JP2008511294A - 非病害性アグロバクテリウム株、Ｒｉプラスミド、およびそれらに基づく形質転換方法 - Google Patents

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Abstract

本発明は、アグロバクテリウム株Ｋ５９９（ＮＣＰＰＢ ２６５９）の「非病害性」（disarmed）変異株、ＲｉプラスミドｐＲｉ２６５９の「非病害性」プラスミド変異体、およびそれらの誘導体、ならびに植物形質転換におけるこれら菌株およびプラスミドの利用方法に関する。
【選択図】図１Ｃ

Description

発明の分野
本発明は、アグロバクテリウム株Ｋ５９９（ＮＣＰＰＢ ２６５９）の「非病害性（disarmed）」変異株、ＲｉプラスミドｐＲｉ２６５９の「非病害性」プラスミド変異体、およびそれらの誘導体、ならびに植物形質転換におけるこれらの菌株およびプラスミドの利用方法に関する。
アグロバクテリウム属（最近の総説については、Gelvin 2003を参照されたい）は、いくつかの種に分類されてきた。しかしながら、この分類は、その大部分が病害の総体的症状および宿主域を反映したものであった。Ａ．ラジオバクター（A. radiobacter）は「無毒性」種であり、Ａ．ツメファシエンス（A. tumefaciens）はクラウンゴール病を引き起こし、Ａ．リゾゲネス（A. rhizogenes）は毛状根病を引き起こし、Ａ．ルビ（A. rubi）はケインゴール病を引き起こし、そしてＡ．ビティス（A. vitis）はブドウおよび少数の他の植物種でえい瘤を引き起こす（Otten 1984; Smith and Townsend 1907; Hildebrand 1934; for review on A. rhizogenes see Nilsson and Olsson, 1997）。Bergey’s Manual of Systematic Bacteriologyは今でもこの命名法を反映しているが、分類は複雑で紛らわしい。病害の総体的症状は、主に、Ｔｉ（腫瘍誘発性）プラスミドおよびＲｉ（根誘発性）プラスミドと呼ばれる大型プラスミドに由来するＤＮＡ（Ｔ−ＤＮＡ）が植物細胞ゲノム中に移入されたり、組み込まれたり、植物細胞ゲノム中で発現されたりすることに起因する（Van Laerebeke 1974; Chilton 1977, 1982; Moore 1979; White 1982; Tepfer 1983; Nester 1984）。特定のプラスミドを除去してこのプラスミドを他のタイプの腫瘍原性プラスミドと置き換えると、病害症状が変化する可能性がある。たとえば、ノパリン型ＴｉプラスミドｐＴｉＣ５８を含有するＡ．ツメファシエンスＣ５８が植物に感染すると、クラウンゴール奇形腫が発生する。このプラスミドを除去した場合、菌株は非病原性になる。除去処理された菌株にＲｉプラスミドを導入すると、細菌は発根性株に「変化」する（Lam 1984, White 1980）。さらに、Ａ．ツメファシエンスに由来するＴｉ（腫瘍誘発性）プラスミドをＡ．リゾゲネスに導入することが可能であり；得られる菌株は、リュウキュウベンケイソウ属（Kalanchoe）植物で改変された形態の腫瘍を誘発する（Costantino 1980）。したがって、単に一タイプの癌原性プラスミドを他のタイプのものと置き換えるだけでＡ．ツメファシエンスはＡ．リゾゲネスに「変化」しうるので、「種」という用語は無意味になる。したがって、これらの特徴は染色体外プラスミドにのみ関係しているので、細菌株をそれらのクラウンゴール表現型または毛状根表現型により区別する方法は、近年ではもはや適切とは思われない。ゲノムＤＮＡ分析の結果、以前はＡ．リゾゲネスとして分類されたいくつかの菌株がＡ．ツメファシエンスとの関連のほうが強かったり、その逆であったりすることが明らかにされた。
より意味のある分類体系では、アグロバクテリウム属は、増殖特性および代謝特性に基づいて「次亜種」に分けられる（Keane 1970）。この体系を用いると、ほとんどのＡ．ツメファシエンス株およびＡ．ルビ（Tighe 2000）株は次亜種Ｉに属し、Ａ．リゾゲネス株は次亜種ＩＩにあてはまり、次亜種ＩＩＩはＡ．ビティス株により代表される。つい最近、アグロバクテリウム属に対するさらに他の分類学的な分類体系が提案された（Young 2001）。Ａ．ツメファシエンスＣ５８の全ゲノム（線状染色体および環状染色体、Ｔｉプラスミド、ならびに他の大型プラスミドから構成される（Goodner 1999, 2001; Wirawan 1996））のＤＮＡ配列が最近すべて決定されたことは、アグロバクテリウム「株」を真の「種」に再分類するための出発点となりうる。ＲＡＰＤ（ランダム増幅多型ＤＮＡ）に基づく最近の分類は、ゲノムの差を反映したものであり、いくつかのアグロバクテリウム株の「ファミリー」樹を提供している（Llop 2003）。改変分類スキームがＳａｗａｄａにより提案された（Sawada 1993）。
アグロバクテリウムの遺伝的背景についてはほとんど探究されていないが、植物感染におけるそれらのＴｉプラスミドまたはＲｉプラスミドの機能については十分な知見がすでに存在する。Ｔ−ＤＮＡを動員するには、Ｔｉプラスミド上またはＲｉプラスミド上の他の場所に位置する遺伝子（まとめてｖｉｒ遺伝子と呼ばれる）の産物をトランスで創傷植物細胞由来の特定のエリシターで活性化させることにより、Ｔ−ＤＮＡの一本鎖コピー（Ｔ鎖）を合成して植物細胞に移入することが必要である（Zambryski 1992;Zupan 1995）。Ｔｉプラスミド上のＴ−ＤＮＡ配列は、Ｔ−ＤＮＡの認識（Wang 1984）に必要とされる短い２４ｂｐ直列反復配列（Yadav 1982）につなげられている。これらの境界領域を直接取り囲む配列は、右境界領域で開始されるＴ鎖合成の方向性に関与するように思われる（Wang 1987）。Ｔ−ＤＮＡ境界配列につなげられた外来ＤＮＡは、ベクターとしてＡ．ツメファシエンスを用いて植物細胞内に移入可能である（Hernalsteens 1980）。ホルモン合成に関与する生来型のＴ−ＤＮＡ遺伝子を不活性化または除去すれば、Ａ．ツメファシエンスは、クラウンゴール病症状を引き起こすことができなくなるであろう。病害症状に関与する遺伝子を不活性化または除去するこの過程は、「非病害化（disarming）」と称される。Ａ．ツメファシエンスを遺伝子操作する第１の方法は、導入された遺伝子でＴ−ＤＮＡの遺伝子を直接置き換えることにより、非病害化と所望の遺伝子の導入とが同時に含まれるものであった。「同型遺伝子接合」と称される方法（Matzke and Chilton, 1981）により、Ｔｉプラスミドの生来型のＴ−ＤＮＡは、形質転換のために所望の遺伝子で置き換えられた。Ａ．ツメファシエンスを遺伝子操作すべく開発された他のストラテジーは、単一のＴ−ＤＮＡ相同性領域と単一の境界配列とを含有する共組込み中間ベクター中に所望の遺伝子をクローニングすることを含むものであった。この系では、配列は、単一のクロスオーバー事象により組み換えられ、結果として、組み込まれた対象の遺伝子を含む完全ベクターを生じる（Horsch 1985）。共組込み系では、ＴｉプラスミドのＴ−ＤＮＡ領域と導入された組込みベクター上のＤＮＡ配列との間の相同性領域が対をなす。有用な共組込みプラスミドの一例は、ノパリン菌株（Ｃ５８）に由来するＴｉプラスミドの境界領域間の全Ｔ−ＤＮＡ領域がｐＢＲ３２２で置き換えられたｐＧＶ３８５０であり、したがって、ｐＢＲ３２２相同性を含有する任意の遺伝子構築物に対する組換え部位を提供する（Zambryski 1983）。
Ｔ−ＤＮＡがｖｉｒ遺伝子と同一のプラスミド上に存在する必要がないという発見（de Framond 1983; Hoekema 1983, 1985）に基づいて、バイナリーベクターが開発された。バイナリーベクターは、Ｔｉプラスミドとは分離してＡ．ツメファシエンス中に保持され、Ｔ−ＤＮＡ境界配列間に対象の遺伝子と植物選択マーカー遺伝子とを含有する。これらのベクターは、相同的組換え部位を有するように特定的に遺伝子操作の施されたＴｉプラスミドを必要としないので、大きな柔軟度を提供する。それが理由で、任意の非病害性Ａ．ツメファシエンス株を用いて、任意のバイナリーベクターの遺伝子を移入することが可能である。汎用性があるおかげで、バイナリーベクターは、現在のところ、植物におけるアグロバクテリウム媒介形質転換の対象となる遺伝子をクローニングするための好ましい媒介ベクターである。しかしながら、とくに、標的植物種がＡ．ツメファシエンスを介して非効率的にしか形質転換されない場合、バイナリーベクターと併用されるＡ．ツメファシエンス株はいずれも、それぞれのＴｉプラスミドが非病害化されたものでなければならない。さもなければ、バイナリーベクターの所望の遺伝子は、細菌の生来型のＴ−ＤＮＡの癌原性植物ホルモン遺伝子と一緒に共形質転換され、それにより、所望の遺伝子の形質転換効率が低下するとともに、標的細胞の多くで腫瘍原性病害症状を引き起こし、さらにはそれにより、これらの細胞の正常植物への分化が阻止されるであろう。
バイナリーベクターと一般に併用される野生型Ａ．ツメファシエンス株を非病害化する処理は、いくつかの場合には、同型遺伝子接合の形態を伴うものであった。Ｔ−ＤＮＡの外側に位置する領域と相同的であるＴｉプラスミド配列がつなげられたマーカー遺伝子を含有する媒介構築物は、細菌接合により野生型Ａ．ツメファシエンスに導入される（Hood 1986, 1993）。非病害性Ａ．ツメファシエンス株は、典型的には、その全Ｔ−ＤＮＡ配列が除去されているが、右境界配列を除去することによりＴ−ＤＮＡ動員を不活性化させることが可能であることも実証されている。すなわち、Ａ．ツメファシエンスのノパリン型菌株を用いた研究報告から、Ｔ−ＤＮＡの右境界領域は遺伝子移入に必要であるが、左境界領域は必要でないことが明らかにされている（Joos 1983; Peralto and Ream 985; Shaw 1984; Wang 1984）。アグロバクテリウム・ツメファシエンスは、さまざまな双子葉植物宿主域および追加的にいくつかの単子葉植物科の宿主域を有する（De Cleene 1976; Smith 1995）。Ａ．ツメファシエンスには、いくつかの異なる株が存在し、それぞれ、それらが感染した植物細胞中で合成されるオピンの型にちなんで命名されて、オクトピン型、ノパリン型、およびＬ，Ｌ−スクシナモピン型に分類される。これらの菌株は、同一ではないが類似した宿主域を有しており、さまざまな植物種に遺伝子移入すべく多くのタイプのＡ．ツメファシエンスの非病害性変種が使用され成功を収めている（van Wordragen 1992; Hood 1993）。
アグロバクテリウム・リゾゲネス株は、Ａ．ツメファシエンス株のときと同一の方法で分類される。典型的には、それらは、それらが産生するオピンにより分類される。最も一般的な菌株は、アグロピン型菌株（たとえば、ＲｉプラスミドｐＲｉ Ａ４により特徴付けられる）、マンノピン型菌株（たとえば、ＲｉプラスミドｐＲｉ８１９６により特徴付けられる）、およびククモピン型菌株（たとえば、ＲｉプラスミドｐＲｉ２６５９により特徴付けられる）である。いくつかの他の菌株は、ミキモピン型（たとえば、ＲｉプラスミドｐＲｉ１７２４により特徴付けられる）である。ミキモピンおよびククモピンは、立体異性体であるが、ヌクレオチドレベルでは、それらの間に相同性は見いだされていない（Suzuki 2001）。
