CN101208432B

CN101208432B - 用于制备经稳定转化的、能育的玉米植物的改良方法

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Publication number: CN101208432B
Application number: CN2006800227324A
Authority: CN
Inventors: J·彭; P·穆拉比特; C·巴格雷; Z·王; L·曼金; B·塞恩; F-M·赖; K·梅; H·张; L·内阿
Original assignee: BASF Plant Science GmbH
Current assignee: BASF Plant Science GmbH
Priority date: 2005-06-23
Filing date: 2006-06-22
Publication date: 2013-03-13
Anticipated expiration: 2026-06-22
Also published as: EP2159289A2; CA2612445A1; US7994399B2; WO2006136596A2; AU2006260924A1; ATE495265T1; BRPI0612671A2; DE602006019588D1; AU2006260924B2; WO2006136596A3; EP1896594A2; EP1896594B1; US20090249514A1; EP2159289A3; CN101208432A

Abstract

本发明涉及改良的方法，所述方法借助于农杆菌介导的转化将DNA掺入玉米植物基因组中。优选的是以专利保藏号PTA-6170和PTA-6171保藏于美国典型培养物保藏中心的玉米株系的用途。

Description

用于制备经稳定转化的、能育的玉米植物的改良方法

背景技术

技术领域

本发明涉及借助于农杆菌(Agrobacterium)介导的转化将DNA整合进玉米(Zea mays)植物基因组中的改良方法。

相关领域描述

在过去十年中，通过重组DNA技术将基因从大范围的生物转移至农作物成为可能。该进步提供了大量机会来改良植物对害虫、疾病和除草剂的抗性并且修饰生物合成过程以改变植物产品的质量。然而，对多数单子叶植物物种(包括玉米)而言，引入外源DNA的有效转化方法的可用性仍然是重大的障碍。

已经有许多方法尝试转化单子叶植物，其中“生物射弹”是最广泛使用的转化方法。在“生物射弹”(微粒介导的DNA递送)方法中，微粒颗粒用DNA包被，并通过机械装置加速到足够穿透植物细胞壁和细胞核的速度(WO 91/02071)。外源DNA掺入到宿主DNA并产生经转化的细胞。“生物射弹”方法存在许多变通方案(Sanford 1990；Fromm 1990；Christou 1988；Sautter 1991)。该方法已被用于产生稳定转化的单子叶植物，包括稻和玉米(Christou 1991；Gordon-Kamm 1990；Vasil 1992，1993；Wan 1994；Sommers 1992)。然而，即使使用最新的改良，仍然需要4到6个月来恢复转基因植物(Weeks 1993；Vasil 1992，1993；Becker 1994，Rasco-Gaunt2001)。微粒介导的DNA递送带来大量问题，例如在整合前DNA频繁断裂、在转录及非转录染色体区中随机整合、待转化序列优先是多插入、复杂的整合模式、包括选择性标记基因的主链序列整合在相同的基因座。另外，微粒介导的植物转化通常基于依赖于基因型的细胞培养方法，这常常需要通过耗时的回交将转基因二次转移进优良育种材料的背景中。

基于原生质体的方法已主要用于稻中，其中DNA通过脂质体、PEG或电穿孔递送给原生质体(Shimamoto 1989；Datta 1990b)。可从多种组织分离原生质体，但是通常需要使用细胞壁降解酶。认为很可能细胞壁降解酶的使用能够抑制随后的再生过程。另外，多数基于原生质体的方法需要建立长期的胚胎发生悬浮培养物。由于长期悬浮培养中的体细胞克隆变异，来自原生质体的一些再生物是不育和表型异常的(Davey 1991；Rhodes1988)。通过电穿孔的转化涉及使用短、高压电场在细胞膜上产生“孔”，DNA通过所述孔被摄取。该方法已被用于生产经稳定转化的单子叶植物(Paszkowski 1984；Shillito 1985；Fromm 1986)，特别是从稻生产(Shimamoto 1989；Datta 1990b；Hayakawa 1992)。

已报导用于转化单子叶植物的大量其他方法，包括例如“花粉管方法”(WO 93/18168；Luo 1988)、将DNA大量注射进花分蘖中(Du 1989；De laPena 1987)、将农杆菌注射进发育中的颖果(WO 00/63398)和在DNA溶液中组织培养种子(T

pfer 1989)。WO 94/00583中公开了在胚胎发生开始时直接将外源DNA注射进受精的植物胚珠中。

尽管农杆菌介导的基因转移广泛应用于双子叶植物，但是适应单子叶植物中的应用长期令人失望。存在若干文献的报导，所述文献陈述了单子叶植物的农杆菌转化(例如讨论过的WO 94/00977)。特别是Gould 1991；Mooney 1991；和Raineri 1990的方法，其陈述了玉米、稻和小麦的农杆菌转化。这些方法中存在一些基因转移的证据，但是它们缺乏关于转移效率、再现性的令人信服的证据和基因转移的证明(Potrykus 1990)，并且当产生植物时缺乏转基因在后代中遗传的证据。在Gould的工作(其中存在经转化植物的证据)中，不存在基因的孟德尔式遗传。Hiei等(1994)的尝试说明转基因稻植物可以根据农杆菌介导的转化获得，但是使用的具体细菌菌株和细菌载体的选择对于成功获得转基因是关键性的。Ishida等(1996)的文章指出，可能通过将不成熟胚与根癌农杆菌(A.tumefaciens)共培养来高效转化玉米。在稻和玉米转化的报导中，使用含有virB、virC和virG基因额外拷贝的超二元载体pTOK233达成高效转化。WO 95/06722和EP-A1 672752公开了使用不成熟胚的盾片与根癌农杆菌转化单子叶植物的方法，所述不成熟胚未经过去分化处理。EP-A1 0 709 462描述了用于转化单子叶植物的方法，其中改良在于在没有选择装置的共培养步骤后包含一天的恢复周期。

尽管本领域已知的方法(特别是WO 95/06722中提供的方法)提供了用于制备转基因玉米植物的方法，但是所有这些方法仍然是耗时费力的。特别是当需要建立大量转基因植物时(例如在基于基因组学的筛选方法中，所述方法需要构建数百到数千个不同的转基因植物)，效率具有非常高的商业重要性。

因此，本发明的目的在于提供用于转化玉米植物的改良的、有效的方法，使用所述方法从转化时到获得再生植物的时间短于常规方法。该目的通过本发明达到。

发明概述

因此，本发明的第一个实施方案涉及用于制备转基因玉米植物的方法，所述方法包括步骤：

a.分离玉米植物的不成熟胚，和

b.用共培养培养基将所述分离的不成熟胚与包含一个转基因T-DNA且属于根瘤菌科(Rhizobiaceae)属的土传细菌共培养，所述不成熟胚未进行去分化处理，所述T-DNA至少包含一个选择性标记基因，和

c.将共培养的不成熟胚转移至恢复培养基，所述恢复培养基包含

i.有效量的至少一种抗生素，其抑制或阻抑土传细菌生长，和

ii.浓度从约1g/l到约10g/l的L-脯氨酸，和

iii.浓度从约1μM到约50μM的硝酸银，和

iv.有效量的至少一种生长素化合物，

但是不含有效量的毒害植物的选择剂，和

d.诱导胚性愈伤组织形成，并在培养基上选择转基因愈伤组织，所述培养基包含：

i.有效量的至少一种生长素化合物，和

ii.有效量的选择剂，所述选择剂允许选择包含转基因T-DNA的细胞，和

e.从所述转基因愈伤组织再生并选择植物，所述植物含有转基因T-DNA。

不成熟的胚优选来自近交、杂种、(优选不同)近交之间的F1、近交和杂种之间的F1、近交和自然传粉变种之间的F1、市售F1变种、前述变种和前述任何后代之间杂交或自花传粉的任何F2。

优选，不成熟胚分离自(HiIIA×A188)杂种与近交系的杂交，所述近交系的代表性种子已根据布达佩斯条约以专利保藏号(Patent DepositDesignation)PTA-6170(株系BPS553的种子)和PTA-6171(株系BPS631的种子)保藏于美国典型培养物保藏中心(Manasses，VA 20110-2209，美国)。

在优选的实施方案中，不成熟胚是处于传粉后不少于2天阶段中的胚。优选不成熟胚在共培养培养基中直接分离和制备，不经额外的洗涤步骤。优选，将不成熟胚进行转化(共培养)，而不经去分化预处理。可任选用酶或损伤处理不成熟胚。从温室收集的穗(ear)上切下并保存于约4℃冰箱中最多10天的胚仍然可转化。

优选，土传细菌是属于农杆菌科的细菌，更优选属于卸甲(disarmed)根癌农杆菌或毛根农杆菌(Agrobacterium rhizogenes)的菌株。在另一优选的实施方案中，土传细菌是毛根农杆菌菌株K599(NCPPB 2659)的卸甲菌株变体。这类菌株描述于2004年9月2日提交的美国临时申请申请号No.60/606789中，其在本文完整引入作为参考。

在用于感染和共培养步骤的另一优选的实施方案中，将共培养培养基或感染培养基中的土传细菌(例如农杆菌)的悬液直接用于每个胚，除去覆盖在胚上的多余液体。可通过多种手段完成除去，优选通过空气干燥或吸收。在优选的实施方案中，使用从约1到约10μl的土传细菌(例如农杆菌)悬液。优选直接在共培养的培养基上用农杆菌感染不成熟胚。优选使用10⁶到10¹¹CFU/ml浓度的细菌(cfu：菌落形成单位)。

优选在共培养中使用的培养基含有约1μM到约10μM的硝酸银和约50mg/L到约1,000mg/L的L-半胱氨酸。

在优选的实施方案中，选择步骤在单个选择步骤中完成，不经中间组织转移。

在另一优选的实施方案中，将再生步骤产生的生根小植株直接转移至土壤培养基中。

本发明另一优选的实施方案涉及通过将(HiIIA×A188)杂种与选自以下的近交系杂交获得的玉米植物，所述近交系的代表性种子根据布达佩斯条约，以专利保藏号PTA-6170(株系BPS553的种子)和PTA-6171(株系BPS631的种子)保藏于美国典型培养物保藏中心(Manasses，VA20110-2209，美国)。

优选，所述玉米植物是转基因的(例如包含转基因T-DNA)。本发明的其他目的涉及所述玉米植物的后代(例如近交系)、由所述后代产生的近交或杂种植物以及前述植物的部分。这类部分可包括，但不仅限于组织、细胞、花粉、胚珠、根、叶、种子、小孢子和营养性部分。

本发明的另一实施方案涉及用于随后将至少两种DNA构建体转化进植物中的方法，所述方法包括步骤：

a)用第一构建体进行第一转化并选择抗咪草烟的植物，所述构建体包含第一突变的ahas选择性标记基因，所述第一基因赋予对咪草烟(imazethapyr)的抗性以及对灭草喹(imazaquin)的敏感性，和

b)用第二构建体进行第二转化并选择抗灭草喹的植物，所述构建体包含第二突变的ahas选择性标记基因，所述第二基因赋予对咪草烟和灭草喹二者的抗性。

优选所述第一基因为XI12 ahas突变基因和/或其中所述第二基因为XA17 ahas突变基因。更优选所述植物为玉米植物。

本发明的另一实施方案涉及植物细胞或植物，其包含

a)第一突变的ahas选择性标记基因，所述第一基因赋予对咪草烟的抗性以及对灭草喹的敏感性，和

b)第二突变的ahas选择性标记基因，所述第二基因赋予对咪草烟和灭草喹二者的抗性。

优选所述第一基因为XI12 ahas突变基因和/或其中所述第二基因为XA17 ahas突变基因。更优选所述第一和所述第二基因为转基因。植物优选为玉米植物。

一般定义

应当理解本发明不限于如此所述的任何具体的方法、方案、细胞系、植物种或属、构建体和试剂。还应当理解本文使用的命名法仅用于描述具体实施方案的目的，并不旨在限制本发明的范围，本发明的范围仅由附带的权利要求书限制。必须注意本文中和附带的权利要求书中所使用的单数形式包括复数参考，除非上下文以其他方式明确指出。因此，例如关于“载体”是指一种或多种载体，并包括本领域技术人员已知的其等价物，等等。

术语“约”在本文中使用是指近似地、粗略地、左右或在范围内。当术语“约”与数值范围结合使用时，其通过扩大所公开数值的上限和下限修饰该范围。通常，术语“约”在本文中用于修饰所述值之上或之下的数值，变化为之上或之下(高于或低于)百分之二十。

如本文所用的，词语“或”是指具体列表中任一成员，也包括该列表成员的任意组合。

术语“核酸”是指单链或双链、有义或反义形式的脱氧核糖核苷酸或核糖核苷酸，及其多聚体或杂交体。

除非另有说明，具体的核酸序列也暗中包括其保守修饰的变体(例如简并密码子取代)和互补序列，以及明确指出的序列。术语“核酸”在本文中与“基因”、“cDNA”、“mRNA”、“寡核苷酸”和“多核苷酸”可互换使用。

