CN101010432A - 卸甲农杆菌菌株、Ri质粒和基于它们的转化方法 - Google Patents

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Abstract

本发明涉及农杆菌菌株K599(NCPPB2659)的“卸甲”菌株变体、Ri质粒pRi2659的“卸甲”质粒变体及其衍生物以及在植物转化中使用这些菌株和质粒的方法。

Description

卸甲农杆菌菌株、Ri质粒和基于它们的转化方法
技术领域
本发明涉及农杆菌菌株K599(NCPPB 2659)的“卸甲”菌株变体、Ri质粒pRi2659的“卸甲”质粒变体及其衍生物以及在植物转化中使用这些菌株和质粒的方法。
背景技术
农杆菌属(最近的综述参考Gelvin 2003)已经被划分为多个物种。然而，这种划分最主要反映了疾病症状学和宿主范围。放射形农杆菌(A.radiobacter)为“无毒力”物种，根癌农杆菌(A.tumefaciens)引起冠瘿病，发根农杆菌(A.rhizogenes)引起发根病，悬钩子农杆菌(A.rubi)引起茎瘿病，葡萄农杆菌(A.vitis)在葡萄和少数其他植物物种上引起菌瘿(Otten1984；Smith和Townsend 1907；Hildebrand 1934；发根农杆菌的综述参阅Nilsson和Olsson，1997)。尽管Bergey的系统细菌学手册(Manual ofSystematic Bacteriology)仍反映这种命名法，但该分类是复杂并且让人困惑的。疾病症状学主要归因于来自大质粒的DNA(T-DNA)在植物基因组中的转移、整合和表达，所述大质粒称为Ti(诱导瘤)和Ri(诱导根)质粒(Van Laerebeke 1974；Chilton 1977，1982；Moore 1979；White 1982；Tepfer 1983；Nester 1984)。加工特定的质粒并用另一类型的致瘤质粒替代此质粒可以改变疾病症状。例如，用含有胭脂碱型Ti质粒pTiC58的根癌农杆菌C58感染植物导致形成冠瘿畸胎瘤。加工此质粒时，该菌株变成非致病性的。在加工菌株中引入Ri质粒将细菌“转变”成发根菌株(Lam1984；White 1980)。此外，可以将来自根癌农杆菌的Ti质粒(诱导瘤)引入发根农杆菌，得到的菌株在高凉菜属(Kalanchoe)植物中刺激形态改变的瘤(Costantino 1980)。因此，由于通过用一种类型的致瘤质粒替换另一种就可以简单地将根癌农杆菌“转变”成发根农杆菌，因此术语“物种”开始失去意义。因此，近年来通过其冠瘿或发根表型区分菌株的方法看来已经不合适了，因为这些特征只是与染色体外质粒相关。基因组DNA分析显示前期分类为发根农杆菌的一些菌株与根癌农杆菌关系更为密切，反之亦然。
更有意义的分类系统基于生长和代谢特征将农杆菌属划分成“生物变型”(Keane 1970)。使用这一系统，多数根癌农杆菌和悬钩子农杆菌(Tighe2000)菌株属于生物变型I，发根农杆菌菌株划分在生物变型II中，葡萄农杆菌菌株代表生物变型III。更近地，已经提出了农杆菌属的另一种分类学分类系统(Young 2001)。最近，根癌农杆菌C58完整基因组(由线性和环形染色体、Ti质粒和另一大质粒组成，Goodner 1999，2001；Wirawan1996)DNA序列的完成可能提供将农杆菌“菌株”再分类到真实“物种”的起点。最近基于RAPD(随机扩增多态性DNA)的划分反映了基因组差异，并提供了若干农杆菌菌株的“家族”树(Llop 2003)。Sawada提出了改进的分类方案(Sawada 1993)。
尽管对农杆菌遗传背景的探索很少，但对其Ti或Ri质粒在植物感染中的功能已经有了广泛的了解。T-DNA的固定需要基因产物位于Ti或Ri质粒，一起称为vir基因，它们被来自损伤植物细胞的某些激发子反式激活而合成T-DNA的单链拷贝(T链)并转移进植物细胞(Zambryski 1992；Zupan 1995)。Ti质粒上T-DNA序列的侧翼为24 bp的短正向重复(Yadav1982)，这是T-DNA识别所必需的(Wang 1984)。紧密围绕在这些边界周围的序列似乎与在右边界起始的T链合成的极性有关(Wang 1987)。可以使用根癌农杆菌作为载体将侧翼为T-DNA边界序列的外源DNA转移进植物细胞(Hernalsteens 1980)。失活或移除与激素合成相关的天然T-DNA基因将使根癌农杆菌不能产生冠瘿病症状。这种失活或移除造成疾病症状的基因的方法称为“卸甲”(disarming)。由于引入的基因直接替换T-DNA中的基因，因此根癌农杆菌改造的第一种方法涉及同时卸甲并引入目的基因。通过称为“同基因化”(Matzke和Chilton，1981)的方法，使用于转化的目的基因替换Ti质粒的天然T-DNA。开发用于改造根癌农杆菌的另一策略涉及将目的基因克隆进共整合中间载体，所述中间载体含有单个T-DNA同源性区和单个边界序列。在这种系统中，序列通过单交换事件重组(Horsch 1985)，产生包括整合的目的基因的完整载体。共整合系统在Ti质粒的T-DNA区与引入的整合载体DNA序列之间的同源区配对。有用的共整合质粒的一个实例为来自胭脂碱菌株(C58)的Ti质粒pGV3850，其中用pBR322替换了边界间的整个T-DNA区，从而提供用于含有pBR322同源性的任何基因构建体的重组位点(Zambryski 1983)。
基于T-DNA不需要与vir基因在同一质粒上这一发现(de Framond1983；Hoekema 1983，1985)开发了双元载体。双元载体与Ti质粒在根癌农杆菌中分开保持，并在T-DNA边界序列之间含有目的基因和植物选择标记基因。由于这些载体不需要带有同源重组位点的特殊改造的Ti质粒，因此它们提供了很高程度的灵活性。因为这个原因，可以使用任何卸甲根癌农杆菌菌株转移任何双元载体的基因。由于其多能性，双元载体是目前克隆用于农杆菌介导的植物转化的基因时优选的中间载体。然而，与双元载体一起使用的任何根癌农杆菌菌株其自身的Ti质粒必须是卸甲的，特别是在如果靶植物物种不能通过根癌农杆菌高效转化的情况下。否则来自双元载体的目的基因将与来自细菌天然T-DNA的致瘤植物激素基因共转化，从而降低目的基因的转化效率并在许多靶细胞中产生致瘤疾病症状，因此阻止这些细胞分化成正常植物。
在一些情况下，使与双元载体一起普遍使用的野生型根癌农杆菌菌株卸甲涉及同基因化(homogenotization)的一种形式。通过细菌接合(Hood1986，1993)将中间构建体引入野生型根癌农杆菌，所述中间构建体含有标记基因，其侧翼为与T-DNA外侧区域同源的Ti质粒序列。而卸甲的根癌农杆菌菌株一般移除了其整个T-DNA序列，还已经证明可以通过移除右边界序列使T-DNA转移失活：来自使用根癌农杆菌胭脂碱型菌株的工作的报道显示T-DNA的右边界是基因转移所必需的，而左边界则不然(Joos1983；Peralto和Ream 985；Shaw 1984；Wang 1984)。根癌农杆菌具有广泛的双子叶宿主范围以及一些单子叶植物科宿主范围(De Cleene 1976；Smith 1995)。存在若干不同的根癌农杆菌菌株，每一种都可以分类到章鱼碱型、胭脂碱型和L，L-琥珀碱(succinamopine)型中，这是根据其感染的植物细胞中合成的冠瘿碱的类型命名的。这些菌株具有相当(尽管不相同)的宿主范围，并且已经将多种类型根癌农杆菌类型的卸甲形式成功用于将基因转移进多种植物物种(van Wordragen 1992；Hood 1993)。
以与根癌农杆菌菌株相同的方式对发根农杆菌菌株分类。一般根据其产生的冠瘿碱分类。最普遍的菌株为农杆碱型菌株(如特征为Ri质粒pRiA4)、甘露碱型菌株(如特征为Ri质粒pRi8196)和南瓜氨酸型菌株(如特征为Ri质粒pRi2659)。一些其他菌株为mikimopine型(如特征为Ri质粒pRi1724)。mikimopine和南瓜氨酸是立体异构体，但在核苷酸水平没有发现它们之间的同源性(Suzuki 2001)。
已经证明很难使用根癌农杆菌转化大豆(Glycine max L.Merr.)，这至少部分是因为它对野生型根癌农杆菌感染具有抗性。用多种大豆栽培种和根癌农杆菌进行的比较研究提示大豆对根癌农杆菌的敏感性有限，并且取决于栽培种和细菌菌株(Bush 1991；Byrne 1987；Hood 1987)。难于在组织培养中操作大豆使大豆对根癌农杆菌的顽拗现象这一问题进一步复杂化。尽管目前已取得一些进展，但大豆中农杆菌介导的转化仍然低效而费力，并且仍然在寻求提高效率的方法。
如上文所述，一些根癌农杆菌菌株能比其他菌株更容易地感染大豆。菌株A281是具有胭脂碱型C58染色体背景的超毒力、宽宿主范围的L，L-琥珀碱型根癌农杆菌，其含有L，L-琥珀碱型Ti质粒pTiBo542(Hood1987)。卸甲这种菌株产生目前广泛用于大豆转化的EHA101和EHA105(Hood 1986，1987)。已描述了多种其他卸甲农杆菌菌株(A208，US5,416,011；LBA 4404，WO 94/02620)。Hood等(1993)公开了各为章鱼碱型、胭脂碱型和L，L-琥珀碱型的三种Ti质粒的卸甲。已公开根癌农杆菌菌株A281和EHA101能转化大豆。公开了来自菌株A281的质粒pTiBo542的卸甲衍生物，并命名为pEHA105。
一些植物物种的发根农杆菌Ri转化的植物具有特征性表型，具有缩短的节间、褶皱叶和具有广泛侧分支的丰富的根质量(Tepfer 1984)。RiT-DNA中的rol基因诱导对植物激素的敏感性和/或植物激素代谢的变化(Maurel 1994；Moritz和Schmülling 1998；Nilsson 1997；Shen 1988)。此外，通过用发根农杆菌感染进行的植物组织转化提高了某些代谢物的产生(Ermayanti 1994；Mano 1986；Sim 1994)。
天然的“装甲”发根农杆菌K599(pRi2659)能在多种大豆栽培种中诱导发根形成，所述栽培种包括Jack、Williams 82、Cartter、Fayette、Hartwig、Mandarin、Lee 68、Peking和PI437654(Cho 2000)。
对于发根农杆菌的情况，菌株8196的甘露碱Ri质粒具有与任何pTiT-DNA癌基因都不共享同源性的单个T区(Lahners 1984)。此观察提示，在这种菌株中，与tmr Ti突变体中由于tms表达的机制不同的新机制负责根诱导。对于如A4等农杆碱菌株的情况，将两种不同的Ri质粒区：TL区和TR区转移进植物基因组(Huffman 1984；Jouanin 1984；White 1985)。通过菌株A4进行的植物转化中所遇到的TL-DNA的大小非常恒定，而TR-DNA的长度则较为多变。用根癌农杆菌T区进行的杂交显示了pRi TR区中与章鱼碱Ti质粒TR-DNA的农杆碱合成相关基因的同源性。即使在所有的再生转化植物中都没有发现tms样基因(Taylor 1985；Jouanin1986a)，但在共有的pTi癌基因中仅发现了与fm基因座的同源性(Willmitzer 1982；Huffman 1984；Jouanin 1984)，提示了TR-DNA指导的生长素合成在根诱导中可能发挥作用。相反，TL区不与pTiT-DNA杂交(Jouanin 1984)。Slightom等(1986)测定的TL-DNA序列证实了核苷酸水平上这种同源性的缺失。然而，TL-DNA与甘露碱pRi8196的单个T区高度同源，因此可能能够诱导转化根。
Vilaine等(Vilaine 1987)已经证明单独转移TL-DNA以及单独转移TR-DNA不在感染植物节段上引起根诱导，提示在农杆碱型Ri质粒上存在根诱导的两种独立的分子机制。Vilaine等还描述了通过缺失来自Ri质粒pRiA4的TL、TR或同时缺失TL和TR区来卸甲农杆碱型发根农杆菌A4RS菌株，而产生发根农杆菌菌株RS(pRiB278b)的方法。描述了将卸甲Ri质粒与带有TL或TR区的粘粒接合，从而“挽救”发根表型。没有公开所述卸甲发根农杆菌菌株用于基因转移的用途。
尽管对于许多植物物种而言，根癌农杆菌介导的植物转化已经成为植物生物技术工业的标准方法，但很少使用发根农杆菌。目前，仅使用天然的“装甲”发根农杆菌菌株将外源基因整合进植物(如Narayanan 1999；Kouchi 1999)。由于发根农杆菌也可以“反式”转移双元载体的T-DNA，因此已经使用Ri质粒作为载体用于将外源DNA引入双子叶植物物种(Bevan 1984；Simpson 1986；Hamill 1991)。然而，这些公开内容中使用的发根农杆菌是“装甲”的(包含其天然Ri质粒)，并且仍能够引起发根表型(参阅如Narayanan 1999)。
尽管已经通过本领域描述的方法克服了与植物转化相关的一些问题，但仍然非常需要改进方法和备选方法。尽管在农杆菌介导转化方法领域中已经取得了显著的进展，但仍然存在对提高这些方法的便利性、速度和效率的改进方法的需要，特别是对转化对标准根癌农杆菌菌株转化具有顽拗现象的单子叶植物和双子叶植物的需要。因此，本发明的目的在于提供备选方法，其对多种植物物种提供提高的转化效率。可以通过本发明实现这一目的。
发明内容
本发明将农杆菌菌株K599(NCPPB 2659)的“卸甲”菌株变体用于T-DNA向植物细胞的递送。在下文中不使用先前作为“发根农杆菌”的分类，因为除了发根诱导表型(这是Ri质粒的结果，而非细菌基因组的结果)以外，基于核糖体rDNA序列的比较分析，该菌株似乎与其他发根农杆菌关系很远。因此，认为该菌株是不明确属于根癌农杆菌或发根农杆菌型菌株的独特样品。
本发明的第一个实施方案涉及产生转基因植物细胞的方法，所述方法包括：
a)提供农杆菌菌株K599(NCPPB2659)或所述菌株衍生物的转基因非致病性菌株变体细菌，其中所述菌株变体能感染植物细胞，但没有诱导发根表型的特性，且其中所述菌株变体还包含转基因T-DNA，和
b)将植物细胞与所述细菌共培养，和
c)分离或选择植物细胞，所述植物细胞包含稳定整合进其基因组的所述转基因T-DNA。
本发明的另一实施方案涉及产生转基因植物的方法，所述方法包括步骤：
a)提供农杆菌菌株K599(NCPPB2659)或所述菌株衍生物的转基因非致病性菌株变体细菌，其中所述菌株变体能感染植物细胞，但没有诱导发根表型的特性，且其中所述菌株变体还包含转基因T-DNA，和
b)将植物、植物细胞或植物组织与所述细菌共培养，和
c)分离或选择并任选地再生植物，所述植物包含稳定整合进其基因组的所述转基因T-DNA。
本发明的方法可以用于转化几乎所有种类的植物，优选来自选自单子叶植物、双子叶植物和裸子植物的植物细胞、植物组织或植物。更优选地，植物来自选自以下的属：苜蓿属(Medicago)、番茄属(Lycopersicon)、芸苔属(Brassica)、香瓜属(Cucumis)、茄属(Solanum)、核桃属(Juglans)、棉属(Gossypium)、苹果属(Malus)、葡萄属(Vitis)、金鱼草属(Antirrhinum)、杨属(Populus)、草莓属(Fragaria)、拟南芥属(Arabidopsis)、云杉属(Picea)、辣椒属(Capsicum)、藜属(Chenopodium)、菊属(Dendranthema)、牵牛属(Pharbitis)、松属(Pinus)、豌豆属(Pisum)、稻属(Oryza)、玉蜀黍属(Zea)、小麦属(Triticum)、黑小麦属(Triticale)、黑麦属(Secale)、黑麦草属(Lolium)、大麦属(Hordeum)、大豆属(Glycine)、黄杉属(Pseudotsuga)、伽蓝菜属(Kalanchoe)、甜菜属(Beta)、向日葵属(Helianthus)和烟草属(Nicotiana)。
在本发明优选的实施方案中，转基因T-DNA包含至少一种可在植物中表达的选择标记基因。
本发明的另一实施方案涉及农杆菌菌株K599(NCPPB 2659)或所述菌株衍生物的非致病性菌株变体(下文的“卸甲”菌株变体)，其中所述菌株变体能够感染植物细胞，但没有诱导发根表型的特性。本发明的另一实施方案涉及农杆菌菌株K599(NCPPB2659)或所述菌株衍生物的转基因非致病性菌株变体，其中所述菌株变体能够感染植物细胞，但没有诱导发根表型的特性，并且其中所述菌株变体还包含转基因T-DNA。
在本发明的优选实施方案中，所述农杆菌菌株K599(NCPPB 2659)(或所述菌株的衍生物)的非致病性菌株变体能够感染植物细胞、介导T-DNA转移进植物细胞和介导T-DNA插入植物基因组，但没有诱导发根表型的特性。更优选地，这通过存在Ri质粒pRi2659(农杆菌K599(NCPPB2659)中的天然Ri质粒)的非致病性质粒变体或其衍生物来实现。所述非致病性质粒变体优选提供植物细胞感染和转化所需的全部功能，但没有引起发根表型的序列。
农杆菌菌株K599(NCPPB 2659)的衍生物优选为土传植物致病性细菌，其特征在于16S-23S rRNA基因间序列，所述基因间序列包含选自SEQ ID NO：5、6、7、8、9、10、11、12、13和14所述序列基序的至少一种序列基序。非致病性菌株变体还可以包含一种或多种特征，所述特征选自存在突变的或嵌合virA或virG基因或存在超毒力质粒。农杆菌菌株K599(NCPPB 2659)的非致病性菌株变体可以包含(下文定义的)pRi2659质粒的非致病性质粒变体。
本发明的另一实施方案涉及pRi2659(农杆菌K599(NCPPB 2659)中的天然Ri质粒)或其衍生物的非致病性质粒变体，所述质粒变体提供植物细胞感染和转化所需的功能，但没有引起发根表型的序列(下文的“卸甲”质粒变体)。优选地——特别是与包含于分开的(双元)载体中的转基因T-DNA组合使用时——所述“卸甲”质粒变体不包含能转移进植物基因组的元件(如T-DNA元件)。有多种方法可以提供这种“卸甲”质粒变体。这可以通过(如通过诱变)使T-DNA发生功能障碍或优选地通过缺失Ri质粒的整个T-DNA来实现。
在本发明特别优选的实施方案中，所述非致病性质粒变体包含选自以下所述序列的至少一种序列：
a)包含SEQ ID NO：25所述序列或SEQ ID NO：24所述序列中至少100个连续核苷酸序列的序列，和
b)与SEQ ID NO：24所述序列或SEQ ID NO：24所述序列中至少1000个连续核苷酸序列具有至少90％序列同一性的序列，和
c)在等价于68℃在由5×SSPE、1％SDS、5×Denhardt试剂和100μg/mL变性鲑精DNA组成的溶液中结合或杂交，其后68℃在包含0.1×SSPE和0.1％SDS的溶液中洗涤的条件下与探针杂交的序列，所述探针由SEQ ID NO：24所述序列或其互补序列中的至少100个连续核苷酸组成。
本文提供了质粒pRI2659卸甲形式的分离序列。因此，本发明优选的实施方案涉及选自以下所述序列的分离的核苷酸序列：
a)包含SEQ ID NO：24所述序列或SEQ ID NO：24所述序列中至少100个连续核苷酸序列的序列，和
b)与SEQ ID NO：24所述序列或SEQ ID NO：24所述序列中至少1000个连续核苷酸序列具有至少90％序列同一性的序列，和
c)在等价于68℃在由5×SSPE、1％SDS、5×Denhardt试剂和100μg/mL变性鲑精DNA组成的溶液中结合或杂交，其后68℃在包含0.1×SSPE和0.1％SDS的溶液中洗涤的条件下与探针杂交的序列，所述探针由SEQ ID NO：24所述序列或其互补序列中的至少100个连续核苷酸组成。
更优选地，通过描述卸甲pRi2659质粒或(上文定义的)以上衍生物的核苷酸序列描述所述非致病性质粒变体。甚至更优选或备选地，衍生物编码与SEQ ID NO：112所述序列具有至少85％氨基酸序列同一性的virD2蛋白。预计所述virD2蛋白是卸甲pRI2659质粒的转化中增强性能的关键因子。因此本发明的另一实施方案涉及多肽，其包含选自以下的氨基酸序列：
a)SEQ ID NO：112所述序列或其至少200个连续氨基酸的序列，
b)与SEQ ID NO：112所述序列具有至少85％(优选至少90％或92％，更优选至少95％或98％，最优选至少99％)序列同一性的序列。
然而，卸甲pRI2659质粒编码的其他蛋白质也考虑用于优化转化方法，因此本发明的另一实施方案涉及多肽，其包含选自以下的氨基酸序列：
a)SEQ ID NO：25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39、40、41、42、43、44、45、46、47、48、49、50、51、52、53、54、55、56、57、58、59、60、61、62、63、64、65、66、67、68、69、70、71、72、73、74、75、76、77、78、79、80、81、82、83、84、85、86、87、88、89、90、91、92、93、94、95、96、97、98、99、100、101、102、103、104、114、115、116、117、118、119、120、121、122、123、124、126、128、129、130、131、132、133、134、136、137、139、140、142、143、144、145、146、147、148、149、150、151、152、154、155、156、158、159、161、162、163、164、165、166、167、168、169、170、171、172、173、174、175、176、177、178、179、180、181、182、183、184、185、186或187中任一项所述的序列或其至少200个连续氨基酸(优选至少300个连续氨基酸，更优选至少400个连续氨基酸，优选全部连续氨基酸)的序列，
b)与SEQ ID NO：25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39、40、41、42、43、44、45、46、47、48、49、50、51、52、53、54、55、56、57、58、59、60、61、62、63、64、65、66、67、68、69、70、71、72、73、74、75、76、77、78、79、80、81、82、83、84、85、86、87、88、89、90、91、92、93、94、95、96、97、98、99、100、101、102、103、104、114、115、116、117、118、119、120、121、122、123、124、126、128、129、130、131、132、133、134、136、137、139、140、142、143、144、145、146、147、148、149、150、151、152、154、155、156、158、159、161、162、163、164、165、166、167、168、169、170、171、172、173、174、175、176、177、178、179、180、181、182、183、184、185、186或187中任一项所述的序列具有至少85％(优选至少90％或92％，更优选至少95％或98％，最优选至少99％)序列同一性的序列。
本发明的另一实施方案涉及编码所述多肽的分离的核酸序列。这些序列可以是分离的天然序列(如包含于pRI2659质粒)或基于遗传密码简并性得到的其他序列。
因此，本发明优选的实施方案涉及pRi2659或其衍生物的非致病性质粒变体，其中所述质粒变体包含天然致病性pRi2659或其衍生物中植物细胞感染和转化所需的序列，但没有T-DNA，优选GenBank检索号AJ271050(SEQ ID NO：4)所述序列中从碱基538左右至碱基15519左右或者SEQ IDNO：26所述序列中从碱基3644左右至18577碱基左右的序列所述的区域。此序列对应于致病性农杆菌菌株K599(NCPPB 2659)中提供的原始致病性Ri质粒pRi2659的T-DNA序列。更优选地，所述非致病性质粒变体是这样的序列：在(例如，等价于68℃在由5×SSPE、1％SDS、5×Denhardt试剂和100μg/mL变性鲑精DNA组成的溶液中结合或杂交，其后68℃在包含0.1×SSPE和0.1％SDS的溶液中洗涤)的高严格条件下，其与致病性农杆菌菌株K599(NCPPB 2659)中提供的原始致病性Ri质粒pRi2659杂交，但在高严格条件下不与GenBank检索号AJ271050(SEQ ID NO：4)中从碱基538左右至碱基15519左右或者SEQ ID NO：26所述序列中从碱基3644左右至18577碱基左右的序列杂交。
更优选地，pRi2659的衍生物是能够介导将T-DNA从土传细菌转移进植物细胞的质粒，其特征还在于：
a)与编码天然pRi2659质粒的DNA(如包含于农杆菌菌株K599(NCPPB 2659))具有至少90％的同源性或
b)在等价于68℃在由5×SSPE、1％SDS、5×Denhardt试剂和100μg/mL变性鲑精DNA组成的溶液中结合或杂交，其后68℃在包含0.1×SSPE和0.1％SDS的溶液中洗涤的条件下与天然pRi2659质粒杂交。
优选地，所述农杆菌菌株K599(NCPPB 2659)或其衍生物的转基因非致病性菌株变体包含于双元载体质粒上，所述双元载体质粒与提供植物感染所需特征的质粒(如没有成瘤或发根诱导特性的Ti或Ri质粒)分离。优选地，T-DNA侧翼至少为右边界序列(更优选为右和左边界序列)。优选为Ti和/或Ri边界。在优选实施方案中，所述转基因T-DNA包含至少一个用于赋予所述植物农学价值性状的表达盒。在另一优选的实施方案中，所述T-DNA还包含至少一种标记基因，其允许选择和/或鉴定转化的植物、植物细胞或组织。
已经证明质粒pRI2659的T-DNA边界在T-DNA转移中特别有效，因此在产生转基因植物(特别是转基因大豆植物)中特别有效。因此本发明的另一实施方案涉及侧翼为来自发根农杆菌pRi2659质粒的至少一种T-DNA边界的转基因T-DNA，所述转基因T-DNA不包含引起发根表型的序列。优选地，至少一种所述边界序列描述于SEQ ID NO：18或19。更优选地，所述转基因T-DNA包含用于赋予所述植物农学价值性状的至少一种表达盒或至少一种标记基因，所述标记基因允许选择和/或鉴定转化的植物、植物细胞或组织。本发明的另一主题涉及包含本发明所述转基因T-DNA的转基因载体。
本发明的其他实施方案涉及包含本发明的核苷酸序列、非致病性质粒变体或转基因T-DNA的细胞或非人生物。优选地，所述细胞或非人生物选自细菌、酵母、植物、哺乳动物和昆虫。在一个优选的实施方案中，所述细胞或生物为根瘤菌(Rhizobiaceae)属的土传细菌。在另一优选的实施方案中，所述细胞或生物为植物细胞或植物生物，更优选选自单子叶植物和双子叶植物。
从下文的说明书中，本发明的其他目的、优势和特征将是显而易见的。
附图简述
图1A说明通过RAPD(随机扩增多态性DNA)确定的农杆菌菌株关系的树形图(图2来自Llob 2003)。多种菌株的描述参阅下文表1。在此条件下农杆菌菌株K599(NCPPB 2659)聚类到不同的栽培种组中，其与传统的“根癌农杆菌”菌株如C58或Ach5和其他“发根农杆菌”菌株如NCPPB 8196或ATCC15834分离。
图1B说明通过16S rRNA比较确定的农杆菌菌株关系的树形图。使用Clustal W程序(Saitou 1987)汇编序列。通过其各自16S rRNA的GenBank检索号描述菌株。评估了以下菌株：
物种 检索号     备选名/树形图中的名称(如果与GenBank检索号不同)
  根癌农杆菌 AB114201
  根癌农杆菌 AF388033     菌株52
  根癌农杆菌 AF388030     菌株42
  根癌农杆菌 AY306228     NCPPB 4042
  根癌农杆菌 AY306224     CSL 3276
  根癌农杆菌 AY306223     CSL 3139
  根癌农杆菌 AY306222
  根癌农杆菌 D14500
  根癌农杆菌 AJ389902     NCPPB 1641
  根癌农杆菌 AJ012209     C58
  根癌农杆菌 S56774     C58
  根癌农杆菌 AB102735
  根癌农杆菌 AB102734
  根癌农杆菌 AB102733
  根癌农杆菌 AB102732
  农杆菌亚种 AY174112     JS71
  农杆菌亚种 D14506
  农杆菌亚种   D14504
  发根农杆菌   D14501
  发根农杆菌   X67232
  发根农杆菌   X67224
  葡萄农杆菌   D14502
  葡萄农杆菌   D12795
  葡萄农杆菌   X67225
  葡萄农杆菌 AB118158
  葡萄农杆菌 AB114418
  葡萄农杆菌 AJ389912
  葡萄农杆菌 AJ389911
  悬钩子农杆菌 D14503
  悬钩子农杆菌 X67228
  悬钩子农杆菌 D12787
  A.larrymoorei Z30542     Ficus staim
  豌豆根瘤菌(R.leguminosarum) D14513
  山羊豆根瘤菌(R.galegae) D11343
  草木犀根瘤菌(S.meliloti) D14509
  S.fredii D14516
  热带根瘤菌(R.tropici) D11344
  发根农杆菌 K599     BPS 599
  根癌农杆菌 AGLO     BPS 600
  根癌农杆菌 AGL1     BPS 601
  根癌农杆菌 MP90     BPS 602
  根癌农杆菌 LBA4404     BPS 603
图1C说明通过virD2氨基酸序列比较确定的农杆菌菌株关系的树形图。使用Clustal W程序(Saitou 1987)汇编序列。通过其各自virD2蛋白的GenBank检索号描述菌株。评估了以下菌株：
物种 检索号   备选名/树形图中的名称(如果与GenBank检索号不同)
  农杆菌K599     Ri2659＝K599
  根癌农杆菌     AAL57024     TiAB2/73
  根癌农杆菌     AD3250
  根癌农杆菌     B25063     TiA6
  根癌农杆菌     B37763     TiC58
  发根农杆菌     CAA31351     A4b
  根癌农杆菌     NP 053396     TiSAKURA
  根癌农杆菌     NP 059814     Ti15955
  发根农杆菌     NP 066749     Ri1724
  根癌农杆菌     NP 396503     TiC58 Cereon