ダイズ（Glycine max L. Merr.）は、Ａ．ツメファシエンスを用いた形質転換が非常に困難であることが判明しているが、その理由は、少なくとも部分的には、野生型Ａ．ツメファシエンスによる感染に対して抵抗性を有することにある。いくつかのダイズ品種およびＡ．ツメファシエンス株を用いた比較研究から、Ａ．ツメファシエンスのダイズ感染性はわずかであり、品種および細菌株の両方に依存することが示唆される（Bush 1991; Byrne 1987; Hood 1987）。Ａ．ツメファシエンスに対するダイズの抵抗性に関する問題は、組織培養でダイズを扱うことが困難であることによってさらに複雑になる。これまでにいくらかの進歩があったとはいえ、ダイズにおけるアグロバクテリウム媒介形質転換は、依然として非効率的で労力がかかるので、その効率を改善する方法が継続的に探索されている。
先に述べたように、いくつかのＡ．ツメファシエンス株は、他のものよりも容易にダイズに感染する。一菌株Ａ２８１は、ノパリン型Ｃ５８染色体的背景を有するきわめて毒性の強い広い宿主域のＬ，Ｌ−スクシナモピン型Ａ．ツメファシエンスであり、Ｌ，Ｌ−スクシナモピン型ＴｉプラスミドｐＴｉＢｏ５４２を含有する（Hood 1987）。この菌株を非病害化することにより、ダイズ形質転換に関連して現在広く使用されている菌株ＥＨＡ１０１およびＥＨＡ１０５が生産されてきた（Hood 1986, 1987）。種々の他の非病害性アグロバクテリウム株が報告されている（Ａ２０８、ＵＳ５，４１６，０１１；ＬＢＡ４４０４、ＷＯ ９４／０２６２０）。Hood et al. (1993)には、３種のＴｉプラスミド（それぞれ、オクトピン型、ノパリン型、およびＬ，Ｌ−スクシナモピン型）の非病害化が開示されている。アグロバクテリウム・ツメファシエンス株Ａ２８１およびＥＨＡ１０１は、ダイズを形質転換しうるものとして開示されている。菌株Ａ２８１に由来するプラスミドｐＴｉＢｏ５４２の非病害性誘導体が開示され、ｐＥＨＡ１０５と名付けられている。
いくつかの植物種のアグロバクテリウム・リゾゲネスＲｉ形質転換植物は、短縮された節間、皺のある葉、および多数の側方分枝を有する過剰な根量を特徴とする表現型を有する（Tepfer 1984）。Ｒｉ Ｔ−ＤＮＡ中のｒｏｌ遺伝子は、植物ホルモンに対する感受性の変化および／または植物ホルモンの代謝の変化を引き起こす（Maurel 1994; Moritz and Schmuelling 1998; Nilsson 1997; Shen 1988）。さらに、Ａ．リゾゲネスの感染による植物組織の形質転換は、特定の代謝産物の産生を増大させる（Ermayanti 1994; Mano 1986; Sim 1994）。
生来型の「病害性（armed）」アグロバクテリウム・リゾゲネスＫ５９９（ｐＲｉ２６５９）は、Ｊａｃｋ、Ｗｉｌｌｉａｍｓ ８２、Ｃａｒｔｔｅｒ、Ｆａｙｅｔｔｅ、Ｈａｒｔｗｉｇ、Ｍａｎｄａｒｉｎ、Ｌｅｅ ６８、Ｐｅｋｉｎｇ、およびＰＩ４３７６５４（Cho 2000）をはじめとするさまざまなダイズ品種において毛状根形成を誘発しうる。
Ａ．リゾゲネスの場合、菌株８１９６のマンノピンＲｉプラスミドは、ｐＴｉ Ｔ−ＤＮＡオンコジーンのいずれとも相同性を共有しない単一のＴ領域を有する（Lahners 1984）。この観測から、ｔｍｒ Ｔｉ突然変異体におけるｔｍｓ発現に基づくものとは異なる新規な機序がこの菌株による根誘発に関与していることが示唆される。Ａ４のようなアグロピン菌株の場合、Ｒｉプラスミドの２つの異なる領域（ＴＬ領域およびＴＲ領域）が植物ゲノムに移入される（Huffman 1984; Jouanin 1984; White 1985）。菌株Ａ４により形質転換された植物で見られるＴＬ−ＤＮＡのサイズは、かなり一定しているが、ＴＲ−ＤＮＡの長さは、より変動的である。Ａ．ツメファシエンスのＴ領域とのハイブリダイゼーションにより、ｐＲｉ ＴＲ領域において、アグロピン合成に関与するオクトピンＴｉプラスミドのＴＲ−ＤＮＡの遺伝子との相同性が明らかにされた。一般的なｐＴｉオンコジーン間では、ｆｍ遺伝子座との相同性のみが見いだされたことから（Willmitzer 1982; Huffman 1984; Jouanin 1984）、たとえ、再生されたすべての形質転換植物のゲノム中にｔｍｓ様遺伝子が見いだされなくても、ＴＲ−ＤＮＡ指令オーキシン合成が根誘発の役割を担う可能性のあることが示唆される（Taylor 1985; Jouanin 1986a）。これとは対照的に、ＴＬ領域は、ｐＴｉ Ｔ−ＤＮＡの遺伝子にハイブリダイズしない（Jouanin 1984）。Slightom et al. (1986)により確定されたＴＬ−ＤＮＡ配列から、ヌクレオチドレベルでこの相同性不在が確認される。しかしながら、ＴＬ−ＤＮＡは、マンノピンｐＲｉ８１９６の単一のＴ領域とかなり相同的であるので、形質転換根を誘発しうる可能性がある。
Ｖｉｌａｉｎｅら（Vilaine 1987）は、ＴＬ−ＤＮＡ単独の移入さらにはＴＲ−ＤＮＡ単独の移入が感染植物断片で根誘発を引き起こさないことを実証し、このことから、アグロピン型Ｒｉプラスミドには根誘発に関して２つの独立した分子機序が存在することを示唆した。Ｖｉｌａｉｎｅらはさらに、ＲｉプラスミドｐＲｉＡ４に由来するＴＬ領域、ＴＲ領域、またはＴＬ領域とＴＲ領域の両方を欠失させることによりアグロピン型アグロバクテリウム・リゾゲネスＡ４ＲＳ株を非病害化すると、Ａ．リゾゲネス株ＲＳ（ｐＲｉＢ２７８ｂ）が得られると記載している。非病害性ＲｉプラスミドとＴＬ領域またはＴＲ領域を保有するコスミドとの接合により毛状根表現型が「レスキュー」されると記載されている。該非病害性Ａ．リゾゲネス株を遺伝子移入に使用することについては開示されていない。
アグロバクテリウム・ツメファシエンス媒介植物形質転換は、多くの植物種に対して植物バイオテクノロジー産業における標準になってきているが、アグロバクテリウム・リゾゲネスの使用は、ごくわずかに行われているにすぎない。現在までのところ、外来遺伝子を植物中に組み込むために、生来型の「病害性」アグロバクテリウム・リゾゲネス株だけが利用されたにすぎない（たとえば、Narayanan 1999; Kouchi 1999）。Ａ．リゾゲネスを用いてバイナリーベクターのＴ−ＤＮＡを「トランスで」移入することも可能であるので、双子葉植物種中に外来ＤＮＡを導入するためのベクターとしてＲｉプラスミドが使用されてきた（Bevan 1984; Simpson 1986; Hamill 1991）。しかしながら、これらの開示で利用されたアグロバクテリウム・リゾゲネス株は、（それらの生来型のＲｉプラスミドを含むことが原因で）「病害性」であるので、依然として毛状根表現型を誘発する可能性がある（たとえば、Narayanan 1999を参照されたい）。
植物形質転換に関係する問題点のいくつかは、当技術分野で報告された方法により克服されたが、依然として改良および代替的手順がかなり必要とされている。アグロバクテリウム媒介形質転換法の領域で著しい進歩がみられるが、そのような方法、さらにはとくに、標準的Ａ．ツメファシエンス株による形質転換に対して抵抗性のある単子葉植物および双子葉植物の形質転換法、の容易性、速度、および効率を向上させる改良された方法の必要性が依然として存在する。したがって、本発明の目的は、広範にわたるさまざまな植物種に対して改良された形質転換効率を与える代替法を提供することであった。この目的は本発明により解決される。
発明の概要
本発明では、植物細胞中へのＴ−ＤＮＡ送達のためにアグロバクテリウム株Ｋ５９９（ＮＣＰＰＢ ２６５９）の「非病害性」変異株を使用する。これ以降では、「Ａ．リゾゲネス」株としてこれまでの分類を利用しない。なぜなら、毛状根誘発性表現型（これは、細菌ゲノムに起因するのではなくＲｉプラスミドに起因する）のほかに、リボソームｒＤＮＡ配列の比較分析に基づいて、菌株は、他のＡ．リゾゲネス株にごくわずかに関連付けられるにすぎないと思われるからである。したがって、該菌株はユニークであると考えられ、一義的にＡ．ツメファシエンス型またはＡ．リゾゲネス型の菌株であるとみなされるものではない。
本発明の第１の実施形態は、以下のステップ：
ａ） アグロバクテリウム株Ｋ５９９（ＮＣＰＰＢ ２６５９）または該菌株の誘導体のトランスジェニック非病原性変異株の細菌を準備するステップ、ここで、該変異株は植物細胞に感染可能であるが、毛状根表現型誘発性を欠損し、かつ該変異株はさらにトランスジェニックＴ−ＤＮＡを含むものである、および
ｂ） 植物細胞を前記細菌と共培養するステップ、および
ｃ） 安定的にゲノムに組み込まれた前記トランスジェニックＴ−ＤＮＡを含んでなる植物細胞を単離または選択するステップ
を含む、トランスジェニック植物細胞の作製方法に関する。
本発明の他の実施形態は、以下のステップ：
ａ） アグロバクテリウム株Ｋ５９９（ＮＣＰＰＢ ２６５９）または該菌株の誘導体のトランスジェニック非病原性変異株の細菌を準備するステップ、ここで、該変異株は植物細胞に感染可能であるが、毛状根表現型誘発性を欠損し、かつ該変異株はさらにトランスジェニックＴ−ＤＮＡを含むものである、および
ｂ） 植物体、植物細胞または植物組織を前記細菌と共培養するステップ、および
ｃ） 安定的にゲノムに組み込まれた前記トランスジェニックＴ−ＤＮＡを含んでなる植物を単離または選択し、かつ任意により再生するステップ
を含む、トランスジェニック植物の作製方法に関する。
本発明に係る方法は、実質的にすべての種類の植物、好ましくは、単子葉植物、双子葉植物、および裸子植物からなる群より選択される植物に由来する植物細胞、植物組織、または植物体を形質転換するために使用可能である。より好ましくは、植物は、ウマゴヤシ属（Medicago）、トマト属（Lycopersicon）、アブラナ属（Brassica）、キュウリ属（Cucumis）、ナス属（Solanum）、クルミ属（Juglans）、ワタ属（Gossypium）、リンゴ属（Malus）、ブドウ属（Vitis）、キンギョソウ属（Antirrhinum）、ハコヤナギ属（Populus）、イチゴ属（Fragaria）、シロイヌナズナ属（Arabidopsis）、トウヒ属（Picea）、トウガラシ属（Capsicum）、アカザ属（Chenopodium）、キク属（Dendranthema）、アサガオ属（Pharbitis）、マツ属（Pinus）、エンドウ属（Pisum）、イネ属（Oryza）、トウモロコシ属（Zea）、コムギ属（Triticum）、ライコムギ属（Triticale）、ライムギ属（Secale）、ドクムギ属（Lolium）、オオムギ属（Hordeum）、ダイズ属（Glycine）、トガサワラ属（Pseudotsuga）、リュウキュウベンケイ属（Kalanchoe）、フダンソウ属（Beta）、ヒマワリ属（Helianthus）、およびタバコ属（Nicotiana）からなる群より選択される属に由来する。
本発明の好ましい実施形態では、トランスジェニックＴ−ＤＮＡは、植物で発現可能な選択マーカー遺伝子を少なくとも１つ含む。
本発明の他の実施形態は、アグロバクテリウム株Ｋ５９９（ＮＣＰＰＢ ２６５９）または該菌株の誘導体の非病原性変異株（これ以降では「非病害性」変異株）に関し、ただし、該変異株は、植物細胞に感染可能であるが、毛状根表現型誘発性を欠損している。本発明の他の実施形態は、アグロバクテリウム株Ｋ５９９（ＮＣＰＰＢ ２６５９）または該菌株の誘導体のトランスジェニック非病原性変異株に関し、ただし、該変異株は、植物細胞に感染可能であるが、毛状根表現型誘発性を欠損し、かつ該変異株は、トランスジェニックＴ−ＤＮＡをさらに含む。