如本文所用的，短语“核酸序列”是指代表核苷酸的缩写、字母、字符或词语的连续列表。在一个实施方案中，核酸可以是“探针”，其为相对短的核酸，通常少于100个核苷酸长。核酸探针通常从约50个核苷酸长到约10个核苷酸长。核酸的“靶区”是指被鉴定为感兴趣的核酸部分。核酸的“编码区”是指当位于适当调节序列调控下时以序列特异的方式被转录和翻译，以产生特定多肽或蛋白质的核酸部分。编码区被指为编码此类多肽或蛋白质。

术语“反义”理解为是指具有与靶序列互补的序列的核酸，例如信使RNA(mRNA)序列，其表达的封闭被认为是由与靶序列杂交引起的。

术语“有义”理解为是指具有与靶序列同源或相同的序列的核酸，例如与蛋白质转录因子结合的序列和参与给定基因表达的序列。根据优选的实施方案，核酸包含目的基因和允许所述目的基因表达的元件。

术语“基因”是指有效连接到适当调节序列的编码区，所述调节序列能够以一些方式调节多肽的表达。基因包括编码区(开放阅读框，ORF)之前(上游)和之后(下游)的DNA非翻译调节区(例如启动子、增强子、抑制子等)，以及根据需要，包括单个编码区(即外显子)之间的插入序列(即内含子)。

当涉及结构基因使用时，如本文所用的术语“编码区”是指编码新生多肽中存在的氨基酸的核苷酸序列，所述新生多肽是mRNA分子翻译的结果。在真核生物中，编码区界限为5’侧的核苷酸三联体“ATG”(其编码起始子甲硫氨酸)和3’侧定义为终止密码子的三个三联体(即TAA、TAG、TGA)之一。除含有内含子之外，基因的基因组形式也可包含位于序列5’和3’两端的序列，其存在于RNA转录物中。这些序列被称为“侧翼”序列或区域(这些侧翼序列位于mRNA转录物上存在的未翻译序列的5’或3’)。5’侧翼区可含有调控或影响基因转录的调节序列，如启动子和增强子。3’侧翼区可含有指导转录终止、转录后切割和多聚腺苷酸化的序列。

术语“多肽”、“肽”、“寡肽”、“多肽”、“基因产物”、“表达产物”和“蛋白质”在本文可互换使用，是指连续氨基酸残基的多聚体或寡聚体。

如本文所用的术语“分离的”是指材料从其最初环境中被取出。例如，存在于生活动物中的天然存在的多核苷酸或多肽未被分离，但是从天然体系中一些或全部共存材料中分离的相同多核苷酸或多肽是被分离的。这类多核苷酸可以是载体的部分和/或这类多核苷酸或多肽可以是组合物的部分，只要这类载体或组合物不是其最初环境的部分，就应当是分离的。

就生物、多肽或核酸序列而言，术语“野生型”、“天然”或“天然来源的”是指所述生物是天然存在的，或可来自至少一种天然存在的未被人改变、突变或以其他方式操作的生物。

本文(例如关于玉米植物或植物细胞)所用术语“转基因的”或“重组的”旨在指具有掺入的外源基因或DNA序列的细胞和/或植物，所述外源基因或DNA序列包括但不仅限于可能通常不存在的基因或DNA序列、在给定的细胞类型中通常不转录或翻译(“表达”)的基因，或期望引入未转化细胞和/或植物中的任何其他基因或DNA序列，如通常可存在于未转化细胞和/或植物中但是期望其表达改变的基因。

优选，关于例如核酸序列(或包含所述核酸序列的生物、表达盒或载体)的术语“转基因的”或“重组的”是指通过重组方法产生的所有构建体，其中任一

a)所述核酸序列，或

b)与所述核酸序列a)有效连接的遗传调控序列，例如启动子，或

c)a)和b)

不位于其天然的遗传环境中，或已通过重组方法被修饰，修饰的实例为取代、添加、删除、倒位或插入一个或多个核苷酸残基。天然遗传环境是指来源生物中的天然染色体基因座，或指基因组文库中的存在。在基因组文库的情况下，核酸序列的天然遗传环境优选是固定的，至少是部分固定的。该环境至少位于核酸序列一侧的侧翼，并具有至少50bp，优选至少500bp，特别优选至少1000bp，非常特别优选至少5000bp长度的序列。当通过非天然的、合成的“人造”方法(例如诱变)修饰时，天然存在的表达盒(例如启动子与相应基因的天然存在的组合)成为重组表达盒。这类方法已被描述(US 5,565,350；WO 00/15815)。优选，如本文所用的关于核酸的术语“重组的”是指核酸与另一核酸共价联结并相邻，在所述核酸的天然环境中所述另一核酸不与之相邻。“重组的”多肽或蛋白质是指通过重组DNA技术产生的多肽或蛋白质，即从用外源重组DNA构建体转化的细胞产生，所述构建体编码目的多肽或蛋白质。重组核酸和多肽也可包含下述分子，所述分子同样不存在于天然中，而是被人修饰、改变、突变或以其他方式操作。

“重组多肽”是在序列上与天然存在的多肽有至少一个氨基酸残基差异的非天然存在多肽。用于生产所述重组多肽和/或核酸的优选方法可包括直接或非直接诱变、DNA混编或循环重组(recursive recombination)的其他方法。

术语“异源核酸序列”或“异源DNA”可交换使用，是指与另一核酸序列连接的核苷酸序列，所述另一核酸序列与所述核苷酸序列天然不相连或天然中在不同位置相连。异源DNA对其被引入的细胞而言不是内源的，而是得自另一细胞。尽管并非必须，但是通常这类异源DNA编码下述RNA和蛋白质，所述RNA和蛋白质通常不由其被表达进入其中的细胞产生。

可以通过在标准(即根据与外源DNA接触的细胞数量、经递送的DNA数量、DNA递送类型和条件、一般培养条件等经标准化或规格化的)实验条件下恢复的经转化细胞(或从个体经转化细胞长成的转基因生物)的数量测量本文所使用的“转化效率”或“转化频率”。例如，当使用经分离的不成熟胚作为转化起始材料时，转化的频率可以被表示为每100个被转化的分离的不成熟胚所获得的转基因植物株系数量。

术语“一个细胞”是指单个细胞。术语“多个细胞”是指细胞群体。种群可以是包含一种细胞类型的纯种群。类似地，种群可包含多于一种细胞类型。在本发明中，不限制细胞群体可包含的细胞类型数。细胞可以是经同步化的或未经同步化的，优选细胞是经同步化的。

术语“染色体DNA”或“染色体DNA序列”理解为与细胞周期状态无关的细胞核基因组DNA。因此，染色体DNA可以被组织为染色体或染色单体，它们可以是浓缩的或解螺旋的。进入染色体DNA的插入可以通过本领域已知的多种方法证明和分析，例如PCR分析、Southern印迹分析、荧光原位杂交(FISH)和原位PCR。

如本文所用的术语“结构基因”旨在表示被转录为mRNA，然后翻译为由特异多肽表征的氨基酸序列的DNA序列。

术语“表达”是指基因产物的生物合成。例如，在结构基因的情况下，表达涉及结构基因转录为mRNA，和任选地涉及mRNA随后翻译为一种或多种多肽。

术语“转化”包括将遗传材料引入植物细胞，优选导致染色体整合和通过减数分裂的稳定遗传。转化也包括将遗传材料以参与表染色体复制(epichromosomal replication)和基因表达的植物病毒载体的形式引入植物细胞，所述植物病毒载体可以表现出与减数分裂稳定性相关的不同性质。

如本文所用的术语“表达盒”或“表达构建体”旨在表示待表达的任何核酸序列与启动子序列和任选地额外元件(例如终止子和/或多聚腺苷酸化序列)有效连接的组合，所述额外元件促进所述核酸序列的表达。

如本文所用的术语“启动子”旨在表示指导DNA序列(例如结构基因)转录的DNA序列。通常启动子位于基因的5’区，接近结构基因的转录起始位点。如果启动子是诱导型启动子，则转录速率响应诱导剂而提高。相反，如果启动子是组成型启动子，则转录速率不受诱导剂的调节。启动子也可以以组织特异或组织优选的模式被调节，因此仅在特定组织类型如叶、根或分生组织中对转录相关编码区是有活性的。

术语“有效地连接”或“有效地连接的”应当理解为表示例如调节元件(例如启动子)与待表达的核酸序列，以及根据需要其他调节元件(如例如终止子)以下述方式顺序排列：各调节元件能够实现其预期的功能来允许、修饰、促进或以其他方式影响所述核酸序列的表达。表达可根据与有义和反义RNA相关的核酸序列的排列而产生。为此，不必须要求化学意义上的直接连接。遗传调控序列(例如增强子序列)也可对来自远处位置的靶序列或实际上来自其他DNA分子的靶序列发挥其作用。优选的排列为下述排列，所述排列中待重组表达的核酸序列位于作用为启动子的的序列之后，使得两个序列彼此共价连接。启动子序列和待重组表达的核酸序列之间的距离优选为少于200碱基对，特别优选少于100碱基对，非常特别优选少于50碱基对。有效的连接和表达盒可以借助于常规重组和克隆技术(例如如Maniatis 1989；Silhavy 1984；Ausubel 1987；Gelvin 1990中所述)来产生。然而，也可将其他序列(例如作用为限制性酶特异切割位点接头的序列)置于两个序列之间。序列的插入也可导致融合蛋白质的表达。优选，由启动子和待表达核酸序列连接组成的表达盒可以以整合的载体形式存在，并可以通过例如转化被插入植物基因组。

发明详述

本发明的一个实施方案涉及用于制备转基因玉米植物的方法，其包括步骤

a.分离玉米植物的不成熟胚，和

b.用共培养培养基将所述分离的不成熟胚与属于根瘤菌属的土传细菌共培养，所述不成熟胚未进行去分化处理，所述土传细菌至少包含一个转基因T-DNA，所述T-DNA至少包含一个选择性标记基因，和

ii.浓度从约1g/l到约10g/l的L-脯氨酸，和

iii.浓度从约1μM到约50μM的硝酸银，和

iv.有效量的至少一种生长素化合物，

但是不含有效量的毒害植物的选择剂，和

i.有效量的至少一种生长素化合物，和

ii.有效量的选择剂，所述选择剂允许选择包含转基因细胞，和

1.不成熟胚的来源和制备

不成熟胚实际上可以从任何玉米变体或植物分离。

不成熟胚优选来自近交、杂种、(优选不同)近交之间的F1、近交和杂种之间的F1、近交和自然传粉变种之间的F1、市售F1变种、前述变种和前述任何后代之间杂交或自花传粉的任何F2。

前述株系和杂交的雄性和雌性亲本的所有组合均包括在内。合适的玉米变体包括但不仅限于P3732、A188、H84、B37Ht、Mo17Ht、W117Ht、Oh43、H99、W64A Ht rhm、F1(A188×Black Mexican Sweet)、F1(A188×B73Ht)、F1(B73Ht×A188)、F1(H84×A188)、F1(Mo17Ht×A188)和F1(C103×A188)。可从保藏所如美国典型培养物保藏中心(ATCC)和本领域已知用于种子材料的其他保藏所获得作为种子的这类变体。

更优选，不成熟胚分离自F1或F2(HiIIA×A188)植物与近交系的杂交。

玉米基因型HiIIAxA188的F1种子可以优选通过将HiIIA(雌性亲本)与近交系A188(雄性)杂交产生，并种植在温室中作为花粉供体。(HiIIAxA188)的F2种子通过F1(HiIIAxA188)植物在温室或大田中的自花传粉产生，并种植在温室中作为花粉供体。

用于同F1或F2(HiIIA×A188)植物杂交的最优选的近交系为选自以下的株系，所述株系的代表性种子已按照布达佩斯条约，以专利保藏号PTA-6170(株系BPS553的种子)和PTA-6171(株系BPS631的种子)保藏于美国典型培养物保藏中心(Manasses，VA 20110-2209，美国)。

BPS553×(HiIIA×A188)或BPS631×(HiIIA×A188)的杂种不成熟胚优选使用近交系BPS553或BPS631作为雌性亲本，F1或F2(HiIIA×A188)植物作为雄性亲本，在温室中产生。单独与本领域已知为最佳可转化玉米材料之一的(HiIIA×A188)不成熟胚(Ishida等1996，Frame等2002)相比，这些杂种不成熟胚已显示格外高的可转化性。来自(HiIIA×A188)杂种和BPS553株系之间杂交的杂种不成熟胚的可转化性至少是(HiIIA×A188)胚效率的两倍(比较参见下文实施例7)。因此，上述杂交是用于玉米转化的更好材料。

因此，本发明另一优选的实施方案涉及通过将(HiIIA×A188)杂种与选自以下的近交系杂交获得的玉米植物，所述近交系的代表性种子已按照布达佩斯条约，以专利保藏号PTA-6170(株系BPS553的种子)和PTA-6171(株系BPS631的种子)保藏于美国典型培养物保藏中心(Manasses，VA20110-2209，美国)。优选所述玉米植物是转基因的(例如包含转基因T-DNA)。本发明的其他目的涉及所述玉米植物的后代(例如近交系)、从所述后代产生的近交或杂种植物，和前述植物的部分。这类部分可包括但不仅限于组织、细胞、花粉、胚珠、根、叶、种子、小孢子和营养性部分。