  根癌农杆菌     NP 536300     TiC58 UW
  大豆慢生根瘤菌(Bradyrhizobiumjaponicum)USDA 110 NP 766684
  支气管炎博德特氏菌(Bordetellabronchiseptica)RB50 NP 887044
  发根农杆菌     P13462     RiA4
  肺炎链球菌(Streptococcuspneumoniae)TIGR4 ZP 00402780
  支气管炎博德特氏菌RB50 ZP 00613251
  棕色固氮菌(Azotobacter ZP 00416447
  vinelandii)OP
图2农杆菌质粒pRi2659 T-DNA区的物理限制性图。箭头指示右边界区和左边界区(来自：Combard 1987)。
图3与AGL1(pBPSMM192b)(I)或SHA016(pBPSMM192b)(II)共培养2天后叶腋分生组织外植体中大豆的瞬时GUS表达(5天)。SHA016/pBPSMM192b是卸甲转基因农杆菌K599变体菌株。AGL1/pBPSMM192b是对照菌株。农杆菌菌株SHA001和SHA016是农杆菌菌株K599(NCPPB2659)的功能性等价菌株，即包含卸甲pRi2659Δtet质粒。
图4使用以农杆菌SHA001(pBPSEW008)感染的叶腋分生组织外植体进行感染后35天大豆中的稳定GUS表达(I、II、III：多种外植体的实例)。SHA001(pBPSEW008)是卸甲的转基因农杆菌K599变体菌株(pRi2659Δtet)。
图5使用含有pBPSMM192b的重组SHA001的转基因番茄小植株(A)和转基因叶中的GUS表达(B)。SHA001(pBPSMM192b)是卸甲的转基因农杆菌K599变体菌株(pRi2659Δtet)。
图6卸甲四环素标记的K599(pRi2659Δtet)的DNA杂交。用右边界检测时，双交换事件中杂交条带的缺失指示来自pRi2659的T-DNA区的缺失(下方的DNA杂交)。上方DNA杂交的杂交条带指示T-DNA缺失以外的侧翼DNA的存在。
RF＝用右侧翼探针杂交
RB＝用左侧翼探针杂交
WT＝野生型
S＝由导致包含野生型T-DNA和缺失T-DNA的插入的单交换重组得到的克隆
CS＝由单交换得到的具有与计算的条带大小匹配的条带图式的克隆(中间产物)。
D＝由导致预期DNA缺失的双交换重组得到的克隆(预期的终产物)。
图7大豆子叶的发根测定。
[a]用卸甲K599感染不引起发根。
[b]用野生型K599感染引起发根。
图8植物细胞中的瞬时GUS表达(构建体描述参阅下文的实施例)。
A：玉米胚转化。SHA001是卸甲农杆菌K599变体菌株。LBA4404是对照菌株。
B：SHA001与多种双元载体(在图下标出，描述参阅实施例)组合转化其他植物组织。I：大豆苗叶腋节；II：大豆器官发生愈伤组织；III：番茄子叶。
图9用AHAS选择的稳定T1转基因拟南芥。用农杆菌菌株MP90(对照菌株1)、野生型农杆菌菌株K599(对照菌株2)和卸甲农杆菌菌株K599(SHA001)进行转化，它们各自分别包含双元质粒pBPSEW008或pBPSMM192b。
图10稳定T1转基因拟南芥的GUS染色。用AHAS选择稳定的T1转基因拟南芥。用农杆菌菌株MP90(对照菌株1)、野生型农杆菌菌株K599(对照菌株2)和卸甲农杆菌菌株K599(SHA001)进行转化，它们各自分别包含双元质粒pBPSEW008或pBPSMM192b。
图11质粒pRi2659T-DNA区的图，包括右侧翼区和左侧翼区。
图12构建用于卸甲菌株K599的缺失盒中所使用步骤的流程图。
图13A：载体pBPSMM192b和pBPSMM232的质粒图。
B：载体pBPSEW008的质粒图。
图14A-E：多种土传细菌16S-23S rRNA基因间序列区的比对。
K599：      农杆菌菌株K599(NCPPB 2659)
AE008980：  根癌农杆菌C58
AE009348：  根癌农杆菌C58
AE008265：  根癌农杆菌C58
AE007948：  根癌农杆菌C58
AE009201：  根癌农杆菌C58
U45329：    葡萄农杆菌NCPPB3554
AE102735：  根癌农杆菌(放射形农杆菌)
MAFF301001
农杆菌菌株C58具有4个rRNA操纵子。它们是K599 16S-23S rRNA基因间序列的已知最近的亲缘物。来自其他农杆菌菌株的其他16S-23SrRNA基因间序列具有低同源性，并且不能良好地累积。这显示这一区域表现出足够的变异性，可用作区分农杆菌菌株K599和其他近亲物种的标志序列。16S-23S rRNA基因间序列是16S和23S rRNA之间的区域，通常编码tRNA(如Ile、Ala、Asp、Trp)。
图15用卸甲农杆菌菌株K599(pRi2659Δ)转化的大豆T1和T0植物的DNA杂交。用HindIII消化基因组DNA并用gusINT基因检测。在T-DNA中存在单个HindIII位点。M＝1kb标记物；wt＝未转化的基因组DNA；泳道1-7：单个T1株系；泳道8，T0植物。
图16农杆菌物种的多种virD2氨基酸序列的对比。用星号(*)标出了区别pRI2659(SEQ ID NO：112)编码的virD2蛋白质和其已知同源物的单突变。
TiAB2/73：  根癌农杆菌
TiA6：      根癌农杆菌
Ti-SUKURA： 根癌农杆菌
RiA4 ：     发根农杆菌
Ri1724：    发根农杆菌
Ri2659：    农杆菌菌株K599
一般定义
缩写：BAP-6-苄基氨基嘌呤；2，4-D-2，4-二氯代苯氧基乙酸；MS-Murashige和Skoog培养基；NAA-1-萘乙酸；MES，2-(N-吗啉代)乙磺酸，IAA，吲哚乙酸；Kan：硫酸卡那霉素；GA3-赤霉酸；TimentinTM：替卡西林钠/克拉维酸钾。
应该理解，本发明不受限于所述的具体方法、方案、细胞系、植物种或属、构建体和试剂。还应理解，本文使用的术语仅用于描述具体实施方案的目的，并不旨在限制本发明的范围，本发明的范围仅受附带的权利要求的限制。
本文使用的术语“约”指大约、约略、在......左右或在......区域内。当术语“约”与数值范围结合使用时，它通过扩展所述数值以上和以下的边界来修饰该范围。本文中一般使用术语“约”通过上下20％、优选10％(更高或更低)的变化修饰所述值以上或以下的数值。
本文使用的“或”一词指具体列表中的任一成员，还包括该列表中成员的任何组合。
“农学价值性状”包括植物生物中可用于或有利于食品生产或食品产品(包括植物部分和植物产品)的任何表型。还包括非食品农产品如纸等。农学价值性状的部分列表包括害虫抗性、活力、发育时间(至收获的时间)、增强的营养含量、新的生长图式、香味或颜色、盐、热、干旱和冷耐性等。优选地，农学价值性状不包括选择标记基因(如编码仅便于检测或选择转化细胞的除草剂或抗生素抗性的基因)、引起产生植物激素(如仅用于选择的生长素、赤霉酸、细胞分裂素、脱落酸和乙烯)或报道基因(如萤光素酶、葡糖醛酸糖苷酶、氯霉素乙酰转移酶(CAT)等)的激素生物合成基因。这些农学价值的重要性状可以包括害虫抗性的提高(如Melchers2000)、活力、发育时间(至收获的时间)、增强的营养含量、新的生长图式、香味或颜色、盐、热、干旱和冷耐性(如Sakamoto 2000；Saijo 2000；Yeo 2000；Cushman 2000)等。技术人员会认识到，可以从大量多核苷酸中选择赋予这些以及其他农学价值性状。
术语“核酸”指脱氧核糖核苷酸或核糖核苷酸及其单链或双链、有义或反义形式的聚合物或杂合体。除非另有说明，具体的核酸序列还暗中包括其保守性修饰的变体(如简并密码子替换)和互补序列以及明确指出的序列。本文中术语“核酸”与“基因”、“cDNA”、“mRNA”、“寡核苷酸”和“多核苷酸”可互换使用。
本文使用的短语“核酸序列”指从5’至3’末端阅读的单链或双链脱氧核糖核酸或核糖核酸碱基聚合物。其包括染色体DNA、自主复制质粒、DNA或RNA的传染性聚合物和发挥一级结构作用的DNA或RNA。“核酸序列”还指代表核苷酸的缩写、字母、字或词的连续列表。在一个实施方案中，核酸可以是“探针”，其为相对短的核酸，长度通常小于100个核苷酸。核酸探针经常从长度约50个核苷酸至长度约10个核苷酸。核酸的“靶标区”是核酸中鉴定为重要的部分。核酸的“编码区”是核酸的部分，其置于适当调节序列控制下时，以序列特异性方式转录并翻译以产生特定多肽或蛋白质。编码区编码这样的多肽或蛋白质。
术语“目的核苷酸序列”指任何核苷酸序列，本领域普通技术人员认为对所述核苷酸序列的操作是任何目的(如赋予改善的品质)所需要的。这些核苷酸序列包括但不仅限于结构基因的编码序列(如报道基因、选择标记基因、药物抗性基因、生长因子等)和不编码mRNA或蛋白质产物的非编码调节序列(如启动子序列、多腺苷酸化序列、终止序列、增强子序列等)。目的核酸序列可以优选编码农学价值性状。
术语“反义”应理解为指具有与靶序列(如信使RNA(mRNA))互补的序列的核酸，认为通过与靶序列杂交启动对所述靶序列表达的阻断。
术语“有义”应理解成指具有与靶序列(如与蛋白转录因子结合的序列和与给定基因的表达相关的序列)同源或相同的序列的核酸。根据优选的实施方案，核酸包含目的基因和允许所述目的基因表达的元件。
术语“基因”指与适当的调节序列有效连接的编码区，所述调节序列能以某些方式调节多肽的表达。基因包括编码区(可读框，ORF)之前(上游)和之后(下游)的DNA非翻译调节区(如启动子、增强子、抑制子等)以及适当时单个编码区(即外显子)之间的间插序列(即内含子)。本文使用的术语“结构基因”旨在指转录成mRNA的DNA序列，所述mRNA接着翻译成特定多肽的特征氨基酸序列。
术语“基因组”或“基因组DNA”指宿主生物可遗传的遗传信息。所述基因组DNA包括核DNA(也称为染色体DNA)以及质体(如叶绿体)和其他细胞器(如线粒体)的DNA。优选地，术语基因组或基因组DNA指核的染色体DNA。
术语“染色体DNA”或“染色体DNA序列”应理解为独立于细胞周期状态的细胞核的基因组DNA。因此染色体DNA可以组织在染色体或染色单体中，它们可以是浓缩的或解旋的。可以通过本领域已知的多种方法证明并分析染色体DNA中的插入，所述方法为如聚合酶链式反应(PCR)分析、DNA印迹分析、荧光原位杂交(FISH)和原位PCR。
当涉及结构基因时，本文使用的术语“编码区”指编码氨基酸的核苷酸序列，所述氨基酸作为mRNA分子翻译的结果可见于新生多肽中。在真核生物中，编码区的边界为编码起始密码子甲硫氨酸的核苷酸三联体“ATG”的5’侧和指定终止密码子的三个三联体(即TAA、TAG、TGA)之一的3’侧。除了含有内含子以外，基因组形式的基因还可以包括存在于RNA转录物中的位于序列5’和3’末端的序列。这些序列称为“侧翼”序列或区域(这些侧翼序列位于mRNA转录物中存在的非翻译序列的5’或3’)。5’侧翼区可以含有调节序列如启动子和增强子，它们控制或影响基因的转录。3’侧翼区可以含有指导转录终止、转录后切割和多腺苷酸化的序列。
本文使用的术语“氨基酸序列”指代表氨基酸残基的缩写、字母、字或词的列表。本文可以通过共知的三字母符号或IUPAC-IUB生物化学命名委员会推荐的单字母符号表示氨基酸。同样，可以通过其普遍接受的单字母代码表示核苷酸。
术语“多肽”、“肽”、“寡肽”、“多肽”、“基因产物”、“表达产物”和“蛋白质”在本文中可互换使用，指连续氨基酸残基的聚合物或寡聚物。
本文使用的术语“分离的”指物质已经从其最初环境中移出。例如，活的动物中的天然存在的多核苷酸或多肽不是分离的，但从天然系统的一些或全部共存物质中分离的相同多核苷酸或多肽则是分离的。这些多核苷酸可以是载体的一部分和/或这些多核苷酸或多肽可以是组合物的一部分，并且将是分离的，因为这种载体或组合物不是其最初环境的一部分。优选地，在涉及核酸(如“分离的核酸序列”)时，术语“分离的”指已鉴定并从一般与其天然来源相关的至少一种污染核酸中分离的核酸序列。分离的核酸是以与其在自然界中不同的形式或背景存在的核酸。相反，非分离的核酸是以其在自然界中存在的状态存在的核酸如DNA和RNA。例如，给定的DNA序列(如基因)存在于宿主细胞染色体中相邻基因附近；RNA序列(如编码特定蛋白质的特定mRNA序列)作为与编码多种蛋白质的多种其他mRNA形成的混合物存在于细胞中。然而，例如，包含如SEQ ID NO：18的分离的核酸序列包括例如，通常含有SEQ ID NO：18的细胞中的这些核酸序列，其中所述核酸序列在与天然细胞不同的染色体或染色体外位置，或者侧翼为与天然存在的核酸序列不同的核酸序列。分离的核酸序列可以以单链或双链形式存在。当使用分离的核酸序列表达蛋白质时，核酸序列将最少含有有义或编码链(即核酸序列可以是单链的)的至少一部分。或者，它可以含有有义和反义链(即核酸序列可以是双链的)。
本文使用的术语“纯化的”指从其天然环境中移出、分离或分开的分子，可以是核酸或氨基酸序列。因此“分离的核酸序列”是纯化的核酸序列。“基本纯化的”分子至少60％不含、优选至少75％不含、最优选至少90％不含与其天然共存的其他组分。
就生物、多肽或核酸序列而言，术语“野生型”、“天然”或“天然来源”指该生物是天然存在的或可得自至少一种天然存在的生物，而没有被人为改变、突变或操作。
“多核苷酸构建体”指至少部分通过重组方法产生的核酸。术语“DNA构建体”指由脱氧核糖核酸组成的多核苷酸构建体。构建体可以是单链的或优选双链的。构建体可以是环状或线性的。技术人员熟悉获得一种DNA构建体的多种方法。可以通过惯用的重组和克隆技术制备构建体，例如Maniatis 1989、Silhavy 1984和Ausubel 1987所述。
本文使用的术语“互补”或“互补性”指通过碱基配对原则相关的核苷酸序列。例如，序列5′-AGT-3′与序列5′-ACT-3′互补。互补性可以是“部分”或“全部”的。“部分”互补性是一个或多个核酸碱基不能根据碱基配对原则匹配。两核酸之间的“全部”或“完全”互补性是每一个核酸碱基都能根据碱基配对原则与另一碱基匹配。核酸链之间互补性的程度对核酸链之间杂交的效率和强度具有显著的影响。本文使用的核酸序列的“互补序列”指核苷酸序列，其核酸显示与该核酸序列的核酸的全部互补性。
涉及核酸使用时，术语“同源性”或“同一性”指互补性程度。两核酸间的同源性或同一性应理解为指每种情况下在序列完整长度上的核酸序列同一性，其借助程序算法GAP(Wisconsin Package Version 10.0，University ofWisconsin，Genetics Computer Group(GCG)，Madison，USA)使用以下参数通过比较而计算：
缺口权重：12     长度权重：4
平均匹配：2,912  平均错配：2,003
例如在核酸水平与序列SEQ ID NO：20具有至少95％同源性(或同一性)的序列应理解为指通过上述程序算法用上述参数设置与SEQ ID NO：20比较后具有至少95％同源性的序列。可以是部分同源性(即小于100％的部分同一性)或完全同源性(即100％的完全同一性)。
或者，部分互补序列应理解为至少部分抑制完全互补序列与靶核酸杂交的序列，使用功能术语“基本同源”指代。可以使用低严格条件下的杂交测定(DNA或RNA印迹、溶液杂交等)检查对完全互补序列与靶序列之间杂交的抑制。在低严格条件下，基本同源的序列或探针(即能与另一目的寡核苷酸杂交的寡核苷酸)会竞争并抑制完全同源序列与靶标的结合(即杂交)。这不是说低严格条件允许非特异性结合；低严格条件需要两序列的彼此结合是特异性(即选择性)相互作用。可以使用甚至没有部分互补性程度(如小于约30％同一性)的第二种靶标测试非特异性结合的没有；在不存在非特异性结合的情况下，探针不会与第二种非互补靶标杂交。
涉及双链核酸序列如cDNA或基因组克隆使用时，术语“基本同源”指在上述低严格条件下能与双链核酸序列的一条或两条链杂交的任何探针。涉及单链核酸序列使用时，术语“基本同源”指在上述低严格条件下能与单链核酸序列杂交的任何探针。
本文使用的术语“杂交”包括“使核酸链通过碱基配对与互补链结合的任何方法”(Coombs 1994)。杂交和杂交强度(即核酸间结合的强度)受到如核酸间的互补性程度、相关条件的严格度、形成杂交体的Tm和核酸中的G∶C比等因素的影响。
本文使用的术语“Tm”指“解链温度”。解链温度是双链核酸分子群体半数解离成单链时的温度。计算核酸Tm的等式为本领域所熟知。标准参照物表明，当核酸在1M NaCl的水溶液中时，可以通过等式Tm＝81.5+0.41(％G+C)简单的估计Tm值(参阅如Anderson和Young，QuantitativeFilter Hybridization，《Nucleic Acid Hybridization》(1985))。其他参照包括更复杂的计算，其在Tm的计算中考虑结构和序列特征。
低严格条件在涉及核酸杂交时，其包括的条件等价于当使用长度约100到约1000个核苷酸的DNA探针时，在68℃、由5×SSPE(43.8g/L NaCl、6.9g/L NaH2PO4.H2O和1.85g/L EDTA，用NaOH调节pH至7.4)、1％SDS、5×Denhardt′s试剂[50×Denhardt′s每500mL含有下列物质：5g菲克(400型，Pharmacia)、5g BSA(V组分；Sigma)]和100μg/mL变性鲑精DNA组成的溶液中结合或杂交，随后在室温下含有0.2×SSPE和0.1％SDS的溶液中漂洗。
当涉及核酸杂交时，高严格条件所包括的条件等价于当使用长度约100到约1000个核苷酸的DNA探针时，在68℃、由5×SSPE、1％SDS、5×Denhardt′s试剂和100μg/mL变性鲑精DNA组成的溶液中结合或杂交，继之于68℃在含有0.1×SSPE和0.1％SDS的溶液中漂洗。
当涉及目的杂交条件的杂交条件时，术语“等价”意指杂交条件和目的杂交条件导致具有相同范围的同源性百分比(％)的核酸序列杂交。例如，如果目的杂交条件导致第一核酸序列与具有与第一核酸序列从80％到90％同源性的其它核酸序列的杂交，若另一杂交条件也导致第一核酸序列与具有与第一核酸序列从80％到90％同源性的其它核酸序列的杂交，那么此另一杂交条件被称为等价于目的杂交条件。
涉及核酸杂交使用时，本领域熟知可以使用多种等价条件以包括低或高严格条件；例如考虑探针的长度和性质(DNA、RNA、碱基组成)和靶标的性质(DNA、RNA、碱基组成、存在于溶液中或固定等)以及盐浓度和其他组分(如甲酰胺、硫酸葡聚糖、聚乙二醇存在与否)等因素，并可以改变杂交溶液以产生与上文列出的条件不同但等价的低或高严格杂交条件。本领域技术人员了解，尽管可以优选高严格度以减少或消除非特异性结合，但也可以优选低严格度以检测具有不同同源性的多种核酸序列。
“转基因”、“转基因的”或“重组的”指人为操作的多核苷酸或人为操作的多核苷酸的拷贝或互补序列。例如，包含与第二个多核苷酸有效连接的启动子的转基因表达盒可以作为对包含该表达盒的分离核酸人为操作(如Sambrook 1989或《Current Protocols in Molecular Biology》1-3卷，John Wiley&Sons，Inc.(1994-1998)中所述方法)的结果而包括与第二个多核苷酸异源的启动子。在另一实例中，重组表达盒可以包含多核苷酸，其中以使该多核苷酸非常不可能在自然界中发现的方式组合所述多核苷酸。例如，人为操作的限制性位点或者质粒载体可以使启动子在第二个多核苷酸的侧翼或者将它们分离。技术人员会认识到，可以以多种方式操作多核苷酸，而不仅限于上述实例。
本文使用的术语“转基因”或“重组”(如涉及植物细胞或植物)指含有转基因的细胞和/或植物，或者通过引入转基因改变了基因组的细胞和/或植物，或者整合了外源基因或DNA序列的细胞和/或植物，所述外源基因或DNA序列包括但不仅限于可能一般不存在的基因或DNA序列、在给定细胞类型中一般不转录和翻译(“表达”)的基因或希望引入未转化细胞和/或植物的任何其他基因或DNA序列，例如在未转化细胞和/或植物中一般存在，但希望改变其表达的基因。优选地，就核酸而言，本文使用的术语“重组”指该核酸与天然环境中它不相邻的核酸共价结合并毗邻。可以通过若干方法产生转基因细胞、组织和植物，所述方法包括通过人为介入(如通过本文所述的方法)将包含核酸(通常为DNA)的“转基因”引入靶细胞或将转基因整合进靶细胞的染色体。
本文使用的术语“转基因”指通过实验操作引入细胞基因组的任何核酸序列。转基因可以是“内源DNA序列”或“异源DNA序列”(即“外源DNA”)。术语“内源DNA序列”指在其引入的细胞中天然可见的核苷酸序列，其前提为它与天然存在序列相比不含有某种修饰(如点突变、存在选择标记基因等)。
例如，就核酸序列(或包含所述核酸序列的生物、表达构建体或载体)而言，术语“转基因”或“转基因的”指通过实验操作产生的所有构建体，其中
a)所述核酸序列，或
b)与所述核酸序列a)有效连接的遗传控制序列如启动子，或
c)(a)和(b)
不在其天然遗传环境中，或者通过实验操作进行了修饰，修饰的实例为一个或多个核苷酸残基的替换、添加、缺失、倒置或插入。天然遗传环境指来源生物中的天然染色体基因座，或者指基因组文库的存在。对于基因组文库的情况，优选(至少部分)保留核酸序列的天然遗传环境。环境至少在核酸序列的一侧，并且具有长度至少为50bp，优选至少500bp，特别优选至少1000bp，非常特别优选至少5000bp的序列。当通过非天然的合成的“人工”方法(如诱变)进行修饰时，天然存在的表达构建体(如天然存在的启动子与相应基因的组合)称为转基因表达构建体。已经描述了这些方法(US 5,565,350；WO 00/15815)。
术语“异源核酸序列”或“异源DNA”可互换使用，指与核酸序列连接或经过操作而连接的核苷酸序列，所述核酸序列和核苷酸序列在自然界中不连接，或在自然界中在不同位置连接。异源DNA对其引入的细胞而言不是内源性的，而是得自另一细胞。异源DNA还包括含有某种修饰的内源DNA序列。异源DNA一般(尽管不必然)编码其在其中表达的细胞在正常情况下不产生的RNA和蛋白质。异源DNA的实例包括报道基因、转录和翻译调节序列、选择标记蛋白(如赋予药物抗性的蛋白质)等。优选地，就调节序列(如本发明的启动子)而言，术语“转基因”或“重组”指所述调节序列与天然环境中它不相邻的核酸共价结合并毗邻。
术语“外源基因”指通过实验操作引入细胞基因组的任何核酸(如基因序列)，并可包括可见于该细胞的基因序列，只要引入的基因与天然存在基因相比含有某种修饰(如点突变、存在选择标记基因等)。
“重组”多肽或蛋白质指通过重组DNA技术产生的多肽或蛋白质，即用编码所需多肽或蛋白质的外源重组DNA构建体转化的细胞所产生的多肽或蛋白质。重组核酸和多肽还包括不存在于自然界，而是人为修饰、改变、突变或其他操作的分子。优选地，“重组多肽”是通过至少一个氨基酸残基区别于天然存在多肽的非天然存在多肽。产生所述重组多肽和/或核酸的优选方法可以包括定向或非定向诱变、DNA改组或其他递归重组的方法。
术语“遗传修饰的生物”或“GMO”指包含转基因DNA的任何生物。示例性生物包括植物、动物和微生物。
术语“细胞”或“植物细胞“指单个细胞或细胞群体。群体可以是含有一种细胞类型的纯群体。同样，群体可以包含超过一种细胞类型。在本发明中，对细胞群体可以包含的细胞类型数没有限制。细胞可以是同步化或不同步化的。在本发明的含义内，植物细胞可以是分离的(如悬浮培养的)或包含于植物组织、植物器官或任何发育阶段的植物。
术语“器官”就植物(或“植物器官”)而言指植物的部分，可包括(但不仅限于)例如根、果实、嫩枝、茎、叶、花药、萼片、花瓣、花粉、种子等。
术语“组织”就植物(或“植物组织”)而言指多个植物细胞的排列，包括分化的和未分化的植物组织。植物组织可以组成植物器官的部分(如植物叶的表皮)，但也可以组成肿瘤组织(如愈伤组织)和培养物中的多种细胞类型(如单细胞、原生质体、胚、愈伤组织、原球茎样体等)。植物组织可以在植物中(in planta)，在器官培养物、组织培养物或细胞培养物中。
本文使用的术语“植物”指多个植物细胞，其高度分化成任何植物发育阶段中存在的结构。这些结构包括一种或多种植物器官，包括但不仅限于果实、嫩枝、茎、叶、花瓣等。优选地，术语“植物”包括完整植物，嫩枝营养器官/结构(如叶、茎和块茎)、根、花和花器官/结构(如苞片、萼片、花瓣、雄蕊、心皮、花药和胚珠)、种子(包括胚、胚乳和种皮)和果实(成熟子房)、植物组织(如维管组织、基本组织等)和细胞(如保卫细胞、卵细胞、毛状体等)以及其后代。可用于本发明方法的植物纲一般与适用于转化技术的高等和低等植物纲范围相同，包括被子植物(单子叶和双子叶植物)、裸子植物、蕨类和多细胞藻类。其包括多种倍性水平的植物，包括非整倍体、多倍体、二倍体、单倍体和半合子。本发明范围内包括植物界的高等和低等植物的所有属和种。还包括成熟植物、种子、嫩枝和苗及部分、繁殖材料(如种子和果实)和来自于此的培养物，例如细胞培养物。优选来自以下植物科的植物和植物材料：苋科(Amaranthaceae)、芸苔科(Brassicaceae)、石竹科(Carophyllaceae)、藜科(Chenopodiaceae)、菊科(Compositae)、葫芦科(Cucurbitaceae)、唇形科(Labiatae)、豆科(Leguminosae)、碟形花亚科(Papilionoideae)、百合科(Liliaceae)、亚麻科(Linaceae)、锦葵科(Malvaceae)、蔷薇科(Rosaceae)、虎耳草科(Saxifragaceae)、玄参科(Scrophulariaceae)、茄科(Solanaceae)、番杏科(Tetragoniaceae)。
一年生、多年生、单子叶和双子叶植物是用于产生转基因植物的优选宿主生物。此外，本发明的重组系统或方法可有利地用于所有的观赏植物、林业、水果或观赏树木、花、切花、灌木或草坪中。所述植物可包括但不仅限于苔藓植物如苔纲(Hepaticae)(苔类)和Musci(藓类)；蕨类植物如羊齿类、木贼和石松；裸子植物如针叶树、苏铁、银杏和买麻藤纲(Gnetatae)；藻类如绿藻纲(Chlorophyceae)、褐藻纲(Phaeophyceae)、红藻纲(Rhodophyceae)、Myxophyceae、黄藻纲(Xanthophyceae)、硅藻纲(Bacillariophyceae)(硅藻)和裸藻纲(Euglenophyceae)。
本发明的植物可以包括蔷薇科(Rosaceae)如玫瑰、杜鹃花科(Ericaceae)如rhododendron和azalea、大戟科(Euphorbiaceae)如猩猩木和巴豆、石竹科(Caryophyllaceae)诸如石竹、茄科(Solanaceae)如矮牵牛、苦苣苔科(Gesneriaceae)如非洲紫罗兰、凤仙花科(Balsaminaceae)如凤仙花、兰科(Orchidaceae)如兰、鸢尾科(Iridaceae)如唐菖蒲、鸢尾、小苍兰和番红花、菊科(Compositae)如金盏花、牻牛儿苗科(Geraniaceae)如天竺葵、百合科(Liliaceae)如龙血树(Drachaena)、桑科(Moraceae)如榕、天南星科(Araceae)如philodendron等。
特别地，本发明的转基因植物还选自双子叶作物植物，例如豆科(Leguminosae)如豌豆、苜蓿和大豆；伞形科(Umbelliferae)特别是胡萝卜属(尤其是carota(胡萝卜)和芹菜(Apium)种，特别是Graveolens var.dulce种(芹菜)等)；茄科(Solanaceae)，特别是番茄属(Lycopersicon)，尤其是番茄种(番茄)和茄属，特别是tuberosum(马铃薯)和melongena(茄子)、烟草等；以及辣椒属(Capsicum)，特别是annuum种(胡椒)等；豆科(Leguminosae)，特别是大豆属(Glycine)，尤其是max(大豆)等种；十字花科(Cruciferae)，特别是芸苔属，尤其是napus(欧洲油菜)、campestris(甜菜)、oleracea cv Tastie(卷心菜)、oleracea cv Snowball Y(花椰菜)和oleracea cv Emperor(花茎甘蓝)；以及拟南芥属(Arabidopsis)，尤其是拟南芥(thaliana)种等等；菊科(Compositae)，特别是莴苣属(Lactuca)，尤其是莴苣种(sativa)等等。
特别地，本发明的转基因植物选自单子叶作物植物，例如谷类如小麦、大麦、高粱和粟、黑麦、黑小麦、玉米、稻或燕麦和甘蔗。其他优选的是树木如苹果、梨、柑橘、李、樱桃、桃、油桃、杏、木瓜、芒果和其他木本物种，包括松柏和落叶树木如白杨、松、水杉、雪松、栎等。特别优选拟南芥、烟草、油菜、大豆、玉米(玉蜀黍)、小麦、亚麻子、马铃薯和万寿菊。
可以通过在标准实验条件(即对接触外源DNA的细胞数、递送DNA的量、DNA递送的类型和条件、一般培养条件等进行标准化或归一化)下回收的转化细胞(或从单个转化细胞长成的转基因生物)数测量本文使用的“转化效率”或“转化频率”。例如，当使用分离的叶柄作为转化的起始材料时，转化频率可以表达为每个转化叶柄获得的转基因嫩枝(或得到的可育植物株系)的数目。
术语“表达”指基因产物的生物合成。例如，对于结构基因的情况，表达涉及结构基因转录成mRNA和任选的其后mRNA翻译成一种或多种多肽。
本文使用的术语“表达盒”或“表达构建体”旨在指待表达的任何核酸序列有效连接启动子序列和任选的促进所述核酸序列表达的其他元件(如终止子和/或多腺苷酸化序列)的组合。
本文使用的术语“启动子”、“启动子元件”或“启动子序列”指当与目的核苷酸序列连接时，能够控制目的核苷酸序列转录成mRNA的DNA序列。启动子一般(尽管不必然是)位于目的核苷酸序列的5’(即上游)(如靠近结构基因转录起始位点)，启动子控制目的核酸序列向mRNA的转录并提供RNA聚合酶和起始转录的其他转录因子特异性结合的位点。如果多核苷酸序列来源于外来物种，或者如果来自同一物种时，对其最初形式进行了修饰，则所述多核苷酸序列就生物或第二种多核苷酸序列而言是“异源的”。例如，启动子与异源编码序列有效连接指来自与启动子来源物种不同的物种的编码序列，或者如果来自同一物种时为不天然与启动子连接的编码序列(如遗传改造的编码序列或来自不同生态型或变种的等位基因)。合适的启动子可以来自植物或植物病原体，如植物病毒。