本発明の好ましい実施形態では、アグロバクテリウム株Ｋ５９９（ＮＣＰＰＢ ２６５９）（または該菌株の誘導体）の前記非病原性変異株は、植物細胞に感染可能であり、植物細胞へのＴ−ＤＮＡの移入を媒介することが可能であり、かつ植物ゲノムへのＴ−ＤＮＡの挿入を媒介することが可能であるが、毛状根表現型誘発性は欠損している。より好ましくは、これは、ＲｉプラスミドｐＲｉ２６５９（アグロバクテリウム株Ｋ５９９；ＮＣＰＰＢ ２６５９中の生来型のＲｉプラスミド）またはその誘導体の非病原性プラスミド変異体の存在により達成される。前記非病原性プラスミド変異体は、好ましくは、植物細胞感染および形質転換に必要とされる機能をすべて提供するが、毛状根表現型を誘発する配列を欠損している。
アグロバクテリウム株Ｋ５９９（ＮＣＰＰＢ２６５９）の誘導体は、好ましくは、配列番号５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、および１４により示される配列モチーフからなる群より選択される少なくとも１つの配列モチーフを含む１６Ｓ−２３Ｓ ｒＲＮＡ遺伝子間配列により特徴付けられる土壌の植物病原性細菌である。非病原性変異株は、突然変異型もしくはキメラ型のｖｉｒＡ遺伝子またはｖｉｒＧ遺伝子の存在あるいは強毒性プラスミドの存在からなる群より選択される１つ以上の特徴をさらに含みうる。アグロバクテリウム株Ｋ５９９（ＮＣＰＰＢ２６５９）の非病原性変異株は、ｐＲｉ２６５９プラスミドの非病原性プラスミド変異体（以下に定義されるとおり）を含みうる。
本発明のさらに他の実施形態は、ｐＲｉ２６５９（アグロバクテリウム株Ｋ５９９；ＮＣＰＰＢ ２６５９中の生来型のＲｉプラスミド）またはその誘導体の非病原性プラスミド変異体に関し、ただし、該プラスミド変異体は、植物細胞感染および形質転換に必要とされる機能を提供するが、毛状根表現型を誘発する配列を欠損している（これ以降では「非病害性」プラスミド変異体）。好ましくは、とくに分離型（バイナリー）ベクター中に含まれるトランスジェニックＴ−ＤＮＡと組み合わせて使用する場合、前記「非病害性」プラスミド変異体は、植物ゲノム中に移入されうるエレメント（たとえばＴ−ＤＮＡエレメントなど）を含んでいない。そのような「非病害性」プラスミド変異体を提供する種々の手段が存在する。これは、Ｔ−ＤＮＡの境界領域を非機能的にすることにより（たとえば突然変異誘発により）または好ましくはＲｉプラスミドから全Ｔ−ＤＮＡを欠失させることにより、実現可能である。
本発明に係るとくに好ましい一実施形態では、前記非病原性プラスミド変異体は、
ａ） 配列番号２４により示される配列または配列番号２４により示される配列のうち少なくとも１００個の連続したヌクレオチドからなる配列、を含む配列、および
ｂ） 配列番号２４により示される配列、または配列番号２４により示される配列のうち少なくとも１０００個の連続したヌクレオチドからなる配列、に対して少なくとも９０％の配列同一性を有する配列、および
ｃ） ５×ＳＳＰＥ、１％ＳＤＳ、５×デンハルト試薬および１００μｇ／ｍＬの変性サケ精子ＤＮＡからなる溶液中、６８℃での結合またはハイブリダイゼーションと、それに続く、０．１×ＳＳＰＥおよび０．１％ＳＤＳを含む溶液中、６８℃での洗浄と、等価の条件下で、配列番号２４により示される配列もしくはその相補配列のうち少なくとも１００個の連続したヌクレオチドからなるプローブにハイブリダイズする配列、
により示される配列の群より選択される少なくとも１つの配列を含んでいる。
プラスミドｐＲｉ２６５９の非病害性変種の単離された配列が本発明で提供される。したがって、本発明の好ましい実施形態は、
ａ） 配列番号２４により示される配列または配列番号２４により示される配列のうち少なくとも１００個の連続したヌクレオチドからなる配列、を含む配列、および
ｂ） 配列番号２４により示される配列、または配列番号２４により示される配列のうち少なくとも１０００個の連続したヌクレオチドからなる配列、に対して少なくとも９０％の配列同一性を有する配列、および
ｃ） ５×ＳＳＰＥ、１％ＳＤＳ、５×デンハルト試薬および１００μｇ／ｍＬの変性サケ精子ＤＮＡからなる溶液中、６８℃での結合またはハイブリダイゼーションと、それに続く、０．１×ＳＳＰＥおよび０．１％ＳＤＳを含む溶液中、６８℃での洗浄と、等価の条件下で、配列番号２４により示される配列もしくはその相補配列のうち少なくとも１００個の連続したヌクレオチドからなるプローブにハイブリダイズする配列、
により示される配列の群より選択される、単離されたヌクレオチド配列に関する。
より好ましくは、前記非病原性プラスミド変異体は、上述の非病害性ｐＲｉ２６５９プラスミドまたは誘導体（先に定義したとおり）を記述するヌクレオチド配列により記述される。さらにより好ましくはまたは他の選択肢として、誘導体は、配列番号１１２により示される配列に対して少なくとも８５％のアミノ酸配列同一性を有するｖｉｒＤ２タンパク質をコードしている。前記ｖｉｒＤ２タンパク質は、非病害性ｐＲｉ２６５９プラスミドの形質転換性能の向上に対する重要な因子であると予想される。したがって、本発明の他の実施形態は、
ａ） 配列番号１１２により示される配列またはそのうちの少なくとも２００個の連続したアミノ酸からなる配列、
ｂ） 配列番号１１２により示される配列に対して少なくとも８５％（好ましくは少なくとも９０％もしくは９２％、より好ましくは少なくとも９５％もしくは９８％、最も好ましくは少なくとも９９％）の配列同一性を有する配列
からなる群より選択されるアミノ酸配列を含むポリペプチドに関する。
しかしながら、非病害性ｐＲｉ２６５９プラスミドによりコードされる他のタンパク質もまた、形質転換過程の最適化に有用であると考えられるので、本発明の他の実施形態は、
ａ） 配列番号２５、２６、２７、２８、２９、３０、３１、３２、３３、３４、３５、３６、３７、３８、３９、４０、４１、４２、４３、４４、４５、４６、４７、４８、４９、５０、５１、５２、５３、５４、５５、５６、５７、５８、５９、６０、６１、６２、６３、６４、６５、６６、６７、６８、６９、７０、７１、７２、７３、７４、７５、７６、７７、７８、７９、８０、８１、８２、８３、８４、８５、８６、８７、８８、８９、９０、９１、９２、９３、９４、９５、９６、９７、９８、９９、１００、１０１、１０２、１０３、１０４、１１４、１１５、１１６、１１７、１１８、１１９、１２０、１２１、１２２、１２３、１２４、１２６、１２８、１２９、１３０、１３１、１３２、１３３、１３４、１３６、１３７、１３９、１４０、１４２、１４３、１４４、１４５、１４６、１４７、１４８、１４９、１５０、１５１、１５２、１５４、１５５、１５６、１５８、１５９、１６１、１６２、１６３、１６４、１６５、１６６、１６７、１６８、１６９、１７０、１７１、１７２、１７３、１７４、１７５、１７６、１７７、１７８、１７９、１８０、１８１、１８２、１８３、１８４、１８５、１８６、もしくは１８７のいずれか１つにより示される配列またはそのうちの少なくとも２００個の連続したアミノ酸（好ましくは少なくとも３００個の連続したアミノ酸、より好ましくは少なくとも４００個の連続したアミノ酸、好ましくはすべての連続したアミノ酸）からなる配列、
ｂ） 配列番号２５、２６、２７、２８、２９、３０、３１、３２、３３、３４、３５、３６、３７、３８、３９、４０、４１、４２、４３、４４、４５、４６、４７、４８、４９、５０、５１、５２、５３、５４、５５、５６、５７、５８、５９、６０、６１、６２、６３、６４、６５、６６、６７、６８、６９、７０、７１、７２、７３、７４、７５、７６、７７、７８、７９、８０、８１、８２、８３、８４、８５、８６、８７、８８、８９、９０、９１、９２、９３、９４、９５、９６、９７、９８、９９、１００、１０１、１０２、１０３、１０４、１１４、１１５、１１６、１１７、１１８、１１９、１２０、１２１、１２２、１２３、１２４、１２６、１２８、１２９、１３０、１３１、１３２、１３３、１３４、１３６、１３７、１３９、１４０、１４２、１４３、１４４、１４５、１４６、１４７、１４８、１４９、１５０、１５１、１５２、１５４、１５５、１５６、１５８、１５９、１６１、１６２、１６３、１６４、１６５、１６６、１６７、１６８、１６９、１７０、１７１、１７２、１７３、１７４、１７５、１７６、１７７、１７８、１７９、１８０、１８１、１８２、１８３、１８４、１８５、１８６、または１８７のいずれか１つにより示される配列に対して少なくとも８５％（好ましくは少なくとも９０％もしくは９２％、より好ましくは少なくとも９５％もしくは９８％、最も好ましくは少なくとも９９％）の配列同一性を有する配列、
からなる群より選択されるアミノ酸配列を含むポリペプチドに関する。
本発明のさらに他の実施形態は、前記ポリペプチドをコードする単離された核酸配列に関する。これらの配列は、単離された天然の配列（ｐＲｉ２６５９プラスミド中に含まれる配列）または遺伝暗号の縮重に基づいて誘導される他の配列でありうる。
したがって、本発明の好ましい実施形態は、ｐＲｉ２６５９またはその誘導体の非病原性プラスミド変異体に関し、ただし、該プラスミド変異体は、生来型の病原性ｐＲｉ２６５９またはその誘導体の植物細胞感染および形質転換に必要とされる配列を含むが、Ｔ−ＤＮＡ、好ましくは、ＧｅｎＢａｎｋ登録番号ＡＪ２７１０５０（配列番号４）により特徴付けられる配列の塩基５３８付近から塩基１５５１９付近までの配列または配列番号２６により特徴付けられる配列の塩基３６４４付近から塩基１８５７７付近までの配列を欠損している。この配列は、病原性アグロバクテリウム株Ｋ５９９（ＮＣＰＰＢ ２６５９）中に提供される元の病原性ＲｉプラスミドｐＲｉ２６５９のＴ−ＤＮＡに対応する。より好ましくは、前記非病原性プラスミド変異体は、高ストリンジェンシーの条件下（たとえば、５×ＳＳＰＥ、１％ＳＤＳ、５×デンハルト試薬および１００μｇ／ｍＬの変性サケ精子ＤＮＡからなる溶液中、６８℃での結合またはハイブリダイゼーションと、それに続く、０．１×ＳＳＰＥおよび０．１％ＳＤＳを含む溶液中、６８℃での洗浄と、等価の条件下）で、病原性アグロバクテリウム株Ｋ５９９（ＮＣＰＰＢ ２６５９）中に提供される元の病原性ＲｉプラスミドｐＲｉ２６５９とハイブリダイズするが、該高ストリンジェンシーの条件下で、ＧｅｎＢａｎｋ登録番号ＡＪ２７１０５０（配列番号４）により特徴付けられる配列の塩基５３８付近から塩基１５５１９付近までの配列、配列番号２６により特徴付けられる配列の塩基３６４４付近から塩基１８５７７付近までの配列のいずれともハイブリダイズしない、配列である。
より好ましくは、ｐＲｉ２６５９の誘導体は、植物細胞への土壌細菌由来のＴ−ＤＮＡの移入を媒介することができ、
ａ） 生来型のｐＲｉ２６５９プラスミド（アグロバクテリウム株Ｋ５９９（ＮＣＰＰＢ２６５９）に含まれるものと同様）をコードするＤＮＡに対して少なくとも９０％の配列同一性を有すること、または
ｂ） ５×ＳＳＰＥ、１％ＳＤＳ、５×デンハルト試薬および１００μｇ／ｍＬの変性サケ精子ＤＮＡからなる溶液中、６８℃での結合またはハイブリダイゼーションと、それに続く、０．１×ＳＳＰＥおよび０．１％ＳＤＳを含む溶液中、６８℃での洗浄と、等価の高ストリンジェンシーの条件下で、生来型のｐＲｉ２６５９プラスミドとハイブリダイズすること、
によりさらに特徴付けられるプラスミドである。
好ましくは、アグロバクテリウム株Ｋ５９９（ＮＣＰＰＢ ２６５９）またはその誘導体の前記トランスジェニック非病原性変異株中のＴ−ＤＮＡは、植物感染に必要とされる特徴を提供するプラスミドとは分離してバイナリーベクタープラスミド（たとえば、新生物誘発性もしくは毛状根誘発性を欠損しているＴｉプラスミドまたはＲｉプラスミド）に含まれる。好ましくは、Ｔ−ＤＮＡは、少なくとも右境界配列（より好ましくは右境界配列および左境界配列）につなげられている。好ましいのは、Ｔｉおよび／またはＲｉ境界領域である。好ましい実施形態では、前記トランスジェニックＴ−ＤＮＡは、農学上有益な形質を前記植物に付与するための少なくとも１つの発現カセットを含んでいる。他の好ましい実施形態では、前記Ｔ−ＤＮＡは、形質転換された植物体、植物細胞、もしくは植物組織の選択および／または特定を可能にする少なくとも１つのマーカー遺伝子をさらに含んでいる。
