序列为如SEQ ID NO：3中所示多核苷酸的核苷酸400到609，或核苷酸260到609，或核苷酸200到609。

6.权利要求5的方法，其中所述表达盒还包含有效连接所述启动子多核苷酸的一个或多个多核苷酸。

7.权利要求5的方法，其中所述分离的启动子多核苷酸的核苷酸序列为如SEQ ID NO：3所示多核苷酸的核苷酸400到609，或核苷酸260到609，或核苷酸200到609。

8.赋予或提高大豆植物中线虫抗性的方法，其包括a)制备如权利要求4所述的表达盒，b)用a)的表达盒转化大豆植物细胞，其中所述启动子多核苷酸应答线虫刺激而诱导大豆植物细胞中有效连接的第二多核苷酸的转录；和c)再生所转化的大豆植物细胞以产生转基因植物和d)选择与具有相同基因型但是不包含a)的表达盒的大豆植物相比具有提高的线虫抗性的大豆植物。

9.权利要求8的方法，其中所述有效连接的第二多核苷酸编码破坏植物寄生线虫的代谢、生长和/或生殖、赋予或提高大豆植物对植物寄生线虫的抗性，或对植物寄生线虫有毒的物质。

10.赋予或提高大豆植物中线虫抗性的方法，其包括a)制备如权利要求3所述的表达盒，其包含与权利要求1的启动子多核苷酸为反义方向的第二多核苷酸，b)用a)的构建体转化大豆植物细胞，其中所述第二多核苷酸破坏或下调所述启动子多核苷酸的调节功能；和c)再生所转化的大豆植物细胞以产生转基因植物和d)选择与具有相同基因型但是不包含a)的表达盒的大豆植物相比具有提高的线虫抗性的大豆植物。

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