如果启动子为诱导型启动子，则转录速率应答于诱导剂而提高。相反，如果启动子为组成型启动子，则转录速率不受诱导剂的调节。另外，可以以组织特异性或组织优选的方式调节启动子，从而其仅在特定组织类型(如叶、根或分生组织)中活跃转录相关编码区。用于启动子时，术语“组织特异性”指这样的启动子，它能够指导目的核苷酸序列在特定组织类型(如花瓣)中选择性表达，而同一核苷酸序列在不同的组织类型(如根)中的表达相对缺失。可以通过例如以下来评估启动子的组织特异性：将报道基因与启动子序列有效连接以产生报道构建体，将报道构建体引入植物基因组从而使报道构建体整合进得到的转基因植物的每种组织中，检测转基因植物的不同组织中报道基因的表达(例如检测mRNA、蛋白质或报道基因编码的蛋白质的活性)。与报道基因在其他组织中的表达水平相比，检测到报道基因在一种或多种组织中较高的表达水平表明该启动子对于检测到较高表达水平的组织具有特异性。当用于启动子时，术语“细胞类型特异的”指这样的启动子，它能够指导目的核苷酸序列在特定细胞类型中的选择性表达，而在同一组织的不同类型细胞中同一核苷酸序列的表达相对缺失。当用于启动子时，术语“细胞类型特异的”还指能促进目的核苷酸序列在单个组织内的区域中选择性表达的启动子。可以使用本领域熟知的方法评估启动子的细胞类型特异性，如GUS活性染色(如实施例7中所述)或免疫组织化学染色。简言之，将组织切片包埋在石蜡中，用一级抗体与石蜡切片反应，所述抗体对表达受启动子控制的目的核苷酸序列所编码的多肽产物具有特异性。使对一级抗体具有特异性的标记(如缀合过氧化物酶)的二级抗体与切片的组织结合，通过显微术检测(如用抗生物素蛋白/生物素)特异性结合。启动子可以是组成型或可调节的。涉及启动子时，术语“组成型”指启动子能在无刺激(如热激、化学品、光等)的情况下指导有效连接的核酸序列转录的启动子。组成型启动子一般能指导转基因在基本上任何细胞和任何组织中表达。相反，“可调节”启动子是在存在刺激(如热激、化学品、光等)情况下能指导有效连接的核酸序列转录水平的启动子，所述转录水平与不存在刺激时有效连接的核酸序列的转录水平不同。
在需要基因在转基因植物或其他生物的所有组织中表达时，可以使用“组成型”启动子，它通常在多数环境和发育或细胞分化状态下具有活性(Benfey 1989)。可用于植物的启动子还包括得自Ti或Ri质粒、来自植物细胞、植物病毒或发现其启动子在植物中具有功能的其他生物。在植物中具有功能并因此适用于本发明方法的细菌启动子包括章鱼碱合成酶启动子、胭脂碱合酶启动子和甘露碱合成酶启动子。控制性状基因和/或选择标记表达的启动子可以是组成型的。适用于植物的组成型启动子包括如花椰菜花叶病毒(CaMV)35S转录起始区(Franck 1980；Odell 1985；Shewmaker 1985；Gardner 1986)、19S转录起始区(US 5,352,605和WO84/02913)和区域VI启动子、来自根癌农杆菌T-DNA的1’或2’启动子和本领域技术人员已知在植物细胞中具有活性的其他启动子。其他合适的启动子包括来自玄参花叶病毒的全长转录物启动子、肌动蛋白启动子(如稻肌动蛋白启动子；McElroy 1990)、组蛋白启动子、微管蛋白启动子或甘露碱合酶启动子(MAS)。其他组成型植物启动子包括多种泛蛋白或聚泛蛋白启动子(Sun 1997；Christensen 1989，1992；Bruce 1989；Holtorf1995)、mas、Mac或DoubleMac启动子(US 5,106,739；Comai 1990)、泛蛋白启动子(Holtorf 1995)、核酮糖二磷酸羧化酶/加氧酶小亚基(SSU)启动子(US 4,962,028)、豆球蛋白B启动子(GenBank检索号X03667)、来自农杆菌的胭脂碱合酶(NOS)启动子、TR双启动子、来自农杆菌的章鱼碱合酶(OCS)启动子、Smas启动子、肉桂醇脱氢酶启动子(US5,683,439)、液泡ATPase亚基启动子、pEMU启动子(Last 1991)、MAS启动子(Velten 1984)、玉米H3组蛋白启动子(Lepetit 1992；Atanassova1992)、α-conglycinin启动子、菜豆蛋白启动子、ADH启动子和热激启动子、来自拟南芥的腈水解酶启动子(WO 03/008596；GenBank检索号U38846，核苷酸3,862至5,325或5342)、来自小麦的富含脯氨酸蛋白启动子(WO 91/13991)、豌豆ptxA基因启动予和来自本领域技术人员已知的多种植物基因的其他转录起始区。
当然，启动子可以在所有时间在一种或一些组织中调节表达。或者，启动子可以在所有组织中但仅在特定的发育时间点调节表达。如上文指出的，切除启动子(如与序列特异性切割DNA的多核苷酸连接的启动子)通常不是组成型的，而是仅在转基因生物的部分生活周期和至少一种组织中具有活性。可以使用指导目的基因在特定组织中表达或在更精确的环境或发育控制下表达的启动子。可以通过诱导型启动子影响转录的环境条件的实例包括病原体攻击、缺氧条件、乙烯或光的存在。在发育控制下的启动子包括仅在某些组织或器官中起始转录的启动子，所述组织或器官为例如叶、根、果实、种子或花或其部分。启动子的操作还取决于其在基因组中的定位而发生变化。在一些位置诱导型启动子变得完全或者部分组成性的。在发育控制下的组织特异性植物启动子的实例包括仅在某些组织中起始转录的启动子，所述组织为例如果实、种子、花、花药、子房、花粉、分生组织、花、叶、茎、根和种子。尤其可以使用来自番茄的组织特异性ES启动子指导基因表达，从而使所需基因产物位于果实中(参阅如Lincoln1988；Deikman 1988，1992)。其他合适的组织特异性启动子包括来自以下基因的启动子：玉米MAC1(Sheridan 1996)、玉米Cat3(GenBank号L05934，Abler 1993)、编码玉米油质蛋白18 kD的基因(GenBank号J05212，Lee1994)、拟南芥viviparous-1(Genbank检索号U93215)、编码拟南芥油质蛋白的基因(Genbank检索号Z17657)、拟南芥Atmycl(Urao 1996)、拟南芥2S种子贮藏蛋白基因家族(Conceicao 1994)、编码欧洲油菜油质蛋白20kD的基因(GenBank号M63985)、欧洲油菜油菜籽蛋白(GenBank号J02798，Josefsson 1987)、油菜籽蛋白基因家族(如来自欧洲油菜，Sjodahl 1995，US5,608,152；Stalberg 1996)、编码欧洲油菜2S贮藏蛋白的基因(Dasgupta1993)、编码大豆油质蛋白A(Genbank检索号U09118)和油质蛋白B(Genbank号U09119)的基因、编码大豆低分子量富含硫蛋白的基因(Choi1995)、菜豆蛋白基因(US 5,504,200，Bustos 1989；Murai 1983；Sengupta-Gopalan 1985)、2S白蛋白基因(Joseffson 1987)、豆球蛋白基因(Shirsat 1989)、USP(未知种子蛋白)基因(Bumlein 1991)、蔗糖结合蛋白基因(WO 00/26388)、豆球蛋白B4基因(LeB4；Bumlein 1991a，b；1992；Fiedler 1995)、拟南芥油质蛋白基因(WO 98/45461)、芸苔Bce4基因(WO91/13980)、编码“高分子量麦谷蛋白”(HMWG)、醇溶蛋白、分支酶、ADP-葡萄糖焦磷酸酶(AGPase)或淀粉合酶的基因。其他优选的启动子是允许在单子叶植物如玉米、大麦、小麦、黑麦、稻等中种子特异性表达的启动子。可以有利地使用的启动子为lpt2或lpt1基因启动子(WO95/15389，WO 95/23230)或WO 99/16890中所述启动子(大麦醇溶蛋白基因、谷蛋白基因、水稻素基因、谷醇溶蛋白基因、醇溶蛋白基因、玉米醇溶蛋白基因、kasirin基因或黑麦醇溶蛋白基因)。其他优选的是叶特异性和光诱导启动子，如cab或核酮糖二磷酸羧化酶/加氧酶启动子(Simpson1985；Timko 1985)；花药特异性启动子如LAT52启动子(Twell 1989b)；花粉特异性启动子如Zml3启动子(Guerrero 1993)和小孢子优先启动子如apg启动子(Twell 1993)。其他合适的启动子为例如块茎、贮藏根或根特异性启动子如I类patatin启动子(B33)、马铃薯组织蛋白酶D抑制剂启动子、淀粉合酶(GBSS1)启动子或sporamin启动子和果实特异性启动子如番茄果实特异性启动子(EP-A 409625)。
其他合适的启动子为确保叶特异性表达的启动子。可能提到的启动子为马铃薯细胞质FBPase启动子(WO 98/18940)、Rubisco(核酮糖-1，5-二磷酸羧化酶)SSU(小亚基)启动子或马铃薯ST-LSI启动子(Stockhaus1989)。其他优选启动子是控制在种子和植物胚中表达的启动子。
还可以有利地使用如EP-A 249676所述的其他合适的启动子，例如果实成熟特异性启动子，如番茄果实成熟特异性启动子(WO 94/21794)、花特异性启动子如八氢番茄红素合酶启动子(WO 92/16635)或P1-rr基因(WO 98/22593)启动子或其他节特异性启动子。启动子还可以是髓特异性启动子，如WO 93/07278所述分离自植物TrpA基因的启动子。此外，还描述了发育调节的启动子(Baerson 1993)。
表达盒还可以含有化学诱导型启动子(综述文章：Gatz 1997)，通过这种手段可以在特定的时间点控制外源基因在植物中的表达。类似的可以使用如PRP1启动子(Ward 1993)、水杨酸诱导型启动子(WO 95/19443)、苯磺酰胺诱导型启动子(EP 0388186)、四环素诱导型启动子(Gaz 1991，1992)、脱落酸诱导型启动子(EP-A1 0335528)或乙醇-环己酮诱导型启动子(WO 93/21334)等启动子。谷胱甘肽-S转移酶同工型II基因的启动子(GST-II-27)也是合适的，它被外源应用的安全剂如N，N-二烯丙基-2，2-二氯乙酰胺(WO 93/01294)激活，并在单子叶植物和双子叶植物的多种组织中有效。本发明可使用的其他示例性诱导型启动子包括来自应答于铜的ACE1系统的启动子(Mett 1993)或来自玉米的应答于苯磺酰胺除草剂安全剂的In2启动子(Hershey 1991；Gatz 1994)。可以使用应答于植物通常不应答的诱导剂的启动子。示例性诱导型启动子为来自胆固醇激素基因的诱导型启动子，其转录活性被糖皮质激素诱导(Schena 1991)。其他优选的启动子为生物或非生物胁迫诱导的启动子，例如PRP1基因的病原体诱导型启动子(Ward 1993)、番茄热诱导型hsp80启动子(US 5,187,267)、马铃薯冷诱导型α-淀粉酶启动子(WO 96/12814)或损伤诱导型pinII启动子(EP-A1 0375091)。
启动子还可以包括能修饰表达特异性特征的其他启动子、启动子元件或最小启动子。因此，还可以例如由于遗传控制序列，由于某些胁迫因素作用而发生组织特异性表达。例如，已描述了用于水胁迫、脱落酸(Lam1991)和热胁迫(Schoffl 1989)的这些元件。
术语“有效的连接”或“有效连接”应理解为指例如调节元件(如启动子)与待表达的核酸序列以及适当时其他调节元件(如终止子)的顺序排列，其中每个调节元件都能实现其预期功能，以允许、修饰、促进或影响所述核酸序列的表达。表达可取决于核酸序列相对于有义或反义RNA的排列。为实现这一点，化学意义上的直接连接不是必需的。遗传控制序列(如增强子序列)可以从很远的位置或从实际上其他DNA分子对靶序列发挥其功能。优选的排列是将待重组表达的核酸序列置于作为启动子的序列之后，以使两个序列彼此共价连接。启动子序列和待重组表达的核酸序列之间的距离优选小于200个碱基对，特别优选小于100个碱基对，非常特别优选小于50个碱基对。可以通过如所述(如Maniatis 1989；Silhavy 1984；Ausubel 1987；Gelvin 1990)惯用的重组和克隆技术产生有效连接和表达构建体。然而，也可以将其他序列(例如作为接头的带有限制性酶特异性切割位点的序列或作为信号肽的序列)置于两个序列之间。插入序列也可以引起表达融合蛋白。优选地，由启动子和待表达核酸序列连接组成的表达构建体可以以载体整合的形式存在，并可通过如转化插入植物基因组。
本文使用的术语“转化”指将遗传物质(如转基因)引入细胞中。细胞转化可以是稳定的或瞬时的。术语“瞬时转化”或“瞬时转化的”指在不将转基因整合进宿主细胞基因组的情况下将一个或多个转基因引入细胞。可以通过如酶联免疫吸附测定(ELISA)检测瞬时转化，其检测一个或多个转基因所编码多肽的存在。或者可以如本文所证明的，通过检测转基因(如uid A基因)所编码蛋白质(如β-葡糖醛酸糖苷酶)的活性来检测瞬时转化(如通过用在存在GUS酶时给出蓝色沉淀的X-Gluc进行染色的GUS酶活性的组织化学测定；以及使用GUS-Light试剂盒(Tropix)的GUS酶活性化学发光测定)。术语“瞬时转化体”指瞬时整合了一种或多种转基因的细胞。相反，术语“稳定转化”或“稳定转化的”指将一种或多种转基因引入并整合于细胞基因组，优选得到染色体整合和通过减数分裂的稳定遗传性。可以通过细胞基因组DNA与能结合一种或多种转基因的核酸序列的DNA印迹杂交检测细胞的稳定转化。或者，还可以通过细胞基因组DNA聚合酶链式反应扩增转基因序列来检测细胞的稳定转化。术语“稳定转化体”指将一种或多种转基因稳定整合进基因组DNA的细胞。因此，稳定转化体与瞬时转化体的区别在于，来自稳定转化体的基因组DNA含有一种或多种转基因，而来自瞬时转化体的基因组DNA不含有转基因。转化还包括以植物病毒载体的形式将遗传物质引入植物细胞，其涉及表染色体(epichromosomal)复制和基因表达，其就减数分裂稳定性而言可以显示可变特性。
术语用细菌“感染”指在一定条件下将靶生物样品(如细胞、组织等)与细菌共温育，以使细菌内含有的核酸序列引入靶生物样品的一个或多个细胞。
术语“分生组织”或“分生细胞”或“分生的组织”可互换使用，旨在指未分化的植物组织，其持续分裂、形成新的细胞，如可见于茎或根的尖端。
术语“节”旨在指叶在茎上附着的点。术语“节间”旨在指茎上两个节之间的节段或部分。
术语“叶柄”旨在指叶附着于茎的柄。
术语“腋芽”旨在指沿茎或枝上的小突起，有时包围于保护性鳞片(protective scale)中，并包括未发育嫩枝、叶或花，也称为侧芽。
术语“下胚轴”旨在指茎在子叶和根之间的部分。术语“叶腋”旨在指叶和其生出的茎之间的角。腋芽在叶腋处出现。
术语“子叶”旨在指种子植物胚的叶，其在萌发后保留在种子中，或者伸出、长大并变绿，也称为种子叶。大豆种子由两片半种子组成，它们是子叶。两片子叶含有在萌发时为苗提供营养的食物和营养储备，直到苗长成。子叶的颜色在发育的种荚里是绿色，但在谷物变种中随着植物的成熟而变成黄色。胚轴位于子叶之间，并靠近最接近珠孔的末端附着在子叶上。
术语“农杆菌”指土传革兰氏阴性杆状植物致病细菌。农杆菌与根瘤菌、中华根瘤菌属和Allorhizobium都是属于根瘤菌科细菌(Kersters和DeLey.1984)的属，根瘤菌科基于核糖体特征包括于变形菌的α-2亚纲(Willems和Collins.1993)。该科成员为需氧的革兰氏阴性菌。细胞一般为杆状(0.6-1.0μm乘以1.5-3.0μm)，单个或成对出现，无内生孢子，可通过1至6个周生鞭毛移动。在含有碳水化合物的培养基上生长时通常产生可观的胞外多糖粘液。基于16S rDNA比较分析，农杆菌物种根癌农杆菌(放射形农杆菌)、发根农杆菌、悬钩子农杆菌和葡萄农杆菌与Allorhizobium undicola一起和所有的根瘤菌物种形成单系群(Sawada1993，Young 2003)。农杆菌是包含植物致病性物种的人工属。农杆菌、Allorhizobium和根瘤菌的单系特征及其共有的表型一般定义支持将其合并为根瘤菌这一个属。农杆菌分类和表征(包括区分根癌农杆菌和发根农杆菌及其多种冠瘿碱类型分类)是本领域所熟知的实践(参阅如《Laboratory guide for identification of plant pathogenic bacteria》，第三版.(2001)N.W.Schaad，J.B.Jones和W.Chun编辑ISBN 0890542635；例如其中出版的Moore等的文章)。
最近的分析证明通过其植物致病性特性进行分类是不合理的。因此，使用基于基因组分析和比较(如16S rRNA测序，RFLP、Rep-PCR等)的更先进的方法说明多种菌株之间的关系(参阅如Young 2003，Farrand2003，de Bruijn 1996，Vinuesa 1998)。可以将农杆菌分成至少三个生物变型，与基于差别生物化学和生理测试的物种划分相对应。农杆菌的致病性菌株共享共有的特征，它们含有至少一个大质粒--诱导肿瘤或根(分别为Ti和Ri)的质粒。通过包括转移DNA(T-DNA)和毒力(vir)基因的质粒不同区域确定毒力。毒力基因介导T-DNA转移进入感染植物细胞，其中T-DNA整合进植物DNA中。根据“传统”分类，农杆菌包括但不仅限于以下菌株：根癌农杆菌菌株(一般根据其天然“装甲”Ti质粒在感染植物中引起冠瘿)和发根农杆菌(根据其天然“装甲”Ri质粒在感染宿主植物中引起发根病)、悬钩子农杆菌(由其天然“装甲”质粒在悬钩子上引起茎瘿)、葡萄农杆菌和放射形农杆菌(归入非致病性农杆菌)。
图1A(基于RAPD(随机扩增多态性DNA)，得自Llob 2003；图2)和1B(基于16S rRNA测序)中展示了通过证明农杆菌菌株K599关系的两种方法得到的农杆菌属成员的系统发生关系。
表1：农杆菌菌株(来自Llob 2003，表1)
  菌株参照     来源   生物变型   冠瘿碱类型     宿主
A281(＝带有质粒pTiBo524的C58) 1 农杆碱
Ach5     USA 1     章鱼碱     李
ATCC 15834     USA 发根农杆菌     ND     未知
B6     USA 1     ND     未知
CFBP 42     法国 1     ND     番茄
CFBP1903(C58) USA 1 胭脂碱     Prunuscerasus
IVIA 014     Zaragoza，西班牙 2 胭脂碱     桃
IVIA 66R     Sevilla，西班牙 2 ND     玫瑰
IVIA 251-1     Badajoz，西班牙 1 胭脂碱     杏
IVIA 251-21     Badajoz，西班牙 2 胭脂碱     樱桃
IVIA 251-22     Badajoz，西班牙 1     胭脂碱     樱桃
IVIA 254-1     Vanlencia， ND     未知     桃
  西班牙
IVIA 254-2   Vanlencia，西班牙 2 胭脂碱     桃
IVIA 260-67   Badajoz，西班牙 2    胭脂碱     杨
IVIA 282-64   Tenerife，西班牙 2 胭脂碱 玫瑰
IVIA 325-4   Tarragona，西班牙 1    胭脂碱     桃×杏
IVIA 325-7   Tarragona，西班牙 2    胭脂碱     桃×杏
IVIA 339-26   Ourense，西班牙 3 ND     葡萄
IVIA 347-4   Valencia，西班牙 1 胭脂碱 桃
IVIA 354-35   Valencia，西班牙 2 胭脂碱     杏
IVIA 360-54   Navarra，西班牙 1 ND     葡萄
IVIA 388-30   Zaragoza，西班牙 2    胭脂碱     杏
IVIA 436-46   Zaragoza，西班牙 1 胭脂碱/甘露碱 桃×杏
IVIA 545-45   Castellon，西班牙 2 胭脂碱 柑橘
IVIA 576-80   Cuenca，西班牙 1 胭脂碱     柳
IVIA 678-2   Valencia，西班牙 1 ND 桃×杏
IVIA 796-6   Valencia，西班牙 2 ND 桃×杏
IVIA 1.102   Valencia，西班牙 1 Chrysopine 菊
IVIA 1853-2   Zaragoza，西班牙 2 ND 桃
172-17T**   Ourense，西班牙 1 章鱼碱 葡萄
225-226P   Ourense，西班牙 1 章鱼碱 葡萄
194-459Y   Ourense，西班牙 3 章鱼碱 葡萄
K84 Australia   放射形农杆菌 胭脂碱/章鱼碱 土壤
  NCIB 8196     未知   发根农杆菌  ND     未知
  NCPPB 1649     南非   2  ND     玫瑰
  NCPPB 2437     USA   1  ND     未知
  NCPPB2659(K599) UK 发根农杆菌 南瓜氨酸 黄瓜
  NCPPB 3554   澳大利亚   3  ND     葡萄
ATCC：美国典型培养物保藏中心，USA；CFRP：Collection Francaisedes Bacteries Phytopa-togenes，法国；IVIA：Instituto Valenciano deInvestigaciones Agrarias，西班牙；NCIB：国家工业细菌保藏中心(National Collection of Industrial Bacteria)，UK：NCPPB：植物致病性细菌国家保藏中心(National Collection of Plant Pathogenic Bacteria)，UK；ND：未确定。
本文使用的术语Ti质粒指在农杆菌中自主复制，并且是它在农杆菌感染植物中介导冠瘿的天然“装甲”形式的质粒。用天然“装甲”形式的农杆菌Ti质粒感染植物细胞通常引起感染细胞产生冠瘿碱(如胭脂碱、农杆碱、章鱼碱等)。因此，引起产生胭脂碱的农杆菌菌株(如菌株LBA4301、C58、A208)称为“胭脂碱型”农杆菌；引起产生章鱼碱的农杆菌菌株(如菌株LBA4404、Ach5、B6)称为“章鱼碱型”农杆菌；引起产生农杆碱的农杆菌菌株(如菌株EHA105、EHA101、A281)称为“农杆碱型”农杆菌。卸甲Ti质粒应理解为没有其介导冠瘿的特性但提供植物感染功能的Ti质粒。优选地，以这样的方式修饰所述“卸甲”质粒的T-DNA区：即除了边界序列以外不将功能性内部Ti序列转移进植物基因组。在优选的实施方案中(使用双元载体系统时)缺失了整个T-DNA区(包括T-DNA边界)。
本文使用的术语Ri质粒指在农杆菌中自主复制，并且是它在农杆菌感染植物中介导发根病的天然“装甲”形式的质粒。用天然“装甲”形式的农杆菌Ri质粒感染植物通常引起感染植物产生冠瘿碱(转化植物细胞中产生的特定氨基糖衍生物，如农杆碱、南瓜氨酸、章鱼碱、mikimopine等)。传统上以与根癌农杆菌菌株相同的方式将发根农杆菌区分为亚类。最普遍的菌株为农杆菌型菌株(如特征为Ri质粒pRi-A4)、甘露碱型菌株(如特征为Ri质粒pRi8196)和南瓜氨酸型菌株(如特征为Ri质粒pRi2659)。一些其他菌株为mikimopine型(如特征为Ri质粒pRi1724)。Mikimopine和南瓜氨酸是立体异构体，但pRi质粒在核苷酸水平上无同源性(Suzuki2001)。卸甲Ri质粒应理解为没有介导发根病的特性但提供植物感染功能的Ri质粒。优选地，以这样的方式修饰所述“卸甲”Ri质粒的T-DNA区：即除了边界序列以外不将功能性内部Ti序列转移进植物基因组。在优选的实施方案中(使用双元载体系统时)缺失了整个T-DNA区(包括T-DNA边界)。
尽管Ti和Ri质粒在菌株间存在相当大的变化，但它们带有相似的vir基因。
本文使用的术语“16S-23S rRNa基因间序列”旨在指位于编码16SrRNA和23S rRNA的序列之间的基因组DNA区。所述基因间序列可以与编码16S rRNA和23S rRNA的序列重叠。
发明详述
本发明将农杆菌菌株K599(NCPPB 2659)的“卸甲”菌株变体用于T-DNA递送进入植物细胞。在下文中不使用菌株K599先前作为“发根农杆菌”的分类，因为除了发根诱导表型(这是Ri质粒的结果，而非细菌基因组的结果)以外，基于核糖体rDNA序列的比较分析，该菌株似乎与其他发根农杆菌关系很远。因此，认为该菌株是不明确属于根癌农杆菌或发根农杆菌菌株的独特样品。
本发明的第一个实施方案涉及产生转基因植物细胞的方法，所述方法包括：
a)提供农杆菌菌株K599(NCPPB2659)或所述菌株衍生物的转基因非致病性菌株变体，其中所述菌株变体能感染植物细胞，但没有诱导发根表型的特性，且其中所述菌株变体还包含转基因T-DNA，和
b)将植物细胞与所述细菌共培养，和
c)分离或选择植物细胞，所述植物细胞包含稳定整合进其基因组的所述转基因T-DNA。
本发明的另一实施方案涉及产生转基因植物的方法，所述方法包括步骤：
a)提供农杆菌菌株K599(NCPPB2659)或所述菌株衍生物的转基因非致病性菌株变体细菌，其中所述菌株变体能感染植物细胞，但没有诱导发根表型的特性，且其中所述菌株变体还包含转基因T-DNA，和
b)将植物、植物细胞或植物组织与所述细菌共培养，和
c)分离或选择并任选地再生植物，所述植物包含稳定整合进其基因组的所述转基因T-DNA。
相对于现有技术，本发明的方法具有一种或多种以下优势：
a)它非常高效地转化对本领域已知根癌农杆菌菌株介导的转化顽拗的植物物种，特别是大豆和树木如杨和栗。令人吃惊地，本文提供的发根农杆菌K599的卸甲衍生物(分别为pRi2659Δ和pRi2659Δtet)对大豆具有高感染率，并且就常规农杆菌菌株而言提供了对于植物转化的改善。
b)由于其强感染特性，其可以以远低于根癌农杆菌的浓度使用。这允许使用对通常的根癌农杆菌共培养高度敏感的靶组织(如植物如小麦的合子或未成熟胚)。
c)此外，来自pRi2659的T-DNA边界用于产生新的双元载体。这些边界序列就常规使用的边界序列而言提供了改善，特别是与卸甲菌株变体发根农杆菌K599(pRi2659Δ)组合时。
d)最后，本发明与其他基于农杆菌的植物转化系统相容。
本发明的方法几乎可用于转化所有类型的植物。上文“一般定义”章节中列出了优选的植物。优选选自单子叶植物、双子叶植物和裸子植物的植物细胞、植物组织或植物。更优选的植物选自以下的属：苜蓿属、番茄属、芸苔属、香瓜属、茄属、核桃属、棉属、苹果属、葡萄属、金鱼草属、杨属、草莓属、拟南芥属、云杉属、辣椒属、藜属、菊属、牵牛属、松属、豌豆属、稻属、玉蜀黍属、小麦属、黑小麦属、黑麦属、黑麦草属、大麦属、大豆属、黄杉属、伽蓝菜属、甜菜属、向日葵属和烟草属。
在本发明优选的实施方案中，转基因T-DNA包含赋予所述植物农学价值性状的至少一种表达盒或至少一种标记基因，其允许选择和/或鉴定转化的植物、植物细胞或组织。下文描述了优选的标记基因。
1.“卸甲”农杆菌菌株K599(NCPPB2659)
本发明的另一实施方案涉及农杆菌菌株K599(NCPPB 2659)或所述菌株衍生物的非致病性变体(下文的“卸甲”菌株变体)，其中所述菌株变体能够感染植物细胞，但没有诱导发根表型的特性。
涉及农杆菌菌株K599(NCPPB2659)时，术语“衍生物”旨在指土传植物致病性细菌，其特征在于16S-23S rRNA基因间序列，所述基因间序列包含选自：
1.5’-AATCGTCGATGCGAATTGTTG-3’(基序M1，SEQ ID NO：5)
2.5’-GTTTTGTCCTGACGCTGTCGCGA-3’(基序M2，SEQ ID NO：6)
3.5’-TCTAACGATCGCTGCGCTCCGGA-3’(基序M3，SEQ ID NO：7)
4-5’-CGCCACGAGGCGCGACGGA-3’(基序M4，SEQ ID NO：8)
5.5’-TTATGGGCGAATTGATCTGA-3’(基序M5，SEQ ID NO：9)
6.5’-GTCCTGCTAAGGATTGATGCCT-3’(基序M6，SEQ ID NO：10)
7.5’-AGACCAGTCCTTGTGAAACC-3’(基序M7，SEQ ID NO：11)
8.5’-CCTGGGCATTTTTGTTGTTGG-3’(基序M8，SEQ ID NO：12)
9.5’-AATGGTATGGCTTCGAGGTG-3’(基序M9，SEQ ID NO：13)
10.5’-CTCAAAGAAGACCGTACCGACA-3’(基序M10，SEQ ID NO：14)的至少一种序列基序。
优选地，农杆菌菌株K599(NCPPB2659)的衍生物特征在于16S-23SrRNA基因间序列，所述基因间序列包含选自SEQ ID NO：5、6、7、8、9、10、11、12、13和14所述基序的至少2或3种基序，优选至少4或5种基序，更优选至少6或7种基序，最优选至少8、9或10种基序。
可以从已知16S-23S rRNA基因间序列可变区的多重比对鉴定其他特征序列基序(图14A-E比较了与农杆菌K599最相似的)。优选地，农杆菌K599的衍生物特征在于16S-23S rRNA基因间序列，所述基因间序列包含与碱基对SEQ ID NO：20或其互补序列具有至少90％、更优选至少95％、最优选至少98％同一性的序列。特别优选特征在于SEQ ID NO：21所述的16S rRNA序列的菌株。
非致病性菌株变体还可以包含选自以下的一种或多种特征：存在突变或嵌合virA或virG基因或存在超毒力质粒。农杆菌菌株K599(NCPPB2659)的非致病性菌株变体可以包含(下文定义的)pRI2659质粒的非致病性质粒变体。
本发明的另一实施方案涉及农杆菌菌株K599(NCPPB 2659)或所述菌株衍生物的转基因非致病性菌株变体，其中所述菌株变体能够感染植物细胞，但没有诱导发根表型的特性，并且其中所述菌株变体还包含转基因T-DNA。在本发明优选的实施方案中，转基因T-DNA包含赋予所述植物农学价值性状的至少一种表达盒或至少一种标记基因，其允许选择和/或鉴定转化的植物、植物细胞或组织。下文描述了优选的标记基因。下文描述了优选的T-DNA。
在本发明优选的实施方案中，所述农杆菌菌株K599(NCPPB 2659)(或所述菌株衍生物)的非致病性菌株变体能够感染植物细胞、介导T-DNA转移进植物细胞和介导T-DNA插入植物基因组，但没有诱导发根表型的特性。更优选地，这通过存在Ri质粒pRi2659(农杆菌菌株K599(NCPPB 2659)中的天然Ri质粒)的非致病性质粒变体或其衍生物(如下文所定义)来实现。所述非致病性质粒变体优选提供植物细胞感染和转化所需的全部功能，但没有引起发根表型的序列。下文描述了Ri质粒pRi2659的优选的非致病性质粒变体。