プラスミドｐＲｉ２６５９のＴ−ＤＮＡ境界領域は、Ｔ−ＤＮＡの移入ひいてはトランスジェニック植物（特定的にはトランスジェニックダイズ植物）の生産にとくに有効であることが実証されている。したがって、本発明の他の実施形態は、アグロバクテリウム・リゾゲネスｐＲｉ２６５９プラスミドに由来する少なくとも１つのＴ−ＤＮＡ境界領域につなげられたトランスジェニックＴ−ＤＮＡに関し、ただし、該トランスジェニックＴ−ＤＮＡは、毛状根表現型を誘発する配列を含まない。好ましくは、前記境界配列の少なくとも１つは、配列番号１８または１９により示される。より好ましくは、前記トランスジェニックＴ−ＤＮＡは、農学上有益な形質または少なくとも１つのマーカー遺伝子を前記植物に付与するための少なくとも１つの発現カセットを含む。ただし、該マーカー遺伝子は、形質転換された植物体、植物細胞、もしくは植物組織の選択および／または特定を可能にする。本発明の他の課題は、本発明に係る前記トランスジェニックＴ−ＤＮＡを含むトランスジェニックベクターに関する。
本発明の他の実施形態は、本発明に係るヌクレオチド配列、非病原性プラスミド変異体、またはトランスジェニックＴ−ＤＮＡを含む、細胞または非ヒト生物に関する。好ましくは、前記細胞または非ヒト生物は、細菌、酵母、植物、哺乳動物、および昆虫からなる群より選択される。好ましい一実施形態では、前記細胞または生物は、リゾビウム科（genus Rhizobiaceae）の土壌細菌である。他の好ましい実施形態では、前記細胞または生物は、植物細胞または植物生物、より好ましくは、単子葉植物および双子葉植物からなる群より選択される。
本発明の他の目的、利点、および特徴は、以下の説明から明らかになろう。
図面の簡単な説明
図１Ａ：ＲＡＰＤ（ランダム増幅多型ＤＮＡ）により決定したときのアグロバクテリウム株の関係を示す樹状図（Llob 2003の図２）。種々の菌株の説明については、以下の表１を参照されたい。アグロバクテリウム株Ｋ５９９（ＮＣＰＰＢ ２６５９）は、この条件下では、Ｃ５８やＡｃｈ５のような伝統的な「アグロバクテリウム・ツメファシエンス」株と区別されるだけでなくＮＣＰＰＢ ８１９６やＡＴＣＣ １５８３４のような他の「アグロバクテリウム・リゾゲネス」株とも区別される異なるグループの変種に分類される。
図１Ｂ：１６Ｓ ｒＲＮＡ比較により決定したときのアグロバクテリウム株の関係を示す樹状図。配列は、Ｃｌｕｓｔａｌ Ｗプログラム（Saitou 1987）を用いて編集されている。菌株は、それらのそれぞれの１６Ｓ ｒＲＮＡのＧｅｎＢａｎｋ登録番号により示されている。以下の菌株が評価対象となっている：
Figure 2008511294
図１Ｃ：ｖｉｒＤ２アミノ酸配列比較により決定したときのアグロバクテリウム株の関係を示す樹状図。配列は、Ｃｌｕｓｔａｌ Ｗプログラム（Saitou 1987）を用いて編集されている。菌株は、それらのそれぞれのｖｉｒＤ２タンパク質のＧｅｎＢａｎｋ登録番号により示されている。以下の菌株が評価対象となっている：
Figure 2008511294
図２：アグロバクテリウムプラスミドｐＲｉ２６５９のＴ−ＤＮＡ領域の物理的制限地図。矢印は、右境界領域および左境界領域を示している（出典：Combard 1987）。
図３：ＡＧＬ１（ｐＢＰＳＭＭ１９２ｂ）（Ｉ）またはＳＨＡ０１６（ｐＢＰＳＭＭ１９２ｂ）（ＩＩ）のいずれかと２日間共培養した後の葉腋成長点外植片のダイズにおける一過的ＧＵＳ発現（５日間）。ＳＨＡ０１６／ｐＢＰＳＭＭ１９２ｂは、非病害性トランスジェニックアグロバクテリウムＫ５９９変異株である。ＡＧＬ１／ｐＢＰＳＭＭ１９２ｂは、対照菌株である。アグロバクテリウム株ＳＨＡ００１およびＳＨＡ０１６は、アグロバクテリウム株Ｋ５９９（ＮＣＰＰＢ ２６５９）（ｐＲｉ２６５９Δｔｅｔ）の機能的に等価な菌株である。すなわち、非病害性ｐＲｉ２６５９Δｔｅｔプラスミドを含む。
図４：アグロバクテリウムＳＨＡ００１（ｐＢＰＳＥＷ００８）を感染させた葉腋成長点外植片を用いたときの感染後３５日目のダイズにおける安定なＧＵＳ発現（Ｉ、ＩＩ、ＩＩＩ：種々の外植片についての実施例）。ＳＨＡ００１（ｐＢＰＳＥＷ００８）は、非病害性トランスジェニックアグロバクテリウムＫ５９９変異株（ｐＲｉ２６５９Δｔｅｔ）である。
図５：ｐＢＰＳＭＭ１９２ｂを含有する組換えＳＨＡ００１を用いたときのトランスジェニックトマト幼植物（Ａ）およびトランスジェニック葉におけるＧＵＳ発現（Ｂ）。ＳＨＡ００１（ｐＢＰＳＭＭ１９２ｂ）は、非病害性トランスジェニックアグロバクテリウムＫ５９９変異株（ｐＲｉ２６５９Δｔｅｔ）である。
図６：非病害性テトラサイクリンマーカー付きＫ５９９（ｐＲｉ２６５９Δｔｅｔ）のサザンハイブリダイゼーション。右境界領域でプローブしたときにダブルクロスオーバー事象のハイブリダイズバンドが消失したことから、ｐＲｉ２６５９からＴ−ＤＮＡ領域が欠失されたことが示唆される（下側のサザン）。上側のサザンのハイブリダイズバンドから、Ｔ−ＤＮＡ欠失部の外側の隣接ＤＮＡの存在が示唆される。
ＲＦ＝右隣接部プローブを用いたハイブリダイゼーション
ＲＢ＝左隣接部プローブを用いたハイブリダイゼーション
ＷＴ＝野生型
Ｓ＝野生型Ｔ−ＤＮＡおよび欠失型Ｔ−ＤＮＡの両方を含む挿入をもたらすシングルクロスオーバー組換えの結果として生じたクローン
ＣＳ＝シングルであることが確認されたもの；シングルクロスオーバーの結果として生じたクローンとバンドパターンマッチングで計算されたバンドサイズ（中間産物）
Ｄ＝目標のＴ−ＤＮＡ欠失をもたらすダブルクロスオーバー組換えの結果として生じたクローン（目標の最終産物）
図７：ダイズ子葉を用いた毛状根アッセイ
［ａ］ 非病害性Ｋ５９９による感染は毛状根を誘発しない。
［ｂ］ 野生型Ｋ５９９による感染は毛状根を誘発する。
図８：植物細胞における一過的ＧＵＳ発現（構築物の説明については、以下の実施例を参照されたい）。
Ａ：トウモロコシ胚形質転換。ＳＨＡ００１は、非病害性アグロバクテリウムＫ５９９変異株である。ＬＢＡ４４０４は、対照菌株である。
Ｂ：種々のバイナリーベクターと組み合わされたＳＨＡ００１による他の植物組織の形質転換（以下の図に示されている；説明については、実施例を参照されたい）。Ｉ：ダイズ苗腋生節；ＩＩ：ダイズ器官形成カルス；ＩＩＩ：トマト子葉。
図９：ＡＨＡＳで選択された安定なＴ１トランスジェニックシロイヌナズナ。アグロバクテリウム株ＭＰ９０（対照菌株１）、野生型アグロバクテリウム株Ｋ５９９（対照菌株２）、および非病害性アグロバクテリウム株Ｋ５９９（ＳＨＡ００１）を用いて、形質転換を行った。各菌株は、それぞれ、バイナリープラスミドｐＢＰＳＥＷ００８またはｐＢＰＳＭＭ１９２ｂのいずれかを含む。
図１０：安定なＴ１トランスジェニックシロイヌナズナのＧＵＳ染色。ＡＨＡＳで選択された安定なＴ１トランスジェニックシロイヌナズナ。アグロバクテリウム株ＭＰ９０（対照菌株１）、野生型アグロバクテリウム株Ｋ５９９（対照菌株２）、および非病害性アグロバクテリウム株Ｋ５９９（ＳＨＡ００１）を用いて、形質転換を行った。各菌株は、それぞれ、バイナリープラスミドｐＢＰＳＥＷ００８またはｐＢＰＳＭＭ１９２ｂのいずれかを含む。
図１１：右隣接領域および左隣接領域を含むプラスミドｐＲｉ２６５９ Ｔ−ＤＮＡ領域の地図。
図１２：菌株Ｋ５９９を非病害化するために使用した欠失カセットを構築するために使用したステップを詳述したフローチャート。
図１３：Ａ：ベクターｐＢＰＳＭＭ１９２ｂおよびｐＢＰＳＭＭ２３２のプラスミド地図
Ｂ：ベクターｐＢＰＳＥＷ００８のプラスミド地図。
図１４：Ａ〜Ｅ：土壌細菌の種々の１６Ｓ−２３Ｓ ｒＲＮＡ遺伝子間配列領域のアライメント。
Ｋ５９９： アグロバクテリウム株Ｋ５９９（ＮＣＰＰＢ ２６５９）
ＡＥ００８９８０： アグロバクテリウム・ツメファシエンスＣ５８
ＡＥ００９３４８： アグロバクテリウム・ツメファシエンスＣ５８
ＡＥ００８２６５： アグロバクテリウム・ツメファシエンスＣ５８
ＡＥ００７９４８： アグロバクテリウム・ツメファシエンスＣ５８
ＡＥ００９２０１： アグロバクテリウム・ツメファシエンスＣ５８
Ｕ４５３２９： アグロバクテリウム・ビティスＮＣＰＰＢ３５５４
ＡＥ１０２７３５： アグロバクテリウム・ツメファシエンス（リゾビウム・ラジオバクター）ＭＡＦＦ３０１００１
アグロバクテリウム株Ｃ５８は、４つのｒＲＮＡオペロンを有する。これらは、Ｋ５９９の１６Ｓ−２３Ｓ ｒＲＮＡ遺伝子間配列に最も近い既知の類縁体である。他のアグロバクテリウム株に由来する他の１６Ｓ−２３Ｓ ｒＲＮＡ遺伝子間配列は、低い相同性を有し、十分に蓄積されていなかった。このことから、この領域は、アグロバクテリウム株Ｋ５９９と他の近縁種とを区別するシグネチャー配列として使用するのに十分な多様性を呈することがわかる。１６Ｓ−２３Ｓ ｒＲＮＡ遺伝子間配列とは、１６Ｓ ｒＲＮＡと２３Ｓ ｒＲＮＡとの間の領域のことであり、通常、ｔＲＮＡ（たとえば、Ｉｌｅ、Ａｌａ、Ａｓｐ、Ｔｒｐ）をコードする。
図１５：非病害性アグロバクテリウム株Ｋ５９９（ｐＲｉ２６５９Δ）で形質転換されたダイズＴ１およびＴ０植物体のサザンハイブリダイゼーション。ゲノムＤＮＡをＨｉｎｄＩＩＩで消化し、ｇｕｓＩＮＴ遺伝子でプローブした。Ｔ−ＤＮＡ中にはＨｉｎｄＩＩＩ部位が１つ存在する。Ｍ＝１ｋｂマーカー；ｗｔ＝非形質転換ゲノムＤＮＡ；レーン１〜７、それぞれのＴ１系列；レーン８、Ｔ０植物体。
図１６：アグロバクテリウム種の種々のｖｉｒＤ２アミノ酸配列のアライメント。ｐＲｉ２６５９によりコードされるｖｉｒＤ２タンパク質（配列番号１１２）をその既知の相同体と区別するユニークな突然変異は、アステリスク（＊）が記されている。
ＴｉＡＢ２／７３： アグロバクテリウム・ツメファシエンス
ＴｉＡ６： アグロバクテリウム・ツメファシエンス
Ｔｉ−ＳＵＫＵＲＡ： アグロバクテリウム・ツメファシエンス
ＲｉＡ４： アグロバクテリウム・リゾゲネス
Ｒｉ１７２４： アグロバクテリウム・リゾゲネス
Ｒｉ２６５９： アグロバクテリウム株Ｋ５９９
一般的定義
略号： ＢＡＰ：６−ベンジルアミノプリン； ２，４−Ｄ：２，４−ジクロロフェノキシ酢酸； ＭＳ：ムラシゲ・スク−グ培地； ＮＡＡ：１−ナフタレン酢酸； ＭＥＳ：２−（Ｎ−モルホリノ）−エタンスルホン酸； ＩＡＡ：インドール酢酸； Ｋａｎ：硫酸カナマイシン； ＧＡ３：ジベレリン酸； チメンチン（Ｔｉｍｅｎｔｉｎ）ＴＭ：チカルシリンジナトリウム／クラブラン酸カリウム。
当然のことながら、本発明は、記載のごとき特定の方法、プロトコル、細胞株、植物種もしくは属、構築物、および試薬に限定されるものではない。同様に当然のことながら、本明細書中で使用される用語は、特定の実施形態を説明することだけを目的としたものにすぎず、添付の特許請求の範囲によってのみ限定される本発明の範囲を限定しようとするものではない。本明細書および添付の特許請求の範囲で使用する場合、単数形は、文脈上明らかに異なる場合を除いて、複数形表現を包含することに留意しなければならない。したがって、たとえば、「ベクター」が言及された場合、１つもしくはそれ以上のベクターが言及されたことになり、また、当業者に公知のその等価物などが包含される。
「約（付近）」という用語は、本明細書中では、近似的、概算、およそ、または近傍という意味で使用される。「約」という用語が数値範囲と組み合わせて使用された場合、境界値が記載の数値超および数値未満に拡張されて、その範囲は変更される。一般的には、「約」という用語は、本明細書中では、２０パーセント、好ましくは１０パーセントの上下（高低）変動により、数値を指定値超および指定値未満に変更するように使用される。