用于分离不成熟胚的玉米植物如本领域已知地培养和传粉，优选如下文实施例中所述。

本文所用的术语“不成熟胚”是指处于传粉后早期发育和成熟阶段的不成熟种子的胚。待用本发明方法处理的不成熟胚的发育阶段不受限制，所收集的胚可以处于传粉后的任何阶段。优选的胚是在受精后不少于2天收集的胚。还优选的是能够诱导去分化愈伤组织的不成熟胚的盾片，所述愈伤组织在用下文所述方法转化后具有再生正常植物的能力。

在优选的实施方案中，不成熟胚是处于传粉后不少于2天阶段的胚。更优选，不成熟胚分离自在传粉后(DAP)7到14天(优选8到11天)收集的玉米植物的穗(优选长出的第一个穗)。收集的确切时间根据生长条件和玉米变种而变化。不成熟胚的尺寸是它们发育阶段的良好标志。用于转化的不成熟胚的最佳长度为约1到1.6mm，包括盾片的长度。胚应当是半透明的，而不是不透明的。

在本发明优选的实施方案中，将不成熟胚分离并直接置于固化的共培养培养基表面上，不经额外的洗涤步骤。尽管本领域所述方法均包括若干制备和洗涤步骤，但是在所述显著节约时间和成本的改良中这些步骤均被省略。在本发明中，农杆菌感染步骤在共培养培养基上发生，而不是本领域已知的在含农杆菌悬液细胞的管中发生。

优选，将不成熟胚进行转化(共培养)，不经去分化预处理。可任选用细胞壁降解酶或损伤(例如用解剖刀切割或用针穿空)处理不成熟胚。然而在本发明优选的实施方案中，该降解或损伤步骤不是必需的并被省略。

术语“去分化”、“去分化处理”或“去分化预处理”是指通过在去分化培养基上培养植物组织已分化细胞获得细胞簇(例如愈伤组织)的过程，所述细胞簇显示无组织的生长。更具体地，本文所用的术语“去分化”旨在表示在植物体范围内不具有具体功能的快速分裂细胞的形成过程。就发育为不同植物组织的能力而言，这些细胞通常具有提高的潜能。优选，该术语旨在表示分化的或特化的组织回复为更多能或全能的(例如胚性的)形式。去分化可以导致植物组织的程序重编(首先回复为未分化的、未特化的细胞，然后进入新的和不同的路径)。本文所用的术语“全能性”旨在表示含有形成完整植物所需的所有遗传和/或细胞信息的植物细胞。可以通过某些植物生长调节剂(例如生长素和/或细胞分裂素化合物)，特别是通过其某些组合和/或浓度来引发去分化。

2.共培养

用于将T-DNA转移进入不成熟胚所使用的土传细菌可以是根瘤菌科(Rhizobiaceae)的任何种。根瘤菌科包括农杆菌属、根瘤菌属(Rhizobium)、中华根瘤菌属(Sinorhizobium)，异根瘤菌属(Allorhizobium)是该细菌科中的属并根据核糖体特征包括在变形菌纲(Proteobacteria)的α-2亚纲中。该科的成员是需氧、革兰氏阴性的。细胞通常为棒状(0.6-1.0μm乘1.5-3.0μm)，单独或成对出现，无内生孢子，并能通过一到六根有缘毛的鞭毛活动。在含糖类培养基上生长时，通常产生可观的细胞外多糖黏质。特别优选的为根瘤菌科，如草木樨中华根瘤菌(Sinorhizobium meliloti)、苜蓿中华根瘤菌(Sinorhizobium medicae)、费氏中华根瘤菌(Sinorhizobiumfredii)、根瘤菌属NGR234种、根瘤菌属BR816种、根瘤菌属N33种、根瘤菌属GRH2种、黄豆中华根瘤菌(Sinorhizobium saheli)、Sinorhizobiumterangae、豌豆根瘤菌三叶草生物型(Rhizobium leguminosarum biovartrifolii)、豌豆根瘤菌蚕豆生物型(Rhizobium leguminosarum biovar viciae)、豌豆根瘤菌菜豆生物型(Rhizobium leguminosarum biovar phaseoli)、热带根瘤菌(Rhizobium tropici)、菜豆根瘤菌(Rhizobium etli)、山羊豆根瘤菌(Rhizobium galegae)、高卢根瘤菌(Rhizobium gallicum)、贾氏根瘤菌(Rhizobium giardinii)、海南根瘤菌(Rhizobium hainanense)、Rhizobiummongolense、羽扇豆根瘤菌(Rhizobium lupini)、百脉根中慢生根瘤菌(Mesorhizobium loti)、华癸中生根瘤菌(Mesorhizobium huakuii)、鹰嘴豆中慢生根瘤菌(Mesorhizobium ciceri)、Mesorhizobium mediterraneium、天山中慢生根瘤菌(Mesorhizobium tianshanense)、Bradyrhizobiumelkanni、大豆慢生根瘤菌(Bradyrhizobium japonicum)、辽宁慢生根瘤菌(Bradyrhizobium liaoningense)、氢瘤固氮根瘤菌(Azorhizobiumcaulinodans)、Allobacterium undicola、Phyllobacterium myrsinacearum、根癌农杆菌、放射形农杆菌(Agrobacterium radiobacter)、毛根农杆菌、葡萄农杆菌(Agrobacterium vitis)和悬钩子农杆菌(Agrobacterium rubi)。

农杆菌属、异根瘤菌属和根瘤菌属的单源性质和它们共同的表型属界限支持它们聚合为单一的属——根瘤菌属。农杆菌属菌株(包括根癌农杆菌和毛根农杆菌的分化)的分类和表征以及它们的多种冠瘿碱型种类是本领域公知的实践(参阅例如Laboratory guide for identification of plantpathogenic bacteria，第三版.(2001)Schaad，Jones和Chun(编)ISBN0890542635；例如其中公开的Moore等的文章)。近期的分析证明根据其植物致病特征进行分类可能是不合理的。因此，使用基于基因组分析和比较(如16S rRNA测序；RFLP；Rep-PCR等)的更先进的方法来阐明多种菌株的关系(参阅例如Young 2003、Farrand 2003、de Bruijn 1996、Vinuesa1998)。通过证明农杆菌菌株K599关系的两种方法得到的农杆菌属成员系统发生关系描述于Llob 2003(图2)。

本领域已知不仅是农杆菌，其他土传菌也能够介导T-DNA转移，只要它们具有Ti或Ri质粒的T-DNA转移的相关功能元件即可(Klein &Klein 1953；Hooykaas 1977；van Veen 1988)。

优选所述土传细菌是农杆菌属的。本文所用的术语“农杆菌”是指土传的、革兰氏阴性的、棒状的植物致病细菌。根据比较性16S rDNA分析(Sawada 1993，Young 2003)，农杆菌、根癌农杆菌(同放射形农杆菌)、毛根农杆菌、悬钩子农杆菌和葡萄农杆菌的种与Allorhizobium undicola一起形成含所有根瘤菌属物种的单源群。农杆菌是包含植物致病种的人造属。

本文所用的术语Ti质粒是指下述质粒，所述质粒在农杆菌中能够复制，并且在被农杆菌感染的植物中天然是介导根癌的“有甲”形式。用农杆菌Ti质粒的天然、“有甲”形式感染植物细胞通常导致被感染的细胞产生冠瘿碱(例如胭脂碱、农杆碱、章鱼碱等)。因此，引起胭脂碱产生的农杆菌菌株(例如菌株LBA4301、C58、A208)被称作“胭脂碱型”农杆菌；引起章鱼碱产生的农杆菌菌株(例如菌株LBA4404、Ach5、B6)被称作“章鱼碱型”农杆菌；引起农杆碱产生的农杆菌菌株(例如菌株EHA105、EHA101、A281)被称作“农杆碱型”农杆菌。卸甲Ti质粒理解为缺乏其根癌介导特征但是以其他方式提供植物感染功能的Ti质粒。优选，所述“卸甲”质粒的T-DNA区域以下述方式修饰：除了边界序列外，没有功能性内部Ti序列可以被转移进植物基因组。在优选的实施方案(与二元载体体系使用时)中，缺失了整个T-DNA区(包括T-DNA边界)。

本文所用的术语Ri质粒是指下述质粒，所述质粒在农杆菌中能够复制，并且在被农杆菌感染的植物中天然是介导发根病的“有甲”形式。用农杆菌Ri质粒的天然、“有甲”形式感染植物细胞通常引起被感染细胞产生冠瘿碱(由被转化植物细胞产生的特异氨基糖衍生物，例如农杆碱、黄瓜碱、章鱼碱、mikimopine等)。毛根农杆菌菌株传统上以与根癌农杆菌菌株相同的方式被区分为亚类。最常见的菌株是农杆碱型菌株(例如由Ri质粒pRi-A4所表征的)、甘露碱型菌株(例如由Ri质粒pRi8196所表征的)和黄瓜碱型菌株(例如由Ri质粒pRi2659所表征的)。一些其他菌株是mikimopine型的(例如由Ri质粒pRi1723所表征的)。Mikimopine和黄瓜碱是立体异构体，但是在核苷酸水平上未发现pRi质粒间的同源性(Suzuki2001)。卸甲Ri质粒被理解为缺乏其发根病介导特征，但是以其他方式提供植物感染功能的Ri质粒。优选，所述“卸甲”Ri质粒的T-DNA区域以下述方式被修饰：除了边界序列外，没有功能性内部Ri序列可以被转移进植物基因组。在优选的实施方案(当与二元载体体系使用时)中，缺失了整个T-DNA区(包括T-DNA边界)。

根癌农杆菌和毛根农杆菌的Ti和Ri质粒分别带有负责植物遗传转化的基因(Kado 1991)。载体以农杆菌Ti或Ri质粒为基础，并利用天然体系将DNA转移进入植物基因组。作为该高度发达寄生的一部分，农杆菌将其基因组信息的指定部分(T-DNA；侧翼为约25bp的重复，称作左边界和右边界)转移进植物细胞的染色体DNA(Zupan 2000)。通过所谓的vir基因(原始Ti质粒的部分)的组合作用介导了所述DNA转移。为了利用该天然体系，开发了缺乏原始肿瘤诱导基因的Ti质粒(“卸甲载体”)。在进一步的改良——所谓的“二元载体体系”——中，通过整合进入穿梭载体将T-DNA从Ti质粒的其他功能元件(例如vir基因)物理分离，这允许更容易地操作(EP-A 120 516；US 4.940.838)。这些二元载体(除卸甲T-DNA及其边界序列外)包含用于在农杆菌和大肠杆菌(E.coli)二者中复制的原核序列。农杆菌介导的转化的一个优点在于通常只有被边界包围的DNA被转移进基因组中，且优选只有一个拷贝被插入。农杆菌载体体系和用于农杆菌介导的基因转移的方法的描述是本领域已知的(Miki 1993；Gruber 1993；Moloney1989)。

因此，对农杆菌介导的转化而言，遗传组合物(例如包含表达盒)被整合进特定的质粒(穿梭质粒或中间体质粒)中或二元载体中。如果要将Ti或Ri质粒用于转化，则至少Ti或Ri质粒T-DNA的右边界(但是大部分情况下是右边界和左边界)与要以侧翼区形式被引入的表达盒连接。优选使用二元载体。二元载体能够在大肠杆菌和农杆菌二者中复制。它们可包含选择性标记基因和侧翼被右和左T-DNA边界序列包围的接头或多聚接头(用于插入例如待转移的表达盒)。它们可以被直接转移进农杆菌(Holsters 1978)。选择性标记基因允许选择经转化的农杆菌，并且是例如赋予卡那霉素抗性的nptII基因。在该情况下起宿主生物作用的农杆菌应当已经包含具有vir区的质粒。后者是将T-DNA转移至植物细胞所需的。以这种方式转化的农杆菌可用于转化植物细胞。T-DNA用于转化植物细胞的用途已被深入地研究并描述(EP 120 516；Hoekema 1985；An 1985)。

常见的二元载体是以“广宿主泛围”质粒为基础的，如来自P型质粒RK2的pRK252(Bevan 1984)或pTJS75(Watson 1985)。大部分这类载体是pBIN19(Bevan 1984)的衍生物。多种二元载体是已知的，其中一些可以商业获得，例如pBI101.2或pBIN19(Clontech Laboratories，Inc.美国)。其他的载体是根据尺寸和操作进行了改良的(例如pPZP；Hajdukiewicz1994)。改良的载体体系也描述于WO 02/00900。

优选土传细菌是属于农杆菌科的细菌，更优选属于卸甲根癌农杆菌或毛根农杆菌菌株。在优选的实施方案中，用于本发明实践的农杆菌菌株包括章鱼碱菌株(例如LBA4404)或农杆碱菌株(例如EHA101或EHA105)。用于DNA转移的合适根癌农杆菌菌株是例如EHA101pEHA101(Hood1986)、EHA105[pEHA105](Li 1992)、LBA4404[pAL4404](Hoekema1983)、C58C1[pMP90](Koncz & Schell 1986)和C58C1[pGV2260](Deblaere 1985)。其他合适的菌株是根癌农杆菌C58——一种胭脂碱菌株。其他合适的菌株是根癌农杆菌C58C1(Van Larebeke 1974)、A136(Watson1975)或LBA4011(Klapwijk 1980)。在另一优选的实施方案中，土传细菌是毛根农杆菌菌株K599的卸甲菌株变体(NCPPB 2659)。这类菌株描述于2004年9月2日提交的美国临时申请申请号No.60/606789，其在本文引用作为参考。