在本发明的另一优选实施方案中，进一步修饰本发明的非致病性农杆菌菌株以提高转化效率，例如通过改变vir基因表达和/或其诱导。这可以通过例如存在突变的或嵌合的virA或virG基因来实现(如对于根癌农杆菌描述于Hansen 1994；Chen和Winans 1991；Scheeren-Groot等，1994)。还可以与超毒力质粒(如基于pTOK246的载体，Ishida 1996)组合以产生所谓的超毒力菌株。还可以通过使用来自pSB1超毒力质粒的载体产生超毒力菌株变体(Komari 1996)。
2.“卸甲”pRi2659质粒
本文提供了质粒pRI2659卸甲形式的分离序列。此序列及序列信息可以其整体或部分使用。该质粒表达多种蛋白质(见表4)，其中一些对本领域而言是新的，并且最可能与pRI2659质粒优异的转化性能相关。序列和序列信息还允许多种用途，包括但不仅限于
a)增加对质粒优异的转化性能的了解，
b)利用来自该质粒的分离特征(如蛋白质)提高其他植物转化方法(如基于标准根癌农杆菌的转化)的性能，和
c)直接改变和优化所述质粒。
因此，本发明优选的实施方案涉及选自以下所述序列的分离的核苷酸序列：
a)包含SEQ ID NO：24所述序列或SEQ ID NO：24所述序列中至少100个连续核苷酸(优选至少250或500个连续核苷酸，更优选至少1000或2500个连续核苷酸，甚至更优选至少5000或10000个连续核苷酸，最优选全部连续核苷酸)的序列的序列，和
b)与SEQ ID NO：24所述序列或SEQ ID NO：24所述序列中至少1000个连续核苷酸(优选至少2000或4000个连续核苷酸，更优选至少5000或10000个连续核苷酸，甚至更优选至少20000或50000个连续核苷酸，最优选全部连续核苷酸)的序列具有至少90％(优选至少92％或95％，更优选至少97％或98％，最优选至少99％)序列同一性的序列，和
c)在等价于68℃在由5×SSPE、1％SDS、5×Denhardt试剂和100μg/mL变性鲑精DNA组成的溶液中结合或杂交，其后68℃在包含0.1×SSPE和0.1％SDS的溶液中洗涤的条件下与探针杂交的序列，所述探针由SEQ ID NO：24所述序列或其互补序列中至少100个连续核苷酸(优选至少250或500个连续核苷酸，更优选至少1000或2500个连续核苷酸，甚至更优选至少5000或10000个连续核苷酸，最优选全部连续核苷酸)组成。
本发明的另一实施方案涉及质粒pRi2659(农杆菌菌株K599(NCPPB2659)中的天然Ri质粒)或其衍生物的非致病性(“卸甲”)质粒变体，所述质粒变体提供植物细胞感染和转化所需的功能，但没有引起发根表型的序列(下文的“卸甲”质粒变体)。优选地，所述非致病性质粒变体包含天然致病性pRi2659或其衍生物中植物细胞感染和转化所需的序列，但没有介导发根表型的T-DNA序列。
优选地，pRi2659或其衍生物的非致病性质粒变体不包含可以转移进植物基因组的元件(如T-DNA元件)。这在与双元载体中包含的转基因T-DNA组合时特别有利。有多种方法可以提供这种“卸甲”质粒变体。例如可以通过以下方法实现：
1.使T-DNA边界发生功能障碍(如通过诱变)或
2.缺失来自Ri质粒的整个T-DNA，或
3.筛选天然缺失或非致病性突变体，或
4.通过诱导DNA切口并切除T-DNA进行的缺失诱变(如使用乙酰丁香酮)，或
5.转座子诱变并筛选非致病性突变体，或
6.使用如基因替换策略定向并特异性缺失相关基因。通过用缺失替换来替换RB和LB之间的野生型基因拷贝可以仅将需要缺失的基因精确地切除。
在本发明特别优选的实施方案中，所述非致病性质粒变体包含选自以下所述序列的至少一种序列：
a)包含SEQ ID NO：24所述序列或SEQ ID NO：24所述序列中至少100个连续核苷酸(优选至少250或500个连续核苷酸，更优选至少1000或2500个连续核苷酸，甚至更优选至少5000或10000个连续核苷酸，最优选全部连续核苷酸)的序列的序列，和
b)与SEQ ID NO：24所述序列或SEQ ID NO：24所述序列中至少1000个连续核苷酸(优选至少2000或4000个连续核苷酸，更优选至少5000或10000个连续核苷酸，甚至更优选至少20000或50000个连续核苷酸，最优选全部连续核苷酸)的序列具有至少90％(优选至少92％或95％，更优选至少97％或98％，最优选至少99％)序列同一性的序列，和
c)在等价于68℃在由5×SSPE、1％SDS、5×Denhardt试剂和100μg/mL变性鲑精DNA组成的溶液中结合或杂交，其后68℃在包含0.1×SSPE和0.1％SDS的溶液中洗涤的条件下与探针杂交的序列，所述探针由SEQ ID NO：24所述序列或其互补序列中至少100个连续核苷酸(优选至少250或500个连续核苷酸，更优选至少1000或2500个连续核苷酸，甚至更优选至少5000或10000个连续核苷酸，最优选全部连续核苷酸)组成。
更优选地，通过描述卸甲pRi2659质粒或(上文定义的)上述衍生物的核苷酸序列描述所述非致病性质粒变体。甚至更优选或作为替代地，衍生物编码与SEQ ID NO 112所述序列具有至少85％(优选至少90％或92％，更优选至少95％或98％，最优选至少99％)氨基酸序列同一性的virD2蛋白。
预期所述virD2蛋白是增强卸甲pRI2659质粒转化性能的关键因素。因此，本发明的另一实施方案涉及包含选自以下的氨基酸序列的多肽：
a)SEQ ID NO：112所述序列或其至少200个连续氨基酸(优选至少300个连续氨基酸，更优选至少400个连续氨基酸，优选全部连续氨基酸)的序列，
b)与SEQ ID NO：112所述序列具有至少85％(优选至少90％或92％，更优选至少95％或98％，最优选至少99％)序列同一性的序列。
然而，卸甲pRI2659质粒编码的其他蛋白质也认为可用于优化转化方法，因此本发明的另一实施方案涉及包含选自以下的氨基酸序列的多肽：
a)SEQ ID NO：25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39、40、41、42、43、44、45、46、47、48、49、50、51、52、53、54、55、56、57、58、59、60、61、62、63、64、65、66、67、68、69、70、71、72、73、74、75、76、77、78、79、80、81、82、83、84、85、86、87、88、89、90、91、92、93、94、95、96、97、98、99、100、101、102、103、104、114、115、116、117、118、119、120、121、122、123、124、126、128、129、130、131、132、133、134、136、137、139、140、142、143、144、145、146、147、148、149、150、151、152、154、155、156、158、159、161、162、163、164、165、166、167、168、169、170、171、172、173、174、175、176、177、178、179、180、181、182、183、184、185、186或187中任一项所述序列或其至少200个连续氨基酸(优选至少300个连续氨基酸，更优选至少400个连续氨基酸，优选全部连续氨基酸)的序列，
b)与SEQ ID NO：25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39、40、41、42、43、44、45、46、47、48、49、50、51、52、53、54、55、56、57、58、59、60、61、62、63、64、65、66、67、68、69、70、71、72、73、74、75、76、77、78、79、80、81、82、83、84、85、86、87、88、89、90、91、92、93、94、95、96、97、98、99、100、101、102、103、104、114、115、116、117、118、119、120、121、122、123、124、126、128、129、130、131、132、133、134、136、137、139、140、142、143、144、145、146、147、148、149、150、151、152、154、155、156、158、159、161、162、163、164、165、166、167、168、169、170、171、172、173、174、175、176、177、178、179、180、181、182、183、184、185、186或187中任一项所述序列具有至少85％(优选至少90％或92％，更优选至少95％或98％，最优选至少99％)序列同一性的序列。
本发明的另一实施方案涉及编码所述多肽的分离的核酸序列。这些序列可以是分离的天然序列(如包含于pRI2659质粒)或基于遗传密码简并性衍生的其他序列。
最优选地，本文提供的virD2蛋白衍生序列包含图16中(通过星号(*))指出的virD2蛋白的至少一个独特氨基酸残基。
优选地，通过从天然质粒中缺失整个T-DNA(包括边界)获得非致病性质粒变体。更优选地，对于本发明的非致病性质粒变体而言，缺失的T-DNA对应于SEQ ID NO：4的从碱基538左右至碱基15519左右的序列或SEQ ID NO：26从碱基3644左右至18577碱基左右的序列。
优选从Ri质粒中缺失整个T-DNA(更优选包括完整的右和左边界)。由于过去在Ti质粒上保留任一边界部分的卸甲Ti质粒，存在来自双元质粒的DNA整合在此边界后的可能，因此优选缺失Ri质粒(如pRi2659)的整个T-DNA，包括完整的RB和LB。本发明优选的实施方案中使用的方法消除了外源DNA整合的可能。因此，本发明优选的实施方案涉及pRi2659或其衍生物的非致病性质粒变体，其中所述质粒变体包含天然致病性pRi2659或其衍生物中植物细胞感染和转化所需的序列，但没有T-DNA，优选没有GenBank检索号AJ271050(SEQ ID NO：4)表征序列的约碱基538至约碱基15,519或SEQ ID NO：26所表征的序列的从碱基3644左右至18577碱基左右的序列描述的区域。此序列对应于致病性农杆菌菌株K599(NCPPB 2659)中提供的原始致病性Ri质粒pRi2659的T-DNA。更优选地，所述非致病性质粒变体是这样的序列：在高严格条件(例如，等价于68℃在由5×SSPE、1％SDS、5×Denhardt试剂和100μg/mL变性鲑精DNA组成的溶液中结合或杂交，其后68℃在包含0.1×SSPE和0.1％SDS的溶液中洗涤)下与致病性农杆菌菌株K599(NCPPB 2659)中提供的原始(天然)致病性Ri质粒pRi2659杂交，但在所述高严格条件下不与GenBank检索号AJ271050(SEQ ID NO：4)表征的序列从碱基538左右至碱基15519左右的序列或SEQ ID NO：26所表征序列中从碱基3644左右至18577碱基左右杂交。
更优选地，pRi2659的衍生物是能够介导T-DNA从土传细菌转移进植物细胞的质粒，其特征还在于
a)与编码(农杆菌菌株K599(NCPPB2659)中包含的)天然pRi2659质粒的DNA具有至少90％(优选至少91％或92％，更优选至少95％或98％，最优选至少99％)的序列同一性，或
b)在高严格条件下(例如等价于68℃在由5×SSPE、1％SDS、5×Denhardt试剂和100μg/mL变性鲑精DNA组成的溶液中结合或杂交，其后68℃在包含0.1×SSPE和0.1％SDS的溶液中洗涤)与(如SEQ ID NO：111所述的)天然pRi2659质粒杂交。
在优选的实施方案中，本发明的非致病性质粒变体在高严格条件下与致病性农杆菌菌株K599(NCPPB 2659)的完整天然致病性Ri质粒pRi2659杂交，但在高严格条件下不与SEQ ID NO：4所表征序列中从碱基538左右至碱基15519左右或SEQ ID NO：26所表征序列中从碱基3644左右至18577碱基左右的序列杂交。
涉及pRi2659时，术语“衍生物”指能介导T-DNA从土传细菌转移进植物细胞的质粒，其特征还在于
a)与编码(如农杆菌菌株K599(NCPPB2659)中包含的)天然pRi2659质粒的DNA具有至少90％、更优选至少95％、最优选至少98％的序列同一性，或
b)在(上文所述的)高严格条件下与天然pRi2659质粒杂交。
更优选地，天然致病性形式的这些pRi2659的衍生物介导冠瘿碱合成的南瓜氨酸型表型。
3.转基因T-DNA
优选地，农杆菌菌株K599(NCPPB 2659)或其衍生物的所述转基因非致病性菌株变体中的T-DNA包含于双元载体质粒上，所述双元载体质粒与提供植物感染所需特征的质粒(如缺乏其成瘤或发根诱导特性的Ti或Ri质粒)分开。因此，本发明另一实施方案涉及转基因T-DNA，其侧翼为来自发根农杆菌pRi2659质粒的至少一种T-DNA边界，所述转基因T-DNA不包含引起发根表型的序列。
优选地，T-DNA侧翼至少为右边界序列(更优选为右和左边界序列)。优选Ti和/或Ri边界。T-DNA边界是约25bp的重复，在本领域中已充分定义(Zupan 2000)。边界通过与所谓的vir基因(原始Ti或Ri质粒的部分)的组合作用介导T-DNA转移。
在优选的实施方案中，所述转基因T-DNA包含至少一个赋予所述植物农学价值性状的表达盒。在另一优选的实施方案中，所述T-DNA还包含至少一种标记基因，其允许选择和/或鉴定转化植物、植物细胞或组织。
已经证明质粒pRI2659的T-DNA边界在T-DNA转移中特别有效，因此在产生转基因植物(特别是转基因大豆植物)中特别有效。因此，优选地，T-DNA包含来自pRi2659质粒的T-DNA边界(如整合进双元载体中)。右边界具有与超驱动序列功能等同的8bp序列的16次重复(Hansen1992)。这些边界序列提供了与常规使用的边界序列相比的优势。特别优选农杆菌菌株K599(NCPPB 2659)的卸甲菌株变体或衍生物与包含Ri质粒(更优选pRi2659质粒)边界的转基因T-DNA的组合，所述组合促进如大豆的高转化效率。特别优选包含SEQ ID NO：18所述序列的左边界序列，SEQ ID NO：18代表SEQ ID NO：4的碱基538至561(pRi2659的T-DNA区)。
5′-tggcaggata tattgtggtg taaa-31(SEQ ID NO：18)
特别优选包含SEQ ID NO：19所述序列的右边界序列，SEQ ID NO：19代表SEQ ID NO：4的碱基15496至15519(pRi2659的T-DNA区)。
5′-tgacaggata tatccccttg tcta-31(SEQ ID NO：19)
因此，本发明另一实施方案涉及包含转基因T-DNA的质粒载体，所述转基因T-DNA侧翼为来自发根农杆菌pRi2659质粒的至少一种T-DNA边界。优选地，这些边界描述于SEQ ID NO：18或19。更优选地，质粒包含含有如SEQ ID NO：19所述序列的右边界。最优选地，质粒包含两种边界序列，其分别包含SEQ ID NO：18或19所述序列。优选所述质粒不包含引起发根表型的序列，更优选所述质粒不包含内部T-DNA蛋白质编码序列，最优选所述质粒基本不包含内部T-DNA序列。在此上下文中术语“内部”指侧翼为T-DNA边界的DNA(但不包括T-DNA边界)。T-DNA边界应理解为至少包含分别如SEQ ID NO：18或19所述序列的序列。术语“基本”旨在指可以包含一些不与致病性表型相关的内部序列，优选这些序列不多于200碱基对，优选不多于100碱基对，最优选不多于50碱基对，优选与边界序列直接相连。
可以以多种形式提供待通过非致病性菌株变体方法整合进植物基因组的T-DNA。可以以DNA构建体提供T-DNA，优选整合进特定的质粒，可以是穿梭或中间载体或双元载体。例如(但不仅限于)可以通过以下方法提供：
a)可以将T-DNA整合进非致病性菌株变体的染色体DNA。
b)可以将T-DNA整合进非致病性菌株变体中包含的卸甲Ri质粒DNA。
c)T-DNA可以以与卸甲Ri质粒分开的质粒的形式包含于非致病性菌株变体中。
优选地，所述非致病性菌株变体中的T-DNA包含于与卸甲Ri质粒分开的双元载体质粒上。
在优选的实施方案中，所述T-DNA还包含至少一种标记基因，其允许选择和/或鉴定转化植物、植物细胞或组织。
本发明的另一实施方案涉及包含本发明核苷酸序列、非致病性质粒变体或转基因T-DNA的细胞或非人生物。优选地，所述细胞或非人生物选自细菌、酵母、植物、哺乳动物和昆虫。在一个优选的实施方案中，所述细胞或生物为根瘤菌科的土传细菌。在另一优选的实施方案中，所述细胞或生物为植物细胞或植物生物，更优选选自单子叶或双子叶植物。最优选的植物选自大豆、玉米(玉蜀黍)、小麦、油菜籽(卡诺拉)、万寿菊、马铃薯、稻、大麦和番茄。
本发明的另一实施方案涉及包含本发明转基因T-DNA的转基因载体。优选以双元载体的形式提供T-DNA。在所谓的“双元载体系统”中，T-DNA通过整合进允许早期操作的穿梭载体而在物理上与Ri质粒的其他功能性元件(如vir基因)分开(基于Ti质粒的双元系统的描述参阅EP-A 120516；US 4.940.838)。这些双元载体包含(除了还具有其边界序列的卸甲T-DNA以外)用于在农杆菌和大肠杆菌中复制的原核序列。在目前的情况下，除了其卸甲Ri质粒以外，用于转化的卸甲发根农杆菌菌株还包含带有待转移T-DNA的双元质粒，其优选包含用于选择转化的农杆菌细胞的基因(通常在T-DNA之外)、用于选择所转化植物细胞的标记和待转移的目的核酸序列(后两者通常包含于T-DNA中)。可以通过例如电穿孔或其他转化方法将双元质粒转移进卸甲发根农杆菌(Mozo 1991)。双元载体能够在大肠杆菌和农杆菌中复制。它们可以直接转化进农杆菌(如Holsters 1978所述)。在这种情况下，作为宿主生物的农杆菌应该已经含有带有vir区的质粒。后者是将T-DNA转化进植物细胞所需要的。这样转化的农杆菌可以用于转化植物细胞。允许选择转化的农杆菌的选择标记为例如赋予卡那霉素抗性的nptI或nptII基因或赋予链霉素、大观霉素抗性的aadA基因。多种标记(选择标记和报道基因)都适用于鉴定和/或选择转化的植物细胞、组织或植物(详细内容见下文)。对于农杆菌载体系统和用于农杆菌介导的转化方法的描述是本领域已知的(Miki 1993；Gruber 1993；Moloney 1989)。已知多种双元载体，其中一些是市售的，如pBIN 19(Clontech Laboratories，Inc.USA)。适用于基于根癌农杆菌的转化的所有载体都可用于本发明的方法。通常的双元载体基于“宽宿主范围”质粒，如衍生自P型质粒RK2的pRK252(Bevan 1984)或pTJS75(Watson1985)。这些载体多数衍生自pBIN19(Bevan 1984)。已知多种双元载体，其中一些是市售的，例如pBI101.2或pBIN19(Clontech Laboratories，Inc.USA)。其他载体在大小和操作上进行了改进(如pPZP，Hajdukiewicz1994)。改进的载体系统还描述于WO 02/00900。可以通过通常的DNA重组技术修饰双元载体或任何其他载体、在大肠杆菌中增殖并通过如电穿孔或其他转化技术引入农杆菌(Mozo 1991)。
因此，本发明另一实施方案涉及细胞或非人生物，所述细胞或非人生物包含(上文指出的)本发明非致病性质粒变体或本发明的转基因T-DNA或包含所述T-DNA的载体。优选地，所述细胞或非人动物选自细菌、酵母、植物、哺乳动物和昆虫。更优选地，所述细胞或非人动物为根瘤菌科的土传细菌。特别优选土传细菌如苜蓿中华根瘤菌(Sinorhizobiummeliloti)、Sinorhizobium medicae、费氏中华根瘤菌(Sinorhizobiumfredii)、根瘤菌NGR234种、根瘤菌BR816种、根瘤菌N33种、根瘤菌GRH2种、萨赫勒中华根瘤菌(Sinorhizobium saheli)、适宜中华根瘤菌(Sinorhizobium terangae)、豌豆根瘤菌三叶草生物变种(Rhizobiumleguminosarum biovar trifolii)、豌豆根瘤菌蚕豆生物变种(Rhizobiumleguminosarum biovar viciae)、豌豆根瘤菌菜豆生物变种(Rhizobiumleguminosarum biovar phaseoli)、热带根瘤菌(Rhizobium tropici)、菜豆根瘤菌(Rhizobium etli)、山羊豆根瘤菌(Rhizobium galegae)、Rhizobium gallicum、Rhizobium giardinii、Rhizobium hainanense、Rhizobium mongolense、羽扇豆根瘤菌(Rhizobium lupini)、百脉根中慢生根瘤菌(Mesorhizobium loti)、Mesorhizobium huakuii、Mesorhizobiumciceri、地中海中慢生根瘤菌(Mesorhizobium mediterraneium)、Mesorhizobium tianshanense、埃氏慢生根瘤菌(Bradyrhizobium elkanni)、大豆慢生根瘤菌(Bradyrhizobium j aponicum)、Bradyrhizobiumliaoningense、茎瘤固氮根瘤菌(Azorhizobium caulinodans)、Allobacteriumundicola、紫金牛叶杆菌(Phyllobacterium myrsinacearum)、根癌农杆菌、放射形农杆菌、发根农杆菌、葡萄农杆菌和悬钩子农杆菌。
在本发明优选的实施方案中，待通过本发明的卸甲发根农杆菌菌株方法整合进植物基因组的T-DNA包含至少一种赋予所述植物农学价值性状的表达盒。在另一优选的实施方案中，所述T-DNA还包含至少一种标记基因，其允许选择和/或鉴定转化植物、植物细胞或组织。因此，待插入靶植物基因组的T-DNA包含至少一种表达盒，所述表达盒可以例如促进表达选择标记基因、性状基因、反义RNA或双链RNA。优选地，所述表达盒包含在植物细胞中具有功能的启动子序列，所述启动子序列与表达后赋予这样转化的植物有利表型的核酸序列有效连接。本领域技术人员了解在此上下文中可以利用的多种序列，例如用以提高食品和饲料的品质、产生化学品、精细化学品或药物(如维生素、油、碳水化合物，Dunwell 2000)、赋予对除草剂的抗性或赋予雄性不育。此外，可以增强生长、产量和对非生物和生物胁迫因素(如真菌、病毒或昆虫)的抗性。可以通过过表达蛋白质或通过降低内源蛋白质的表达赋予有利的特性，其中通过如表达相应的反义RNA(Sheehy 1988；US 4,801,340；MoI 1990)或双链RNA(Matzke2000；Fire 1998；Waterhouse 1998；WO 99/32619；WO 99/53050；WO00/68374；WO 00/44914；WO 00/44895；WO 00/49035；WO 00/63364)降低表达。
对于在植物中进行的表达，优选植物特异性启动子。原则上，术语“植物特异性启动子”应理解为指能在植物或植物部分、植物细胞、植物组织或植物培养物中管理基因(特别是外源基因)的表达的启动子。在此上下文中，表达可以是例如(上文定义和指出的)组成型、诱导型或发育依赖性的。
除了启动子以外，遗传组分和/或表达盒还可以包含其他遗传控制序列。术语“遗传控制序列”应以广义理解，指对本发明DNA构建体或其中包含的表达盒的实现或功能有影响的所有序列。例如，遗传控制序列在原核或真核生物中修饰转录和翻译。优选地，本发明的表达盒还包含(作为额外的遗传控制序列的)待重组表达的目的核酸序列5’上游的在植物中具有功能的启动子和3’下游的终止子序列以及适当时其他惯用的调节元件，在每种情况下它们都与待重组表达的核酸序列有效连接。
遗传控制序列描述于例如″Goeddel；《Gene Expression Technology：Methods in Enzymology》185，Academic Press，San Diego，CA(1990)″或″Gruber和Crosby，《Methods in Plant Molecular Biology andBiotechnolgy》，CRC Press，Boca Raton，Florida，编辑：Glick和Thompson，第7章，89-108″及其中引用的参考文献。
这些控制序列的实例为结合诱导物或阻抑物并从而调节核酸表达的序列。遗传控制序列还包括基因的5’非翻译区、内含子或非翻译3’区，例如肌动蛋白-1内含子或Adh1-S内含子1、2和6(一般可参考《The MaizeHandbook》，第116章，Freeling和Walbot编辑，Springer，New York(1994))。已经证明它们在基因表达的调节中可能发挥重要的作用。因此，已经证明，5’非翻译序列能够增强异源基因的瞬时表达。可以提到的翻译增强子的实例为烟草花叶病毒5’前导序列(Gallie 1987)等。此外，它们可以促进组织特异性(Rouster 1998)。此外，它们可以促进组织特异性(Rouster 1998)。相反，暗色-2(opaque-2)基因的5’非翻译区抑制表达。缺失所述区域引起基因活性的提高(Lohmer 1993)。遗传控制序列还可包括用于起始翻译的核糖体结合序列。这特别在待表达的核酸序列不提供适当的序列或它们与表达系统不相容时是优选的。
表达盒还可以有利地包含与启动子有效连接的一种或多种增强子序列，所述增强子序列可以使核酸序列的重组表达提高。还可以在待重组表达的核酸序列的3’末端插入其他有利的序列，如其他调节元件或终止子。适合作为控制序列的多腺苷酸化信号为植物多腺苷酸化信号，优选基本对应于来自根癌农杆菌T-DNA多腺苷酸化信号的序列，特别是章鱼碱合酶(OCS)终止子和胭脂碱合酶(NOS)终止子。
在基因构建体中可以存在待重组表达的核酸序列的一个或多个拷贝。此外，遗传控制序列还应理解为指编码由信号肽序列组成的融合蛋白的序列。
控制序列还应理解为允许从基因组中移除插入序列的序列。基于cre/lox(Sauer B 1998；Odell 1990；Dale 1991)、FLP/FRT(Lysnik 1993)或Ac/Ds系统(Wader 1987；US 5,225,341；Baker 1987；Lawson 1994)的方法允许(适当时组织特异性和/或诱导型地)从宿主细胞基因组中移除特定DNA序列。在此上下文中，控制序列可以指其后允许移除(如通过cre重组酶方法)的特定侧翼序列(如lox序列)。
本发明的遗传组分和/或表达盒还可以包含其他功能元件。术语功能元件应以广义理解，指对本发明的遗传组分、表达盒或重组生物的再生、扩增或功能有影响的所有元件。功能元件可以包括例如(但不仅限于)：
1.选择标记基因
选择标记基因可用于选择和分离成功转化的或同源重组的细胞。优选地，在本发明的方法中，可以使用一种标记在原核宿主中进行选择，而使用另一标记在真核宿主(特别是植物物种宿主)中进行选择。标记可以提供对杀生物剂如抗生素、毒素、重金属等的保护或通过互补将原养传递到自养宿主而发挥作用。用于植物的优选选择标记基因可以包括但不仅限于以下：
1.1负选择标记
负选择标记赋予对杀生物化合物如代谢抑制剂(如2-脱氧葡萄糖-6-磷酸，WO 98/45456)、抗生素(如卡那霉素、G418、博来霉素或潮霉素)或除草剂(如膦丝菌素或草甘膦)的抗性。特别优选的负选择标记为赋予对除草剂的抗性的选择标记。可以提到的实例为：
-膦丝菌素乙酰转移酶(PAT；也称为Bialophos抗性；bar；de Block1987；EP 0333033；US 4,975,374)；
-赋予对草甘膦(N-(膦酰甲基)甘氨酸)的抗性的5-烯醇式丙酮基莽草酸-3-磷酸合酶(EPSPS；US 5,633,435)或草甘膦氧化还原酶基因(US5,463,175)(Shah 1986)；
-草甘膦降解酶(草甘膦氧化还原酶；gox)；
-茅草枯失活脱卤素酶(deh)；
-失活磺酰脲和咪唑啉酮的乙酰乳酸合酶(例如带有如S4和/或Hra突变的突变ALS变体)；
-降解溴苯腈的腈水解酶(bxn)；
-编码如新霉素磷酸转移酶的卡那霉素或G418抗性基因(NPTII；NPTI)(Fraley等1983)，其表达赋予对抗生素卡那霉素和相关抗生素新霉素、巴龙霉素、庆大霉素和G418的抗性的酶；
-赋予对2-脱氧葡萄糖的抗性的2-脱氧葡萄糖-6-磷酸磷酸酶(DOGR1基因产物；WO 98/45456；EP 0807836)(Randez-Gil等1995)；
-介导对潮霉素的抗性的潮霉素磷酸转移酶(HPT)(Vanden Elzen等1985)；
-二氢叶酸还原酶(Eichholtz等1987)。
赋予对抗生素抗性的细菌来源的其他负选择标记包括赋予对抗生素大观霉素抗性的aadA基因、庆大霉素乙酰转移酶、链霉素磷酸转移酶(SPT)、氨基葡糖苷-3-腺嘌呤转移酶和博来霉素抗性决定子(Hayford 1988；Jones1987；Svab 1990；HiIIe 1986)。
特别优选的是赋予对D-氨基酸(如D-丙氨酸和D-丝氨酸)产生的有毒效应的抗性的负选择标记(WO 03/060133)。在此上下文中特别优选的负选择标记为来自酵母纤细红酵母(Rhodotorula gracilis)(红冬孢酵母(Rhodosporidium toruloides))的daoI基因(EC：1.4.3.3：GenBank登录号：U60066)和大肠杆菌基因dsdA(D-丝氨酸脱水酶(D-丝氨酸脱氨酶)(EC：4.3.1.18；GenBank登录号：J01603))。
1.2)正选择标记
正选择标记赋予转化植物与未转化植物相比的生长优势。如来自根癌农杆菌(菌株：PO22；GenBank登录号：AB025109)的异戊烯基转移酶(细胞分裂素生物合成的关键酶)等基因可促进转化植物的再生(如通过在无细胞分裂素的培养基上选择)。已经描述了相应的选择方法(Ebinuma等2000a，b)。赋予转化植物与未转化植物相比的生长优势的其他正选择标记描述于例如EP-A 0601092。生长刺激选择标记可包括(但不仅限于)β-葡糖醛酸糖苷酶(与例如细胞分裂素葡糖苷酸组合)、甘露糖-6-磷酸异构酶(与甘露糖组合)、UDP-半乳糖-4-表异构酶(与例如半乳糖组合)，其中优选甘露糖-6-磷酸异构酶与甘露糖的组合。
1.2)反选择标记
反选择标记特别适用于选择具有定义的缺失序列(含有所述标记)的生物(Koprek 1999)。反选择标记的实例包括胸苷激酶(TK)、胞嘧啶脱氨酶(Gleave 1999；Perera 1993；Stougaard 1993)、细胞色素P450蛋白(Koprek 1999)、卤代烷脱卤素酶(Naested 1999)、iaaH基因产物(Sundaresan 1995)、胞嘧啶脱氨酶codA(Schlaman&Hooykaas 1997)或tms2基因产物(Fedoroff&Smith 1993)。