本明細書中で使用する場合、「または」という単語は、特定のリストのいずれか１つのメンバーを意味するとともに、そのリストのメンバーの任意の組合せをも包含する。
「農学上有益な形質」には、食品製造または食品製品（植物の一部分および植物生産物を包含する）に有用もしくは有利な植物生物の任意の表現型が包含される。紙などのような非食品農業製品もまた、包含される。農学上有益な形質の部分的なリストには、有害生物抵抗性、生長力、発育期間（収穫までの期間）、栄養素含有量の増大、新規な成長パターン、風味もしくは色、耐塩性、耐暑性、耐乾燥性、耐寒性などが含まれる。好ましくは、農学上有益な形質には、選択マーカー遺伝子（たとえば、形質転換細胞の検出または選択を容易にするためにのみ使用される除草剤耐性または抗生物質耐性をコードする遺伝子）、植物ホルモン（たとえば、選択のためにのみ使用されるオーキシン、ジベレリン、サイトカイニン、アブシジン酸、およびエチレン）の産生を引き起こすホルモン生合成遺伝子、レポーター遺伝子（たとえば、ルシフェラーゼ、グルクロニダーゼ、クロラムフェニコールアセチルトランスフェラーゼ（ＣＡＴ）など）はいずれも包含されない。そのような農学上有益な重要な形質には、有害生物抵抗性（たとえば、Melchers 2000）、生長力、発育期間（収穫までの期間）、栄養素含有量の増大、新規な成長パターン、風味もしくは色、耐塩性、耐暑性、耐乾燥性、耐寒性（たとえば、Sakamoto 2000; Saijo 2000; Yeo 2000; Cushman 2000）などの改良が包含されうる。当業者であれば、これらのおよび他の農学上有益な形質を付与すべく選択される多数のポリヌクレオチドが存在することはわかるであろう。
「核酸」という用語は、デオキシリボヌクレオチドまたはリボヌクレオチド、および一本鎖もしくは二本鎖、センスもしくはアンチセンスのいずれかの形態のそれらのポリマーまたはハイブリッドを意味する。とくに指示がないかぎり、特定の核酸配列は、明示された配列だけでなく、その保存的改変変異体（たとえば縮重コドン置換体）および相補的配列をも暗黙的に包含する。「核酸」という用語は、本明細書中では、「遺伝子」、「ｃＤＮＡ」、「ｍＲＮＡ」、「オリゴヌクレオチド」、および「ポリヌクレオチド」と同義的に使用される。
「核酸配列」という表現は、５’末端から３’末端の方向に解読されるデオキシリボヌクレオチド塩基またはリボヌクレオチド塩基の一本鎖もしくは二本鎖のポリマーを意味する。それは、染色体ＤＮＡ、自己複製プラスミド、ＤＮＡまたはＲＮＡの感染性ポリマー、および主に構造的役割を担うＤＮＡまたはＲＮＡを包含する。「核酸配列」はまた、ヌクレオチドを表す略号、文字、記号、または単語の連続的リストを意味する。一実施形態では、核酸は、比較的短い核酸（通常は１００ヌクレオチド長未満）である「プローブ」でありうる。多くの場合、核酸プローブは、約５０ヌクレオチド長〜約１０ヌクレオチド長である。核酸の「標的領域」は、対象となる特定される核酸部分である。核酸の「コード領域」は、適切な調節配列の制御下に配置されたときに特定のポリペプチドまたはタンパク質を産生するように配列特異的に転写および翻訳される核酸部分である。コード領域は、そのようなポリペプチドまたはタンパク質をコードすると言われる。
「対象のヌクレオチド配列」という用語は、当業者によりなんらかの理由で（たとえば、向上した品質を付与するために）操作することが望ましいとみなされうる任意のヌクレオチド配列を意味する。そのようなヌクレオチド配列としては、構造遺伝子（たとえば、レポーター遺伝子、選択マーカー遺伝子、薬剤耐性遺伝子、増殖因子など）のコード配列、およびｍＲＮＡやタンパク質産物をコードしない非コード調節配列（たとえば、プロモーター配列、ポリアデニル化配列、終止配列、エンハンサー配列など）が挙げられるが、これらに限定されるものではない。対象の核酸配列は、好ましくは、農学上有益な形質をコードしうる。
「アンチセンス」という用語は、標的配列に相補的な配列を有する核酸、たとえば、標的配列とのハイブリダイゼーションにより発現のブロックを開始させようと試みられるメッセンジャーＲＮＡ（ｍＲＮＡ）配列を意味するものと解釈される。
「センス」という用語は、標的配列と相同もしくは同一の配列を有する核酸、たとえば、タンパク質転写因子に結合して所与の遺伝子の発現に関与する配列を有する核酸を意味するものと解釈される。好ましい実施形態によれば、核酸は、対象の遺伝子、および該対象の遺伝子の発現を可能にするエレメントを包含する。
「遺伝子」という用語は、なんらかの形でポリペプチドの発現を調節しうる適切な調節配列に機能しうる形で連結されたコード領域を意味する。遺伝子には、コード領域（オープンリーディングフレーム、ＯＲＦ）の前（上流）および後（下流）のＤＮＡの非翻訳調節領域（たとえば、プロモーター、エンハンサー、リプレッサーなど）、さらには、妥当な場合には、個々のコード領域（すなわちエキソン）間の介在配列（すなわちイントロン）が包含される。本明細書中で使用する場合、「構造遺伝子」という用語は、ｍＲＮＡに転写されてから特定のポリペプチドに特有なアミノ酸の配列に翻訳されるＤＮＡ配列を意味するものとする。
「ゲノム」または「ゲノムＤＮＡ」という用語は、宿主生物の遺伝可能な遺伝情報を意味する。前記ゲノムＤＮＡは、核のＤＮＡ（染色体ＤＮＡとも呼ばれる）だけでなくプラスチド（たとえば葉緑体）および他の細胞オルガネラ（たとえばミトコンドリア）のＤＮＡをも包含する。好ましくは、ゲノムまたはゲノムＤＮＡという用語は、核の染色体ＤＮＡを意味する。
「染色体ＤＮＡ」または「染色体ＤＮＡ配列」という用語は、細胞周期状態に依存しない細胞核のゲノムＤＮＡとして解釈されるものとする。したがって、染色体ＤＮＡは、染色体中または染色分体中に組織化されうるものであり、凝縮状または非コイル状でありうる。染色体ＤＮＡ中への挿入は、たとえば、ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）分析、サザンブロット分析、蛍光ｉｎ ｓｉｔｕハイブリダイゼーション（ＦＩＳＨ）、およびｉｎ ｓｉｔｕ ＰＣＲのような当技術分野で公知の種々の方法により実証および分析が可能である。
本明細書中で使用する場合、構造遺伝子に関連して使用されるときの「コード領域」という用語は、ｍＲＮＡ分子の翻訳の結果として生じる新生ポリペプチド中に見いだされるアミノ酸をコードするヌクレオチド配列を意味する。コード領域は、真核生物の場合、５’側では、イニシエーターメチオニンをコードするヌクレオチドトリプレット「ＡＴＧ」により、３’側では、停止コドンを指定する３つのトリプレット（すなわち、ＴＡＡ、ＴＡＧ、ＴＧＡ）のうちの１つにより、境界付けられる。イントロンを含有するほかに、ゲノム形態の遺伝子はまた、ＲＮＡ転写産物に存在する配列の５’末端および３’末端の両方に位置する配列を含みうる。これらの配列は、「隣接」配列または領域（これらの隣接配列は、ｍＲＮＡ転写産物に存在する非翻訳配列の５’側または３’側に位置する）と呼ばれる。５’隣接領域は、遺伝子の転写を制御したりまたはそれに影響を及ぼしたりするプロモーターやエンハンサーのような調節配列を含有しうる。３’隣接領域は、転写の終止、転写後の切断およびポリアデニル化を指令する配列を含有しうる。
本明細書中で使用する場合、「アミノ酸配列」という用語は、アミノ酸残基を表す略号、文字、記号、または単語のリストを意味する。アミノ酸は、本明細書中では、それらの一般に知られる三文字記号またはＩＵＰＡＣ−ＩＵＢ生化学命名法委員会（Biochemical Nomenclature Commission）により推奨される一文字記号のいずれかで参照可能である。
ヌクレオチドも同様に、それらの一般に受け入れられている一文字コードにより参照可能である。「ポリペプチド」、「ペプチド」、「オリゴペプチド」、「ポリペプチド」、「遺伝子産物」、「発現産物」、および「タンパク質」という用語は、本明細書中では、連続したアミノ酸残基のポリマーまたはオリゴマーを参照すべく同義的に使用される。
本明細書中で使用する場合、「単離された」という用語は、物質がその元の環境から取り出されたことを意味する。たとえば、生きている動物中に存在する天然のポリヌクレオチドまたはポリペプチドは、単離されたものではないが、天然で共存する物質の一部もしくは全部から分離させた同一のポリヌクレオチドまたはポリペプチドは、単離されたものである。そのようなポリヌクレオチドは、ベクターの一部分であったり、かつ／または、そのようなポリヌクレオチドまたはポリペプチドは、組成物の一部分であったりすることもあり、そうであれば、そのようなベクターまたは組成物がその元の環境の一部分ではないという点で単離されたものである。好ましくは、「単離された核酸配列」の場合のように核酸に関連して使用されるときの単離された」という用語は、同定され、かつその天然源中で通常はそれと一体化されている少なくとも１種の混入核酸から分離された、核酸配列を意味する。単離された核酸は、天然に見いだされるものとは異なる形態または周囲状態で存在する核酸である。これとは対照的に、単離されていない核酸は、天然に存在する状態で見いだされるＤＮＡやＲＮＡのような核酸である。たとえば、所与のＤＮＡ配列（たとえば遺伝子）は、隣接する遺伝子に近接して宿主細胞染色体上に見いだされ；特異的タンパク質をコードする特異的ｍＲＮＡ配列のようなＲＮＡ配列は、多数のタンパク質をコードする多数の他のｍＲＮＡとの混合物として細胞内に見いだされる。しかしながら、たとえば配列番号１８を含む単離された核酸配列は、一例として、核酸配列が天然の細胞のものとは異なる染色体内位置または染色体外位置に存在するか、さもなければ天然に見いだされるものとは異なる核酸配列がつなげられている、通常は配列番号１８を含有する細胞内の核酸配列を包含する。単離された核酸配列は、一本鎖または二本鎖の形態で存在しうる。単離された核酸配列を利用してタンパク質を発現させる場合、核酸配列は、最低限、センス鎖またはコード鎖の少なくとも一部分を含有するであろう（すなわち、核酸配列は一本鎖でありうる）。他の選択肢として、それは、センス鎖およびアンチセンス鎖の両方を含有しうる（すなわち、核酸配列決は二本鎖でありうる）。
本明細書中で使用する場合、「精製された」という用語は、自然環境から取り出された、単離された、または分離された、核酸配列またはアミノ酸配列のいずれかの分子を意味する。したがって、「単離された核酸配列」は、精製された核酸配列である。「実質的に精製された」分子は、天然でそれらと一体化されている他の成分が少なくとも６０％除去、好ましくは少なくとも７５％除去、より好ましくは少なくとも９０％除去されたものである。
生物のポリペプチド配列または核酸配列に関連する「野生型」、「天然」、または「天然源」という用語は、該生物が天然に存在するものであるか、またはヒトによる改変、突然変異、他の操作がいずれも行われていない少なくとも１つの天然に存在する生物中に入手可能なものであることを意味する。
「ポリヌクレオチド構築物」とは、少なくとも一部分が組換え法により作製された核酸を意味する。「ＤＮＡ構築物」という用語は、デオキシリボヌクレオチドからなるポリヌクレオチド構築物を意味する。構築物は、一本鎖または好ましくは二本鎖でありうる。構築物は、環状または線状でありうる。当業者は、ＤＮＡ構築物の１つを取得するためのさまざまな方法に精通している。構築物は、たとえば、Maniatis 1989, Silhavy 1984、およびAusubel 1987に記載されているように、慣用的な組換え技術およびクローニング技術を利用して調製可能である。