优选，这些菌株包含Ti或Ri质粒的卸甲质粒变体，其提供将T-DNA转移进入植物细胞所需的功能(例如vir基因)。在优选的实施方案中，用于转化植物组织的农杆菌菌株含有L，L-琥珀碱型Ti质粒(优选卸甲的，例如pEHA101)，所述植物组织用植物酚化合物预培养。在另一优选的实施方案中，用于转化植物组织的农杆菌菌株含有章鱼碱型Ti质粒(优选卸甲的，例如pAL4404)，所述植物组织用植物酚化合物预培养。一般地，当使用章鱼碱型Ti质粒或辅助质粒时，优选virF基因被缺失或灭活(Jarschow1991)。

本发明的方法也可与特定的农杆菌菌株结合使用以进一步提高转化效率，如下述农杆菌菌株，所述农杆菌菌株中因为存在突变或嵌合的virA或virG基因而改变了vir基因表达和/或其诱导(例如Hansen 1994；Chen和Winans 1991；Scheeren-Groot，1994)。优选为根癌农杆菌菌株LBA4404(Hiei 1994)与超毒性质粒的进一步结合。优选这些是基于pTOK246的载体(Ishida 1996)。

二元载体或任何其他载体可通过常见的DNA重组技术修饰，在大肠杆菌中扩增，并通过例如电穿孔或其他转化技术(Mozo 1991)引入农杆菌。

以与Ishida(Ishida 1996)中描述相似的方式培养并使用农杆菌。含载体的农杆菌菌株可例如在补充有合适抗生素(例如50mg/l壮观霉素)的YP培养基(5g/l酵母提取物、10g/l蛋白胨、5g/l NaCl、15g/l琼脂，pH 6.8)上生长3天。用接种环从固体培养基上收集细菌并将其重悬。在本发明优选的实施方案中，通过使用冻存于-80℃的等分式样开始农杆菌培养。

通过农杆菌转化不成熟胚可以通过仅将不成熟胚与农杆菌接触完成。用于感染和共培养的农杆菌浓度可能需要变化。例如，制备具有约10⁵到10¹¹，优选10⁶到10¹⁰，更优选约10⁸细胞或cfu/ml种群密度的农杆菌细胞悬液，将不成熟胚浸没入该悬液中大约3到10分钟。然后将得到的不成熟胚在固体培养基上与农杆菌一同培养数天。

在用于感染和共培养步骤的另一优选实施方案中，将共培养或感染培养基中的土传细菌(例如农杆菌)的悬液直接应用于每个胚，去除覆盖胚的多余液体量。可通过多种方式进行去除，优选通过晾干或吸干。这是省力省时的，并且降低由多余农杆菌使用造成的非故意的农杆菌介导的损伤。在优选的实施方案中，使用从约1μl到约10μl的土传细菌(例如农杆菌)悬液。优选，用农杆菌直接在共培养基上感染不成熟胚。优选，使用10⁶到10¹¹cfu/ml浓度的细菌。

为了用农杆菌处理分离的不成熟胚，将细菌重悬于植物适用的共培养培养基中。向共培养培养基中补充抗氧化剂(例如硝酸银)、吸收酚的化合物(如聚乙烯吡咯烷酮，Perl 1996)或硫醇基化合物(例如二硫苏糖醇、L-半胱氨酸，Olhoft 2001)可进一步促进农杆菌介导的转化的效率，补充的所述化合物能够降低由植物防御反应(如酚氧化)引起的组织坏死。在另一优选的实施方案中，共培养培养基由至少一种硫醇基化合物组成，所述硫醇基化合物优选选自硫代硫酸钠、二硫苏糖醇(DTT)和L-半胱氨酸。优选浓度在约1mM和10mM的L-半胱氨酸之间，0.1mM到5mM的DTT和/或0.1mM到5mM的硫代硫酸钠。优选，共培养中使用的培养基包含从约1μM到约10μM的硝酸银和从约50mg/L到约1,000mg/L的L-半胱氨酸。这导致不成熟胚针对农杆菌介导的损伤(例如诱导的坏死)易损性高度降低，并高度提高整体转化效率。

可使用从数小时到7天的共培养周期范围。农杆菌与分离的不成熟胚一起共培养通常进行从约12小时到约5天，优选从约1天到约3天。

在本发明的改良实施方案中，可在农杆菌共培养之前或期间用酚化合物处理分离的不成熟胚和/或农杆菌。适用于本发明范围的“植物酚化合物”或“植物酚”是能够诱导正向趋化应答的经分离的取代酚分子，特别是在含Ti质粒的农杆菌属物种(特别是含Ti质粒的根癌农杆菌)中能够诱导提高的vir基因表达的那些。测量对植物酚化合物趋化反应的方法已被描述(Ashby1988)，测量vir基因表达诱导的方法也是公知的(Stachel 1985；Bolton1986)。农杆菌共培养期间的预处理和/或处理至少具有两个有益效应：诱导Ti质粒或辅助质粒的vir基因(Van Wordragen 1992；Jacq 1993；James1993；Guivarc′h 1993)，和增强外源DNA掺入进植物细胞基因组中的感受态。

优选的植物酚化合物是在植物细胞伤口渗出物中发现的那些。最公知的植物酚化合物之一为乙酰丁香酮，其存在于多种植物的大量受伤和完整细胞中，虽然浓度不同。然而，乙酰丁香酮(3，5-二甲氧基-4-对羟基苯乙酮)不是能够诱导vir基因表达的唯一植物酚。其他实例为α-羟基-乙酰丁香酮、芥子酸(3，5-二甲氧基-4-羟基肉桂酸)、丁香酸(4-羟基-3，5-二甲氧基苯甲酸)、阿魏酸(4-羟基-3-甲氧基肉桂酸)、儿茶酚(1，2-二羟基苯)、对羟基苯甲酸(4-羟基苯甲酸)、β-二羟基甲酸(2，4-二羟基苯甲酸)、原儿茶酸(3，4-二羟基苯甲酸)、pyrrogallic acid(2，3，4-三羟基苯甲酸)、五倍子酸(3，4，5-三羟基苯甲酸)和香草醛(3-甲氧基-4-羟基苯甲醛)，和已知或预测能够在培养基中以相似结果代替乙酰丁香酮的酚化合物。在本文使用时，所述分子被称作植物酚化合物。

植物酚化合物可以单独或与其他植物酚化合物组合添加至植物培养基。特别优选的植物酚化合物组合至少包含乙酰丁香酮和对羟基苯甲酸，但是预测两种或更多植物酚化合物的其他组合也会协同作用于增强转化效率。

另外，某些化合物如渗透保护剂(例如，优选以约700mg/L浓度的L-脯氨酸或甜菜碱)、植物激素(NAA等)、冠瘿碱或糖被添加时与植物酚化合物组合协同作用。

在本发明的一个实施方案中，优选在分离的不成熟胚与农杆菌接触之前(例如数小时到一天)将植物酚化合物(特别是乙酰丁香酮)添加至培养基。在含植物酚化合物(如乙酰丁香酮)的培养基中孵育培养细胞的确切时间据认为不是关键性的，其仅受不成熟胚开始分化的时间限制。

也相信培养基中植物酚化合物的浓度对用于整合性转化的感受态发育具有影响。培养基中植物酚化合物的最佳浓度范围可根据玉米变种(不成熟胚来自其中)而不同，但是预期约100μM到700μM是适用于许多目的的浓度。然而，低至约25μM的浓度可用于获得对转化效率的好影响。同样，预期高达约1000μM的更高浓度会产生相似的影响。应用于其他植物酚化合物的相当浓度和最佳浓度可通过实验根据本发明容易地确立。

要与经分离的不成熟胚共培养的农杆菌可以如本领域技术人员已知的用乙酰丁香酮或另一植物酚化合物预孵育，或从其培养基中分离后直接使用。用于根癌农杆菌的特别适合的诱导条件已由Vernade等(1988)描述。农杆菌转化效率可以通过本领域已知的大量其他方法增强，例如真空渗入(WO 00/58484)、热激和/或离心、添加硝酸银、超声处理法等。

在本发明中观察到用农杆菌转化分离的不成熟胚的效率可以如下所述显著地提高：将共培养培养基的pH保持在从5.4到6.4的范围内，优选5.6到6.2，特别优选5.8到6.0。在本发明的改良实施方案中，通过MES和磷酸氢钾缓冲液的组合介导pH稳定在该范围中。

3.恢复和选择

与上述细菌共培养后可(例如通过洗涤步骤)去除剩余的细菌。共培养步骤后使用的培养基优选包含杀菌剂(抗生素)。该步骤旨在促进农杆菌感染的胚中胚性愈伤组织形成的启动，并杀死剩余的农杆菌细胞。因此，本发明的方法包括将共培养的不成熟胚转移至恢复培养基的步骤，所述培养基包含

ii.浓度从约1g/l到约10g/l的L-脯氨酸，和

iii.浓度从约1μM到约50μM的硝酸银，和

iv.有效量的至少一种生长素化合物，

但是不含有效量的毒害植物的选择剂。

任选的所述恢复培养基也可包含至少一种植物生长因子。待使用的优选杀菌性抗生素为例如羧苄青霉素(500mg/L)或特美汀^TM(GlaxoSmithKline；替卡西林二钠和棒酸钾的混合物；0.8g特美汀^TM含有50mg棒酸钾和750mg替卡西林)。化学上，替卡西林二钠是N-(2-羧基-3，3-二甲基-7-氧代-4-硫代-1-氮杂二环[3.2.0]庚-6-基)-3-硫代-苯丙酰胺酸二钠盐。化学上，棒酸钾是(Z)-(2R，5R)-3-(2-羟基亚乙基)-7-氧代-4-氧杂-1-氮杂二环[3.2.0]庚烷-2-羧酸钾。

优选在恢复阶段不使用毒害植物水平的选择剂(例如除草剂、毒害植物抗生素、毒害植物D-氨基酸等)。当经转化的植物细胞需要基于阴性选择性标记(见下文)的使用来选择时，要与所述阴性选择性标记一起使用的阴性(或毒害植物的)选择剂应当仅在恢复阶段后使用。相反，用于阳性选择和/或筛选标记选择的剂甚至可以在恢复阶段中使用。用于优选的恢复培养基的实例在下文给出(A-4或A-5)。

恢复阶段可持续约1天到约14天，优选约5天到约8天。优选，该时间段中盾片侧保持向上并且不能埋入培养基中。

恢复步骤后，将不成熟胚转移至选择培养基上并培养，所述选择培养基含有用于诱导胚性愈伤组织形成的合适植物生长调节剂。选择培养基还包含至少一种化合物，所述化合物终止或至少延缓未转化细胞的生长，或刺激经转化细胞的生长超出未转化细胞的生长速率。

本文所用的术语“植物生长调节剂”(PGR)是指天然存在的或合成的(非天然存在的)化合物，其能够调节植物生长和发育。PGR可单独作用或彼此聚合作用或与其他化合物(例如糖、氨基酸)聚合作用。

更具体地，用于胚性愈伤组织诱导和选择的培养基包含

i.有效量的至少一种生长素化合物，和

ii.有效量的选择剂，所述选择剂允许选择包含转基因细胞。

另外，胚性愈伤组织诱导培养基可任选地包含有效量的至少一种抗生素，所述抗生素抑制或阻抑土传细菌(如上文定义)的生长。

术语“生长素”或“生长素化合物”包括下述化合物，其刺激细胞伸长和分裂、维管组织分化、果实发育、不定根形成、乙烯产生并且——在高浓度下——诱导去分化(愈伤组织形成)。最常见的天然存在生长素是吲哚乙酸(IAA)，其在根和茎中被极性转运。合成生长素化合物在现代农业中被广泛使用。合成生长素化合物包括吲哚-3-丁酸(IBA)、萘乙酸(NAA)和2，4-二氯苯氧乙酸(2，4-D)。

用作单独生长素化合物作用时，优选使用约0.2mg/l到约6mg/l的浓度，更优选约0.3到约2mg/l，最优选约1.5mg/l的2，4-D。当使用其他生长素化合物或其组合时，以下述方式选择它们优选的组合：去分化效应等于将上文定义浓度的2，4-D用作单独生长素化合物时所达到的效应。

另外，可使用不同生长素的组合，例如2，4-D和百草枯(Picloram)的组合。优选，约0.5mg/l浓度的2，4-D可以与一种或多种其他类型的生长素化合物(例如浓度约1到约2mg/l的百草枯)组合用于促进胚性愈伤组织形成的质量/数量。

培养基还可任选地补充有一种或多种额外的植物生长调节剂，如例如细胞分裂素化合物(例如6-苄氨基嘌呤)和/或其他生长素化合物。这类化合物包括，但不仅限于IAA、NAA、IBA、细胞分裂素、生长素、细胞激动素(kinetin)、草甘膦和thiadiazorun。细胞分裂素化合物包括例如6-异戊烯腺嘌呤(IPA)和6-苄基腺嘌呤/6-苄氨基嘌呤(BAP)。