2)报道基因
报道基因编码易于定量的蛋白质，并通过其颜色或酶活性使得可以评估转化效率、表达位置或表达时间。在此上下文中非常特别优选编码如以下报道蛋白质(Schenborn 1999)的基因：绿色荧光蛋白(GFP)(Sheen1995；Haseloff 1997；Reichel 1996；Tian 1997；WO 97/41228；Chui 1996；Leffel 1997)、氯霉素转移酶、萤光素酶(Ow 1986；Millar 1992)、水母发光蛋白基因(Prasher 1985)、β-半乳糖苷酶、R基因座基因(编码在植物组织中调节花青苷色素的产生(红色)的蛋白质，从而使得可以不加入其他辅助物质或显色底物而直接分析启动子活性)(Dellaporta 1988；Ludwig 1990)，非常特别优选β-葡糖醛酸糖苷酶(GUS)(Jefferson 1987b；1987a)。通过将组织与5-溴-4-氯-3-吲哚基-β-D-葡糖醛酸温育后的蓝色来检测β-葡糖醛酸糖苷酶(GUS)的表达；通过光发射检测细菌萤光素酶(LUX)的表达；通过与萤光素温育后的光发射检测萤火虫萤光素酶(LUC)的表达；通过用5-溴-4-氯-3-吲哚基-β-D-半乳吡喃糖苷染色组织后的亮蓝色来检测半乳糖苷酶的表达。报道基因还可以用作可评分标记而作为抗生素抗性标记的替代。这些标记用于检测转移的基因的存在或测量其表达水平。只有在细胞的修饰效率高时，在植物中使用可评分标记鉴定或标记遗传修饰的细胞才能良好发挥作用。
3)复制起点，其确保本发明的表达盒或载体在例如大肠杆菌中扩增。可以提到的实例为ORI(DNA复制起点)、pBR322 ori或P15A ori(Maniatis1989)。用于在大肠杆菌中具有功能性的复制系统的其他实例为ColE1、pSC101、pACYC184等。作为大肠杆菌复制系统的补充或替代，可以使用宽宿主范围复制系统，如P-1不相容质粒的复制系统(如pRK290)。这些质粒特别有效地与有甲或卸甲Ti质粒一起将T-DNA转移到植物宿主。
4)农杆菌介导的转化所必需的元件，例如T-DNA的右和/或(任选的)左边界或vir区。
5)允许或促进插入一种或多种核酸序列的多克隆位点(MCS)。
一般使用转基因表达技术制备包含T-DNA的构建体(或本发明范围内使用的任何其他DNA构建体)。重组表达技术包括构建重组核酸和在转染细胞中表达基因。实现这些目的的分子克隆技术为本领域已知。本领域技术人员熟知多种适用于构建重组核酸的克隆和体外扩增方法。足以通过许多克隆训练指导技术人员这些技术和方法的实例可见于Berger和Kimmel(1987)，Maniatis 1989，Silhavy 1984，Ausubel 1998。优选地，通过使用本领域技术人员熟悉的重组和克隆技术将DNA构建体的上述必要组分与上述序列连接来产生本发明的DNA构建体。
构建多核苷酸构建体通常需要使用能在细菌中复制的载体。多种市售试剂盒都可用于从细菌中纯化质粒。为了正确的使用它们，要遵循生产商的说明书(参阅如来自Pharmacia Biotech的EasyPrepTM，FlexiPrepTM；来自Stratagene的StrataCleanTM和来自Qiagen的QIAexpressTM ExpressionSystem)。可以进一步操作分离和纯化的质粒，以产生用于转染细胞或整合进根癌农杆菌以感染和转化植物的其他质粒。使用农杆菌作为转化方法时构建穿梭载体。
4.转化方法
本发明的方法可用于获得转基因植物或细胞、部分、组织、来自它们的收获材料。
因此，本发明的另一主题涉及在其基因组中(优选在其核、染色体DNA中)包含本发明的DNA构建体(如包含Ri质粒pRi2659的边界的T-DNA)的转基因植物或植物细胞，并涉及细胞、细胞培养物、组织、部分或繁殖材料，例如在为植物生物体的情况下为来自这些植物的叶、根、种子、果实、花粉等。本发明其他重要的方面包括通过所公开的方法制备的转基因植物的后代以及来自这些后代的细胞和来自这些后代的种子。
可以不包括植物变种，特别是根据植物育种者权利(Plant BreedersRights)的可登记植物变种。应该注意，植物不必仅因为在其基因组内稳定地含有引入植物细胞或其祖先的转基因，就被认为是“植物变种”。除了植物以外，本发明提供这些植物的任何克隆、种子，自交或杂交子代和后代和这些中任一项的部分或繁殖体，如插条和种子，它们可用于有性或无性生殖或繁殖。本发明还包括这些植物的有性或无性繁殖的子代、克隆或后代或所述植物、子代、克隆或后代的任何部分或繁殖体。可被人或动物消费的本发明遗传修饰的植物还可以例如直接或在本领域已知的加工之后用作食品或饲料。
本发明的方法基本上可用于所有的植物变种，包括(上文定义和指出的)单子叶和双子叶植物的变种。令人吃惊的是，本发明的卸甲发根农杆菌菌株引起对于单子叶植物如玉米(玉蜀黍)的高转化率。有多种可用于单子叶植物转化的方法。由于其效率和对宿主范围没有限制，微粒轰击经常是有利的(Christou 1995；Jahne 1995)。然而，不规则的结构和转化事件数(如多个或断裂拷贝)需要对大量得到的转基因进行筛选和详细分析(Hadi 1996；Trick 1997)。另一方面，建立由农杆菌介导的用于转化单子叶植物的系统被认为是困难的，因为农杆菌感染单子叶植物是非常罕见的事件，只有使用“超毒力”根癌农杆菌菌株和/或乙酰丁香酮(诱导Ti质粒的vir基因表达的酚类化合物)才能实现合理的效率(Belarmino 2000；Eady2000；Hiei 1994；Smith和Hood 1995；Wilmink 1992)。然而，在本发明之前没有关于通过卸甲发根农杆菌菌株介导单子叶植物转化的报道。
还可以使用多种外植体、植物组织或植物细胞培养物作为共培养方法的靶材料。本领域技术人员会认识到，在DNA构建体稳定整合进转基因植物并确认有效后，可以通过有性杂交将其引入其他植物。可以使用大量标准育种技术中的任一种，取决于待杂交的物种。
为将DNA转移进植物细胞，将植物外植体与包含转基因T-DNA的本发明卸甲发根农杆菌共培养。可以使用适当的培养基从感染的植物材料(如叶、根或茎节段，还包括原生质体或植物细胞悬液)开始再生完整植物，所述培养基可以含有如用于选择转化的细胞的抗生素或杀生物剂。接着可以对获得的植物筛选引入的DNA的存在，在这种情况下所述DNA为本发明的表达构建体。一旦DNA整合进宿主基因组，所述基因型一般是稳定的，并且所述插入也可见于后代。优选地，在稳定转化后，使用转基因T-DNA内包含的选择标记选择植物。可以以惯常的方式培养和杂交得到的植物。应该培养两个或更多世代以确保基因组整合是稳定并且遗传的。
多种组织适于作为农杆菌介导的转化方法的起始材料(外植体)，包括但不仅限于愈伤组织(US 5,591,616；EP-A1604662)、未成熟胚(EP-A1672752)、花粉(US 54,929,300)、嫩枝端(US 5,164,310)或植物原位转化(US 5,994,624)。本文所述的方法和材料基本上可以与本领域已知的所有农杆菌介导的转化方法组合。优选的组合包括(但不仅限于)以下起始材料和方法：
    变种     材料/引用文献
单子叶植物： 未成熟胚(EP-A1 672752)愈伤组织(EP-A1 604662)胚胎发生愈伤组织(US 6,074,877)花序(US 6,037,522)花(植物原位)(WO 01/12828)
    香蕉 US 5,792,935；EP-A1 731632；US 6,133,035
    大麦 WO 99/04618
    玉米 US 5,177,010；US 5,987,840
    菠萝 US 5,952,543；WO 01/33943
    稻 EP-A1 897013；US 6,215,051；WO 01/12828
    小麦 AU-B 738153；EP-A1 856060
    豆 US 5,169,770；EP-A1 397687
    芸苔 US 5,188,958；EP-A1 270615；EP-A1 1009854
    可可 US 6,150,587
    橘 US 6,103,955
    咖啡 AU 729635
棉花 US 5,004,863；EP-A1270355；US 5,846,797；EP-A11,183,377；EP-A1 1,050,334；EP-A1 1,197,579；EP-A1159,436花粉转化(US 5,929,300)植物原位转化(US 5,994,624)
    豌豆 US 5,286,635
    胡椒 US 5,262,316
    杨 US 4,795,855
大豆 萌发的大豆苗的子叶节嫩枝端(US 5,164,310)萌发约7天的大豆苗的初级或较高的叶节的叶腋分生组织器官发生愈伤组织培养物脱水胚轴US 5,376,543；EP-A1 397687；US 5,416,011；US5,968,830；US 5,563,055；US 5,959,179；EP-A1 652965；EP-A1 1,141,346
    甜菜 EP-A1 517833；WO 01/42480
    番茄 US 5,565,347
可以通过本领域已知的多种其他方法增强农杆菌的转化率，例如损伤、真空渗入(WO 00/58484)、热休克和/或离心、加入硝酸银、超声处理等。在本发明优选的实施方案中，在接种(共培养)农杆菌之前损伤外植体材料。可以使用多种损伤方法，包括如切割、摩擦、穿孔、戳刺、用细小微粒或增压流体穿透、等离子体损伤、应用高压或超声处理。可以使用物体例如(但不仅限于)解剖刀、剪刀、针、摩擦物、喷枪、微粒、电基因枪或声波进行损伤。其他替代方案为真空渗入(EP-A11,141,356；EP-A11,171,618)。可以组合本领域已知的其他提高农杆菌转化率的方法，包括但不仅限于超声处理(EP-A1 904,362)或减轻靶组织的重量(EP-A11,137,790)。
以本领域已知的方式培养和使用本发明的卸甲发根农杆菌。例如，可以在补充了适当的抗生素(如50mg/L大观霉素)的YEB培养基(见实施例2.6)上将包含载体的农杆菌菌株培养3天。用接菌环从固体培养基收集细菌并重悬。在本发明优选的实施方案中，从使用冷冻于-80℃的等分试样开始农杆菌培养。对于经分离叶柄的农杆菌处理，将细菌重悬于叶柄培养所使用的培养基中。
用于感染和共培养的农杆菌的浓度可能需要改变。因此，可以使用从105至1010cfu/mL的农杆菌浓度范围和从数小时至7天的共培养期间。农杆菌与经分离叶柄的共培养通常进行1至5天，优选2至4天。
接着用农杆菌培养物接种外植体数分钟至数小时，一般从约10分钟至3小时，优选约0.5小时至1小时。排出过剩的培养基并使农杆菌与靶组织在黑暗中共培养若干天，一般为3天。在这一步骤中，农杆菌将外源遗传构建体转移进靶组织的一些细胞中。在这一步骤中一般不存在选择剂。
可以(尽管不是必须)在农杆菌共培养之前或期间在培养基中使用一种或多种酚类化合物，本发明范围内合适的“植物酚类化合物”或“植物酚类物”是能够诱导正趋化应答的经分离的取代酚分子，特别是能够诱导含有Ri质粒的农杆菌中vir基因表达提高的分子。优选乙酰丁香酮。此外，预计某些化合物在与植物酚类化合物组合添加时发挥协同作用，所述化合物为例如渗透保护剂(如优选浓度为约700mg/L的L-脯氨酸或甜菜碱)、植物激素(尤其是NAA)、冠瘿碱或糖。可以在使分离的叶柄接触农杆菌之前(如若干小时至1天)加入植物酚类化合物特别是乙酰丁香酮。培养基中植物酚类化合物的可能的浓度范围从约25μM至700μM。然而，就本发明方法而言优选不使用乙酰丁香酮。特别合适的用于根癌农杆菌的诱导条件描述于Vernade等(1988)。
在共培养培养基中补充抗氧化剂(如二硫苏糖醇)或硫醇化合物(如L-半胱氨酸，Olhoft 2001)可以进一步提高农杆菌介导的转化的效率，它们可以降低由植物防御应答(如酚氧化)引起的组织坏死。
共培养之后可以包括移除、抑制生长或杀死发根农杆菌的步骤。此步骤可以包括一个或多个洗涤步骤。共培养步骤之后使用的培养基优选含有杀菌剂(抗生素)。此步骤旨在停止或至少延缓未转化细胞的生长并杀死剩余的农杆菌细胞。优选使用的抗生素为例如羧苄青霉素(500mg/L)或特美汀TM(GlaxoSmithKline，替卡西林二钠和克拉维酸钾的混合物，每0.8g特美汀TM含有50mg克拉维酸和750mg替卡西林。化学上，替卡西林二钠为N-(2-羧基-3，3-二甲基-7-氧代-4-硫杂-1-氮杂二环[3.2.0]庚-6-基-3-硫代-苯丙酰胺酸二钠盐。化学上，克拉维酸钾是(Z)-(2R，5R)-3-(2-羟乙烯基)-7-氧代-4-氧杂-1-氮杂二环[3.2.0]庚烷-2-羧酸钾。
共培养步骤之后，优选在包含至少一种植物生长因子的再生培养基上温育外植体。所使用的培养基还可以含有至少一种化合物，所述化合物与选择标记基因组合允许鉴定和/或选择可应用的植物细胞(如选择剂)。然而，优选在共培养步骤之后将外植体在缺乏选择化合物的培养基上先温育一段时间，优选5至14天。建立对所述选择化合物的可靠的抗性水平需要一段时间以防止选择化合物甚至对转化细胞和组织也造成意外的损伤。
优选可以使用本发明的选择方法从未转化细胞中选择转化细胞，即包含整合进宿主细胞DNA的DNA的细胞。一旦产生转化植物细胞，则可以使用技术人员已知的方法获得完整植物。例如使用愈伤组织培养物作为起始物质。可以以已知的方式在这种未分化的细胞生物量中诱导嫩枝和根的形成。可以种植并培养得到的嫩枝。
农杆菌介导的技术一般使基因递送至靶组织中数目有限的细胞中。因此，在本发明优选的实施方案中，在转化后应用选择剂以杀死靶组织中未转化的所有细胞，或通过选择优势鉴定转化细胞。培养期的长度部分取决于选择剂对未转化细胞的毒性。用于所述选择或筛选的选择标记基因和相应的选择化合物可以是多种熟知的选择化合物中的任一种，如抗生素、除草剂或D-氨基酸(详细内容见下文)。这一培养步骤的长度是可变的(取决于选择化合物及其浓度、选择标记基因)，范围从1天至120天。选择和/或筛选标记基因的插入包括于本发明方法的范围内。这可以是有利的，例如其后用作除草剂抗性性状。
例如，使用卡那霉素抗性基因(新霉素磷酸转移酶，NPTII)作为选择标记时，可以在培养基中包括浓度从约3至200mg/L的卡那霉素。用于选择的典型浓度为5至50mg/L。在这种培养基上将组织培养1至3周的时间(优选约7天)，直至发育出嫩枝。
例如，使用膦丝菌素抗性基因(bar)作为选择标记时，可以在培养基中包含浓度从约3至200mg/L的膦丝菌素。用于选择的典型浓度为5至50mg/L。在这种培养基上将组织培养1至3周的时间(优选约7天)，直至发育出嫩枝。
例如，使用dao1基因作为选择标记时，可以在培养基中包括浓度从约3至100mg/L的D-丝氨酸或D-丙氨酸。用于选择的典型浓度为20至40mg/L。在这种培养基上将组织培养1至3周的时间(优选约7天)，直至发育出嫩枝
可以培养通过任何上述转化技术产生的转化植物细胞以再生完整植物，所述完整植物具有所转化的基因型并因而具有所需的表型。这些再生技术依赖于操作组织培养生长培养基中的某些植物激素，一般依赖于与目的核苷酸序列一起引入的杀生物剂和/或除草剂标记。已描述了从培养的原生质体再生植物(Evans 1983；Binding，1985)。还可以从植物愈伤组织、外植体、体细胞胚(Dandekar 1989；McGranahan 1990)、器官或其部分获得再生。已描述了这些再生技术(一般在Klee 1987)。还描述了其他可用的再生技术(Vasil 1984；Weissbach 1989)。
在用于再生和/或选择的本发明方法中使用的培养基还可以任选地补充一种或多种植物生长调节剂，如细胞分裂素化合物(如6-苄氨基嘌呤)和/或生长素化合物(如2，4-D)。本文使用的术语“植物生长调节剂”(PGR)指能调节植物生长和发育的天然存在或合成(非天然存在)化合物。PGR可以单独发挥作用或与另一或其他化合物(如糖、氨基酸)一起发挥作用。术语“生长素”或“生长素化合物”包括刺激细胞伸长和分裂、维管组织分化、果实发育、不定根形成、乙烯产生和(在高浓度下)诱导去分化(愈伤组织形成)的化合物。最普遍的天然存在的生长素是在根和茎中极性转运的吲哚乙酸(IAA)。合成生长素在现代农业中广泛使用。生长素化合物包括吲哚-3-丁酸(IBA)、萘乙酸(NAA)和2，4-二氯代苯氧乙酸(2，4-D)。诱导嫩枝形成的化合物包括但不仅限于IAA、NAA、IBA、细胞分裂素、生长素、激动素(kinetin)、草甘膦和thiadiazorun。
术语“细胞分裂素”或“细胞分裂素化合物”包括刺激细胞分裂、子叶膨胀和侧芽生长的化合物。它们延缓分离叶的枯萎，并且与生长素(如IAA)组合可以影响根和嫩枝的形成。细胞分裂素化合物包括如6-异戊烯基腺嘌呤(IPA)和6-苄基腺嘌呤/6-苄氨基嘌呤(BAP)。
可以通过有性或无性繁殖产生后代。无性繁殖可以通过以本领域熟知的技术诱导体细胞胚胎发生来实现。优选通过有性繁殖/受精产生后代。可以通过自交(自花受粉)或与其他转基因或非转基因植物杂交来实现受精。这时本发明的转基因植物可以发挥母本或父本植物的功能。后代可以包含农学价值性状基因的一个或多个拷贝。优选分离仅包含所述性状基因的一个拷贝的后代。
根据本发明的公开内容，可以无需过度实验就可以产生并实施本文公开并要求保护的所有组合物和方法。尽管以优选实施方案的方式描述了本发明的组合物和方法，但对于本领域技术人员而言，显然可以对本文公开的组合物、方法和步骤或步骤的顺序进行改变而不背离本发明的概念、精神和范围。更特别地，显然可以用在化学和生理学上都相关的其他物质替换本文所述物质而获得相同或相似的结果。所有这些对本领域技术人员而言显而易见的替换或修饰都认为是在后附的权利要求书所定义的本发明精神、范围和概念中。本说明书中提到的所有出版物和专利申请指示了本发明所属领域的技术人员的技术水平。所有出版物和专利申请都引入本文作为参考文献，其程度等同于每个单独的出版物或专利申请都特别地单独指出引入本文作为参考文献。现在通过下文描述的实施例和图表说明本发明的某些方面和实施方案。
序列
1.SEQ ID NO：1：编码pRI2659右侧翼序列的核酸序列
2.SEQ ID NO：2：编码pRI2659左侧翼序列的核酸序列
3.SEQ ID NO：3：克隆载体pRL278的核酸序列(GenBank登录号：
                L05083)
4.SEQ ID NO：4：编码pRI2659的T-DNA区的核酸序列(GenBank登录
                号AJ271050)
5.SEQ ID NO：5：农杆菌菌株K599 16S-23S rRNA基因间序列基序M1：
                5′-AATCGTCGATGCGAATTGTTG-3′
6.SEQ ID NO：6：农杆菌菌株K599 16S-23S rRNA基因间序列基序M2：
                5′-GTTTTGTCCTGACGCTGTCGCGA-3′
7.SEQ ID NO：7：农杆菌菌株K599 16S-23S rRNA基因间序列基序M3：
                5′-TCTAACGATCGCTGCGCTCCGGA-3′
8.SEQ ID NO：8：农杆菌菌株K599 16S-23S rRNA基因间序列基序M4：
                5’-CGCCACGAGGCGCGACGGA-3’
9.SEQ ID NO：9：农杆菌菌株K599 16S-23S rRNA基因间序列基序M5：
                5′-TTATGGGCGAATTGATCTGA-3′
10.SEQ ID NO：10农杆菌菌株K599 16S-23S rRNA基因间序列基序M6：
                5′-GTCCTGCTAAGGATTGATGCCT-3′
11.SEQ ID NO：11农杆菌菌株K599 16S-23S rRNA基因间序列基序M7：
                5′-AGACCAGTCCTTGTGAAACC-3′
12.SEQ ID NO：12农杆菌菌株K599 16S-23S rRNA基因间序列基序M8：
                5′-CCTGGGCATTTTTGTTGTTGG-3′
13.SEQ ID NO：13农杆菌菌株K599 16S-23S rRNA基因间序列基序M9：
                5′-A ATGGTATGGCTTCGAGGTG-3’
14.SEQ ID NO：14农杆菌菌株K599 16S-23S rRNA基因间序列基序
              M10：5′-CTCAAAGAAGACCGTACCGACA-3’
15.SEQ ID NO：15双元载体pBPSEW008[p-NOS∷c-bar∷t-NOS
              p-PcUBI∷c-gusINT∷t-NOS]
16.SEQ ID NO：16双元载体pBPSMM192b
         [p-AtAhas∷c-csr1-2∷t-AtAHAS
         t-NOS∷c-gusINT∷p-SUPER]
         17.SEQ ID NO：17JT-双元载体pBPSMM232
         [p-ZmUbi1∷c-ZmAHASL/Xi12∷t-ZmAHAS
         t-NOS∷c-gusINT∷p-ZmUbi1]
         pBPSMM232是不可在农杆菌中复制而仅在大肠杆菌
         中复制的载体。包含超双元质粒pSB1转化进农杆菌则
         通过选择介导的pBPSMM232和pSB1的融合产生嵌合
         质粒(pSB1/pBPSMM232)(Komari1996)。
18.SEQ ID NO：18 pRi2659的左边界序列
                 5′-TGGCAGGATATATTGTGGTGTAAA-3′
19.SEQ ID NO：19 pRi2659的右边界序列
                 5′-TGACAGGATATATCCCCTTGTCTA-3′
20.SEQ ID NO：20农杆菌菌株K599的16S-23S rRNA基因间序列
21.SEQ ID NO：21编码农杆菌菌株K599的16S rRNA的基因组DNA
22.SEQ ID NO：22缺失载体pBPSSH009
23.SEQ ID NO：23缺失载体pRL278 LF/RF(也称为pBPSSH009b)
24.SEQ ID NO：24编码pRI2659Δ(不包含四环素选择标记(tet))的核酸序列
25.SEQ ID NO：25：rcorf1编码的氨基酸序列，与mll6374样整合酶/重组
                酶[百脉根中慢生根瘤菌(Mesorhizobium loti)
                MAFF303099]相似
26.SEQ ID NO：26 rcorf13编码的氨基酸序列，较少地与pRi1724中
                riorf22相似，与假定的蛋白Bcep02000337相似
                [Burkholderia fungorum LB400]
27.SEQ ID NO：27 rcorf14编码的氨基酸序列，可能为黄瓜碱转运基因，
                与pRi1724中的riorf37(可能的mikimopine转运蛋白)
                相似
28.SEQ ID NO：28：rcorf16编码的氨基酸序列，与SMa2205苜蓿中华根
                瘤菌1021(菌株：1021)(COG1176[E]ABC型亚精胺/
                腐胺转运系统，通透酶组分I)相似
29.SEQ ID NO：29 rcorf19编码的氨基酸序列，与hutI(咪唑酮-5-丙酸水
                解酶[根癌农杆菌菌株C58])相似，较少地与pRi1724
                中的riorf39相似，KEGG途径：组氨酸代谢00340
30.SEQ ID NO：30 rcorf20编码的氨基酸序列，与pRi1724中的riorf41(假
                定的蛋白)相似
31.SEQ ID NO：31 rcorf21编码的氨基酸序列，与pRi1724中的riorf42
                (hutU基因同系物，尿刊酸酶EC号4.2.1.49)相似
32.SEQ ID NO：32 rcorf22编码的氨基酸序列，与未知功能蛋白DUF886
                [中慢生根瘤菌(Mesorhizobium sp.)BNC1]相似，较
                少地与pRi1724中的riorf43相似，与恶臭假单胞菌中
                与hutR相邻的未知基因相似
33.SEQ ID NO：33 rcorf23编码的氨基酸序列，与IS30家族转座酶的C端
                相似
34.SEQ ID NO：34 rcorf32编码的氨基酸序列，与pRi1724中的riorf60相
                似，与gatA-1基因(谷氨酰-tRNA酰胺转移酶，小亚
                基A(gatA-1)，硫磺矿硫化叶菌(Sulfolobus
                solfataricus)P2)相似
35.SEQ ID NO：35 rcorf34编码的氨基酸序列，与pRi1724中的riorf62相
                似，与agaB基因类似的假定ABC转运蛋白基因，农
                杆鸟氨酸通透酶，pfam00528：BPD_transp_1；结合蛋
                白依赖性转运系统内膜组分
36.SEQ ID NO：36 rcorf35编码的氨基酸序列，与pRi1724中的riorf63相
                似，与dppC基因类似的假定ABC转运蛋白基因，
                pfam00528：BPD_transp_1；结合蛋白依赖性转运系统
                内膜组分
37.SEQ ID NO：37 rcorf36编码的氨基酸序列，与pRi1724中的riorf64相
                似，与moaD基因相似的假定ABC转运蛋白基因，甘
                露碱酸通透酶，COG1123：多种ABC型转运系统的
                ATPase组分
38.SEQ ID NO：38 rcorf37编码的氨基酸序列，与pRi1724中的riorf66相
                似，与amaB基因相似，N-氨甲酰基-β-丙氨酸酰胺水解酶
39.SEQ ID NO：39 rcorf39编码的氨基酸序列，与pRi1724中的riorf68相
                似，较少地与pck基因相似，pfam01633：胆碱激酶；胆
                碱/乙醇胺激酶
40.SEQ ID NO：40 rcorf40编码的氨基酸序列，与pRi1724中的riorf69相
                似，与麻风分枝杆菌中的MLCB 1779.29(可能的单磷
                酸酶基因)相似，cd01641：细菌IMPase样_1；Mg++
                依赖性磷酸酶的主要细菌家族，与肌醇单磷酸酶相关
41.SEQ ID NO：41 rcorf41编码的氨基酸序列，与pRi1724中的riorf71相
                似，与pTi15955中的orf2基因相似的假定化学感受器
                基因
42.SEQ ID NO：42 rcorf44编码的氨基酸序列，与pRi1724中的riorf74相
                似，与teuB(周质糖结合蛋白)基因相似，COG1879：
                RbsB；ABC型糖转运系统，周质组分[碳水化合物转运
                和代谢]
43.SEQ ID NO：43 rcorf45编码的氨基酸序列，与pRi1724中的riorf75相
                似，与teuA(ATP结合的糖ABC转运蛋白)基因相似，
                假定的ABC转运蛋白基因，COG1129：MgIA；ABC型
                糖转运系统，ATPase组分[碳水化合物转运和代谢]
44.SEQ ID NO：44 rcorf46编码的氨基酸序列，与pRi1724中的riorf76相
                似，与teuC1(糖ABC转运蛋白通透酶)基因相似，假定
                的ABC转运蛋白基因，pfamO2653：BPD_transp_2；支
                链氨基酸转运系统/通透酶组分
45.SEQ ID NO：45 rcorf47编码的氨基酸序列，与pRi1724中的riorf77相
                似，与teuC2(糖ABC转运蛋白通透酶)基因相似，假定
                的ABC转运蛋白基因，pfamO2653：BPD_ransp_2；支
                链氨基酸转运系统/通透酶组分
46.SEQ ID NO：46 rcorf48编码的氨基酸序列，与pRi1724中的riorf78
                (COG2755[E]溶血磷脂酶L1)和相关酯酶相似
47.SEQ ID NO：47 rcorf50编码的氨基酸序列，与pRi1724中的riorf80相
                似，glpD基因同系物，甘油-3-磷酸脱氢酶[根癌农杆菌
                菌株C58]
48.SEQ ID NO：48 rcorf51编码的氨基酸序列，与pRi1724中的riorf81相
                似，acs(乙酰辅酶A合成酶)基因同系物EC 6.2.1.1.
49.SEQ ID NO：49 rcorf52编码的氨基酸序列，与pRi1724中的riorf82相
                似，adk基因同系物，pfam00406：ADK；腺苷酸激酶，
                EC 2.7.4.3.