「相補的」または「相補性」という用語は、塩基対形成規則により関連付けられるヌクレオチド配列を参照する際に使用される。たとえば、配列５’−ＡＧＴ−３’は、配列５’−ＡＣＴ−３’に相補的である。相補性は、「部分的」または「全体的」でありうる。「部分的」相補性とは、塩基対形成規則に基づいて１つ以上の核酸塩基が一致しないものである。「全体的」または「完全」な核酸間相補性とは、塩基対形成規則に基づいてすべての核酸塩基が他の塩基と一致するものである。核酸鎖間の相補度は、核酸鎖間のハイブリダイゼーションの効率および強度に顕著な影響を及ぼす。本明細書中で使用される核酸配列の「相補体」とは、核酸配列の核酸に対して全体的相補性を示す核酸からなるヌクレオチド配列を意味する。
核酸に関連して使用されるときの「相同性」または「同一性」という用語は、相補度を意味する。２つの核酸間の相同性または同一性は、いずれの場合にも、プログラムアルゴリズムＧＡＰ（Wisconsin Package Version 10.0, University of Wisconsin, Genetics Computer Group (GCG), Madison, USA）を用いてパラメーターを以下のように設定して比較することにより計算される配列の全長にわたる核酸配列の同一性を意味するものと解釈される：
ギャップ加重： １２ 長さ加重： ４
平均マッチ： ２．９１２ 平均ミスマッチ： ２．００３。
たとえば、核酸レベルで配列番号２０の配列に対して少なくとも９５％の相同性（または同一性）を有する配列は、上記のプログラムアルゴリズムにより上記のパラメーターセットを用いて配列番号２０の配列と比較したときに、少なくとも９５％の相同性を有する配列を意味するものと解釈される。部分的相同性（すなわち１００％未満の部分的同一性）または完全な相同性（すなわち１００％の完全な同一性）が存在しうる。
他の選択肢として、部分的に相補的な配列は、完全に相補的な配列が標的核酸にハイブリダイズするのを少なくとも部分的に阻害するものであると解釈され、「実質的に相同な」という機能的用語を用いて参照される。標的配列への完全に相補的な配列のハイブリダイゼーションの阻害は、低ストリンジェンシーの条件下でハイブリダイゼーションアッセイ（サザンブロットまたはノーザンブロット、溶液ハイブリダイゼーションなど）を用いて調べることが可能である。実質的に相同な配列またはプローブ（すなわち、対象の他のオリゴヌクレオチドにハイブリダイズしうるオリゴヌクレオチド）は、低ストリンジェンシーの条件下で標的への完全に相同な配列の結合（すなわちハイブリダイゼーション）と競合しそれを阻害するであろう。このことは、低ストリンジェンシーの条件が非特異的結合を許容するものであると言っているわけではなく；低ストリンジェンシーの条件は、２つの配列の相互の結合が特異的（すなわち選択的）作用であることを必要とする。非特異的結合の不在は、部分的相補度（たとえば、約３０％未満の同一性）さえも欠如している第２の標的を用いることにより試験可能であり；非特異的結合の不在下では、プローブは、第２の非相補的標的にハイブリダイズしないであろう。
ｃＤＮＡまたはゲノムクローンのような二本鎖核酸配列に関連して使用する場合、「実質的に相同な」という用語は、以下に記載されるように低ストリンジェンシーの条件下で二本鎖核酸配列の一方もしくは両方の鎖にハイブリダイズしうる任意のプローブを意味する。一本鎖核酸配列に関連して使用する場合、「実質的に相同な」という用語は、以下に記載されるような低ストリンジェンシーの条件下で一本鎖核酸配列にハイブリダイズしうる任意のプローブを意味する。
本明細書中で使用される「ハイブリダイゼーション」という用語は、「核酸の鎖が塩基対形成を介して相補鎖と一体化する任意の過程」を包含する（Coombs 1994）。ハイブリダイゼーションおよびハイブリダイゼーション強度（すなわち核酸間の一体化強度）は、核酸間の相補度、関係する条件のストリンジェンシー、形成されるハイブリッドのＴｍ、および核酸中のＧ：Ｃ比のような因子による影響を受ける。
本明細書中で使用する場合、「Ｔｍ」という用語は、「融解温度」を参照する際に使用される。融解温度とは、二本鎖核酸分子の集団が半分解離されて一本鎖になる温度のことである。核酸のＴｍを計算する式は、当技術分野で周知である。標準的参考文献により示されるように、Ｔｍ値の簡単な推定値は、核酸が１Ｍ ＮａＣｌの水溶液中に存在する場合、式：Ｔｍ＝８１．５＋０．４１（Ｇ＋Ｃの％）により計算可能である［たとえば、Anderson and Young, Quantitative Filter Hybridization, in Nucleic Acid Hybridization (1985)を参照されたい］。他の参考文献には、Ｔｍを計算するために構造および配列の特徴を考慮したより高度な計算が記載されている。
核酸ハイブリダイゼーションに関連して使用されるときの低ストリンジェンシーの条件は、約１００〜約１，０００ヌクレオチド長のＤＮＡプローブを利用する場合、５×ＳＳＰＥ（４３．８ｇ／Ｌ ＮａＣｌ、６．９ｇ／Ｌ ＮａＨ２ＰＯ４・Ｈ２Ｏ、および１．８５ｇ／Ｌ ＥＤＴＡ、ｐＨはＮａＯＨを用いて７．４に調整される）、１％ＳＤＳ、５×デンハルト試薬［５０×デンハルト試薬は、５００ｍＬあたり次の物質を含有する：５ｇフィコール（Type 400, Pharmacia）、５ｇ ＢＳＡ（Fraction V; Sigma）］、および１００μｇ／ｍＬの変性サケ精子ＤＮＡからなる溶液中、６８℃での結合またはハイブリダイゼーションと、それに続く、０．２×ＳＳＰＥおよび０．１％ＳＤＳを含む溶液中、室温での洗浄と、等価の条件を含む。
核酸ハイブリダイゼーションに関連して使用されるときの高ストリンジェンシーの条件は、約１００〜約１，０００ヌクレオチド長のプローブを利用する場合、５×ＳＳＰＥ、１％ＳＤＳ、５×デンハルト試薬、および１００μｇ／ｍＬの変性サケ精子ＤＮＡからなる溶液中、６８℃での結合またはハイブリダイゼーションと、それに続く、０．１×ＳＳＰＥおよび０．１％ＳＤＳを含む溶液中、６８℃での洗浄と、等価の条件を含む。
対象のハイブリダイゼーション条件に関連させてハイブリダイゼーション条件を参照するときの「等価な」という用語は、ハイブリダイゼーション条件および対象のハイブリダイゼーション条件が、同一範囲の相同性パーセント（％）を有する核酸配列のハイブリダイゼーションを引き起こすことを意味する。たとえば、対象のハイブリダイゼーション条件が、第１の核酸配列と、第１の核酸配列に対して８０％〜９０％の相同性を有する他の核酸配列とのハイブリダイゼーションを引き起こす場合、他のハイブリダイゼーション条件は、もしもこの他のハイブリダイゼーション条件もまた、第１の核酸配列と、第１の核酸配列に対して８０％〜９０％の相同性を有する他の核酸配列とのハイブリダイゼーションを引き起こすのであれば、対象のハイブリダイゼーション条件と等価であると言われる。
核酸ハイブリダイゼーションに関連して使用する場合、低ストリンジェンシーまたは高ストリンジェンシーのいずれかの条件を含む多数の等価な条件を利用しうることは当技術分野で周知であり；プローブの長さおよび性質（ＤＮＡ、ＲＮＡ、塩基組成）および標的の性質（ＤＮＡ、ＲＮＡ、塩基組成、溶液中に存在するかまたは固定されているかなど）ならびに塩および他の成分の濃度（たとえば、ホルムアミド、デキストラン硫酸、ポリエチレングリコールの存在または不在）のような因子を考慮して、ハイブリダイゼーション溶液を変更することにより、先に列挙した条件とは異なるがそれと等価である低ストリンジェンシーまたは高ストリンジェンシーのいずれかのハイブリダイゼーション条件をもたらすことが可能である。非特異的結合を低減または排除するには、より高いストリンジェンシーが好ましい可能性があり、さまざまな相同性を有するより多数の核酸配列を検出するには、より低いストリンジェンシーが好ましい可能性があることは、当業者の熟知するところである。
「トランスジーン」、「トランスジェニック」、または「組換え」とは、ヒトにより操作されたポリヌクレオチドまたはヒトにより操作されたポリヌクレオチドのコピーもしくは相補体を意味する。たとえば、第２のポリヌクレオチドに機能しうる形で連結されたプロモーターを含むトランスジェニック発現カセットは、発現カセットを含む単離された核酸のヒトによる操作の結果として第２のポリヌクレオチドに対して異種であるプロモーターを含みうる（たとえば、Sambrook 1989, or Current Protocols in Molecular Biology Volumes 1-3, John Wiley & Sons, Inc. (1994-1998)に記載の方法により）。他の例では、組換え発現カセットは、ポリヌクレオチドが天然に見いだされるものと極端に異なるように組み合わされたポリヌクレオチドを含みうる。たとえば、ヒトにより操作された制限部位またはプラスミドベクター配列により、プロモーターを第２のポリヌクレオチドにつなげたりまたはそれから分離したりすることが可能である。当業者であればわかるであろうが、ポリヌクレオチドは、多くの方法で操作可能であり、上述の例に限定されるものではない。
本明細書中で使用される「トランスジェニック」または「組換え」という用語（たとえば、植物細胞または植物体に関連して）は、トランスジーンを含有するか、またはトランスジーンの導入により改変されたゲノムを有するか、または組み込まれた外来の遺伝子もしくはＤＮＡ配列（たとえば、限定されるものではないが、おそらく通常は存在しない遺伝子もしくはＤＮＡ配列、所与の細胞型で通常は転写および翻訳（「発現」）されない遺伝子、または形質転換されていない細胞および／もしくは植物体に導入することが望まれる任意の他の遺伝子もしくはＤＮＡ配列、たとえば、形質転換されていない細胞および／もしくは植物体に通常存在しうるが発現を改変することが望まれる遺伝子）を有する、細胞および／または植物体を意味するものとする。好ましくは、核酸に関連して本明細書中で使用される「組換え」という用語は、核酸が、その自然環境では隣接していない核酸に隣接して共有結合されることを意味する。トランスジェニックな細胞、組織、および植物体は、ヒトが介入して核酸（通常はＤＮＡ）を含む「トランスジーン」を標的細胞に導入したりまたはトランスジーンを標的細胞の染色体に組み込んだりすることを含むいくつかの方法により、たとえば、本明細書に記載の方法により、生産可能である。
本明細書中で使用される「トランスジーン」という用語は、実験操作により細胞のゲノム中に導入される任意の核酸配列を意味する。トランスジーンは、「内因性ＤＮＡ配列」または「異種ＤＮＡ配列」（すなわち「外来ＤＮＡ」）でありうる。「内因性ＤＮＡ配列」という用語は、天然に存在する配列と比較してなんら改変（たとえば、点突然変異、選択マーカー遺伝子の存在など）を含有しない限りにおいて、導入される細胞中に天然に見いだされるヌクレオチド配列を意味する。
たとえば核酸配列（または該核酸配列を含む生物、発現構築物、もしくはベクター）に関連する「トランスジーン」または「トランスジェニック」という用語は、実験操作により生成されるすべての構築物を意味する。ただし、
ａ）該核酸配列、または
ｂ）該核酸配列ａ）に機能しうる形で連結された遺伝子制御配列、たとえばプロモーター、または
ｃ）（ａ）および（ｂ）、