选择和愈伤组织诱导阶段可耗时1周到约10周，优选3到7周，更优选4到6周。在选择阶段中，可以将愈伤组织转移至新鲜的选择培养基上一次或多次。然而可选地并优选，在本发明的改良、简化方法中，仅需要一次选择培养基步骤(不经转移至新的选择培养基)。因此节约了约30％的时间和劳力(即每100个不成熟胚60分钟)。基础方案(有2个转移步骤)通常需要在选择培养基上将愈伤组织培养5到6周，而改良、简化的方法需要4周。因此，整个转化过程缩短了1到2周。

农杆菌介导的技术通常可导致基因被递送进入靶标组织中有限数量的细胞中。可通过本领域已知的多种方法(如例如PCR分析、Southern印迹分析、荧光原位杂交(FISH)和原位PCR)证明和分析遗传成分插入到染色体DNA中。然而，优选从未转化的细胞选择成功转化的细胞。优选通过使用选择化合物达到该目的，所述选择化合物与T-DNA上的选择性标记基因组合允许通过选择优势进行这类选择。本领域已知多种选择性标记适用于玉米转化。这类标记可包括，但不仅限于：

i)阴性选择性标记

阴性选择性标记赋予对杀生物化合物的抗性，所述杀生物化合物如代谢抑制剂(例如2-脱氧葡萄糖-6-磷酸盐，WO 98/45456)、抗生素(例如卡那霉素、G418、博来霉素或潮霉素)或除草剂(例如膦丝菌素或草甘膦)。表达标记基因的经转化植物材料(例如细胞、组织或小植株)能够在存在多种浓度的相应选择化合物(例如抗生素或除草剂)时发育，所述选择化合物的存在阻抑未转化的野生型组织的生长。特别优选的阴性选择性标记是赋予除草剂抗性的那些。可提到的实例为：

-膦丝菌素乙酰基转移酶(PAT；也称作Bialophos

抗性；bar；de Block1987；Vasil 1992，1993；Weeks 1993；Becker 1994；Nehra 1994；Wan &Lemaux 1994；EP 0 333 033；US 4,975,374)

-5-烯醇丙酮基莽草酸-3-磷酸合酶(5-enolpyruvylshikimate-3-phosphate synthase)(EPSPS)，其赋予对Glyphosate

(N-(膦酰甲基)甘氨酸)的抗性(Shah 1986；Della-Cioppa 1987)

-Glyphosate

降解酶(Glyphosate

氧化还原酶；gox)，

-Dalapon

失活脱卤素酶(deh)

-磺胺脲和/或咪唑啉酮失活乙酰乳酸合酶(ahas或ALS；例如具有例如S4、XI12、XA17和/或Hra突变的被突变的ahas/ALS变体

-Bromoxynil

降解腈水解酶(bxn)

-卡那霉素或遗传霉素(G418)抗性基因(NPTII；NPTI)，其编码例如新霉素磷酸转移酶(Fraley 1983；Nehra 1994)

-2-脱氧葡萄糖-6-磷酸盐磷酸酶(DOG^R1-基因产物；WO 98/45456；EP0 807 836)，其赋予针对2-脱氧葡萄糖的抗性(Randez-Gil 1995)。

-潮霉素磷酸转移酶(HPT)，其介导对潮霉素的抗性(Vanden Elzen1985)。

-二氢叶酸还原酶(Eichholtz 1987)

赋予抗生素抗性的细菌起源的其他阴性选择性标记基因包括赋予抗生素壮观霉素抗性的aadA基因，庆大霉素乙酰基转移酶，链霉素磷酸转移酶(SPT)，氨基葡糖苷-3-腺嘌呤基转移酶和博来霉素抗性决定子(Hayford1988；Jones 1987；Svab 1990；Hille 1986)。

特别优选的是赋予针对毒效应抗性的阴性选择性标记，所述毒效应由D-氨基酸如D-丙氨酸和D-丝氨酸引起(WO 03/060133；Erikson 2004)。在该竞争中特别优选作为阴性选择性标记的是来自酵母瘦弱红酵母(Rhodotorula gracilis)(红冬孢酵母(Rhodosporidium toruloides))的daol基因(EC：1.4.3.3：GenBank登录号：U60066)和大肠杆菌基因dsdA(D-丝氨酸脱水酶(D-丝氨酸脱氨酶)[EC：4.3.1.18；GenBank登录号：J01603])。

表达这类标记基因的经转化植物材料(例如细胞、胚组织或小植株)能够在存在多种浓度的相应选择化合物(例如抗生素或除草剂)时发育，所述化合物的存在阻抑未转化的野生型组织的生长。得到的植物可以以常规方式育种和杂交。应当培养两代或更多世代，从而确保基因组整合是稳定和遗传的。相应的方法被描述(Jenes 1993；Potrykus 1991)。

另外，可使用报告基因来允许视觉筛选，这可需要或不需要(取决于报告基因的类型)补充底物作为选择化合物。

可使用多种时间流程用于多种阴性选择性标记基因。在抗性基因(例如针对除草剂或D-氨基酸)的情况下，优选贯穿整个愈伤组织诱导阶段进行约4周选择，并在至少4周后进入再生。这样的选择流程可以用于所有的选择体制。还可能(尽管不明确地优选)将选择维持在包括生根的整个再生流程中。

例如，使用膦丝菌素抗性基因(bar)作为选择性标记，培养基中可包含从约1mg/l到50mg/l浓度的膦丝菌素。例如，使用dao1基因作为选择性标记，培养基中可包含约3mg/l到100mg/l浓度的D-丝氨酸或D-丙氨酸。用于选择的典型浓度为20mg/l到40mg/l。例如使用突变的ahas基因作为选择性标记时，培养基中可包含约100nM到约1500nM浓度的PURSUIT^TM。用于选择的典型浓度为约500nM到约1000nM。

在本发明优选的实施方案中，阴性选择性标记是赋予磺胺脲和/或咪唑啉酮类杀虫剂抗性的ahas基因。在本发明的一个实施方案中，不同的ahas突变体可以以允许多重连续转化的方式组合。例如，可使用XI12突变体ahas2基因进行第一轮转化。具有突变的ahas2基因的XI12突变体玉米株系被证明高度抗咪草烟(PURSUIT^TM)，但是对灭草喹(SCEPTER^TM)敏感和对磺胺脲除草剂易感。分离自突变玉米株系的基因XI12 ahas2与对咪唑啉酮除草剂选择偶联已被成功用于玉米、稻和小麦转化的领域(US 6,653,529)。在温室研究中，含XI12 ahas基因的转基因稻植物显示对咪唑啉酮和磺胺脲除草剂的耐受性，所用方式与未转化的XI12突变体植物相似。在用转基因玉米植物进行的大田实验中也观察到相似的现象。可使用例如PURSUIT^TM来实现对包含XI12突变体ahas选择性标记的构建体的选择。

可使用XA17 ahas突变基因来实现对具有XI12突变ahas选择性标记的得到的转基因植物进行第二轮。玉米XA17突变体证明高度抗咪草烟和灭草喹(SCEPTER^TM)，并对硫胺尿素除草剂轻微耐受。因为玉米XA17基因赋予对不同咪唑啉酮化合物和硫胺尿素除草剂不同的耐受性，所以在选择使用咪草烟、灭草喹或硫胺尿素作为选择性试剂时，其可以被用作植物转化中的选择性标记。

突变的XA17 ahas基因及其启动子可以分离自XA17突变体株系。分离序列并表征基因(Bernnasconi 1995)。XA17的突变位于SEQ ID NO：2的第1625位核苷酸。在该位置发生从G到T的单个碱基改变，导致SEQID NO：3的第542位氨基酸从色氨酸到亮氨酸的氨基酸改变(在之前的命名体系中先前称作542突变)。该突变等于拟南芥中第574位氨基酸，现在在新的ahas命名体系中被称作574突变，使得不同的物种中同一突变一致。

XA17突变体及其表型已被描述(US 4,761,373；US 5,304,732；Anderson & Gregeson 1989；Currie 1995；Newhouse 1991)。可以用用于选择的SCEPTER^TM除草剂或硫胺尿素化合物进行选择。因此，多种ahas突变体的组合允许有效的基因叠加，提供用于双重转化的机制。

优选，XA17突变体ahas基因由如SEQ ID NO：3所述的氨基酸序列或下述序列描述，所述序列与SEQ ID NO：3所述的序列具有至少60％，优选至少80％，更优选至少90％，最优选至少95％的同源性并在对应于SEQ ID NO：3第542位具有亮氨酸残基，其能够赋予针对咪草烟和灭草喹除草剂的抗性。

因此，本发明的另一实施方案涉及用于将至少两个DNA构建体随后转化进植物的方法，其包括步骤：

a)用第一构建体进行第一转化并选择抗咪草烟的植物，所述构建体包含第一突变的ahas选择性标记基因，所述第一基因赋予对咪草烟的抗性以及对灭草喹的敏感性，和

本发明的另一实施方案涉及植物细胞或植物，其包含：

ii)阳性选择性标记

另外，可以使用阳性选择性标记。如来自根癌农杆菌(菌株：PO22；Genbank登录号：AB025109)的异戊烯基转移酶基因——作为细胞分裂素生物合成的关键酶——促进转化植物的再生(例如通过在不含细胞分裂素的培养基上选择)。相应的选择方法被描述(Ebinuma 2000a，b)。赋予转化植物与未转化植物相比有生长优势的其他阳性选择性标记描述于例如EP-A0 601 092中。生长刺激选择性标记可包括(但是不仅限于)β-葡糖醛酸糖苷酶(与例如细胞分裂素葡糖醛酸苷)组合、甘露糖-6-磷酸盐异构酶(与甘露糖组合)、UDP-半乳糖-4-表异构酶(与例如半乳糖组合)，其中特别优选甘露糖-6-磷酸盐异构酶与甘露糖组合。

iii)反选择性标记

反选择性标记特别适用于选择确定的序列被缺失的生物，所述序列包含所述标记(Koprek 1999)。用于反选择性标记的实例包括胸腺嘧啶核苷激酶(TK)、胞嘧啶脱氨酶(Gleave 1999；Perera 1993；Stougaard 1993)、细胞色素P450蛋白(Koprek 1999)、haloalkan脱卤素酶(Naested 1999)、iaaH基因产物(Sundaresan 1995)、胞嘧啶脱氨酶codA(Schlaman & Hooykaas1997)或tms2基因产物(Fedoroff & Smith 1993)。

4.再生

胚性愈伤组织诱导和选择阶段(如上所述)后，将得到的成熟胚性愈伤组织转移至允许转基因小植株转换的培养基上。优选这类培养基不包含导致去分化的浓度的生长素，如2，4-D。

在优选的实施方案中，这类培养基可包含一种或多种选自以下的化合物：

i)细胞分裂素如玉米素，优选以约0.5到约10mg/L，更优选从约1.5到约5mg/L的浓度，

ii)有效量的至少一种抗生素，其抑制或阻抑土传细菌(如上所定义的)的生长，和

iii)有效量的选择剂，其允许选择包含转基因T-DNA的细胞。

优选将胚性愈伤组织在该培养基上孵育直到形成枝条，然后转移至生根培养基。这类孵育可耗时1到5周，优选2到3周。

将再生的枝条或小植株(即带根的枝条)转移至含生根培养基(例如配方A-8描述的培养基)的Phytatray或Magenta盒中，孵育直到发育成生根的小植株(通常1到4周，优选2周)。将生根的幼苗转移至Metromix土壤并如本领域所述培养为成熟植物(见实施例)。

在本发明优选的实施方案中，使用改良的步骤并将在平板上再生的小植株直接移植到温室中的MetroMix中，省略在生根盒中的步骤，从而节省时间和劳力。

需要时用适当的选择剂(例如70到100g/ha Pursuit^TM)喷洒推定的转基因植物，并在温室中再培养两周。此时非转基因植物应当发生除草剂症状或死亡。将存活的植物移植进含MetroMix土壤的盆中。

得到的植物可以以常规方式育种和杂交。应当培养两代或更多世代，从而确保基因组整合是稳定和遗传的。例如在开花阶段时，将转基因植物的雄花穗用棕色纸袋包装，防止花粉脱落。对转基因植物进行传粉。最好对转基因植物进行自花传粉。如果抽丝和开花不是同步的，则应当可用与转基因T₀植物具有相同遗传背景的野生型花粉供体或受体植物，用于进行异花传粉。收集T₁种子、干燥并用足够的标签适当地保存在种子袋中。收集转基因T₁种子后，包括土壤和盆的T₀植物应当包装在高压灭菌袋中高压灭菌(双重装袋)。