50.SEQ ID NO：50 rcorf53编码的氨基酸序列，与pRi1724中的riorf83相
                似，与pTi15955中orf2基因相似的假定化学感受器基
                因
51.SEQ ID NO：51 rcorf54编码的氨基酸序列，与riorf84相似，cbbF基
                因同系物，cd00354：FBPase；果糖-1，6-二磷酸酶，催化
                果糖-1，6-二磷酸水解成果糖-6-磷酸的酶，在糖异生途径
                中很关键
52.SEQ ID NO：52 rcorf55编码的氨基酸序列，cbbA基因同系物，cd00947：
                TBP_醛缩酶_IIB；塔格糖-1，6-二磷酸(TBP)醛缩酶和
                相关的B型II类醛缩酶
53.SEQ ID NO：53 rcorf56编码的氨基酸序列，与pdb链A相似，酵母磷
                酸丙糖异构酶(tri1)
54.SEQ ID NO：54 rcorf57编码的氨基酸序列，与pRi1724中的riorf88和
                phrR基因相似，DNA结合蛋白，螺旋-转角-螺旋XRE
                家族
55.SEQ ID NO：55 rcorf58编码的氨基酸序列，与pRi1724中的riorf89和
                thcR基因相似，保守结构域，HTH_ARAC；螺旋-转角-
                螺旋，阿拉伯糖操纵子控制蛋白
56.SEQ ID NO：56 rcorf59编码的氨基酸序列，与pRi1724中的riorf90和
                pTiC58中的Atu6096相似，在中慢生根瘤菌和农杆菌
                物种中保守
57.SEQ ID NO：57 rcorf60编码的氨基酸序列，与pRi1724中的riorf91相
                似，还与农杆菌、中慢生根瘤菌和硝化杆菌物种中的若
                干假定的蛋白相似。
58.SEQ ID NO：58 rcorf61编码的氨基酸序列，与pRi1724中的riorf92相
                似，在若干农杆菌和中慢生根瘤菌菌株中保守的假定蛋
                白
59.SEQ ID NO：59 rcorf62编码的氨基酸序列，与pRi1724中的riorf93相
                似，与幽门螺杆菌中的jhp0928基因相似，COG0827；
                腺嘌呤特异性DNA甲基化酶[DNA复制、重组和修复]
60.SEQ ID NO：60 rcorf63编码的氨基酸序列，与AGR_pTi_191分隔蛋白
                (根癌农杆菌菌株C58)相似，分隔蛋白，COG1475[K]
                预计为转录调节子
61.SEQ ID NO：61 rcorf64编码的氨基酸序列，与假定的蛋白
                MesoDRAFT_1041[中慢生根瘤菌BNC1种]相似，在
                农杆菌、中慢生根瘤菌和硝化杆菌物种中保守
62.SEQ ID NO：62 rcorf66编码的氨基酸序列，与假定的蛋白
                MesoDRAFT_1043[中慢生根瘤菌BNC1种]相似，在
                农杆菌、中慢生根瘤菌和硝化杆菌物种中保守
63.SEQ ID NO：63 rcorf67编码的氨基酸序列，与pRi1724中的riorf96相
                似，较少地与桃红荚硫菌中hydL基因的下游区相似
64.SEQ ID NO：64 rcorf68编码的氨基酸序列，与AGR_pTi_204[根癌农
                杆菌菌株C58]和argG(来自带小棒链霉菌的精氨琥珀
                酸合酶)相似
65.SEQ ID NO：65 rcorf69编码的氨基酸序列，与pRi1724中的riorf100
                相似，与pSa(lncW质粒)中的ardC基因相似，
                COG4227，可能为结合转移蛋白(抗网织蛋白)
66.SEQ ID NO：66 rcorf70编码的氨基酸序列，与pRi1724中的riorf101
                相似，与mll9093天冬氨酸1-脱羧酶[百脉根中慢生根
                瘤菌MAFF303099]和柑橘黄单胞菌中的pgi基因相似，
                COG0853[H]天冬氨酸1-脱羧酶
67.SEQ ID NO：67 rcorf71编码的氨基酸序列，与pRi1724中的riorf106
                相似，与pRtrCFN299a中的teuB基因相似，COG1879：
                RbsB；ABC型糖转运系统，周质组分[碳水化合物转运
                和代谢]
68.SEQ ID NO：68 rcorf72编码的氨基酸序列，与pRi1724中的riorf107
                相似，与豌豆根瘤菌中的mcpC(根瘤菌中的mcpC基
                因)基因相似smart00283：MA；接受甲基的趋化因子
                样结构域(趋化因子感受转导蛋白)
69.SEQ ID NO：69 rcorf77编码的氨基酸序列，可能为traA基因，与
                pRi1724中的riorf112相似，COG0507：RecD；ATP依
                赖性exoDNAse(外切核酸酶V)，α亚基-解旋酶超家族I
                成员[DNA复制、重组和修复]
70.SEQ ID NO：70 rcorf79编码的氨基酸序列，可能为traB基因，与
                pRi1724中的riorf114相似
71.SEQ ID NO：71 rcorf80编码的氨基酸序列，与pRi1724中的riorf115
                相似，发根农杆菌的假定蛋白(菌株MAFF03-01724)
72.SEQ ID NO：72 rcorf82编码的氨基酸序列，可能为与pRi1724中的
                riorf118相似的traM基因，TraR拮抗物
73.SEQ ID NO：73 rcorf96编码的氨基酸序列，可能为与riorf132发根农
                杆菌(菌株：MAFF03-01724)相似的repA基因，
                cd00550：ArsA_ATPase；氧阴离子-易位ATPase
                (ArsA)和cd00592：HTH_MERR；螺旋-转角-螺旋转录
                调节子MERR，N-端结构域
74.SEQ ID NO：74 rcorf97编码的氨基酸序列，可能为与pRi1724中riorf
                133相似的repB基因，smart00470：ParB；ParB样核酸
                酶结构域蛋白
75.SEQ ID NO：75 rcorf98编码的氨基酸序列，可能为与pRi1724中riorf
                134相似的repC基因，营养复制所必需
76.SEQ ID NO：76 rcorf99编码的氨基酸序列，与pRi1724中riorf135相
                似，较少地与pNGR234a中的y4aO相似
77.SEQ ID NO：77 rcorf103编码的氨基酸序列，与pRi1724中riorf137
                和pTiA6NC中的orf4基因相似
78.SEQ ID NO：78 rcorf105编码的氨基酸序列，与pRi1724中riorf139
                相似，与pNGR234a中的y4jF和y4jG之间的未表征
                区相似
79.SEQ ID NO：79 rcorf106编码的氨基酸序列，与pRi1724中riorf140
                和大肠杆菌中的ofr300基因相似，pfam00004：AAA；
                与多种细胞活性相关的ATPase家族(AAA)
80.SEQ ID NO：80 rcorf107编码的氨基酸序列，与pRi1724中riorf141
                的N端相似，为假定的蛋白
81.SEQ ID NO：81 rcorf109编码的氨基酸序列，较少地与SERP1653表皮
                葡萄球菌RP62A(菌株：RP62A)(假定的蛋白)相似
82.SEQ ID NO：82 rcorf110编码的氨基酸序列，与pRi1724中riorf142
                相似，与拟南芥中腔内结合蛋白外显子6的基因相似
83.SEQ ID NO：83 rcorf111编码的氨基酸序列，与pRi1724中riorf143
                和pSG5中spdB3基因相似
84.SEQ ID NO：84 rcorf112编码的氨基酸序列，与pRi1724中riorf144
                相似
85.SEQ ID NO：85 rcorf114编码的氨基酸序列，推定的virF基因，与
                pRi1724中riorf146和pTiSAKURA中tiorf133相似
86.SEQ ID NO：86 rcorf117编码的氨基酸序列，与pRi1724中riorf149
                相似，与N端aatA(atu2196)天冬氨酸氨基转移酶A[根
                癌农杆菌菌株C58]相似
87.SEQ ID NO：87 rcorf119编码的氨基酸序列，可能为virH，与pRi1724
                中riorf151相似，细胞色素P450型氧化酶，可能为通
                过virB/D4的IV型分泌蛋白
88.SEQ ID NO：88  rcorf120编码的氨基酸序列，可能为virA，与pRi1724
                中riorf152相似，两组分virA/G调节系统中的受体
89.SEQ ID NO：89  rcorf121编码的氨基酸序列，可能为virB1，与
                pRi1724中riorf153相似，T复合体转移所需的IV型
                分泌系统
90.SEQ ID NO：90 rcorf123编码的氨基酸序列，可能为virB3，与pRi1724
                中riorf155相似，T复合体转移所需的IV型分泌系统
91.SEQ ID NO：91 rcorf125编码的氨基酸序列，可能为virB5，与pRi1724
                中riorf157相似，T复合体转移所需的IV型分泌系统
92.SEQ ID NO：92 rcorf126编码的氨基酸序列，可能为virB6，与pRi1724
                中riorf158相似，T复合体转移所需的IV型分泌系统
93.SEQ ID NO：93 rcorf127编码的氨基酸序列，可能为virB7，与pRi1724
                中riorf159相似，T复合体转移所需的IV型分泌系统
94.SEQ ID NO：94 rcorf129编码的氨基酸序列，可能为virB9，与pRi1724
                中riorf161相似，T复合体转移所需的IV型分泌系统
95.SEQ ID NO：95 rcorf131编码的氨基酸序列，可能为virB11，与pRi1724
                中riorf163相似，T复合体转移所需的IV型分泌系统
96.SEQ ID NO：96 rcorf132编码的氨基酸序列，可能为virG，与pRi1724
                中riorf164相似，两组分virA/G调节系统中的激活子
97.SEQ ID NO：97 rcorf133编码的氨基酸序列，假定的蛋白，与aa1-103pf
                ISBm1转座酶orfB[猪布鲁菌(Brucella suis)1330](NP
                697552)相似
98.SEQ ID NO：98 rcorf137编码的氨基酸序列，可能为virD1，与pRi1724
                中riorf167相似，virA/G调节的T-DNA边界内切核酸
                酶辅助蛋白
99.SEQ ID NO：99 rcorf138编码的氨基酸序列，可能为virD2，与pRi1724
                中riorf168相似，virA/G调节的T-DNA边界内切核酸
                酶
100.SEQ ID NO：100 rcorf140编码的氨基酸序列，可能为virD4，与
                DRi1724中riorf170相似，virB/D4 IV型分泌系统
                受virA/G调节的组分
101.SEQ ID NO：101 rcorf142编码的氨基酸序列，可能为virF，与pRi1724
                中riorf172相似，较少地与pTiSAKURA中tiorf133
                相似，通过virB/D4复合体的IV型分泌蛋白
102.SEQ ID NO：102 rcorf143编码的氨基酸序列，可能为virE3，与
                DRi1724中riorf173和pRiA6NC中virE3相似，与
                根癌农杆菌中的virE2和IMPA1(AtKAP-α)相互作
                用，virB/D4 IV型分泌蛋白
103.SEQ ID NO：103 rcorf144编码的氨基酸序列，与百脉根中慢生根瘤菌
                MAFF303099 mlr1626相似，预计为甘露糖-6-磷酸
                异构酶
104.SEQ ID NO：104 rcorf145编码的氨基酸序列，与噬菌体整合酶相似
105.SEQ ID NO：105编码pRi2659Δtet(包含四环素选择标记(tet))的
                RF∷tet∷LF区的核酸序列
106.SEQ ID NO：106编码pRi2659的核酸序列
107.SEQ ID NO：107 virG CDS内的PCR引物  5′-TACTTCCTCC
                TCACGCACTC-3′
108.SEQ ID NO：108 virB操纵子内的PCR引物5′-GCCAGCAATG
                ATCAAGAATT TGTTT-3′
109.SEQ ID NO：109 PCR G109正向引物
                5′-TTGGTGCGAC AACTCCTCGG CG-3′
110.SEQ ID NO：110 PCR G112反向引物
                5′-GGTGAGCTCG ATCAGCTTCG GC-3′
111.SEQ ID NO：111编码来自pRi2659的virD2的核酸序列
112.SEQ ID NO：112来自pRi2659的virD2的氨基酸序列，也称为
                rcorf138
113.SEQ ID NO：113含有rcorf2至rcorf12的来自pRi2659的互补核酸
                序列
114.SEQ ID NO：114 rcorf12编码的氨基酸序列，较少地与pRi1724中
                riorf20相似，与假定的蛋白Bcep02000338
                [Burkholderia fungorum LB400]相似
115.SEQ ID NO：115 rcorf11编码的氨基酸序列，与pRi1724中riorf40
                (hutH基因同系物cdO1441：HAL)相似；催化组
                氨酸降解为谷氨酸的第一步的组氨酸氨裂解酶
                (HAL)
116.SEQ ID NO：116 rcorf10编码的氨基酸序列，与转录调节蛋白[大豆慢
                生根瘤菌(Bradyrhizobium japonicum)USDA 110]
                相似，螺旋-转角-螺旋葡糖酸操纵子转录阻抑物
117.SEQ ID NO：117 rcorf9编码的氨基酸序列，与根癌农杆菌C58乙内酰
                脲利用蛋白hyuA相似
118.SEQ ID NO：118 rcorf8编码的氨基酸序列，与根癌农杆菌C58乙内酰
                脲利用蛋白hyuB相似
119.SEQ ID NO：119 rcorf7编码的氨基酸序列，与COG0834
                Burkholderia fungorum LB400 COG0834相似，与
                STH1060相似，谷氨酰胺ABC转运蛋白底物结合蛋
                白[嗜热共生小杆菌(Symbiobacterium
                thermophilum)IAM 14863]
120.SEQ ID NO：120 rcorf6编码的氨基酸序列，与COG0765
                [Burkholderia fungorum LB400]相似，与
                PSPTO5181相似，胱氨酸ABC转运蛋白，通透酶
                蛋白，推定[丁香假单胞菌番茄小种菌株DC3000]
121.SEQ ID NO：121 rcorf5编码的氨基酸序列，与Bcep02000339
                [Burkholderia fungorum LB400]相似，与blr3310相
                似，COG0765：ABC转运蛋白通透酶[大豆慢生根瘤
                菌USDA 110]
122.SEQ ID NO：122 rcorf4编码的氨基酸序列，N端与STH 1062相似，
                与谷氨酰胺ABC转运蛋白ATP结合蛋白[嗜热共生
                小杆菌IAM 14863]相似，C端与bll6362相似，大豆
                慢生根瘤菌USDA 110中的假定蛋白，COG2079[R]
                与丙酸盐代谢相关的未表征蛋白
123.SEQ ID NO：123 rcorf3编码的氨基酸序列，较少地与mlr6097相似，
                氮同化作用控制蛋白[百脉根中慢生根瘤菌
                MAFF303099]，COG0583[K]转录调节子
124.SEQ ID NO：124 rcorf2编码的氨基酸序列，与pRi1724的riorf1相似，
                IS66中的orf3基因同系物
125.SEQ ID NO：125含有rcorf18的来自pRi2659的互补核酸序列
126.SEQ ID NO：126 rcorf18编码的氨基酸序列，与AGR L 1821假定的
                蛋白[根癌农杆菌菌株C58](sdeB基因同系物，
                cd01298：ATZ_TRZ样)相似；TRZ/ATZ家族包括
                来自莠去净降解途径的酶和相关的水解酶
127.SEQ ID NO：127含有rcorf24至rcorf31的来自pRi2659的互补核酸
                序列
128.SEQ ID NO：128 rcorf31编码的氨基酸序列，与pRi1724中的riorf59
                相似，与扭脱甲烷杆菌(Methylobacterium
                extorquens)中的orf3基因相似，COG3931[E]预计
                为N-甲酰谷氨酸
129.SEQ ID NO：129 rcorf30编码的氨基酸序列，与pRi1724中的riorf58
                (eutB同系物)相似，乙醇胺氨裂解酶重链
130.SEQ ID NO：130 rcorf28编码的氨基酸序列，可能为GALLS基因，
                与pRi1724中的riorf55相似，互补virE2，未知机
                制，有效的稳定植物转化所需的
131.SEQ ID NO：131 rcorf27编码的氨基酸序列，可能为反式玉米素合酶，
                与pRi1724中的riorf54相似，EC 2.5.1.-.
132.SEQ ID NO：132 rcorf26编码的氨基酸序列，可能为idi基因，与
                pRi1724中的riorf53相似，与idi(异戊烯二磷酸Δ
                异构酶[结核分枝杆菌CDC1551]EC 5.3.3.2)相似
133.SEQ ID NO：133 rcorf25编码的氨基酸序列，与pRi1724中的riorf52
                相似，与MCA2182脱羧酶家族蛋白[荚膜甲基球菌
                菌株Bath]相似
134.SEQ ID NO：134 rcorf24编码的氨基酸序列，与pRi1724中的riorf51
                相似，较少地与tetR细菌调节家族的mtrR基因相
                似
135.SEQ ID NO：135含有rcorf42至rcorf43的来自pRi2659的互补核酸
                序列
136.SEQ ID NO：136 rcorf43编码的氨基酸序列，与pRi1724中的riorf73
                相似，与SMa2002[苜蓿中华根瘤菌1021](COG2755
                [E]溶血磷脂酶L1)和相关酯酶相似
137.SEQ ID NO：137 rcorf42编码的氨基酸序列，与pRi1724中的riorf73
                (假定的阻抑物基因)相似，与SMa2004[苜蓿中
                华根瘤菌1021](推定的ROK家族转录调节子)相
                似
138.SEQ ID NO：138含有rcorf74至rcorf76的来自pRi2659的互补核酸
                序列
139.SEQ ID NO：139 rcorf76编码的氨基酸序列，可能为traC基因，Ti
                质粒接合的DNA加工，与pRi1724中riorf111相似
140.SEQ ID NO：140 rcorf74编码的氨基酸序列，可能为traG基因，与
                pRi1724中riorf109(cd01126：TraG_VirD4)相似；
                TraG/TraD/VirD4家族为细菌接合蛋白
141.SEQ ID NO：141含有rcorf83至rcorf95的来自pRi2659的互补核酸
                序列
142.SEQ ID NO：142 rcorf95编码的氨基酸序列，可能为与pRi1724中
                riorf131相似的traI基因，LuxI型细胞密度感受调
                节蛋白，合成3-氧代辛酰同型丝氨酸内酯，
                pfam00765：Autoind_synth；自身诱导合成酶
143.SEQ ID NO：143 rcorf94编码的氨基酸序列，可能为与pRi1724中
                riorf130相似的trbB基因，Ri/Ti质粒接合所需的
                IV型转移系统
144.SEQ ID NO：144 rcorf93编码的氨基酸序列，可能为与pRi1724中
                riorf129相似的trbC基因，Ri/Ti质粒接合所需的
                IV型转移系统
145.SEQ ID NO：145 rcorf91编码的氨基酸序列，可能为与pRi1724中
                riorf127相似的trbE基因，Ri/Ti质粒接合所需的
                IV型转移系统
146.SEQ ID NO：146 rcorf89编码的氨基酸序列，可能为与pRi1724中
                riorf125相似的trbK基因，Ri/Ti质粒接合所需的
                IV型转移系统
147.SEQ ID NO：147 rcorf88编码的氨基酸序列，可能为与pRi1724中
                riorf123相似的trbF基因，Ri/Ti质粒接合所需的
                IV型转移系统
148.SEQ ID NO：148 rcorf87编码的氨基酸序列，可能为与pRi1724中
                riorf123相似的trbF基因，Ri/Ti质粒接合所需的
                IV型转移系统
149.SEQ ID NO：149 rcorf86编码的氨基酸序列，可能为与pRi1724中
                riorf122相似的trbG基因，Ri/Ti质粒接合所需的
                IV型转移系统
150.SEQ ID NO：150 rcorf85编码的氨基酸序列，可能为与pRi1724中
                riorf121相似的trbH基因，Ri/Ti质粒接合所需的
                IV型转移系统
151.SEQ ID NO：151 rcorf84编码的氨基酸序列，可能为与pRi1724中
                riorf120相似的trbI基因，pfamO3743：TrbI；细菌
                接合Trbl样蛋白
152.SEQ ID NO：152 rcorf83编码的氨基酸序列，可能为与pRi1724中
                riorf119和pTiC58中traR/AGR pTi 249相似的
                traR基因
153.SEQ ID NO：153含有rcorf100至rcorf102的来自pRi2659的互补核
                酸序列
154.SEQ ID NO：154 rcorf102编码的氨基酸序列，与pTiA6NC中假定的
                整合酶基因orf2(与假单胞菌整合酶样基因相似)相
                似
155.SEQ ID NO：155 rcorf101编码的氨基酸序列，与pAT 22根癌农杆菌
                菌株C58(菌株：C58，分离株：Cereon)(COG0582
                [L]整合酶蛋白)的N端片段相似
156.SEQ ID NO：156 rcorf100编码的氨基酸序列，与pAT 22根癌农杆菌
                菌株C58(菌株：C58，分离株：Cereon)(COG0582
                [L]整合酶蛋白)的C端片段相似
157.SEQ ID NO：157含有rcorf115至rcorf116的来自pRi2659的互补核
                酸序列
158.SEQ ID NO：158 rcorf116编码的氨基酸序列，可能为钾摄取蛋白，与
                Atu0711根癌农杆菌菌株C58和pRi1724中
                riorf148和kup基因(pfam02705：K_trans)相似；K+
                钾转运蛋白
159.SEQ ID NO：159 rcorf115编码的氨基酸序列，与pRi1724中riorf147
                和pNGR234a同系物中y4mC基因(vir诱导基因)
                相似
160.SEQ ID NO：160含有rcorf134至rcorf136的来自pRi2659的互补核
                酸序列
161.SEQ ID NO：161 rcorf136编码的氨基酸序列，可能为virC1，与
                pRi1724中riorf166类似，毒力virA/G调节的蛋白
                质，AGR_pTi_18p；VirC1；与毗邻T-DNA右边界
                的超驱动序列结合；提高T-DNA加工水平
162.SEQ ID NO：162 rcorf135编码的氨基酸序列，可能为virC2，与
                pRi1724中riorf165类似，T-DNA加工毒力virA/G
                调节的蛋白质
163.SEQ ID NO：163 rcorf134编码的氨基酸序列，假定的蛋白，与ISBm1
                转座酶orfA[猪布鲁菌1330](NP 697551)的氨基酸
                4-122/142相似
164.SEQ ID NO：164 rcorf15编码的氨基酸序列，与SMa2207(推定的ABC
                转运蛋白，ATP结合蛋白[苜蓿中华根瘤菌1021]，
                COG3842：PotA)相似；ABC型亚精胺/腐胺转运系
                统，ATPase组分[氨基酸转运和代谢]
165.SEQ ID NO：165 rcorf17编码的氨基酸序列，可能为黄瓜碱转运蛋白，
                与riorf34(假定的蛋白[发根农杆菌]可能为
                mikmopine转运蛋白基因)相似
166.SEQ ID NO：166 rcorf29编码的氨基酸序列，与pRI1724中riorf57
                (eutC同系物)相似，乙醇胺氨基裂解酶轻链
167.SEQ ID NO：167 rcorf33编码的氨基酸序列，与pRI1724中riorf61
                相似，与PH0807相似的假定ABC转运基因，
                pfam00496：SBP_bac_5；细菌胞外溶质结合蛋白，家
                族5
168.SEQ ID NO：168 rcorf38编码的氨基酸序列，与pRI1724中riorf67
                相似，较少地与pck基因相似，smart00587：CHK；含
                有ZnF_C4 abd HLH结构域的激酶结构域
169.SEQ ID NO：169 rcorf49编码的氨基酸序列，与pRI1724中riorf79
                (glpK(甘油激酶)基因同系物EC 2.7.1.30)相似
170.SEQ ID NO：170 rcorf65编码的氨基酸序列，与pRI1724中riorf95
                相似，与pOAD2中nylA基因下游区相似
171.SEQ ID NO：171 rcorf73编码的氨基酸序列，与AGR_pTi_225核酸酶
                [根癌农杆菌菌株C58](COG 1525[L]微球菌核酸酶
                (热核酸酶)同系物)相似
172.SEQ ID NO：172 rcorf75编码的氨基酸序列，可能为traD基因(与
                pRi1724中riorf110相似的接合转移蛋白)
173.SEQ ID NO：173 rcorf78编码的氨基酸序列，可能为与pRi1724中
                riorf113(COG4959：TraF)相似的traF基因；IV型
                分泌途径，蛋白酶TraF[翻译后修饰、蛋白质转换、
                蛋白伴侣/胞内运输和分泌]
174.SEQ ID NO：174 rcorf81编码的氨基酸序列，与pRi1724中riorf 117
                (假定的蛋白)或发根农杆菌(菌株：
                MAFF03-01724)，cd00093：HTH_XRE；螺旋-转角-
                螺旋XRE家族样蛋白相似
175.SEQ ID NO：175 rcorf90编码的氨基酸序列，可能为与pRi1724中
                riorf126相似的trbJ基因，Ri/Ti质粒接合所需的IV
                型转移系统，COG5314；接合转移/进入排斥蛋白[胞
                内运输和分泌]
176.SEQ ID NO：176 rcorf92编码的氨基酸序列，可能为与pRi1724中
                riorf 128相似的trbD基因，Ri/Ti质粒接合所需的
                IV型转移系统
177.SEQ ID NO：177 rcorf104编码的氨基酸序列，与pRi1724中riorf138
                相似和pHH1中gvp1基因(pfam04079：DUF387)
                相似；推定的转录调节子(Ypuh样)蛋白
178.SEQ ID NO：178 rcorf108编码的氨基酸序列，与pRi1724中riorf141
                (假定的蛋白)的C端相似
179.SEQ ID NO：179 rcorf113编码的氨基酸序列，在79个氨基酸上较少
                地与大豆慢生根瘤菌USDA 110(菌株：USDA 110)
                的blr8180(COG1760[E]L-丝氨酸脱氨酶)相似
180.SEQ ID NO：180 rcorf118编码的氨基酸序列，与pRi1724中riorf 150
                相似，豌豆根瘤菌中的aatA基因同系物，由移码分
                开的假定假基因
181.SEQ ID NO：181 rcorf122编码的氨基酸序列，可能为virB2，与
                pRi1724中riorf 154相似，T复合体转移所需的IV
                型分泌系统
182.SEQ ID NO：182 rcorf124编码的氨基酸序列，可能为virB4，与
                pRi1724中riorf 156相似，T复合体转移所需的IV
                型分泌系统
183.SEQ ID NO：183 rcorf128编码的氨基酸序列，可能为virB8，与
                pRi1724中riorf 160相似，T复合体转移所需的IV
                型分泌系统
184.SEQ ID NO：184 rcorf130编码的氨基酸序列，可能为virB10，与
                pRi1724中riorf162相似，T复合体转移所需的IV
                型分泌系统
185.SEQ ID NO：185 rcorf139编码的氨基酸序列，可能为virD3，与
                pRi1724中riorf169相似，受virA/G调节，不是毒
                力所必需的，可能是宿主范围因子
186.SEQ ID NO：186 rcorf141编码的氨基酸序列，可能为virD5，与
                pRi1724中riorf171相似，virB/D4 IV型分泌系统中
                受virA/G调节的组分
187.SEQ ID NO：187 rcorf146编码的氨基酸序列，与根瘤菌种NGR234
                的Y4rB相似
188.SEQ ID NO：188编码农杆菌菌株K599左T-DNA侧翼序列的核苷酸
                序列
实施例
除非另有说明，实施例中的化学品和试剂得自Sigma ChemicalCompany(St.Louis，MO)，限制性内切核酸酶来自New England Biolabs(Beverly，MA)或Roche(Indianapolis，IN)，寡核苷酸由MWG Biotech Inc.(High Point，NC)合成，与生物化学和分子生物学测定相关的其他修饰酶或试剂盒来自Ciontech(Palo Alto，CA)、Pharmacia Biotech(Piscataway，NJ)、Promega Corporation(Madison，Wl)或Stratagene(La JoIIa，CA)。用于细胞培养的材料得自Gibco/BRL(Gaithersburg，MD)或DIFCO(Detroit，MI)。如Sambrook(1989)所述进行用于本发明目的的克隆步骤，如限制性切割、琼脂糖凝胶电泳、纯化DNA片段、将核酸转移至硝酸纤维素和尼龙膜、连接DNA片段、转化大肠杆菌细胞、培养细菌、繁殖噬菌体和重组DNA的序列分析。除非另有说明，使用ABI激光荧光DNA测序仪按照Sanger(Sanger 1977)的方法测序重组DNA分子。提供以下实施例用于说明而非限制。
实施例1：卸甲农杆菌菌株K599