はいずれも、その天然の遺伝子環境で配置されていないか、または実験操作により改変されている。改変の例は、１つ以上のヌクレオチド残基の置換、付加、欠失、逆位、または挿入である。天然の遺伝子環境とは、起源の生物における天然の染色体座またはゲノムライブラリーにおける存在を意味する。ゲノムライブラリーの場合、核酸配列の天然の遺伝子環境は、好ましくは、少なくとも部分的に保持される。該環境は、核酸配列の少なくとも一方の側につなげられ、少なくとも５０ｂｐ、好ましくは少なくとも５００ｂｐ、とくに好ましくは少なくとも１、０００ｂｐ、なかでもとくに好ましくは少なくとも５，０００ｂｐの長さを有する。天然に存在する発現構築物（たとえば、プロモーターと対応する遺伝子との天然に存在する組合せ）は、たとえば突然変異誘発のような非自然的合成的「人工的」方法により改変された場合、トランスジェニック発現構築物になる。そのような方法は報告されている（ＵＳ５，５６５，３５０；ＷＯ ００／１５８１５）。
「異種核酸配列」または「異種ＤＮＡ」という用語は、天然では連結されないかまたは天然では異なる位置に連結されている核酸配列に連結されたかまたは連結されるように操作されたヌクレオチド配列を参照すべく同義的に使用される。異種ＤＮＡは、それが導入される細胞に内在するものではなく、他の細胞から取得されたものである。異種ＤＮＡはまた、なんらかの改変を含有する内因性ＤＮＡ配列を包含する。一般的には、異種ＤＮＡは、それが発現される細胞により通常は産生されないＲＮＡおよびタンパク質をコードするが、必ずしもそうであるとはかぎらない。異種ＤＮＡの例としては、レポーター遺伝子、転写および翻訳の調節配列、選択マーカータンパク質（たとえば、薬剤耐性を付与するタンパク質）などが挙げられる。好ましくは、調節配列（たとえば、本発明に係るプロモーター）に関連する「トランスジェニック」または「組換え」という用語は、該調節配列が、その自然環境では隣接していない核酸に隣接して共有結合されることを意味する。
「外来遺伝子」という用語は、実験操作により細胞のゲノム中に導入される任意の核酸（たとえば、遺伝子配列）を意味し、導入される遺伝子が、天然に存在する遺伝子と比較してなんらかの改変（たとえば、点突然変異、選択マーカー遺伝子の存在など）を含有する限りにおいて、その細胞中に見いだされる遺伝子配列を含みうる。
「組換え」ポリペプチドまたはタンパク質とは、組換えＤＮＡ技術により作製されたポリペプチドまたはタンパク質、すなわち、所望のポリペプチドまたはタンパク質をコードする外因性組換えＤＮＡ構築物により形質転換された細胞から産生されたポリペプチドまたはタンパク質を意味する。組換え核酸およびポリペプチドはまた、その状態で天然に存在するものではなく、ヒトにより改変、変更、突然変異、または他の操作が行われた分子を包含しうる。好ましくは、「組換えポリペプチド」は、配列中の少なくとも１つのアミノ酸残基が天然に存在するポリペプチドのものと異なる天然に存在しないポリペプチドである。前記組換えポリペプチドおよび／または核酸を作製するための好ましい方法は、限定的もしくは非限定的突然変異誘発、ＤＮＡシャッフリング、または他の反復的組換え法を包含しうる。
「遺伝子改変生物」または「ＧＭＯ」という用語は、トランスジーンＤＮＡを含む任意の生物を意味する。代表的な生物としては、植物、動物、および微生物が挙げられる。
本明細書中で使用される「細胞」または「植物細胞」という用語は、単一細胞を意味する。複数形の「細胞」という用語は、細胞の集団を意味する。集団は、１つの細胞型を含む純粋な集団でありうる。同様に、集団は、２つ以上の細胞型を含みうる。本発明では、細胞集団が含みうる細胞型の数に制限はない。細胞は、同調的であっても同調的でなくてもよい。本発明の意味の範囲内の植物細胞は、単離されたもの（たとえば、懸濁培養状態のもの）であってもよいし、任意の発育段階の植物組織、植物器官、または植物体に含まれるものであってもよい。
植物に関連する「器官」（または「植物器官」）という用語は、植物の一部分を意味し、たとえば、根、果実、苗条、茎、葉、葯、萼片、花弁、花粉、種子などを包含する（ただし、これらに限定されるものではない）。
植物に関連する「組織」（または「植物組織」）という用語は、植物の分化組織または未分化組織を含めて複数の植物細胞の構成体を意味する。植物組織は、植物器官の一部分（たとえば、植物の葉の表皮）を構成しうるだけでなく、腫瘍組織（たとえば、カルス組織）および培養下の種々の細胞型（たとえば、単一細胞、プロトプラスト、胚、カルス、プロトコーム様体など）をも構成しうる。植物組織は、植物内、器官培養物中、組織培養中、または細胞培養物中に存在しうる。
本明細書中で使用される「植物」という用語は、複数の植物細胞を意味し、その大部分は、植物の発育の任意の段階で存在する構造体に分化されている。そのような構造体としては、１つ以上の植物器官、たとえば、果実、苗条、茎、葉、花弁などが挙げられるが、これらに限定されるものではない。好ましくは、「植物」という用語は、全植物体、苗条の栄養器官／構造体（たとえば、葉、茎、および塊茎）、根、花および花の器官／構造体（たとえば、苞葉、萼片、花弁、雄蕊、心皮、葯、および胚珠）、種子（胚、胚乳、および種皮を含む）および果実（成熟子房）、植物の組織（たとえば、維管束組織、基本組織など）および細胞（たとえば、孔辺細胞、卵細胞、毛状突起など）、ならびにそれらの後代を包含する。本発明に係る方法に使用しうる植物のクラスは、一般的には、形質転換技術に適した高等植物および下等植物のクラスと同程度に広範囲であり、たとえば、被子植物（単子葉植物および双子葉植物）、裸子植物、シダ類、および多細胞藻類が挙げられる。それは、異数体、倍数体、二倍体、一倍体、および半接合体をはじめとするさまざまな倍数レベルの植物を包含する。植物界の高等植物および下等植物の属および種はすべて、本発明の範囲内に包含される。さらに、成熟植物体、種子、苗条および苗、ならびに一部分、増殖材料（たとえば、種子および果実）、さらにはそれから誘導される培養物、たとえば細胞培養物が包含される。好ましいのは、次の植物科の植物および植物材料である：ヒユ科（Amaranthaceae）、アブラナ科（Brassicaceae）、ナデシコ科（Carophyllaceae）、アカザ科（Chenopodiaceae）、キク科（Compositae）、ウリ科（Cucurbitaceae）、シソ科（Labiatae）、マメ科（Leguminosae）、ソラマメ亜科（Papilionoideae）、ユリ科（Liliaceae）、アマ科（Linaceae）、アオイ科（Malvaceae）、バラ科（Rosaceae）、ユキノシタ科（Saxifragaceae）、ゴマノハグサ科（Scrophulariaceae）、ナス科（Solanaceae）、ツルナ科（Tetragoniaceae）。
一年生植物、多年生植物、単子葉植物、および双子葉植物は、トランスジェニック植物を作製させるのに好ましい宿主生物である。本発明に係る組換え系または方法の使用はさらに、すべての観賞植物、林業用、果実用、もしくは観賞用の高木、花、切花、低木、または芝生に有利である。前記植物としては、コケ植物、たとえば、苔綱（Hepaticae）（ゼニゴケ）および蘚綱（Musci）（スギゴケ）；シダ植物、たとえば、シダ、トクサ、およびヒカゲノカズラ；裸子植物、たとえば、針葉樹、ソテツ、イチョウ、およびグネツム綱（Gnetaeae）；藻類、たとえば、緑藻綱（Chlorophyceae）、褐藻綱（Phaeophpyceae)、紅藻網（Rhodophyceae）、藍藻綱（Myxophyceae）、黄緑藻綱（Xanthophyceae）、珪藻綱（Bacillariophyceae）（珪藻）、およびユーグレナ藻綱（Euglenophyceae）が挙げられうるが、これらに限定されるものではない。
本発明の目的に合った植物は、バラのようなバラ科（Rosaceae）、ロードデンドロンやアザレアのようなツツジ科（Ericaceae）、ポインセチアやクロトンのようなトウダイグサ科（Euphorbiaceae）、ナデシコのようなナデシコ科（Caryophyllaceae）、ペチュニアのようなナス科（Solanaceae）、アフリカスミレのようなイワタバコ科（Gesneriaceae）、キツリフネのようなツリフネソウ科（Balsaminaceae）、ランのようなラン科（Orchidaceae）、グラジオラス、アイリス、フリージア、およびクロッカスのようなアヤメ科（Iridaceae）、マリーゴールドのようなキク科（Compositae）、ゼラニウムのようなフウロソウ科（Geraniaceae）、ドラセナ（Drachaena）のようなユリ科（Liliaceae）、イチジクのようなクワ科（Moraceae）、フィロデンドロンのようなサトイモ科（Araceae）、ならびにその他多数を包含する。
本発明に係るトランスジェニック植物はさらに、とくに、双子葉作物の中から、たとえば、エンドウ豆、アルファルファ、およびダイズのようなマメ科（Leguminosae）；セリ科（Umbelliferae）、とくに、ニンジン属（Daucus）（なかでもとくにキャロタ（carota）種（ニンジン））およびオランダミツバ属（Apium）（なかでもとくにグラベオレンス・バル・ダルス（graveolens var. dulce）種（セロリ））、ならびにその他多数；ナス科（Solanaceae）、とくに、トマト属（Lycopersicon）、なかでもとくにエスクレンタム（esculentum）種（トマト）、およびナス属（Solanum）、なかでもとくにツベロスム（tuberosum）種（ジャガイモ）およびメロンゲナ（melongena）種（ナス）、タバコ、ならびにその他多数；さらにはトウガラシ属（Capsicum）、なかでもとくにアヌム（annum）種（コショウ）およびその他多数；マメ科（Leguminosae）、とくにダイズ属（Glycine）、なかでもとくにマックス（max）種（ダイズ）およびその他多数；アブラナ科（Cruciferae）、とくにアブラナ属（Brassica）、なかでもとくにナプス（napus）種（アブラナ）、カンペストリス（campestris）種（ビート）、オレラセア（oleracea）栽培種タスティー（キャベツ）、オレラセア（oleracea）栽培種スノーボールＹ（カリフラワー）、およびオレラセア（oleracea）栽培種エンペラー（ブロッコリー）；ならびにシロイヌナズナ属（Arabidopsis）、なかでもとくにタリアナ（thaliana）種およびその他多数；さらにはキク科（Compositae）、とくにアキノノゲシ属（Lactuca）、なかでもとくにサティバ（sativa）種（レタス）およびその他多数；から選択される。
本発明に係るトランスジェニック植物は、とくに単子葉作物の中から、たとえば、コムギ、オオムギ、モロコシおよびアワ、ライムギ、ライコムギ、トウモロコシ、イネ、またはオートムギのような穀類、およびサトウキビから選択される。さらに好ましいのは、リンゴ、セイヨウナシ、カリン、プラム、サクランボ、モモ、ネクタリン、アンズ、パパイア、マンゴーのような高木、および他の木質種、たとえば、ポプラ、マツ、セコイア、シーダー、オークなどのような針葉樹および落葉樹である。とくに好ましいのは、シロイヌナズナ（Arabidopsis thaliana）、タバコ（Nicotiana tabacum）、アブラナ、ダイズ、トウモロコシ（メイズ）、コムギ、アマニ、ジャガイモ、およびマンジュギク（tagetes）である。
本明細書中で使用される「形質転換の効率」または「形質転換の頻度」は、標準的実験条件下（すなわち、外来ＤＮＡに接触した細胞の量、送達されたＤＮＡの量、ＤＮＡ送達のタイプおよび条件、一般的培養条件などに関して標準化または規格化された実験条件下）で回収される形質転換細胞（または個々の形質転換細胞から成長させたトランスジェニック生物）の数により測定することが可能である。たとえば、分離された葉柄を形質転換の出発材料として使用した場合、形質転換の頻度は、形質転換された葉柄１つあたり得られるトランスジェニック苗条（または得られる稔性植物系）の数として表すことが可能である。