本发明的其他重要方面包括通过所公开方法制备的转基因植物的后代，以及来自这类后代的细胞，和得自这类后代的种子。

5.优选的遗传成分和T-DNA

优选插入靶标植物基因组中的遗传成分(例如T-DNA)至少包含一个表达盒，其可例如促进选择性标记、性状基因、反义RNA或双链RNA的表达。优选所述表达盒包含在植物细胞中有功能的启动子序列，所述启动子序列与核酸序列有效地连接，所述核酸序列的表达给予这样转化的植物以有利的表型。本领域技术人员知道大量序列，所述序列可用于本文语境中以提高食品和饲料的品质，产生化学品、精细化学品或药物(例如维生素、油、糖类；Dunwell 2000)，赋予对除草剂的抗性，或赋予雄性不育。另外，可促进生长，提高产量和增强对非生物和生物胁迫因素(例如真菌、病毒或昆虫)的抗性。可通过过量表达蛋白质或降低内源蛋白质的表达来赋予有利的性质，所述内源蛋白质表达的降低例如通过表达相应的反义(Sheehy1988；US 4,801,340；Mol 1990)或双链RNA(Matzke 2000；Fire 1998；Waterhouse 1998；WO 99/32619；WO 99/53050；WO 00/68374；WO 00/44914；WO 00/44895；WO 00/49035；WO 00/63364)完成。

用于在植物中表达时，优选植物特异的启动子。术语“植物特异的启动子”理解为基本上表示在植物或植物部分、植物细胞、植物组织或植物培养物中能够控制基因(特别是外源基因)表达的任何启动子。在本文上下文中，表达可以是例如组成型的、诱导型的或发育依赖型的。优选以下：

a)组成型启动子

“组成型”启动子是指确保在植物发育的大部分阶段(优选植物发育的所有时期)中在大量(优选所有)组织中表达的那些启动子。特别优选使用植物启动子或来源于植物病毒的启动子。特别优选CaMV(花椰菜花叶病毒)35S转录物的启动子(Franck 1980；Odell 1985；Shewmaker 1985；Gardner 1986)或19S CaMV启动子(US 5,352,605；WO 84/02913；Benfey1989)。另一合适的组成型启动子是稻肌动蛋白启动子(McElroy 1990)、Rubisco小亚基(SSU)启动子(US 4,962,028)、豆球蛋白B启动子(GenBank登录号No.X03677)、来自农杆菌胭脂碱合酶的启动子、TR二元启动子、来自农杆菌的OCS(章鱼碱合酶)启动子、泛蛋白启动子(Holtorf 1995)、泛蛋白1启动子(Christensen 1989，1992；Bruce 1989)、Smas启动子、肉桂醇脱氢酶启动子(US 5,683,439)、具液泡ATPase亚基的启动子、pEMU启动子(Last 1991)；MAS启动子(Velten 1984)和玉米H3组蛋白启动子(Lepetit1992；Atanassova 1992)、拟南芥腈水解酶-1基因(GenBank登录号No.：U38846，核苷酸3862到5325或5342)或来自小麦的富含脯氨酸蛋白质的启动子(WO 91/13991)，和其他基因的启动子，所述其他基因在植物(特别是单子叶或禾本科(Gramineae)植物)中的组成型表达是技术人员已知的。玉米泛蛋白启动子在小麦和大麦中特别优选。

b)组织特异或组织优选的启动子

其他优选的启动子是对种子具有特异性的启动子，例如菜豆蛋白启动子(US 5,504,200；Bustos 1989，Murai 1983；Sengupta-Gopalan 1985)、2S白蛋白基因的启动子(Joseffson 1987)、豆球蛋白启动子(Shirsat 1989)、USP(未知种子蛋白质)启动子(B

umlein 1991a)、油菜籽蛋白基因启动子(US5,608,152；Stalberg 1996)、蔗糖结合蛋白启动子(WO 00/26388)或豆球蛋白B4启动子(LeB4；B

umlein 1991b，1992)，拟南芥油质蛋白启动子(WO98/45461)和芸苔Bce4启动子(WO 91/13980)。此外优选的启动子是允许在单子叶植物(例如玉米、大麦、小麦、黑麦、稻等等)中种子特异表达的启动子。可有利地使用lpt2或lpt1基因的启动子(WO 95/15389，WO 95/23230)或描述于WO 99/16890中的启动子(大麦醇溶蛋白基因、谷蛋白基因、水稻素基因、谷醇溶蛋白基因、麦醇溶蛋白基因、谷蛋白基因、玉米醇溶蛋白基因、casirin基因或黑麦醇溶蛋白基因的启动子)。还优选的是叶特异性和光诱导的启动子，例如来自cab或核酮糖二磷酸羧化酶-加氧酶的启动子(Simpson 1985；Timko 1985)；花药特异的启动子如来自LAT52的启动子(Twell 1989b)；花粉特异的启动子如来自Zml3的启动子(Guerrero 1993)；和小孢子偏好的启动子如来自apg的启动子(Twell 1993)。

c)化学诱导型启动子

表达盒还可包含化学诱导型启动子(综述文章：Gatz 1997)，借助于所述启动子，植物中外源基因的表达可以被调控在具体的时间点。这类启动子如例如PRP1启动子(Ward 1993)、水杨酸诱导型启动子(WO 95/19443)、苯磺酰胺诱导型启动子(EP 0 388 186)、四环素诱导型启动子(Gatz 1991，1992)、脱落酸诱导型启动子(EP 0 335 528)或乙醇-环己酮诱导型启动子(WO 93/21334)可同样被使用。还适用的是谷胱甘肽-S转移酶同种型II基因的启动子(GST-II-27)，其可被外源应用的安全剂例如N，N-二烯丙基-2，2-二氯乙酰胺(WO 93/01294)激活，其在单子叶植物和双子叶植物的大量组织中有效。可用于本发明的其他示范性诱导型启动子包括来自ACE1体系的启动子，其响应铜(Mett 1993)；或来自玉米的In2启动子，其响应苯磺酰胺除草剂安全剂(Hershey 1991；Gatz 1994)。可利用响应诱导剂的启动子，所述诱导剂通常不为植物所响应。示范性的诱导型启动子是来自类固醇激素基因的诱导型启动子，其转录活性被糖皮质类固醇激素诱导(Schena1991)。

特别优选为组成型启动子。此外，其他的启动子可与待表达的核酸序列有效地连接，所述启动子使得可能在其他植物组织或其他生物(如例如大肠杆菌细菌)中表达。合适的植物启动子基本上是上述的所有启动子。

遗传成分和/或表达盒可还包含除启动子外的遗传调控序列。术语“遗传调控序列”应理解为广义的含义，是指对本发明表达盒的物质化或功能具有影响的所有序列。例如，遗传调控序列修饰原核或真核生物中的转录和翻译。优选，根据本发明的表达盒在待重组表达的目的核酸序列5’上游包含在植物中有功能的启动子，在3’下游包含终止子序列作为额外的遗传调控序列，并且根据需要还包含常规的调节元件，每种情况下均与待重组表达的核酸序列有效地连接。

遗传调控序列还进一步包含基因的5’非翻译区、内含子或非编码3’区，如例如肌动蛋白-1内含子或Adh1-S内含子1、2和6(一般参考The MaizeHandbook，第116章，Freeling和Walbot编，Springer，New York(1994))。已证明它们在基因表达调节中起重要作用。因此，已证明5’非翻译序列可以增强异源基因的瞬时表达。可提到的翻译增强子的实例为烟草花叶病毒5’前导序列(Gallie 1987)等等。另外，它们可促进组织特异性(Rouster1998)。

表达盒可有利地包含一种或多种与启动子有效连接的增强子序列，其使得可能提高核酸序列的重组表达。其他的有利序列(例如其他调节元件或终止子)也可被插入待重组表达的核酸序列3’端。适合用作调控序列的多聚腺苷酸化信号是植物多聚腺苷酸化信号，优选主要对应于来自根癌农杆菌的T-DNA多聚腺苷酸化信号的那些，特别是OCS(章鱼碱合酶)终止子和NOS(胭脂碱合酶)终止子。

调控序列还应被理解为允许从基因组中去除插入序列的调控序列。基于cre/lox(Sauer 1998；Odell 1990；Dale 1991)、FLP/FRT(Lysnik 1993)或Ac/Ds体系(Wader 1987；US 5,225,341；Baker 1987；Lawson 1994)的方法允许——根据需要，组织特异性和/或可被诱导地——从宿主生物基因组中去除特异的DNA序列。调控序列在本文上下文中是指特异的侧翼序列(例如lox序列)，其随后允许去除(例如借助于ore重组酶)。

本发明的遗传成分和/或表达盒可包含其他功能元件。术语功能元件应理解为广义含义，是指对本发明的遗传成分、表达盒或重组生物的产生、扩增或功能具有影响的所有元件。功能元件可包括例如(但不仅限于)：

1)如上所述的选择性标记。

2)报告基因

报告基因编码可容易定量的蛋白质，并通过它们的颜色或酶活性使得可能评估转化效率、表达位点或表达时间。在本文上下文中非常特别优选的是编码下述报告蛋白的基因(Schenborn 1999)，如绿色荧光蛋白(GFP)(Sheen 1995；Haseloff 1997；Reichel 1996；Tian 1997；WO 97/41228；Chui1996；Leffel 1997)、氯霉素转移酶、萤光素酶(Ow 1986；Millar 1992)、水母发光蛋白基因(Prasher 1985)、β-半乳糖苷酶、R位点基因(编码蛋白质，所述蛋白质调节花色素苷色素(红色)在植物组织中的产生，从而使得可能直接分析启动子活性而不用添加其他其他辅助底物或显色底物)(Dellaporta 1988；Ludwig 1990)，非常特别优选β-葡糖醛酸糖苷酶(GUS)(Jefferson 1987a，b)。β-葡糖醛酸糖苷酶(GUS)表达通过用5-溴-4-氯-3-吲哚基-β-D-葡糖醛酸孵育组织得到的蓝色检测，细菌萤光素酶(LUX)表达通过光发射检测；萤火虫萤光素酶(LUC)表达通过用萤光素孵育后的光发射检测；半乳糖苷酶表达通过用5-溴-4-氯-3-吲哚基-β-D-半乳吡喃糖苷染色组织后的亮蓝色检测。报告基因也可用作可评分的标记，作为抗生素抗性标记的备选。这类标记被用于检测转移基因的存在或测量其表达水平。只有当细胞的修饰效率高时，可评分标记在植物中鉴定或标记经遗传修饰细胞的用途才运作良好。

3)复制起点，其确保根据本发明的表达盒或载体在例如大肠杆菌中的扩增。可提到的实例为ORI(DNA复制起点)、pBR322 ori或P15A ori(Maniatis 1989)。

4)农杆菌介导的植物转化必需的元件为例如T-DNA的右边界和左边界或vir区。

本文公开和要求保护的所有成分和方法可以根据本文公开内容制造和进行，而不经过大量实验。尽管就优选的实施方案对本发明的组合物和方法进行了描述，但是本领域技术人员会明白，可对组合物、方法和本文所述方法的步骤或步骤方法顺序进行改变而不偏离本发明的概念、思想和范围。更特别地，应当明白化学和生理上均相关的某些剂可取代本文所述的剂，但是会达到相同或相似的结果。所有这类相似取代和修饰是本领域技术人员明白的，并被认为属于附带的权利要求书所定义的本发明的思想、范围和概念。本文引用的所有出版物、专利和专利申请作为参考引入本文用于所有目的。

序列

1.SEQ ID NO：1二元载体pPBS_MM232。

2.SEQ ID NO：2编码ahas选择性标记的XA17突变体的核酸序列。

3.SEQ ID NO：3编码ahas选择性标记的XA17突变体的氨基酸序列。

按照布达佩斯条约的保藏

按照布达佩斯条约对以下材料进行保藏：

1.玉米株系BPS553的种子；专利保藏号PTA-6170。

2.玉米株系BPS631的种子；专利保藏号PTA-6171。

该保藏于2004年8月26日在美国典型培养物保藏中心((ATCC)，Manassas，VA 20110-2209美国)进行。

实施例

一般方法：

除非另有说明，实施例中的化学品和试剂得自Sigma ChemicalCompany(St.Louis，MO)。用于细胞培养基的材料得自Gibco/BRL(Gaithersburg，MD)或DIFCO(Detroit，MI)。如Sambrook(1989)所述进行为本发明目的所进行的克隆步骤，例如转化大肠杆菌细胞、培养细菌、繁殖噬菌体和序列分析重组的DNA。提供下列实施例用于说明而非限制。

培养基配方

通过将28.9mg普杀特(Pursuit)溶解进100ml的DMSO(Sigma)中制备咪草烟(普杀特)储存溶液(1mM)，并在黑暗中储存于4℃。乙酰丁香酮储存液制备为DMSO中的200mM溶液并储存于-20℃。

A-1玉米YP培养基(用于生长农杆菌)

用1M NaOH将pH调节至6.8。对固体培养基而言，每250mL瓶中添加3g琼脂(EM Science)。每250mL瓶中等分100mL培养基，灭菌，使其冷却并在瓶中凝固。对于平板制备而言，在微波炉中熔化瓶中的培养基，将瓶置于水浴中并冷却至55℃。冷却后添加壮观霉素(Sigma S-4014)至50mg/l的终浓度，充分混合并倒板。

A-2.玉米LS-inf培养基

用1M HCl将pH调节至5.2，过滤灭菌，分散在100mL等分式样中，用于农杆菌感染之前向培养基中添加乙酰丁香酮(100μM)(50μL到100mL培养基-200mM储存液)。

A-3.玉米1.5LSAs培养基(用于共培养)