农杆菌菌株K599是在许多双子叶植物(包括大豆)中引起发根病的土传细菌。已经显示K599对大豆根具有高感染性。于28℃在液体培养基(LB培养基)中培养农杆菌菌株K599(以保藏号NCPPB2659保藏于英国NCPPB保藏中心；www.ncppb.com National Collection of PlantPathogenic Bacteria Central Science Laboratory，Sand Hutton，YorkYO41 1 LZ England)，并使用Qiagen Large Construct kit目录号12462实施改良的纯化pRi质粒的DNA提取方案以对pRi2659质粒富集DNA制备物。
使用右边界(285 bp)或左边界(240 bp)探针进行DNA杂交以确认pRi2659 T-DNA区物理限制性图的正确性(见图6)。确定了限制性酶SphI得到可作为同源区用于缺失载体的可接受片段(侧翼大于2kb)。在pUC19中构建了K599 pRi2659 SphI片段的亚基因组克隆库。用SphI消化富集了pRI2659质粒的分离的农杆菌菌株K599 DNA并在0.8％琼脂糖凝胶上电泳。从琼脂糖凝胶上切下片段区并使用Qiagen QIAquick凝胶提取试剂盒目录号28706纯化，所述片段区代表含有右侧翼DNA的2905bp片段和含有左侧翼DNA的7498bp片段。将这些纯化的凝胶片段连接进pUC19以产生亚基因组克隆库。
用右边界或左边界片段检测来自克隆库的菌落转移，以鉴定含有侧翼DNA的克隆。鉴定了两个克隆：含有右侧翼DNA的2905bp片段和含有左侧翼DNA的7498bp片段。对这些克隆中的每一个进一步亚克隆并使用标准正向和反向引物(分别为SEQ ID NO：1和2)测序。
使用来自每个侧翼克隆的2.1kb片段构建农杆菌缺失盒。同源区提供发生双同源重组的足够空间。构建类似的盒，其中在RF和LF片段之间含有四环素抗性基因(流程图见图12)。对这些构建体进行测序验证。将RF/LF和RF/Tet/LF盒克隆进pRL278的接头修饰形式(SEQ ID NO：3；Peter WoIk，Michigan State University)，分别产生质粒载体pRL278LF/RF(SEQ ID NO：23；无四环素盒)和质粒载体pBPSSH009(SEQ ID NO：22；有四环素盒)。这些载体允许通过使用sacB基因有效选择双同源重组体。在含有单同源重组体的生长培养基中加入蔗糖产生毒性化合物果聚糖。这种化合物作为针对含有该质粒的菌株的反选择，迫使发生野生型表型或目的缺失的双交换。通过电穿孔向菌株K599中分别引入pBPSSH009和pRL278LF/RF并使用100μg/mL卡那霉素进行选择。回收含有整合进Ri质粒的缺失质粒的单交换体并在蔗糖下进行反选择。按如下进行蔗糖/sacB选择：无选择地将含有带sacB和缺失构建体的卡那霉素抗性载体的已确认(通过DNA杂交)单交换事件培养过夜，以允许发生重组。将培养物的连续稀释物涂在含有5％蔗糖(体积/体积)的LB琼脂反选择培养基上。2天后，培养出现的菌落并分离基因组DNA以通过DNA杂交证实T-DNA区的缺失。分离双交换体并通过DNA杂交证实T-DNA缺失的分子确认(图6)。DNA杂交中使用的探针与上文分离含有pRi2659的右侧翼区的片段所用的探针相同。它是含有右边界和边界上游及下游侧翼序列的200bp片段。对于基因组DNA的DNA印迹，用SphI消化基因组DNA样品并在0.8％琼脂糖凝胶上电泳。
得到的菌株命名为：
-农杆菌K599[pRi2659Δtet]菌株：SHA001和SHA016为缺乏其T-DNA区、包含四环素(tet)表达盒的卸甲农杆菌K599菌株(使用pBPSSH009获得)。农杆菌菌株SHA001和SHA016都是卸甲四环素抗性型(即包含pRi2659Δtet质粒)的功能等价菌株。
-农杆菌K599[pRi2659Δ]菌株：SHA017为缺乏其T-DNA区的卸甲农杆菌K599菌株(使用pRL278LF/RF(也称为pBPSSH009b)获得)。
对大豆子叶上发根病症状的功能测试(见下文实施例2)证实了疾病表型的丧失。进行了大豆、玉米、番茄和拟南芥中的植物转化实验(见下文)并证实了卸甲菌株的植物感染特性。在所有的植物物种中都检测到了β-葡糖醛酸糖苷酶(GUS)的瞬时表达。此外，在多种植物物种(包括大豆、玉米和番茄组织)中检测到了稳定的GUS表达。还回收了稳定的PursuitTM和草铵膦抗性拟南芥植物。已经将超毒力pSB1质粒(Komari1996)固定进卸甲K599菌株，并证明在玉米转化中有效。
实施例2：发根测定
将大豆种子(Williams 82栽培种)用于以下测定。接种前1.6天将大豆种子灭菌。将表面没有损伤/裂缝的种子置于无菌烧杯中。每个待评估农杆菌菌株使用30个种子，浸入95％乙醇中1分钟。移除乙醇并用新制备的10％漂白剂和0.0005％TritonX-100处理种子10分钟。每3分钟更换漂白剂。之后倒出漂白剂并在无菌水中洗涤种子4次。将每平板10个种子置于1％琼脂平板上，用ParafilmTM密封并置于25℃、16小时/天的光照(70-100μE/m2s)下。
用于发根测定的农杆菌接种：
接种前将萌发的大豆置于层流操作台(laminar hood)。从摇床中取出新鲜的过夜农杆菌培养物并测定OD650。将1mL的等分试样置于无菌微量离心管中，并以12000rpm使农杆菌沉淀3分钟。移去上清液并用感染培养基(1×MS盐、3.6％葡萄糖、6.9％蔗糖、100mg/L肌醇、1.5mg/L 2，4-D、1mg/L cas氨基酸、1mg/L硫胺HCl、0.5mg/L烟酸、0.5mg/L维生素B6HCl)重悬农杆菌。
将OD650调整至1.0。在感染前1小时将农杆菌接种到感染培养基中以诱导vir基因级联。仅从苗上剪下绿色的子叶，并用解剖刀损伤近轴侧。将子叶置于琼脂平板上，远轴侧向上。在每个子叶的损伤表面接种17至20μL农杆菌。用石蜡膜密封平板并置于25℃、16小时/天光照条件(70-100μE/m2s)下进行共培养。接种后3天将子叶转移到选择培养基(1×MS盐、1×Gamborgs B5维生素、3％蔗糖、100mg/L羧苄青霉素、pH6.2(用KOH))。密封平板并放回到相同的培养条件下。两周后可以检测并收获长进培养基表面的发根(对于诱导发根的菌株)。将收获的根置于选择培养基上。再过2至3周后，将选择培养基上生长的根系传代培养到不包含选择剂的培养基上。每4周应进行传代培养。根应在黑暗中培养。
实施例3用于植物转化的农杆菌的培养和制备
通过将带有所需双元载体的细菌划线到固体YEP生长培养基上并在25℃温育至出现菌落(约2天)来制备农杆菌培养物。取决于Ri质粒、双元载体和细菌染色体上存在的选择标记基因，可以在YEP固体和液体培养基中将不同的选择剂用于根癌农杆菌和发根农杆菌选择。约2天后，(用无菌牙签)分离单菌落并接种到50ml带有抗生素的液体YEP中，摇动(175rpm，25℃)至OD650达到0.8至1.0之间(约2天)。制备用于转化的工作甘油原液(15％)并以1.5mLEppendorf管中的1ml农杆菌原种储存于-70℃。
YEP生长培养基(农杆菌培养基)：
10g/L细菌用蛋白胨、5g/L酵母提取物、5g/L NaCl、12g/L琼脂(Difco)、适当的抗生素、pH7.0。
接种外植体前1天，用5μL至3mL工作农杆菌原种接种500mL锥形瓶中的200mL YEP。在25℃将瓶摇动过夜，直至OD650在0.8至1.0之间。制备大豆外植体之前，通过在20℃以5500×g离心10分钟沉淀农杆菌。将沉淀重悬于液体CCM培养基至需要的密度(OD6500.5至0.8)并在使用前在室温放置至少30分钟。
液体CCM培养基(＝共培养培养基)：
十分之一B5盐、十分之一MS铁原液、3％蔗糖、20mM MES、1×B5维生素、200μM乙酰丁香酮、0.7μM赤霉酸、7.5μM 6-苄氨基嘌呤；pH5.4。
实施例4：植物转化
实施例4a：大豆转化
苗和农杆菌的制备
通过在盖紧盖子的干燥器中将3.5 mL HCl加入100 mL漂白剂(5.25％次氯酸钠)使多个栽培种的大豆种子在氯气中灭菌24至48小时。灭菌后移出种子并将约20个种子种到PlantCon容器中的萌发培养基[1×B5主要盐、1×B5次要盐、1×MSIII铁、2％蔗糖、1×B5维生素、0至5μM BAP、0.8％纯化琼脂(Sigma)；pH 5.8]上。在光(150μm2s)下培养苗直至子叶为绿色、种皮裂开并且上胚轴展开至长度约为0.5cm(约7天)(对于叶外植体)和1至4cm(对于苗外植体)。
将卸甲农杆菌菌株K599(pRi2659Δtet)或带有双元载体pBPSEW008[p-NOS∷c-bar∷t-NOS p-PcUBI∷c-gusINT∷t-NOS](SEQ ID NO：15)或pBPSMM192b[pAtAhas∷c-csr1-2∷t-AtAHASt-NOS∷c-gusINT∷p-SUPER](SEQ ID NO：16)的根癌农杆菌菌株AGL1划线到固体YEP[10g/L细菌用蛋白胨(Difco；Becton，Dickinson，and Co.，Cockeysville，MD，USA)、5g/L酵母提取物(Difco)、5g/L NaCl、50mg/L卡那霉素、1.2％颗粒琼脂(Difco)(仅固体)；pH7.0]上并在25℃温育2天。用无菌牙签挑取单菌落并置于50mL带有抗生素的YEP中，在25℃摇动(175rpm)16小时。OD650达到0.8至1.0后，制备15％甘油工作原液并储存于-80℃。接种外植体前一天，将农杆菌菌株的工作原液(取决于农杆菌的生长和储存浓度，但总是在5μL至50μL之间)加50mg/L卡那霉素加入锥形瓶中的YEP液体培养基中。将瓶在25℃摇动过夜至OD650达到0.8。在制备大豆外植体以前，通过在20℃以5500×g离心10分钟沉淀农杆菌并重悬于液体共培养培养基[1/10×B5主要盐、1/10×B5次要盐、1/10×MSIII铁、1×B5维生素、3％蔗糖、20mM MES、200μM乙酰丁香酮、0.7μM GA3、7.5μM BAP；pH5.4]至需要的密度(如OD6500.5)并在室温温育30分钟。
外植体制备和接种
叶外植体：从子叶节以下2mm的下胚轴移出子叶和上胚轴。为暴露上胚轴和单片叶，将子叶彼此分开，接着在子叶节上方移出上胚轴。在最初的节处移出最初的叶(由叶片、叶柄和托叶组成)，其中在托叶底部小心地剪下，从而使外植体包括叶腋分生组织。通过用尖锐的解剖刀在托叶之间的区域划3至5次来损伤外植体，移出所有发育完成的嫩枝。
苗外植体：通过在下胚轴/上胚轴接合处或下胚轴上方(如果下胚轴很长)移出大部分根来制备外植体，其中包括一片子叶和这个节处生长的任何叶腋组织、紧靠最初的节上方的上胚轴包括顶端以及所有从最初的节上发育完成的叶。然后通过用尖锐的解剖刀5至10次将最初的节刺入存在腋分生组织的上胚轴顶端而损伤最初的节。
制备外植体之后，将外植体完全浸入农杆菌悬液30分钟。温育后，将叶外植体在无菌滤纸上吸干以除去过量的农杆菌培养物，使损伤侧与盖在固体共培养培养基[1/10×B5主要盐、1/10×B5次要盐、1/10×MSIII铁、1×B5维生素、3％蔗糖、20mM MES、200μM AS、0.72μM GA3、7.5μMBAP(0.825至8.25mM L-半胱氨酸，Sigma，0至1mM二硫苏糖醇，0至1mM硫代硫酸钠)、0.5％纯化琼脂；pH5.4]上的约7cm滤纸接触。不吸干地将苗外植体转移至盖在共培养培养基上的滤纸上。该滤纸防止农杆菌在大豆外植体上过度生长。用Parafilm″M″(American National Can，Chicago，Illinois，USA)包好5个平板。在黑暗中以25℃将叶外植体温育2天，苗外植体温育5天。
选择和植物再生
温育后，通过将外植体在嫩枝诱导培养基[1×B5主要盐、1×B5次要盐、1×MSIII铁、1×B5维生素、3％蔗糖、3mM MES、1.0μM(苗外植体)或2.5μM BAP(叶外植体)、5μM激动素、250mg/l替卡西林；pH5.6]中洗涤来除去过剩的农杆菌，将叶外植体在无菌滤纸上吸干以防止水损伤，特别是在叶片上。接着，将约10个叶外植体和5个苗外植体转移至固体嫩枝诱导培养基[0.8％纯化琼脂(Sigma)]上7天(无草铵膦选择)。将叶外植体置于培养基中，使叶与培养基表面垂直，叶柄埋入培养基中，叶片伸出培养基外，苗外植体使整个上胚轴与培养基接触。用Scotch 394通风带(3M，St.Paul，Minnesota，USA)包裹平板并放在培养箱中，其中平均温度为25℃，周期为18小时光照/6小时黑暗、70-100μE/m2s。
7天后，将叶外植体转移至含有3.0mg/L草铵膦的嫩枝诱导培养基，苗外植体转移至含有5.0mg/L草铵膦的嫩枝诱导培养基。此时在叶外植体的叶柄底部和苗外植体的最初节的上胚轴顶端有可观的从头发育的嫩枝。在嫩枝诱导培养基上选择2周后，将叶外植体转移至含有3mg/L草铵膦选择的嫩枝伸长培养基[1×MS主要盐、1×MS次要盐、1×MSIII铁、1×B5维生素、3％蔗糖、3mM MES、0.378mM L-天冬酰胺、0.775mM L-吡咯谷氨酸、0.057μM IAA、1.44μM GA3、2.85μM反式玉米素核苷、250mg/l替卡西林、0.8％纯化琼脂(Sigma)；pH5.6]上以刺激嫩枝原基的嫩枝伸长。对于苗外植体，在上胚轴顶端从外植体上取下枝条叶枕(shoot pad)并转移至相同的嫩枝伸长培养基上。接着每3周将外植体转移至新鲜SEM培养基，直至外植体死亡或健康的嫩枝伸长。在转移中，去除死亡的嫩枝，并剪下形成愈伤组织的外植体底部以帮助促进营养和水转移进上方的嫩枝。接着将伸长的嫩枝转移至生根培养基(1/2×B5盐、1/2×MS铁原液、2％蔗糖、3mM MES、5μM吲哚丁酸、250mg/L特美汀、0.8％Noble琼脂；pH5.6)直至形成根。接着将生根的嫩枝转移至培养箱中的土壤(1∶1(重量/重量)Carolina土∶Metro混合物)中，在20小时光照下直至第三片叶展开。接着在温室中在16小时光照/8小时黑暗的方案下培养植物至成熟。
GUS组织化学测定
评估叶外植体的GUS活性：在37℃置于GUS组织化学染色[80mMNa2HPO4(pH8.0)、8mM Na2EDTA、0.8％(体积/体积)Triton-X、1.6％(体积/体积)二甲基亚砜、20％(体积/体积)甲醇、0.38mM K4Fe(CN)6、1mMX-glucuro CHA盐(Inalco，Milan，Italy)]中1天，其后用70％(体积/体积)乙醇洗涤叶组织并在95％乙醇中脱色(Jefferson 1987；Kosugi 1990)。
实验设计
对于第一个实验，制备40个外植体用于接种带有双元pBPSMM192b(SEQ ID NO：16)的AGL1或SHA016，并在共培养5天后测定瞬时GUS表达。在第二个实验中，以三次重复测试总计120个外植体的嫩枝再生，所述外植体用不同浓度(OD650：0、0.125、0.25、0.5)的带有pBPSEW008(SEQ ID NO：15)的农杆菌AGL1或SHA016进行接种。在第三个实验中，制备120个外植体用于接种带有pBPSEW008(SEQ ID NO：15)的SHA016或AGL1，共培养后36天对其亚组进行稳定GUS表达的染色。在第四个实验中，通过测定伸长的嫩枝的GUS组织化学染色测定推定的转化频率，所述伸长的嫩枝来自转化了带有pBPSE008(SEQ ID NO：15)的农杆菌菌株SHA017(pSB1)或AGL1的苗外植体。此实验由5个不同的接种日期组成。
在第一个实验中，根癌农杆菌AGL1和卸甲农杆菌菌株K599(SHA016)都成功地将T-DNA转移进叶外植体的叶柄(图3)。用AGL1感染的外植体中的42.5％在靶区域中显示GUS+集中灶，而SHA016在10％的靶区域中显示GUS+集中灶(表1)。用SHA016感染的这些外植体中瞬时GUS表达的降低主要导致共培养期间组织死亡。
表1.农杆菌菌株AGL1和SHA016感染叶外植体的能力
  菌株 感染的外植体总数 在靶区域具有GUS(+)集中灶的外植体
AGL1     40     17(42.5％)
SHA016     40     4(10％)
在第二个实验中，在此研究中用不同浓度的卸甲K599接种的外植体的再生潜力彼此未显示显著差异。
表2.接种不同浓度的卸甲K599的外植体的再生潜力
重复   OD 650：0   OD 650：0.125   OD 650：0.25   OD 650：0.5
    1     8/10     8/10     9/10     3/10
    2     10/10     8/10     8/10     6/10
    3     3/10     4/10     9/10     9/10
在第三个实验中，在接种后35天用于GUS组织化学染色的所有外植体均在叶外植体上显示稳定的GUS表达(图4)。
在第四个实验中制备了总计900个苗外植体，其中288个用AGL1(pBPSEW008)接种，612个用SHA017(pSB1、pBPSEW008)接种(表3)。在此研究中，从接种AGL的外植体中鉴定了一个GUS+嫩枝(0.35％)，从接种SHA017的外植体鉴定了25个独立的GUS+嫩枝(4.1％)。其中来自SHA017处理的10个嫩枝发育成成熟的T0植物。该10个T0植物的Southern分析证实每一个植物都是基于植物基因组中T-DNA整合模式的独立转化事件。检测gus和bar基因的探针对植物基因组的DNA杂交还证实了一个株系(21-2)中T-DNA到T1后代的遗传(图15)。
表3.来自接种农杆菌菌株AGL1或SHA017的苗外植体的gus+伸长嫩枝和植物的产生
实验号   农杆菌菌株 接种的外植体数 带有GUS+伸长嫩枝的外植体数 GUS+成熟植物
 E071304   AGL     35     0     0
 E071304   SHA017     174     3     0
 E071504   AGL     104     0     0
 E071504   SHA017     93     5     3
 E071904   AGL     100     1     0
 E071904   SHA017     100     9     2
 E072204B   AGL     27     0     0
 E072204B   SHA017     108     0     0
 E072804B   AGL     22     0     0
 E072804B   SHA017     137     8     5
实施例4b：拟南芥转化
在土壤中培养拟南芥植物(生态型Col-0)至开花，除去初级开花(bolt)以增加次级开花。用目的构建体pBPSEW008(SEQ ID NO：15)和pBPSMM192b(SEQ ID NO：16)转化农杆菌菌株MP90(GV3101(pMP90)；Koncz和Schell 1986)、SHA001和野生型K599并在250mL液体LB培养基(10g/L蛋白胨、5g/L酵母提取物、10g/L NaCI(EM Science))中培养，直至培养物的OD650达到1.2。通过离心(15分钟，4000×g)收获细菌细胞并重悬于渗入溶液(5％蔗糖、0.05％SILWET L-77 [Lehle Seeds，目录号VIS-02]、0.217％MS盐[Sigma M5524])至OD650为0.8-0.9。
接着通过花浸染法(Clough和Bent 1998)用带有上述载体的转基因农杆菌菌株转化开花的拟南芥植物，其中浸入农杆菌溶液10-20秒。其后将植物保持在培养箱中至可收获种子。通过将表面灭菌的种子种到生长培养基(4.4g/L MS盐[Sigma-Aldrich]、1g/L MES[Duchefa]、20g/L蔗糖、6g/L植物琼脂)上来选择转基因种子，所述培养基中补充了用于选择带有bar抗性标记的植物的5mg/L草铵膦、用于选择包含AtAHAS基因表达盒的植物的100nM Pursuit、用于选择带有nptII抗性标记的50mg/L卡那霉素或用于选择包含来自纤细红酵母(Rhodotorula gracilis)的dao1基因表达盒的植物的0.3至30mM D-氨基酸(如下文所述)。将存活的植物转移至土壤中并在温室培养。在37℃使用GUS测定溶液(Jefferson 1987)(0.4M NaH2PO4-H2OpH7.0、0.5M EDTA、0.01％TritonX-100、250mg/LX-葡糖醛酸糖苷酶(Fermentas))将存活植物的样品染色过夜并观察GUS表达(图10)。
通过在包含适当选择剂的培养基上萌发的T2种群中进行T-DNA分离的统计学分析来选择含有单个T-DNA插入基因座的株系。培养带有单个插入T-DNA基因座的植物并自花受粉。接着通过分析T3后代中的T-DNA分离鉴定纯合T3种子原种，并通过RNA印迹分析证实引入基因的表达。
实施例4c：农杆菌介导的欧洲油菜(Brassica napus)转化
在28℃将转化了目的质粒(如pBPSMMl92b)的卸甲农杆菌菌株K599(pRi2659A)在50mL YEB培养基(见实施例4a)中培养过夜。将农杆菌溶液与液体共培养培养基(2倍浓度的MSB5盐(Duchefa)、30g/L蔗糖(Duchefa)、3.75mg/LI BAP(6-苄氨基嘌呤，Duchefa)、0.5g/L MES(Duchefa)、0.5mg/L GA3(赤霉酸，Duchefa)；pH5.2)混合至OD650达到0.5。将在生长培养基B(MSB5盐(Duchefa)、3％蔗糖(Duchefa)、0.8％oxoidagar(Oxoid GmbH)；pH5，8)上培养的欧洲油菜Westar变种的4日龄苗的叶柄剪下。将叶柄在农杆菌溶液中浸2-3秒，其后置于固体培养基中共培养(共培养培养基补充了1.6％Oxoidagar)。共培养持续3天(24℃，光强度约为50μMol/m2s)。其后将叶柄转移至补充了适当选择剂(用于选择包含nptII标记的植物的18mg/L卡那霉素(Dunchefa)，用于选择带有nptII抗性标记的植物的卡那霉素，或用于选择包含来自纤细红酵母的dao1基因表达盒的植物的0.3至30mM D-氨基酸(如下文所述))和300mg/L特美汀(Dunchefa)的共培养培养基。
在24℃将转化叶柄在选择培养基上温育4周。重复这一步骤直至产生嫩枝。将嫩枝转移至补充了适当选择剂(用于选择包含nptII标记的植物的18mg/L卡那霉素(Dunchefa)，用于选择带有nptII抗性标记的植物的卡那霉素，或0.3至30mM D-氨基酸(如下文所述))的A6培养基(MS盐(Sigma Aldrich)、20g/L蔗糖、100mg/L肌醇(Duchefa)、40mg/L硫酸腺嘌呤(Sigma Aldrich)、500mg/L MES、0.0025mg/L BAP(Sigma)、5g/Loxoidagar(Oxoid GmbH)、150mg/L特美汀(Duchefa)、0.1mg/L IBA(吲哚丁酸，Duchefa)；pH5，8)至其伸长。将伸长的嫩枝在A7培养基(无BAP的A6培养基)中培养生根。将生根植物转移至土壤中并在温室中培养。
实施例4d：农杆菌介导的番茄转化。
体外种子萌发
将番茄种子在含有0.1％Tween20的10％CloroxTM(5.25％次氯酸钠)中振荡灭菌15分钟。用无菌蒸馏水将灭菌种子洗涤4-5次。灭菌后，将种子转移至25×100mm培养皿中的萌发培养基[0.25×MS、7.5g/L蔗糖、0.7％纯化琼脂(Sigma)，pH5.8]上。将含有种子的培养皿在黑暗中放置2-3天以获得一致的萌发，并在培养室的光下转移至培养室(25℃，16/8小时光周期，光强度为μE/m2s)。将约8日龄苗的子叶用于农杆菌介导的转化。
农杆菌制备
将带有双元载体pBPSEW008[p-NOS∷c-bar∷t-NOSp-PcUBI∷c-gusINT∷t-NOS](SEQ ID NO：15)或pBPSMM192b[pAtAhas∷c-csr1-2∷t-AtAHAS t-NOS∷c-gusINT∷p-SUPER](SEQ IDNO：16)的卸甲农杆菌菌株K599(SHA001)划线到固体YEP[10g/L细菌用蛋白胨(Difco；Becton，Dickinson，and Co.，Cockeysville，MD，USA)、5g/L酵母提取物(Difco)、5g/L NaCl、50mg/L卡那霉素、1.2％颗粒琼脂(Difco)(仅固体)；pH7.0]上并在25℃温育2天。用无菌牙签挑取单菌落并置于50mL带有抗生素的YEP中，在25℃摇动(175rpm)16小时。OD650达到0.8至1.0后，制备15％甘油工作原液并储存于-80℃。接种外植体前一天，将农杆菌菌株的工作原液(取决于农杆菌的生长和储存浓度，但总在5μL至50μL之间)加50mg/L卡那霉素加入锥形瓶中的YEP液体培养基中。将瓶在25℃摇动过夜至OD650达到0.8。在制备番茄外植体以前，通过在20℃以5500×g离心10分钟沉淀农杆菌并重悬于液体共培养培养基[1/10×B5主要盐、1/10×B5次要盐、1/10×MSIII铁、1×B5维生素、3％蔗糖、20mM MES、200μM乙酰丁香酮、0.7μM GA3、7.5μM BAP；pH5.4]至需要的密度(如OD6500.5)并在室温温育30分钟。
外植体制备
从约8日龄的苗上取下子叶并置于无菌培养皿上。去除子叶的两端并横向切成两半，近轴侧向下转移至无菌滤纸上，并在22℃在黑暗中在预培养培养基[MS盐和维生素、16g/L葡萄糖、0.1mg/L NAA、1mg/L BAP、0.7％纯化琼脂，pH5.8]上放置两天。
共培养
将带有外植体的滤纸置于共培养培养基[MS盐和维生素、16g/L葡萄糖、0.1mg/L NAA、1mg/L BAP、0.7％纯化琼脂、150μM乙酰丁香酮，pH5.8]上，在22℃在黑暗中用农杆菌悬液(OD650为0.3-0.5)接种2至3天。
选择和植物再生
第三天末，在培养室(70μE/m2s)中在25℃将外植体近轴侧向下在恢复培养基(1×MS盐和维生素、16g/L葡萄糖、2mg/L玉米素、0.7％纯化琼脂、200mg/L特美汀)上放置1周。恢复后，将外植体转移至选择/再生培养基(1×MS盐和维生素、30g/L蔗糖、2mg/L玉米素、0.7％纯化琼脂、200mg/L特美汀、50-100nM Pursuit，pH5.8)上2.5周。从子叶上剪下愈伤组织中嫩枝的芽并转移至伸长培养基(1×MS盐和维生素、20g/L蔗糖、0.5mg/L玉米素或0.25mg/L IBA、0.7％纯化琼脂、200mg/L特美汀和50-100nM Pursuit)上2-3周。从愈伤组织上剪下伸长的嫩枝并置于生根培养基(1×MS盐和维生素、20g/L蔗糖、0.25mg/L IBA、0.7％纯化琼脂、100mg/L特美汀和50nM Pursuit，pH5.8)上2-3周，直至小植株可移植到土壤。
GUS组织化学测定
评估叶外植体的GUS活性：在37℃置于GUS组织化学染色[80mMNa2HPO4(pH8.0)、8mM Na2EDTA、0.8％(体积/体积)Triton-X、1.6％(体积/体积)二甲基亚砜、20％(体积/体积)甲醇、0.38mM K4Fe(CN)6、1mMX-glucuro CHA盐(Inalco，Milan，Italy)]中1天，其后用70％(体积/体积)乙醇洗涤叶组织并在95％乙醇中脱色(Jefferson等1987；Kosugi等1990)。
使用含有pBPSMM192b(SEQ ID NO：16)的卸甲农杆菌菌株K599(SHA001)获得转基因番茄小植株(见图5)。
实施例4e：农杆菌介导的玉米转化
使某些玉米近交系或玉米杂交系的种子萌发、生根并在温室中进一步培养。在授粉后8至14(平均10)天(DAP)收获玉米植物的穗，并从其中分离未成熟胚。收获时间根据生长条件和玉米品种而变化。用于转化的未成熟胚的最佳长度为约1至1.5mm(包括盾片长度)。胚应该是半透明而不是不透明的。将剪下的胚收集在基于MS的液体培养基(包含1.5mg/L2，4-D)中。与接种农杆菌同时向培养基中加入乙酰丁香酮(50至100μM)，或者在马上用于农杆菌感染前加入。
农杆菌制备：在YEP培养基上培养用目的质粒(pSB1/pBPSMM232；此质粒是pBPSMM232(SEQ ID NO：17 [p-ZmUbi1∷c-ZmAHASL/Xi12∷t-ZmAHAS t-NOS∷c-gusINT∷p-ZmUbi1])与pSB1(Komari 1996)融合产生的嵌合质粒)转化的农杆菌菌株SHA017(K599[pRi2659Δ])。在上述培养基(包含100μM乙酰丁香酮介质，优选在感染1-2小时前)中涡旋农杆菌悬液。
接种/共培养：将细菌悬液加入含有预浸湿的未成熟胚的微型管(平板)中，并在室温(20-25℃)放置5至30分钟。除去过量的细菌悬液并将残留的培养基中的未成熟胚和细菌转移至培养皿。将未成熟胚扁平侧向下(盾片向上)置于共培养培养基上。密封平板，在22℃在黑暗中温育2-3天。(共培养培养基：MS基础、1.5mg/l2，4-D、15μM AgNO3、100μM乙酰丁香酮)。或者将剪下的未成熟胚直接扁平侧向下(盾片向上)置于共培养培养基上。在每个未成熟胚上加入稀释的农杆菌细胞悬液。密封平板并在22℃于黑暗中温育2-3天。
恢复：共培养后，将胚转移至恢复培养基(MS基础，包含1.5mg/L2，4-D、150mg/L特美汀)，盾片侧向上在27℃在黑暗中温育平板约5至7天。
选择转化的愈伤组织：将未成熟胚转移至选择培养基(恢复培养基还包含选择剂，如浓度为0.3至30mM的D-丙氨酸)(盾片向上)并在27℃于黑暗中温育10-14天(第一次选择)。将产生多种愈伤组织的所有未成熟胚传代培养至第2-3次选择培养基。在这一阶段除去形成的任何根。在与第一次选择相同的条件下温育2周(第二次选择)。从盾片上剪下可再生的愈伤组织(可再生的愈伤组织颜色发白、紧密、无粘液并可能具有胚样结构)并转移至新鲜的第2-3次选择培养基。包裹平板并在27℃于黑暗中温育2周(对于大多数基因型来说不需要第三次选择，可再生愈伤组织可以转移至再生培养基)。
再生转化植物：以与第二次/第三次选择相同的方式剪下增殖的愈伤组织(白色，有形成的胚结构)并转移至再生培养基(与选择培养基相似，但无2，4-D)。包裹平板并在25或27℃置于光(约2,000lux)下2周，或直至可见嫩枝样结构。必要时转移至新鲜的再生培养基。将带有再生的嫩枝或嫩枝样结构的愈伤组织节段转移至含有生根培养基的Phytatray并在与以上步骤相同的条件下温育2周，或直至发育出生根的小植株。在生根培养基(半浓度MS培养基，无2，4-D，无选择剂)上2至4周后，将仍有绿色区域(但未再生出苗)的愈伤组织转移至新鲜的生根Phytatray。将生根的苗转移至温室中的Metromix土中，并各用塑料棚覆盖至少1周直至苗已经建立。当植物达到3-4叶期时，用Osmocote受精并接着喷选择剂(如D-丙氨酸或D-丝氨酸)，在温室中再培养2周。此时非转基因植物应该出现除草剂症状或死亡。将存活的植物移植到含有MetroMix和一茶匙Osmocote的10英寸盆中。
实施例5：pRi2569Δ质粒的纯化、测序和注释
在5升LB液体培养基中以28℃将农杆菌菌株SHA017(卸甲农杆菌K599[pRi2659Δ])培养过夜。按照标准碱裂解方案和接着的酚-氯仿提取来提取总DNA(Sambrook等人，1989)。使用脉冲场凝胶电泳(PFGE)用CHEF-DRIII系统(Bio-Rad目录号170-3695)从总DNA中分离pRi2659Δ质粒DNA。将总DNA上样到0.5×TBE缓冲液(45mM Tris-硼酸、1mM EDTA)中的1％脉冲场琼脂糖(Bio-Rad目录号：162-0137)凝胶上，接着在14℃以6V/cm进行PFGE24小时，起始切换时间1秒，最终切换时间25秒。电泳后，从凝胶两边切下含有分子标记物泳道和样品泳道边缘的凝胶条，用溴化乙啶(Sigma)染色并显影。凝胶条中分离出了一条可见条带，其余的DNA留在孔中。切下单条带并按照Fu和Dooner(2000)使用电洗脱进行回收。
将回收的DNA用作模板，用pRi特异性引物进行PCR扩增以证实回收的pRi DNA。在pRi1724(GenBank登录号AP002086)保守的vir基因区内进行引物设计。
virG正向引物：5′-TACTTCCTCC TCACGCACTC-3′(SEQ ID NO27)
virB反向引物：5′-GCCAGCAATG ATCAAGAATT TGTTT-3′(SEQID NO 28)
可以通过本领域技术人员已知的方法(如鸟枪法克隆)产生pRi的片段。可以单独使用多种市售限制性酶(如BamHI、SphI、EcoRI、HindIII(均可购自new England Biolabs，Beverly，MA))消化Ri质粒制备物，并亚克隆进类似消化的pUC型载体，如pBlueScript(Stratagene，La JoIIa，CA)。接着可以对单个克隆测序，将单个序列组合进重叠群中，以产生如下文所述的全序列图。
按照Margulies等(2005)和Sanger(1977)测序纯化的pRi2659Δ。使用交叉匹配(Green1994-1999)覆盖载体序列并按照Margulies等(2005)和CAP3(Huang and Madan 1999)组合清理的初步序列数据。通过使用以下引物进行PCR扩增来补平剩余的序列缺口并接着测序：
PCR G109正向引物：5′-TTGGTGCGAC AACTCCTCGG CG-3′(SEQ ID NO 29)
PCR G112反向引物：5′-GGTGAGCTCG ATCAGCTTCG GC-3′(SEQ ID NO 30)
按照Sanger(1977)对PCR产物进行测序反应。为进行最后的加工，将序列草图分成100个片段，每个片段与其相连片段具有50个碱基的重叠；合并与每个片段都高度一致的初步序列并用CAP3在高严格度下再组合。用CAP3将这些组合自每个片段的共有序列再组合，以在Vector NTI(Invitrogen，Carlsbad CA)中产生pRi2659Δ(SEQ ID NO：24)、pRi2659Δtet(SEQ ID NO：25)和pRi2659(SEQ ID NO：26)的序列图。使用BLASTx以e-10(Altschul等1997)和GenBank Genpept蛋白质数据库释放版本148注释新的pRi2659序列。
实施例6：pRi2659Δ编码的蛋白质
下表(表4)列出了可能由质粒pRi2659Δ(SEQ ID NO：24)中的可读框编码的蛋白质。列出了蛋白质的SEQ ID NO(SINo)和对所编码氨基酸的详细描述。
表4：pRi2659Δ的可读框及其蛋白质的SEQ ID NO(SINo)
  特征   SINo 细节
rcorf1 25 与mll6374样整合酶/重组酶[百脉根中慢生根瘤菌MAFF303099]相似
  rcorf2   124 与pRi1724的riorf1相似，IS66中的orf3基因同系物
rcorf3 123 较少地与mlr6097相似，氮同化作用控制蛋白[百脉根中慢生根瘤菌MAFF303099]，COG0583[K]转录调节子
rcorf4 122 N端与STH1062相似，与谷氨酰胺ABC转运蛋白ATP结合蛋白[嗜热共生小杆菌IAM 14863]相似，C端与bll6362相似，大豆慢生根瘤菌USDA 110中的假定蛋白，COG2079[R]与丙酸盐代谢相关的未表征蛋白
rcorf5 121 与Bcep02000339[Burkholderia fungorum LB400]相似，与blr3310相似，COG0765：ABC转运蛋白通透酶[大豆慢
生根瘤菌USDA 110]
rcorf6 120 与COG0765[Burkholderia fungorum LB400]相似，与PSPTO5181相似，胱氨酸ABC转运蛋白，通透酶蛋白，推定的[丁香假单胞菌番茄小种菌株DC3000]
rcorf7 119 与COG0834 Burkholderia fungorum LB400 COG0834相似，与STH1060相似，谷氨酰胺ABC转运蛋白底物结合蛋白[嗜热共生小杆菌IAM 14863]
  rcorf8    118 与根癌农杆菌C58乙内酰脲利用蛋白hyuB相似
  rcorf9    117 与根癌农杆菌C58乙内酰脲利用蛋白hyuA相似
rcorf10 116 与转录调节蛋白[大豆慢生根瘤菌USDA 110]相似，螺旋-转角-螺旋葡糖酸操纵子转录阻抑物
rcorf11 115 与pRi1724中riorf40(hutH基因同系物cdO1441：HAL)相似；催化组氨酸降解为谷氨酸的第一步的组氨酸氨裂解酶(HAL)
rcorf12 114 较少地与pRi1724中riorf20相似，与假定蛋白Bcep02000338[Burkholderia fungorum LB400]相似
rcorf13 26 较少地与pRi1724中riorf22相似，与假定蛋白Bcep02000337[Burkholderia fungorum LB400]相似
rcorf14 27 可能为黄瓜碱转运基因，与pRi1724中的riorf37(可能的mikimopine转运蛋白)相似
rcorf15 164 与SMa2207(推定的ABC转运蛋白，ATP结合蛋白[苜蓿中华根瘤菌1021]，COG3842：PotA)相似；ABC型亚精胺/腐胺转运系统，ATPase组分[氨基酸转运和代谢]
rcorf16 28 与SMa2205苜蓿中华根瘤菌1021(菌株：1021)(COG1176[E]ABC型亚精胺/腐胺转运系统，通透酶组分I)相似
rcorf17 165 可能为黄瓜碱转运蛋白，与riorf34(假定蛋白[发根农杆菌]可能为mikimopine转运蛋白基因)相似
rcorf18 126 与AGR_L_1821假定蛋白[根癌农杆菌菌株C58](sdeB基因同系物，cd01298：ATZ_TRZ样)相似；TRZ/ATZ家族包括来自莠去净降解途径的酶和相关的水解酶
rcorf19 29 与hutI(咪唑酮-5-丙酸水解酶[根癌农杆菌菌株C58])相似，较少地与pRi1724中的riorf39相似，KEGG途径：组氨酸代谢00340
rcorf20     30 与pRi1724中的riorf41(假定蛋白)相似
rcorf21 31 与pRi1724中的riorf42(hutU基因同系物，尿刊酸酶，EC号4.2.1.49)相似
rcorf22 32 与未知功能蛋白DUF886[中慢生根瘤菌BNC1种]相似，较少地与pRi1724中的riorf43相似，与恶臭假单胞菌中与hutR相邻的未知基因相似
rcorf23     33 与IS30家族转座酶的C端相似
rcorf24 134 与pRi1724中的riorf51相似，较少地与tetR细菌调节家族的mtrR基因相似
rcorf25 133 与pRi1724中的riorf52相似，与MCA2182脱羧酶家族蛋白[荚膜甲基球菌菌株Bath]相似
rcorf26 132 可能为idi基因，与pRi1724中的riorf53相似，与idi(异戊烯二磷酸Δ异构酶[结核分枝杆菌CDC1551] EC5.3.3.2)相似
rcorf27 131 可能为反式玉米素合酶，与pRi1724中的riorf54相似，EC 2.5.1.-.