用1M NaOH将培养基pH调节至5.8。每瓶称量4g Sigma纯化琼脂(8g/L)并向每瓶中分装500mL培养基，高压灭菌。冷却后添加AgNO₃(以15mM储存)至15μM的终浓度，添加L-半胱氨酸(以150mg/ml储存)至300mg/l的终浓度。倒入100×20mm培养平板。含乙烯丁香酮的培养基应当新鲜使用，不能长期储存。

A-4.玉米恢复培养基-1：IM培养基

称量所需总体积ddH₂O的约3/4，加入蔗糖和盐，搅拌溶解。所有成分溶解后，用ddH₂O调节至最终体积，并使用1M KOH调节至pH 5.8。向1L瓶中等分500ml，向每瓶液体中添加0.9g脱乙酰吉兰糖胶(gelrite)，高压灭菌20分钟(液体循环)。高压灭菌后将瓶置于水浴中冷却至55℃并添加MS维生素(至1.0mg/ml的终浓度)、硝酸银(至15μM的终浓度)和特美汀(Timentin)(至150mg/l的终浓度)。将培养基倒入100×20mm培养平板中，允许培养基在分层超净台(laminar hood)中保持过夜以预防过分凝结。

A-5.玉米恢复培养基-2：MS培养基

用1M NaOH将pH调节至5.8。每瓶添加Sigma纯化琼脂(8g/L)。每瓶分装500mL培养基，高压灭菌。冷却后添加硝酸银(至15μM终浓度)和特美汀(至150mg/l终浓度)。该恢复培养基特别适用于BPS553×(HiIIA×A188)或BPS631×(HiIIA×A188)基因型。

A-6.选择培养基

用1M NaOH将pH调节至5.8。每瓶添加Sigma纯化琼脂(8g/L)，每1L瓶分装500mL培养基，高压灭菌。冷却后添加：

A-7.玉米再生培养基

用1M NaOH将培养基pH调节至5.8。每瓶称量4g纯化琼脂(Sigma，8g/L)。每瓶分装500mL培养基，高压灭菌并使其在瓶中凝固。使用时用微波炉熔化培养基，冷却后添加

倒入100×20mm培养平板

A-8.玉米生根培养基(生根)

用1M NaOH将培养基pH调节至5.8，每瓶添加1g脱乙酰吉兰糖胶(2g/L)，每瓶分装500mL，高压灭菌，倒入一次性Phyatrays中。

基本方案概述

该方案适用于所有玉米株系(包括杂种系和近交系)。

实施例1：制备杂种供体植物

使用以下的玉米近交系用于以下步骤：

1.HiIIA：HiII亲本A；保藏号No.：T0940A，(玉米遗传学和基因组学数据库(Maize Genetics and Genomics Database))，可得自玉米遗传学协会储藏中心(Maize Genetics Cooperation-Stock Center USDA/ARS & CropSci/UIUC，S-123Turner Hall，1102 S.Goodwin Avenue，Urbana IL美国61801-4798；http：//www.maizegdb.org/stock.php)。

2.A188：Agronomy & Plant Genetics，411 Borlaug Hall，Univ ofMinnesota，Saint Paul MN 55108.

3.BPS533(ATCC专利保藏号PTA-6170)

4.BPS631(ATCC专利保藏号PTA-6171)

通过将HiIIA(雌性亲本)与近交系A188(雄性)杂交产生玉米基因型HiIIA×A188的F1种子，并种植于温室作为花粉供体。通过温室中或大田中F1(HiIIA×A188)植物的自花传粉产生(HiIIA×A188)的F2种子，并种植于温室中作为花粉供体。使用近交系BPS553(ATCC专利保藏号PTA-6170)或BPS631(ATCC专利保藏号PTA-6171)作为雌性亲本，F1或F2(HiIIA×A188)植物作为雄性亲本在温室中产生BPS553×(HiIIA×A188)或BPS631×(HiIIA×A188)的杂种不成熟胚。

将种子播种于含Metromix的盆中。一旦种子开始发芽并生根，维持每盆一棵幼苗用于产生不成熟胚，将第二棵幼苗清除；或者种子起初种植在4×4英寸的盆中，播种种子后两周将幼苗移植到10英寸的盆中。向每盆表面添加约一汤匙的Osmocote 14-14-14(一种缓释肥料)。温室温度维持在夜晚24℃白天28℃。自动浇水，但是需根据需要每天手动补充。用Peters20-20-20肥料的1∶15稀释液每周浇植物两次。

1.1近交供体植物的制备

将近交系BPS553或BPS631的种子直接播种于4英寸盆中，播种种子两周后将幼苗移植至10英寸盆中。或者将种子直接播种于10英寸盆中。进行自花传粉或近缘授粉。生长条件与上文用于杂交系的相同。

1.2手工传粉

监测每株玉米植物的穗枝条，发现时用小的白色穗枝条袋(Lawson)将其覆盖。一旦穗枝条开始产生穗丝，切除穗丝并再次用穗枝条袋覆盖。用棕色纸袋将相同植物的雄花穗装袋(条件是雄花穗已经进入开花期)。第二天一早，摇动雄花穗，将花粉和花药移入袋中。然后拿走袋，将花粉在穗枝条的穗丝上摇动。在早晨8点到10点之间进行传粉。保证棕色纸袋在穗枝条上和玉米柄附近。传粉后从植物上去除雄花穗以减少温室中的花粉(许多人的变应原)。

为了确保相同基因型同步传粉，从而避免周末收集/转化，将这些早花植物的穗枝条再次修剪。然后在同一天对一组植物(例如＞5到10个植物)传粉。然而，该实践取决于植物上花粉的质量/数量。对于近交系而言需要近缘传粉。例如，BPS553或BPS631可以自花传粉或在相同基因型间近缘传粉。

1.3收集和预处理穗

在传粉后(DAP)8到14天(平均10天)收集来自玉米植物的穗(最好是首先出现的穗)。收集时间根据生长条件和玉米变种而不同。不成熟胚的尺寸是它们发育阶段的良好标志。用于转化的不成熟胚的最佳长度为约1到1.5mm，包括盾片的长度。胚应当是半透明的，而不是不透明的。如果穗已经准备好，但是当天不能用于转化，则可以收集穗，置于传粉袋中并在4℃冰箱中塑料袋中储存1到3天。

2.制备农杆菌

农杆菌甘油储存液储存于-80℃。将农杆菌接种物从甘油储存液中划线在YP琼脂培养基(A-1)上，所述培养基含有适当的抗生素(例如50mg/l壮观霉素和/或10mg/l四环素)。将细菌培养物在暗中28℃下孵育1到3天，或直到可以看见单个菌落。获得的平板在4℃储存1个月并作为主板用于划出新鲜细胞。新鲜的细胞应当在转化前至少2天从主板上单个菌落中划在含有适当抗生素的YP琼脂上。这些细菌培养物可以在暗中28℃下孵育1到3天。

可选地可以制备冷冻的农杆菌储存液：从冷冻储存液将农杆菌细胞划在平板B-YP-002(YP+50mg/l壮观霉素+10mg/l四环素)上。在28℃下培养2到3天。将其作为主板保存并在4℃储存最多一个月。从主板上将一接种环的农杆菌细胞划在烧瓶中，所述烧瓶含有25ml添加有50mg/l壮观霉素+10mg/l四环素的液体B-YP-000培养基。在设置为300rpm和28℃的摇床上培养2到3天。通过将一份上述农杆菌培养物与一份无菌30％甘油混合制备冷冻农杆菌储存液。振荡以混合均匀并将10μl农杆菌/甘油混合物分装在50μl Eppendorf管中。储存于-80℃。

将充满细菌培养物的一个或两个环(直径2mm)悬浮在1.0到1.8mlLS-inf培养基中，所述培养基补充有100M乙酰丁香酮。这产生具有0.5到2.0之间近以光密度(OD₆₀₀)的细菌悬液。振荡0.5到3小时。振荡如下进行：将微量离心管水平地(而不是垂直地)固定(例如用胶带)在振荡器的平台上，确保将农杆菌细胞更好地分散进溶液中。将100μl农杆菌细胞悬液与900μl的LS-inf溶液摇动(curvet)混合，并测量OD₆₀₀。将原始农杆菌溶液的OD用LS-Inf(含100μM乙酰丁香酮)溶液调节为0.6到2.0。感染前优选将农杆菌悬液在LS-inf+乙酰丁香酮培养基中振荡至少0.5到3小时。开始收集胚之前制备该悬液。

可选地可如下制备用于玉米转化的农杆菌悬液：转化前两天，从-80℃的储存液中，将来自一管的农杆菌划在含B-YP-002(凝固的YP+50mg/l壮观霉素+10mg/l四环素)的平板上并在28℃暗中培养两天。转化前约1到4小时，将一勺细菌细胞置于2ml Eppendorf管中1.5ml M-LS-002培养基(LSinf+200μM乙酰丁香酮)中。振荡管将细菌细胞分散至溶液中，并在1000rpm将管摇动1到4小时。OD₆₀₀应当在0.6到1.0的范围内或约10⁸cfu/mL。

为了以下实施例的目的，使用用二元载体质粒pBPSMM232转化的根癌农杆菌菌株LBA4404或卸甲农杆菌菌株K599(NCPPB 2659)。pBPS_MM232含有ahas基因(作为选择性标记)和gus报告基因。

实施例3：分离不成熟胚

3.1表面灭菌

传粉后8到12天从温室收集穗。去除所有的外壳和穗丝，并将穗在棕色棕色传粉袋中运输回组织培养实验室。将穗轴移进无菌超净台中。将一对大镊子插入穗的基底部，使用该镊子作为操作穗轴的手柄。任选地，当穗上存在昆虫/真菌时，应当首先用20％的商业漂白剂将穗灭菌10分钟(或者30％Clorox溶液15分钟)，然后用无菌水冲洗三次。用镊子握住穗轴，用70％乙醇彻底地喷洒穗，然后用无菌ddH₂O冲洗。

3.2制备并用农杆菌接种不成熟胚

3.2.1方法1：改良的“管”方法

将带有镊子手柄的穗轴置于大的培养平板中。可使用解剖镜。切掉仁的顶部(2/3)并用#10解剖刀去除(为了安全起见，远离握住镊子手柄的手切除来完成仁的切割)。然后用解剖刀(#11解剖刀)从穗轴上的仁上切下不成熟胚：将解剖刀刀锋以一定角度插入仁的一端。将胚乳提起；胚位于胚乳下。被切下的胚收集在含有约1.5到1.8ml农杆菌悬液的微量离心管(或小培养平板)中，所述农杆菌悬浮于含乙酰丁香酮的LS-inf液体培养基(见上文；培养基A-2)中。每管可以含至多100个胚。将含胚的管手摇混合若干次，使管/平板在室温(20到25℃)保持30分钟。用移液管从管/平板中去除多余的细菌悬液。将残余的LS-inf培养基中的不成熟胚和细菌转移至含共培养琼脂培养基的培养平板中。用无菌环转移微量离心管中残余的任何不成熟胚。用移液管去除多余的细菌悬液。优选将小量液体留在平板中以避免胚在涂板时脱水。将不成熟胚置于共培养基上，平侧向下(盾片朝上)。不要将胚埋入培养基中。将平板盖打开置于无菌超净台中约15分钟，蒸发覆盖不成熟胚的多余水分。用3M微孔胶带封住培养皿。约100个胚可被置于培养平板中用于共培养。封住平板并用一片铝箔包裹。将平板在暗中22℃孵育2到3天。如果使用GUS构建体评估瞬时GUS表达，取3到5个胚进行GUS染色。

3.2.2方法2：“滴”方法

切下的不成熟胚直接置于共培养培养基(培养基A-3)上，平侧向下(盾片朝上)。每个平板(20×100mm平板)可以装载至多100个不成熟胚。用重复移液器对每个不成熟胚放入5μl稀释的农杆菌细胞悬液。通过在超净台中将平板盖打开约15分钟去除覆盖不成熟胚的多余水分。用3M微孔胶带封住平板并用铝箔包裹。将平板在暗中22℃孵育2到3天。如果使用GUS构建体评估瞬时GUS表达，取出3-5个不成熟胚用于GUS染色。

表1在两种玉米基因型中比较两种接种方法：“滴”和改良的“管”方法

已经证明共培养基中硫醇化合物(如L-半胱氨酸)的存在显著提高转化效率。

表2近交BPS553和杂种BPS553×(HiIIA×A188)株系中L-半胱氨酸对转化效率的影响。转化实验用分裂穗轴(split-cob)(将玉米穗轴分为两个处理：添加或不添加L-半胱氨酸)实验设计来进行，使用本文所述的“滴”接种方法。每个实验平均由50-100个不成熟胚组成。

TE＝转化效率；^*相较于共培养基中不添加L-半胱氨酸的处理，在95％置信水平上统计学显著

3.2.3共培养时滤纸的应用

如上所述，用解剖刀(#11解剖刀)从穗轴上的仁上切下不成熟胚，并收集在含有约1.5到1.8ml农杆菌悬液的微量离心管(或小培养平板)中，所述农杆菌悬浮于含乙酰丁香酮的LS-inf液体培养基(见上文；培养基A-2)中。每管可以含至多100个胚。将含胚的管手摇混合若干次，使管/平板在室温(20到25℃)保持30分钟。用移液管从管/平板中去除多余的细菌悬液，并将剩余的IS-inf培养基中的不成熟胚转移至一层滤纸的表面，所述滤纸置于琼脂共培养基上。用无菌环将微量离心管中残余的不成熟胚转移至共培养基上的滤纸上。用移液管去除共培养平板中多余的细菌悬液。优选将小量液体留在平板中以避免胚在涂板时脱水。将不成熟胚置于共培养基上，平侧向下(盾片朝上)。将平板盖打开置于无菌超净台中约15分钟，蒸发覆盖不成熟胚的多余水分。用3M微孔胶带封住培养皿。约100个胚可被置于培养平板中用于共培养。封住平板并用一片铝箔包裹。将平板在暗中22℃孵育2到3天。如果使用GUS构建体评估瞬时GUS表达，取3到5个胚进行GUS染色。

表3在BPS553近交系中应用滤纸(FP)对转化的影响。将一层滤纸置于共培养琼脂培养基表面用于滤纸处理，所述培养基含150mg/l L-半胱氨酸和15μM AgNO3。除了滤纸被省略外，对照无滤纸处理与滤纸处理完全相同地进行。用改良的“管”接种方法接种后，将不成熟胚(IEs)置于滤纸上。

还通过向平板中多层滤纸上添加共培养液体培养基溶液在无琼脂培养基的条件下测试共培养条件。使用无琼脂滤纸的优点仅支持包括(但不仅限于)(1)缩短的培养基制备时间，和(2)改变共培养基成分的提高的弹性。

实施例4：恢复

共培养后，将胚转移至恢复培养基(A-4或A-5)上并将平板在暗中27℃下孵育约5到7天。保持盾片侧向上，并且不要埋入培养基中。

表3BPS553×(HiIIA×A188)基因型中共培养后恢复(培养基中不添加选择剂)的长度对转化效率的影响。在重复中用于每次处理的不成熟胚的平均数量为约70。

实施例5：选择

5.1基本选择方案

将不成熟胚转移至第一轮选择培养基(A-6)上。每个平板上大约可放置25到50个不成熟胚。小心地维持胚的相同方向(盾片向上)。不要将胚埋入培养基中。用白色胶带封住培养平板。在暗中27℃下孵育10到14天(第一轮选择)。将产生可变愈伤组织的所有不成熟胚在第二轮选择培养基(A-6)中次培养。尽量避免转移粘的或软的愈伤组织。在该阶段，使用剪刀去除形成的任何枝条(如果可能，尝试从盾片上取下整个胚并丢掉)。将愈伤组织稳固地置于培养基上，不要埋入培养基中。用3M微孔胶带封住平板，置于暗中27℃下。在与第一轮选择相同的条件下孵育2周(第二轮选择)。使用2对精细镊子，在立体显微镜下从盾片上切除可再生的愈伤组织。可再生的愈伤组织颜色是带白色/浅黄色、致密的、不粘滑并可具有一些胚状结构。将愈伤组织转移至新鲜的第二轮选择培养基(A-6)上，用3M微孔胶带封住并在暗中27℃下孵育2周。将愈伤组织稳固地置于培养基上，不要埋入培养基。小心地分组并标记来自同一胚的愈伤组织碎片。

5.1改良的选择方案

可选地和优选应用改良的选择流程：本领域用于玉米转化的所有公开方法(包括上文所述的基本方法)需转移至选择培养基上2到3次，所述选择培养基具有相同或不同的选择剂浓度。转移是指将来自当前培养基平板的愈伤组织材料转移至一组新的培养基平板。转移过程是费力费时的，例如转移来自100个不成熟胚的愈伤组织材料耗时60分钟。在本发明的改良、简化方法中，只需要转移至选择培养基一次。因此，节省了约30％的时间和劳力(即每来自100个不成熟胚的材料用60分钟)。

基础方法通常需要将愈伤组织在选择培养基上培养5到6周，而改良、简化的方法需要4周。因此，整个转化过程缩短了1周或2周。

显示可能用改良、简化的方法在用于选择的愈伤组织阶段对BPS553×(HiIIA×A188)基因型使用0.5μM或0.75μM PURSUIT^TM，对HiIIA×A188基因型仅用0.5μM PURSUIT^TM就可能产生转基因事件。转化效率对BPS553×(HiIIA×A188)基因型为平均20.5％，对HiIIA×A188基因型为2.5。与标准转化方案(在含0.5μM PURSUIT^TM的培养基上2周，随后在含0.75μM PURSUIT^TM的培养基上再3周)相比，简化方法具有36.7％的转化效率，而前一方法具有33.3％的效率。因此，两种方法的转化效率是相当的。

表4.旧方法和改良的简化方法的比较

BPS553×(H×A)：BPS553×(HiIIA×A188)

#IE＝用于转化的不成熟胚数量。

TE：转化效率(％)＝PCR+植物数/#IE×100

更具体地如下进行改良的选择方案：通过解剖显微镜观察并使用一对镊子去除胚体轴，将具有积极生长的愈伤组织细胞的不成熟胚挑选并转移至25×100mm平板中新鲜的M-LS-401培养基上，对一些基因型而言，也可使用M-LS-301培养基。每板仅铺8-10个胚。确保所有的胚接触培养基的表面。用有孔胶带封住平板。将材料在25℃暗中培养25到28天。优选，不让它们在愈伤组织选择培养基上生长多于4周。在解剖显微镜下选择积极生长的愈伤组织材料并转移至下文所述的再生培养基。

实施例6：被转化植物的再生

6.1基本再生方案

以用于第二轮选择相同的方式切下增生的愈伤组织(因胚结构形成而带白色)并转移至25×100mm平板中的再生培养基(A-7)上。将愈伤组织稳固地置于培养基上，不要埋入培养基中。用3M微孔胶带封住平板置于光下，25℃到27℃。仔细地将来自相同胚的愈伤组织碎片分组，根据胚对其编码。

在25℃或27℃下于光(约2,000lux；14/10小时光/暗)下孵育2到3周，或直到能够看见枝条样的结构。根据需要，转移至新鲜的再生培养基。将带有再生枝条或枝条样结构的愈伤组织切片转移至含有生根培养基(A-8)的Phytatray或Magenta盒，并在上一步骤相同的条件下孵育2周，或直到发育出生根的小植株。在生根培养基上2周或4周后，将仍然带有绿色区域的愈伤组织(但是其没有再生出幼苗)转移至新鲜的生根Phytatrays。对幼苗样品进行TaqMan分析以确定T-DNA插入数。

将生根的幼苗转移至温室中的Metromix土壤，用塑料盖将各幼苗覆盖至少1周，直到幼苗定居。以每天浇水，每周补充液体肥料两次来维持植物(生长)。当植物到达3到4片叶子的阶段时，用Osmocote对其施肥。需要时可由有执照人员用70到100g/ha Pursuit^TM喷洒推定的转基因植物，并在温室中再培养两周。在该时间中非转基因植物会产生除草剂症状或死亡。将存活的植物移植至含有MetroMix和1茶匙Osmocote^TM的10英寸盆中。

开花阶段时，将转基因植物的雄花穗用棕色纸袋包装，防止花粉脱落。对转基因植物进行传粉。最好对转基因植物进行自花传粉。如果抽丝和开花不是同步的，则应当可用与转基因T₀植物具有相同遗传背景的野生型花粉供体或受体植物，用于进行异花传粉。收集T₁种子、干燥并用足够的标签适当地保存在种子袋中。收集转基因T₁种子后，包括土壤和盆的T₀植物应当包装在高压灭菌袋中高压灭菌(双重装袋)。

6.2改良的再生方案

在本发明优选的实施方案中，使用改良的步骤。本领域已知的基本方案和转化方案在平板上再生转基因植物，然后转移至含培养基的盒中刺激生根。随后将生根的植物移植到温室中的MetroMix上。该步骤是费力费时的。在改良的方法中，在平板上再生的小植株直接被移植到温室中的MetroMix上，省略了生根盒中的步骤，从而节省了时间和劳动。

因此，更具体地，选择在解剖显微镜下积极生长的愈伤组织材料，将其转移至25×100mm平板中的M-LS-503或M-LS-504培养基上。将平板保持在培养室(设定为14/10小时光/暗和25℃)中生长2到3周直到枝条再生。将健康有活力成长的枝条移植到温室中装有Metro Mix的盆中。此后遵循如上所述的温室方案。移植过程后至少50％的枝条存活。结果显示两个独立的实验分别具有62％和93％的存活率。

实施例7：玉米杂种的转化效率比较

不成熟胚来自玉米杂种系(如下文表5所列)并用如上所述的农杆菌介导的转化转化。转基因事件用TaqMan^TM分析证实。

表5：两种不同杂种来源对不成熟胚的转化效率

对于BPS553×(HiIIA×A188)基因型而言，转化效率足够高，所以可以省略向共培养基中添加硝酸银和L-半胱氨酸。然而，添加这些化合物进一步提高转化效率。

为了证明杂种BPS553×(HiIIA×A188)的F2世代的可转化性，将BPS553×(HiIIA×A188)的F1植物自花传粉，如本申请中所述，根据共培养基中不使用L-半胱氨酸的方案转化F2不成熟胚。用F1和F2不成熟胚二者获得相似的转化效率(表6)。

表6：BPS553×(HiIIA×A188)杂种系F1和F2世代的转化比较。F2不成熟胚通过BPS553×(HiIIA×A188)的自花传粉F1植物来产生。转化实验在共培养中不添加L-半胱氨酸来进行。

F2

4

380

43

11.3

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Claims

1.用于制备转基因玉米植物的方法，其包括步骤：

a.分离玉米植物的不成熟胚，和

b.用共培养培养基将所述分离的不成熟胚与包含至少一个转基因T-DNA且属于根瘤菌科的细菌共培养，所述不成熟胚未进行去分化处理，所述T-DNA包含至少一个选择性标记基因，其中不成熟胚被置于琼脂共培养培养基表面的一层或多层滤纸上，或无琼脂培养基的平板中含液体共培养培养基溶液的一层或多层滤纸上，所述属于根瘤菌科的细菌具有Ti或Ri质粒的T-DNA转移相关功能元件，和

c.将所述共培养的不成熟胚转移至恢复培养基，所述恢复培养基包含：

i.有效量的至少一种抗生素，其抑制或阻抑属于根瘤菌科的细菌生长，和

ii.浓度从1g/l到10g/l的L-脯氨酸，和

iii.浓度从1μM到50μM的硝酸银，

iv.有效量的至少一种生长素化合物，

但是不含有效量的毒害植物的选择剂，和

i.有效量的至少一种生长素化合物，和

2.权利要求1的方法，其中所述不成熟的胚来自近交、杂种、近交之间的F1、近交和杂种之间的F1、近交和自然传粉变种之间的F1、市售F1变种、前述变种和前述任何后代之间杂交或自花传粉的任何F2。

3.权利要求1或2的方法，其中所述不成熟胚是处于传粉后不少于2 天的阶段中的胚。

4.权利要求1或2的方法，其中分离所述不成熟胚，并用属于根瘤菌科的细菌悬液直接接种，不经额外的预先洗涤步骤。

5.权利要求1的方法，其中分离所述不成熟胚、盾片侧向上置于固体共培养培养基表面并用一滴属于根瘤菌科的细菌悬液接种。

6.权利要求1的方法，其中生长素化合物是2，4-D和百草枯的组合。

7.权利要求5或6的方法，其中对共培养步骤而言，将属于根瘤菌科的细菌在感染培养基中的悬液直接用于每个胚，并在属于根瘤菌科的细菌接种后除去多余量的液体。

8.权利要求1或2的方法，其中有效量的生长素化合物为0.5mg/l到6mg/l浓度的2，4-D。

9.根据权利要求1或2的方法，其中对所述不成熟胚进行转化而不经去分化的预处理，在所述预处理中所述不成熟胚用酶处理或被损伤。

10.根据权利要求1或2的方法，其中对所述不成熟胚进行转化而不经去分化的预处理，在所述预处理中所述不成熟胚不用酶处理或不被损伤。

11.权利要求1或2的方法，其中属于根瘤菌科的细菌为卸甲根癌农杆菌或毛根农杆菌菌株。

12.权利要求1的方法，其中所述用于转化的属于根瘤菌科的细菌具有10⁶到10¹¹ CFU/ml的细胞群体。

13.权利要求1或2的方法，其中在共培养中使用的培养基包含1μM到10μM的硝酸银，和50mg/L到1，000mg/L的L-半胱氨酸。

14.权利要求1或2的方法，其中选择在单一选择步骤中完成，不经中间组织转移。

15.权利要求1或2的方法，其中来自再生步骤的生根小植株被直接转移进土壤培养基中。

16.权利要求1的方法，其中所述方法还包括将至少两个DNA构建体依次转化进植物，其包括步骤：

17.权利要求16的方法，其中所述第一基因为XI12ahas突变基因和/或其中所述第二基因为XA17ahas突变基因。

18.权利要求17的方法，其中XA17突变ahas基因编码如SEQ ID NO：3描述的氢基酸序列。