rcorf28 130 可能为GALLS基因，与pRi1724中的riorf55相似，互补virE2，未知机制，有效的稳定植物转化所需的
rcorf29 166 与pRI1724中riorf57(eutC同系物)相似，乙醇胺氨基裂解酶轻链
rcorf30 129 与pRi1724中的riorf58(eutB同系物)相似，乙醇胺氨裂解酶重链
rcorf31 128 与pRi1724中的riorf59相似，与扭脱甲烷杆菌中的orf3基因相似，COG3931 [E]预计为N-甲酰谷氨酸
rcorf32 34 与pRi1724中的riorf60相似，与gatA-1基因(谷氨酰-tRNA酰胺转移酶，小亚基A(gatA-1)，硫磺矿硫化叶菌(Sulfolobus solfataricus)P2)相似
rcorf33     167 与pRI1724中riorf61相似，与PH0807相似的假想ABC
转运基因，pfam00496：SBP_bac_5；细菌胞外溶质结合蛋白，家族5
rcorf34 35 与pRi1724中的riorf62相似，与agaB基因类似的假想ABC转运蛋白基因，农杆鸟氨酸通透酶，pfam00528：BPD_transp_1；结合蛋白依赖性转运系统内膜组分
rcorf35 36 与pRi1724中的riorf63相似，与dppC基因类似的假想ABC转运蛋白基因，pfam00528：BPD_transp_1；结合蛋白依赖性转运系统内膜组分
rcorf36 37 与pRi1724中的riorf64相似，与moaD基因相似的假想ABC转运蛋白基因，甘露碱酸通透酶，COG1123：多种ABC型转运系统的ATPase组分
rcorf37 38 与pRi1724中的riorf66相似，与amaB基因相似，N-氨甲酰基-β-丙氨酸酰胺水解酶
rcorf38 168 与pR11724中riorf67相似，较少地与pck基因相似，smart00587：CHK；含有ZnF_C4 abd HLH结构域的激酶结构域
rcorf39 39 与pRi1724中的riorf68相似，较少地与pck基因相似，pfam01633：胆碱激酶；胆碱/乙醇胺激酶
rcorf40 40 与pRi1724中的riorf69相似，与麻风分枝杆菌中的MLCB 1779.29(可能的单磷酸酶基因)相似，cd01641：细菌IMPase样_1；Mg++依赖性磷酸酶的主要细菌家族，与肌醇单磷酸酶相关
rcorf41 41 与pRi1724中的riorf71相似，与pTi15955中的orf2基因相似的假想化学感受器基因
rcorf42 137 与pRi1724中的riorf73(假想阻抑物基因)相似，与SMa2004[苜蓿中华根瘤菌1021](推定的ROK家族转录调节子)相似
rcorf43 136 与pRi1724中的riorf73相似，与SMa2002[苜蓿中华根瘤菌1021](COG2755[E]溶血磷脂酶L1)和相关酯酶相似
rcorf44     42 与pRi1724中的riorf74相似，与teuB(周质糖结合蛋白)
基因相似，COG1879：RbsB；ABC型糖转运系统，周质组分[碳水化合物转运和代谢]
rcorf45 43 与pRi1724中的riorf75相似，与teuA(ATP结合的糖ABC转运蛋白)基因相似，假想ABC转运蛋白基因，COG1129：MgIA；ABC型糖转运系统，ATPase组分[碳水化合物转运和代谢]
rcorf46 44 与pRi1724中的riorf76相似，与teuC1(糖ABC转运蛋白通透酶)基因相似，假想ABC转运蛋白基因，pfamO2653：BPD_transp_2；支链氨基酸转运系统/通透酶组分
rcorf47 45 与pRi1724中的riorf77相似，与teuC2(糖ABC转运蛋白通透酶)基因相似，假想ABC转运蛋白基因，pfamO2653：BPD_transp_2；支链氨基酸转运系统/通透酶组分
rcorf48 46 与pRi1724中的riorf78(COG2755[E]溶血磷脂酶L1)和相关酯酶相似
rcorf49 169 与pRI1724中riorf79(glpK(甘油激酶)基因同系物EC2.7.1.30)相似
rcorf50 47 与pRi1724中的riorf80相似，glpD基因同系物，甘油-3-磷酸脱氢酶[根癌农杆菌菌株C58]
rcorf51 48 与pRi1724中的riorf81相似，acs(乙酰辅酶A合成酶)基因同系物EC 6.2.1.1.
rcorf52 49 与pRi1724中的riorf82相似，adk基因同系物，pfam00406：ADK；腺苷酸激酶，EC 2.7.4.3.
rcorf53 50 与pRi1724中的riorf83相似，与pTi15955中orf2基因相似的假想化学感受器基因
rcorf54 51 与riorf84相似，cbbF基因同系物，cd00354：FBPase；果糖-1，6-二磷酸酶，催化果糖-1，6-二磷酸水解成果糖-6-磷酸的酶，在糖异生途径中很关键
rcorf55 52 cbbA基因同系物，cd00947：TBP_醛缩酶_IIB；塔格糖-1，6-二磷酸(TBP)醛缩酶和相关的B型II类醛缩酶
rcorf56     53 与pdb链A相似，酵母磷酸丙糖异构酶(tri1)
rcorf57 54 与pRi1724中的riorf88和phrR基因相似，DNA结合蛋白，螺旋-转角-螺旋XRE家族
rcorf58 55 与pRi1724中的riorf89和thcR基因相似，保守结构域，HTH_ARAC；螺旋-转角-螺旋，阿拉伯糖操纵子控制蛋白
rcorf59 56 与pRi1724中的riorf90和pTiC58中的Atu6096相似，在中慢生根瘤菌和农杆菌物种中保守
rcorf60 57 与pRi1724中的riorf91相似，还与农杆菌、中慢生根瘤菌和硝化杆菌物种中的若干假定蛋白相似。
rcorf61 58 与pRi1724中的riorf92相似，在若干农杆菌和中慢生根瘤菌菌株中保守的假定蛋白
rcorf62 59 与pRi1724中的riorf93相似，与幽门螺杆菌中的jhp0928基因相似，COG0827；腺嘌呤特异性DNA甲基化酶[DNA复制、重组和修复]
rcorf63 60 与AGR_pTi_191分隔蛋白(根癌农杆菌菌株C58)相似，分隔蛋白，COG1475[K]预计为转录调节子
rcorf64 61 与假定蛋白MesoDRAFT_1041[中慢生根瘤菌BNC1种]相似，在农杆菌、中慢生根瘤菌和硝化杆菌物种中保守
rcorf65 170 与pRI1724中riorf95相似，与pOAD2中nylA基因下游区相似
rcorf66 62 与假定蛋白MesoDRAFT_1043[中慢生根瘤菌BNC1种]相似，在农杆菌、中慢生根瘤菌和硝化杆菌物种中保守
rcorf67 63 与pRi1724中的riorf96相似，较少地与桃红荚硫菌中hydL基因的下游区相似
rcorf68 64 与AGR_pTi_204[Agrobacterium tumefaciens str.C58]和argG(来自带小棒链霉菌的精氨琥珀酸合酶)相似
rcorf69 65 与pRi1724中的riorf100相似，与pSaflncW质粒中的ardC基因相似，COG4227，可能为结合转移蛋白(抗网织蛋白)
rcorf70     66 与pRi1724中的riorf101相似，与mll9093天冬氨酸1-
脱羧酶[百脉根中慢生根瘤菌MAFF303099]和柑橘黄单胞菌中的pgi基因相似，COG0853[H]天冬氨酸1-脱羧酶
rcorf71 67 与pRi1724中的riorf106相似，与pRtrCFN299a中的teuB基因相似，COG1879：RbsB；ABC型糖转运系统，周质组分[碳水化合物转运和代谢]
rcorf72 68 与pRi1724中的riorf107相似，与豌豆根瘤菌中的mcpC(根瘤菌中的mcpC基因)基因相似smart00283：MA；接受甲基的趋化因子样结构域(趋化因子感受转导蛋白)
rcorf73 171 与AGR_pTi_225核酸酶[根癌农杆菌菌株C58](COG1525[L]微球菌核酸酶(热核酸酶)同系物)相似
rcorf74 140 可能为traG基因，与pRi1724中riorf109(cdO1126：TraG_VirD4)相似；TraG/TraD/VirD4家族为细菌接合蛋白
rcorf75 172 可能为traD基因(与pRi1724中riorf110相似的接合转移蛋白)
rcorf76 139 可能为traC基因，Ti质粒接合的DNA加工，与pRi1724中riorf111相似
rcorf77 69 可能为traA基因，与pRi1724中的riorf112相似，COG0507：RecD；ATP依赖性exoDNAse(外切核酸酶V)，α亚基-解旋酶超家族I成员[DNA复制、重组和修复]
rcorf78 173 可能为与pRi1724中riorf113(COG4959：TraF)相似的traF基因；IV型分泌途径，蛋白酶TraF[翻译后修饰、蛋白质转换、蛋白伴侣/胞内运输和分泌]
rcorf79 70 可能为traB基因，与pRi1724中的riorf114相似
rcorf80 71 与pRi1724中的riorf115相似，发根农杆菌假定蛋白(菌株MAFF03-01724)
rcorf81 174 与pRi1724中riorf117(假定蛋白)或发根农杆菌(菌株：MAFF03-01724)，cd00093：HTH-XRE；螺旋-转角-螺旋XRE家族样蛋白相似
rcorf82 72 可能为与pRi1724中的riorf118相似的traM基因，TraR拮抗物
rcorf83 152 可能为与pRi1724中riorf 119和pTiC58中traR/AGRpTi249相似的traR基因
rcorf84 151 可能为与pRi1724中riorf120相似的trbI基因，pfamO3743：TrbI；细菌接合Trbl样蛋白
rcorf85 150 可能为与pRi1724中riorf 121相似的trbH基因，Ri/Ti质粒接合所需的IV型转移系统
rcorf86 149 可能为与pRi1724中riorf122相似的trbG基因，Ri/Ti质粒接合所需的IV型转移系统
rcorf87 148 可能为与pRi1724中riorf123相似的trbF基因，Ri/Ti质粒接合所需的IV型转移系统
rcorf88 147 可能为与pRi1724中riorf123相似的trbF基因，Ri/Ti质粒接合所需的IV型转移系统
rcorf89 146 可能为与pRi1724中riorf125相似的trbK基因，Ri/Ti质粒接合所需的IV型转移系统
rcorf90 175 可能为与pRi1724中riorf126相似的trbJ基因，Ri/Ti质粒接合所需的IV型转移系统，COG5314；接合转移/进入排斥蛋白[胞内运输和分泌]
rcorf91 145 可能为与pRi1724中riorf127相似的trbE基因，Ri/Ti质粒接合所需的IV型转移系统
rcorf92 176 可能为与pRi1724中riorf128相似的trbD基因，Ri/Ti质粒接合所需的IV型转移系统
rcorf93 144 可能为与pRi1724中riorf129相似的trbC基因，Ri/Ti质粒接合所需的IV型转移系统
rcorf94 143 可能为与pRi1724中riorf130相似的trbB基因，Ri/Ti质粒接合所需的IV型转移系统
rcorf95 142 可能为与pRi1724中riorf131相似的traI基因，LuxI型细胞密度感受调节蛋白，合成3-氧代辛酰同型丝氨酸内酯，pfam00765：Autoind_synth；自身诱导合成酶
rcorf96 73 可能为与riorf132发根农杆菌(菌株：MAFF03-01724)相似的repA基因，cd00550：ArsA_ATPase；氧阴离子-易位ATPase(ArsA)和cd00592：HTH_MERR；螺旋-转
角-螺旋转录调节子MERR，N-端结构域
rcorf97 74 可能为与pRi1724中riorf133相似的repB基因，smart00470：ParB；ParB样核酸酶结构域蛋白
rcorf98 75 可能为与pRi1724中riorf134相似的repC基因，营养复制所必需
rcorf99 76 与pRi1724中riorf135相似，较少地与pNGR234a中的y4aO相似
rcorf100 156 与pAT 22根癌农杆菌菌株C58(菌株：C58，分离株：Cereon)(COG0582[L]整合酶蛋白)的C端片段相似
rcorf101 155 与pAT 22根癌农杆菌菌株C58(菌株：C58，分离株：Cereon)(COG0582[L]整合酶蛋白)的N端片段相似
rcorf102 154 与pTiA6NC中假想整合酶基因orf2(与假单胞菌整合酶样基因相似)相似
rcorf103     77 与pRi1724中riorf137和pTiA6NC中的orf4基因相似
rcorf104 177 与pRi1724中riorf138相似和pHH1中gvp1基因(pfam04079：DUF387)相似；推定的转录调节子(Ypuh样)蛋白
rcorf105 78 与pRi1724中riorf139相似，与pNGR234a中的y4jF和y4jG之间的未表征区相似
rcorf106 79 与pRi1724中riorf140和大肠杆菌中的ofr300基因相似，pfam00004：AAA；与多种细胞活性相关的ATPase家族(AAA)
rcorf107 80 可能为与pRi1724中riorf141的N端相似，为假定的蛋白
rcorf108     178 与pRi1724中riorf141(假定蛋白)的C端相似
rcorf109 81 较少地与SERP1653表皮葡萄球菌RP62A(菌株：RP62A)(假定蛋白)相似
rcorf110 82 与pRi1724中riorf142相似，与拟南芥中腔内结合蛋白外显子6的基因相似
rcorf111     83 与pRi1724中riorf143和pSG5中spdB3基因相似
rcorf112     84 与pRi1724中riorf144相似
rcorf113 179 在79个氨基酸上较少地与大豆慢生根瘤菌USDA 110(菌株：USDA 110)的blr8180(COG1760[E]L-丝氨酸脱氨酶)相似
rcorf114 85 推定的virF基因，与pRi1724中riorf146和pTiSAKURA中tiorf133相似
rcorf115 159 与pRi1724中riorf147和pNGR234a同系物中y4mC基因(vir诱导基因)相似
rcorf116 158 可能为钾摄取蛋白，与Atu0711根癌农杆菌菌株C58和pRi1724中riorf148和kup基因(pfam02705：KJrans)相似；K+钾转运蛋白
rcorf117 86 与pRi1724中riorf149相似，与N端aatA(atu2196)天冬氨酸氨基转移酶A[根癌农杆菌菌株C58]相似
rcorf118 180 与pRi1724中riorf150相似，豌豆根瘤菌中的aatA基因同系物，由移码分开的假想的假基因
rcorf119 87 可能为virH，与pRi1724中riorf151相似，细胞色素P450型氧化酶，可能为通过virB/D4的IV型分泌蛋白
rcorf120 88 可能为virA，与pRi1724中riorf152相似，两组分virA/G调节系统中的受体
rcorf121 89 可能为virB1，与pRi1724中riorf153相似，T复合体转移所需的IV型分泌系统
rcorf122 181 可能为virB2，与pRi1724中riorf154相似，T复合体转移所需的IV型分泌系统
rcorf123 90 可能为virB3，与pRi1724中riorf155相似，T复合体转移所需的IV型分泌系统
rcorf124 182 可能为virB4，与pRi1724中riorf156相似，T复合体转移所需的IV型分泌系统
rcorf125 91 可能为virB5，与pRi1724中riorf157相似，T复合体转移所需的IV型分泌系统
rcorf126 92 可能为virB6，与pRi1724中riorf158相似，T复合体转移所需的IV型分泌系统
rcorf127     93 可能为virB7，与pRi1724中riorf159相似，T复合体转
移所需的IV型分泌系统
rcorf128 183 可能为virB8，与pRi1724中riorf160相似，T复合体转移所需的IV型分泌系统
rcorf129 94 可能为virB9，与pRi1724中riorf161相似，T复合体转移所需的IV型分泌系统
rcorf130 184 可能为virB10，与pRi1724中riorf162相似，T复合体转移所需的IV型分泌系统
rcorf131 95 可能为virB11，与pRi1724中riorf163相似，T复合体转移所需的IV型分泌系统
rcorf132 96 可能为virG，与pRi1724中riorf164相似，两组分virA/G调节系统中的激活子
rcorf133 97 假定蛋白，与aa1-103 pf ISBm1转座酶orfB[猪布鲁菌1330](NP 697552)相似
rcorf134 163 假定蛋白，与ISBm1转座酶orfA[猪布鲁菌1330](NP697551)的氨基酸4-122/142相似
rcorf135 162 可能为virC2，与pRi1724中riorf165类似，T-DNA加工毒力virA/G调节的蛋白质
rcorf136 161 可能为virC1，与pRi1724中riorf166类似，毒力virA/G调节的蛋白质，AGR_pTM8p；VirC1；与毗邻T-DNA右边界的超驱动序列结合；提高T-DNA加工水平
rcorf137 98 可能为virD1，与pRi1724中riorf 167相似，virA/G调节的T-DNA边界内切核酸酶辅助蛋白
rcorf138 99 可能为virD2，与pRi1724中riorf168相似，virA/G调节的T-DNA边界内切核酸酶
rcorf139 185 可能为virD3，与pRi1724中riorf169相似，受virA/G调节，不是毒力所必需的，可能是宿主范围因子
rcorf140 100 可能为virD4，与pRi1724中riorf170相似，virB/D4 IV型分泌系统受virA/G调节的组分
rcorf141 186 可能为virD5，与pRi1724中riorf171相似，virB/D4 IV型分泌系统中受virA/G调节的组分
rcorf142     101 可能为virF，与pRi1724中riorf172相似，较少地与
pTiSAKURA中tiorf133相似，通过virB/D4复合体的IV型分泌蛋白
rcorf143 102 可能为virE3，与pRi1724中riorf173和pRiA6NC中virE3相似，与根癌农杆菌中的virE2和IMPA1(AtKAP-α)相互作用，virB/D4 IV型分泌蛋白
rcorf144 103 与百脉根中慢生根瘤菌MAFF303099 mlr1626相似，预计为甘露糖-6-磷酸异构酶
rcorf145   104 与噬菌体整合酶相似
rcorf146   187 与根瘤菌种NGR234的Y4rB相似
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223.US 5,106,739
224.US 5,187,267
225.US 5,225,341
226.US 5,352,605
227.US 5,416,011
228.US 5,463,175
229.US 5,504,200
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Claims (35)

1.产生转基因植物细胞的方法，该方法包括以下步骤：
a)提供农杆菌菌株K599(NCPPB 2659)或所述菌株衍生物的转基因非致病性菌株变体的细菌，其中所述菌株变体能够感染植物细胞，但没有诱导发根表型的特性，且其中所述菌株变体还包含转基因T-DNA，和
b)将植物细胞与所述细菌共培养，和
c)分离或选择包含其基因组中稳定整合所述转基因T-DNA的植物细胞。
2.产生转基因植物的方法，所述方法包括以下步骤：
a)提供农杆菌菌株K599(NCPPB 2659)或所述菌株衍生物的转基因非致病性菌株变体的细菌，其中所述菌株变体能够感染植物细胞，但没有诱导发根表型的特性，且其中所述菌株变体还包含转基因T-DNA，和
b)将植物、植物细胞或植物组织与所述细菌共培养，和
c)分离或选择并任选地再生包含其基因组中稳定整合所述转基因T-DNA的植物。
3.权利要求1或2的方法，其中所述非致病性菌株变体能够感染植物细胞、介导T-DNA转移进植物细胞和介导T-DNA插入植物基因组，但没有诱导发根表型的特性。
4.权利要求1至3中任一项的方法，其中农杆菌菌株K599(NCPPB2659)的衍生物为土传植物致病性细菌，其特征为16S-23S rRNA基因间序列，所述基因间序列包含选自SEQ ID NO：5、6、7、8、9、10、11、12、13和14所述序列基序的至少一种序列基序。
5.权利要求1至4中任一项的方法，其中所述非致病性菌株变体包含Ri质粒pRi2659或所述质粒的衍生物的非致病性质粒变体。
6. 权利要求5的方法，其中所述非致病性质粒变体包含选自以下所述序列的至少一种序列：
a)包含SEQ ID NO：24所述序列或SEQ ID NO：24所述序列中至少100个连续核苷酸的序列的序列，和
b)与SEQ ID NO：24所述序列或SEQ ID NO：24所述序列中至少1000个连续核苷酸的序列具有至少90％序列同一性的序列，和
c)在等价于68℃在由5×SSPE、1％SDS、5×Denhardt试剂和100μg/mL变性鲑精DNA组成的溶液中结合或杂交，其后68℃下在包含0.1×SSPE和0.1％SDS的溶液中洗涤的条件下与探针杂交的序列，所述探针由SEQ ID NO：24所述序列或其互补序列中的至少100个连续核苷酸组成。
7.权利要求1至6中任一项的方法，其中所述植物细胞、植物组织或植物来自选自单子叶植物、双子叶植物和裸子植物的植物。
8.权利要求7的方法，其中所述植物是选自以下属的植物：苜蓿属(Medicago)、番茄属(Lycopersicon)、芸苔属(Brassica)、香瓜属(Cucumis)、茄属(Solanum)、核桃属(Juglans)、棉属(Gossypium)、苹果属(Malus)、葡萄属(Vitis)、金鱼草属(Antirrhinum)、杨属(Populus)、草莓属(Fragaria)、拟南芥属(Arabidopsis)、云杉属(Picea)、辣椒属(Capsicum)、藜属(Chenopodium)、菊属(Dendranthema)、牵牛属(Pharbitis)、松属(Pinus)、豌豆属(Pisum)、稻属(Oryza)、玉蜀黍属(Zea)、小麦属(Triticum)、黑小麦属(Triticale)、黑麦属(Secale)、黑麦草属(Lolium)、大麦属(Hordeum)、大豆属(Glycine)、黄杉属(Pseudotsuga)、伽蓝菜属(Kalanchoe)、甜菜属(Beta)、向日葵属(Helianthus)和烟草属(Nicotiana)。
9.权利要求1至8中任一项的方法，其中所述转基因T-DNA包含至少一种可在植物中表达的选择标记基因。
10.选自以下所述序列的分离的核酸序列：
a)包含SEQ ID NO：24所述序列或SEQ ID NO：24所述序列中至少100个连续核苷酸的序列的序列，和
b)与SEQ ID NO：24所述序列或SEQ ID NO：24所述序列中至少1000个连续核苷酸的序列具有至少90％序列同一性的序列，和
c)在等价于68℃在由5×SSPE、1％SDS、5×Denhardt试剂和100μg/mL变性鲑精DNA组成的溶液中结合或杂交，其后68℃在包含0.1×SSPE和0.1％SDS的溶液中洗涤的条件下与探针杂交的序列，所述探针由SEQ ID NO：24所述序列或其互补序列中的至少100个连续核苷酸组成。
11.pRi2659或所述Ri质粒的衍生物的非致病性质粒变体，所述质粒变体提供植物细胞感染和转化所需的功能，但没有引起发根表型的序列。
12.权利要求11的非致病性质粒变体，所述质粒变体由权利要求10的核苷酸序列描述。
13.权利要求11或12的非致病性质粒变体，其中所述衍生物编码virD2蛋白质，该蛋白质与SEQ ID NO：112所述序列具有至少85％的氨基酸序列同一性。
14.权利要求11或13的非致病性质粒变体，其中所述变体包含天然致病性pRi2659或其衍生物中植物细胞感染和转化所需的序列，但没有介导发根表型的T-DNA的序列。
15.权利要求11至14中任一项的非致病性质粒变体，其中从天然质粒中缺失了包括边界在内的整个T-DNA。
16.权利要求11至15中任一项的非致病性质粒变体，其中缺失的DNA对应于SEQ ID NO：4中从碱基538左右至碱基15519左右或SEQ IDNO：26中从碱基3644左右至18577碱基左右的序列。
17.权利要求11至16中任一项的非致病性质粒变体，其中所述质粒变体在等价于68℃在由5×SSPE、1％SDS、5×Denhardt试剂和100μg/mL变性鲑精DNA组成的溶液中结合或杂交，其后68℃在包含0.1×SSPE和0.1％SDS的溶液中洗涤的高严格条件下与致病性农杆菌菌株K599(NCPPB 2659)中完整的天然致病性Ri质粒pRi2659杂交，但在所述高严格条件下不与SEQ ID NO：4所表征序列中从碱基538左右至碱基15519左右或SEQ ID NO：26所表征序列中从碱基3644左右至18577碱基左右的序列杂交。
18.权利要求11至17中任一项的非致病性质粒变体，其中pRi2659的衍生物是能够介导T-DNA从土传细菌转移进植物细胞的质粒，其特征还在于：
a)与编码(如农杆菌菌株K599(NCPPB 2659)中包含的)天然pRi2659质粒的DNA具有至少90％的序列同一性，或
b)在等价于68℃在由5×SSPE、1％SDS、5×Denhardt试剂和100μg/mL变性鲑精DNA组成的溶液中结合或杂交，其后68℃在包含0.1×SSPE和0.1％SDS的溶液中洗涤的高严格条件下与天然pRi2659质粒杂交。
19.转基因T-DNA，其侧翼为来自发根农杆菌pRi2659质粒的至少一种T-DNA边界，所述转基因T-DNA不包含引起发根表型的序列。
20.权利要求19的转基因T-DNA，其中所述边界序列由SEQ ID NO：18或19描述。
21.权利要求19或20的转基因T-DNA，其中所述转基因T-DNA包含赋予所述植物农学价值性状的至少一种表达盒或至少一种标记基因，所述标记基因允许选择和/或鉴定转化的植物、植物细胞或组织。
22.转基因载体，其包含权利要求19至21中任一项的转基因T-DNA。
23.细胞或非人生物，其包含权利要求10的核苷酸序列、权利要求11至18中任一项的非致病性质粒变体、权利要求19至21中任一项的转基因T-DNA或权利要求22的转基因载体。
24.权利要求23的细胞或非人生物，其中所述细胞或生物选自细菌、酵母、植物、哺乳动物和昆虫。
25.权利要求23或24的细胞或非人生物，其中所述细胞或生物为根瘤菌(Rhizobiaceae)属的土传细菌。
26.农杆菌菌株K599(NCPPB2659)的非致病性菌株变体或其衍生物，其中所述菌株变体能够感染植物细胞，但没有诱导发根表型的特性。
27.农杆菌菌株K599(NCPPB2659)或所述菌株的衍生物的转基因非致病性菌株变体，其中所述菌株变体能够感染植物细胞，但没有诱导发根表型的特性，并且其中所述菌株变体还包含转基因T-DNA。
28.权利要求26或27中任一项的非致病性菌株变体，其中所述非致病性菌株变体能够感染植物细胞、介导T-DNA转移进植物细胞和介导T-DNA插入植物基因组，但没有诱导发根表型的特性。
29.权利要求26至28中任一项的非致病性菌株变体，其中农杆菌菌株K599(NCPPB2659)的衍生物为土传的植物致病性细菌，其特征为16S-23S rRNA基因间序列，所述基因间序列包含选自SEQ ID NO：5、6、7、8、9、10、11、12、13和14所述序列基序的至少一种序列基序。
30.权利要求26至29中任一项的非致病性菌株变体，其中所述菌株变体包含Ri质粒pRi2659或其衍生物的非致病性质粒变体。
31.权利要求30的非致病性菌株变体，其中所述非致病性质粒变体如权利要求11至18任一项所定义。
32.权利要求25至31中任一项的非致病性菌株变体，其还包含选自：存在突变或嵌合的virA或virG基因或存在超毒力质粒的一种或多种特征。
33.多肽，其包含选自以下的氨基酸序列：
a)SEQ ID NO：112所述序列或其至少200个连续氨基酸的序列，
b)与SEQ ID NO：112所述序列具有至少85％的序列同一性的序列。
34.多肽，其包含选自以下的氨基酸序列：
a)SEQ ID NO：25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39、40、41、42、43、44、45、46、47、48、49、50、51、52、53、54、55、56、57、58、59、60、61、62、63、64、65、66、67、68、69、70、71、72、73、74、75、76、77、78、79、80、81、82、83、84、85、86、87、88、89、90、91、92、93、94、95、96、97、98、99、100、101、102、103、104、114、115、116、117、118、119、120、121、122、123、124、126、128、129、130、131、132、133、134、136、137、139、140、142、143、144、145、146、147、148、149、150、151、152、154、155、156、158、159、161、162、163、164、165、166、167、168、169、170、171、172、173、174、175、176、177、178、179、180、181、182、183、184、185、186或187中任一项所述的序列或其至少200个连续氨基酸的序列，
b)与SEQ ID NO：25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39、40、41、42、43、44、45、46、47、48、49、50、51、52、53、54、55、56、57、58、59、60、61、62、63、64、65、66、67、68、69、70、71、72、73、74、75、76、77、78、79、80、81、82、83、84、85、86、87、88、89、90、91、92、93、94、95、96、97、98、99、100、101、102、103、104、114、115、116、117、118、119、120、121、122、123、124、126、128、129、130、131、132、133、134、136、137、139、140、142、143、144、145、146、147、148、149、150、151、152、154、155、156、158、159、161、162、163、164、165、166、167、168、169、170、171、172、173、174、175、176、177、178、179、180、181、182、183、184、185、186或187中任一项所述的序列具有至少85％序列同一性的序列。
35.核苷酸序列，其包含编码权利要求33或34的多肽的序列。
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