「発現」という用語は、遺伝子産物の生合成を意味する。たとえば、構造遺伝子の場合、発現は、構造遺伝子からｍＲＮＡへの転写および（場合により）それに続くｍＲＮＡから１種以上のポリペプチドへの翻訳を含む。
本明細書中で使用される「発現カセット」または「発現構築物」という用語は、機能しうる形で連結されて発現される任意の核酸配列と、該核酸配列の発現を促進するプロモーター配列および（場合により）さらなるエレメント（たとえば、ターミネーターおよび／またはポリアデニル化配列など）との組合せを意味するものとする。
本明細書中で使用される「プロモーター」、「プロモーターエレメント」、または「プロモーター配列」とは、対象のヌクレオチド配列に連結されたときに対象のヌクレオチド配列からｍＲＮＡへの転写を制御しうるＤＮＡ配列を意味する。プロモーターは、典型的には、必ずというわけではないが、ｍＲＮＡへの転写が制御される対象のヌクレオチド配列の５’側（すなわち上流）に（たとえば、構造遺伝子の転写開始部位に近接して）位置し、転写を開始するためにＲＮＡポリメラーゼおよび他の転写因子による特異的結合の部位を提供する。ポリヌクレオチド配列は、外来種に由来する場合、生物または第２のポリヌクレオチド配列「に対して異種」であり、同一種に由来する場合、その元の形態から改変されている。たとえば、異種コード配列に機能しうる形で連結されたプロモーターとは、プロモーターの由来である種と異なる種に由来するコード配列であることを意味するか、または同一種に由来する場合、天然でプロモーターに一体化されていないコード配列（たとえば、遺伝工学処理の施されたコード配列または異なる生態型もしくは品種に由来する対立遺伝子）であることを意味する。好適なプロモーターは、植物または植物病原体、たとえば植物ウイルスなどに由来することが可能である。
プロモーターが誘導性プロモーターである場合、転写の速度は、誘導剤に応答して増大する。これとは対照的に、プロモーターが構成的プロモーターである場合、転写の速度は誘導剤により調節されない。また、葉、根、または成長点のような特定の組織型においてのみ関連コード領域の転写に関して活性であるように、組織特異的または組織優先的にプロモーターを調節することが可能である。プロモーターに適用される「組織特異的」という用語は、異なる組織型（たとえば、根）において対象の同一ヌクレオチド配列の発現が相対的に不在の状態で、特定の組織型（たとえば、花弁）に対して対象のヌクレオチド配列の選択的発現を指令しうるプロモーターを意味する。プロモーターの組織特異性は、たとえば、レポーター遺伝子をプロモーター配列に機能しうる形で連結させてレポーター構築物を作製し、得られるトランスジェニック植物のすべての組織にレポーター構築物が組み込まれるようにレポーター構築物を植物のゲノム中に導入し、そしてトランスジェニック植物の異なる組織においてレポーター遺伝子の発現を検出することにより（たとえば、レポーター遺伝子によりコードされるｍＲＮＡ、タンパク質、またはタンパク質の活性を検出することにより）、評価することが可能である。他の組織におけるレポーター遺伝子の発現レベルを基準にして１つ以上の組織においてレポーター遺伝子の発現レベルの増大が検出された場合、プロモーターは発現レベルの増大が検出される組織に特異的であることが示唆される。プロモーターに適用される「細胞型特異的」という用語は、同一組織内の異なる細胞型において対象の同一ヌクレオチド配列の発現が相対的に不在の状態で、特定の細胞型において対象のヌクレオチド配列の選択的発現を指令しうるプロモーターを意味する。プロモーターに適用されたときの「細胞型特異的」という用語はまた、単一組織内の領域において対象のヌクレオチド配列の選択的発現を促進しうるプロモーターを意味する。プロモーターの細胞型特異性は、当技術分野で周知の方法、たとえば、ＧＵＳ活性染色（たとえば実施例７に記載のもの）または免疫組織化学的染色を用いて、評価可能である。簡潔に述べると、組織切片をパラフィン中に包埋し、パラフィン切片を、プロモーターにより発現が制御された対象のヌクレオチド配列によりコードされるポリペプチド産物に特異的な一次抗体と反応させる。一次抗体に特異的な標識化（たとえば、ペルオキシダーゼコンジュゲート化）二次抗体を切片組織に結合させて、特異的結合を顕微鏡法により検出する（たとえば、アビジン／ビオチンを用いる）。プロモーターは、構成的または調節的でありうる。プロモーターを参照するときの「構成的」という用語は、プロモーターが、刺激（たとえば、熱ショック、化学物質、光など）の不在下で、機能しうる形で連結された核酸配列の転写を指令しうることを意味する。典型的には、構成的プロモーターは、実質的に任意の細胞および任意の組織においてトランスジーンの発現を指令しうる。これとは対照的に、「調節的」プロモーターは、刺激の不在下における機能しうる形で連結された核酸配列の転写レベルとは異なるレベルで、刺激（たとえば、熱ショック、化学物質、光など）の存在下における機能しうる形で連結された核酸配列の転写を指令しうるプロモーターである。
トランスジェニックな植物または他の生物のすべての組織において遺伝子の発現が望まれる場合、一般的にはほとんどの環境条件および発育または細胞分化の段階で活性である「構成的」プロモーターを使用することが可能である（Benfey 1989）。植物に有用なプロモーターとしては、ＴｉプラスミドもしくはＲｉプラスミドから、植物細胞、植物ウイルス、または植物において機能的であることが明らかにされているプロモーターを含む、他の生物から得られるものも挙げられる。植物において機能し、したがって、本発明に係る方法に使用するのに好適である細菌性プロモーターとしては、オクトピンシンテターゼプロモーター、ノパリンシンターゼプロモーター、およびマンノピンシンテターゼプロモーターが挙げられる。形質遺伝子および／または選択マーカーの発現を制御するプロモーターは、構成的でありうる。植物で使用するのにの好適な構成的プロモーターとしては、たとえば、カリフラワーモザイクウイルス（ＣａＭＶ）の３５Ｓ転写開始領域（Franck 1980; Odell 1985; Shewmaker 1985; Gardner 1986）、１９Ｓ転写開始領域（ＵＳ５，３５２，６０５およびＷＯ ８４／０２９１３）、および領域ＶＩプロモーター、アグロバクテリウム・ツメファシエンスのＴ−ＤＮＡに由来する１’または２’プロモーター、ならびに当業者に公知の植物細胞で活性な他のプロモーターが挙げられる。他の好適なプロモーターとしては、ゴマノハグサモザイクウイルスに由来する全長転写プロモーター、アクチンプロモーター（たとえば、コメアクチンプロモーター；McElroy 1990）、ヒストンプロモーター、チューブリンプロモーター、またはマンノピンシンターゼプロモーター（ＭＡＳ）が挙げられる。他の構成的植物プロモーターとしては、種々のユビキチンまたはポリユビキチンプロモーター（Sun 1997; Christensen 1989, 1992; Bruce 1989; Holtorf 1995）、ｍａｓ、Ｍａｃ、またはＤｏｕｂｌｅＭａｃプロモーター（ＵＳ５，１０６，７３９; Comai 1990）、ユビキチンプロモーター（Holtorf 1995）、ルビスコ小サブユニット（ＳＳＵ）プロモーター（ＵＳ４，９６２，０２８）、レグミンＢプロモーター（ＧｅｎＢａｎｋ Ｎｏ． Ｘ０３６７７）、アグロバクテリウム由来のノパリンシンターゼ（ＮＯＳ）のプロモーター、ＴＲデュアルプロモーター、アグロバクテリウム由来のオクトピンシンターゼ（ＯＣＳ）プロモーター、Ｓｍａｓプロモーター、シンナミルアルコールデヒドロゲナーゼプロモーター（ＵＳ ５，６８３，４３９）、液胞ＡＴＰアーゼサブユニットのプロモーター、ｐＥＭＵプロモーター（Last 1991）；ＭＡＳプロモーター（Velten 1984）、トウモロコシＨ３ヒストンプロモーター（Lepetit 1992; Atanassova 1992）、α−コングリシニンプロモーター、ファセオリンプロモーター、ＡＤＨプロモーター、および熱ショックプロモーター、シロイヌナズナ（Arabidopsis thaliana）由来のニトリラーゼプロモーター（ＷＯ ０３／００８５９６；ＧｅｎＢａｎｋ登録番号：Ｕ３８８４６、ヌクレオチド３，８６２−５，３２５または５，３４２）、コムギ由来の高プロリンタンパク質のプロモーター（ＷＯ ９１／１３９９１）、エンドウマメ（Pisum sativum）ｐｔｘＡ遺伝子のプロモーター、および当業者に公知の種々の植物遺伝子由来の他の転写開始領域が挙げられる。
当然ながら、プロモーターは、ただ１つまたはいくつかの組織において常に発現を調節することが可能である。他の選択肢として、プロモーターは、すべての組織において発現を調節することが可能であるが、ただし、特定の発育時点でのみ可能である。先に述べたように、切除プロモーター（すなわち、配列特異的ＤＮＡ切断ポリヌクレオチドに連結されたプロモーター）は、一般的には構成的でないが、その代わりに、生活環の一部分またはトランスジェニック生物の少なくとも１つの組織でのみ活性である。特定の組織において対象の遺伝子の発現を指令するか、さもなければより正確な環境もしくは発育の制御下にあるプロモーターを使用することが可能である。誘導性プロモーターによる転写に影響を及ぼしうる環境条件の例としては、病原体攻撃、嫌気的条件、エチレン、または光の存在が挙げられる。発育制御下のプロモーターとしては、葉、果実、種子、もしくは花、またはそれらの一部分のような特定の組織または器官においてのみ転写を開始するプロモーターが挙げられる。プロモーターの作用はまた、ゲノム中のその位置に依存して異なりうる。したがって、誘導性プロモーターは、特定の位置において完全にもしくは部分的に構成的になりうる。発育制御下の組織特異的植物プロモーターの例としては、果実、種子、花、葯、子房、花粉、成長点、花、葉、茎、根、および種子のような特定の組織においてのみ転写を開始するプロモーターが挙げられる。トマトに由来する組織特異的ＥＳプロモーターは、所望の遺伝子産物が果実に位置するように遺伝子発現を指令するのにとくに有用である（たとえば、Lincoln 1988; Deikman 1988, 1992を参照されたい）。他の好適な種子特異的プロモーターとしては、次の遺伝子に由来するものが挙げられる：トウモロコシ由来のＭＡＣ１（Sheridan 1996）、トウモロコシ由来のＣａｔ３（ＧｅｎＢａｎｋ Ｎｏ．Ｌ０５９３４, Abler 1993）、トウモロコシ由来のオレオシン１８ｋＤをコードする遺伝子（ＧｅｎＢａｎｋ Ｎｏ．Ｊ０５２１２, Lee 1994）、シロイヌナズナ属（Arabidopsis）由来のｖｉｖｉｐａｒｏｕｓ−１（Ｇｅｎｂａｎｋ Ｎｏ．Ｕ９３２１５）、シロイヌナズナ属（Arabidopsis）由来のオレオシンをコードする遺伝子（Ｇｅｎｂａｎｋ Ｎｏ．Ｚ１７６５７）、シロイヌナズナ属（Arabidopsis）由来のＡｔｍｙｃｌ（Urao 1996）、シロイヌナズナ属（Arabidopsis）由来の２Ｓ種子貯蔵タンパク質遺伝子ファミリー（Conceicao 1994）、ブラシカ・ナプス（Brassica napus）由来のオレオシン２０ｋＤをコードする遺伝子、ブラシカ・ナプス（Brassica napus）由来のナピン（ＧｅｎＢａｎｋ Ｎｏ．Ｊ０２７９８, Josefsson 1987）、ナピン遺伝子ファミリー（たとえば、ブラシカ・ナプス（Brassica napus）由来；Sjodahl 1995, ＵＳ５，６０８，１５２; Stalberg 1996）ブラシカ・ナプス（Brassica napus）由来の２Ｓ貯蔵蛋白質をコードする遺伝子（Dasgupta 1993）、ダイズ由来のオレオシンＡ（Ｇｅｎｂａｎｋ Ｎｏ．Ｕ０９１１８）およびオレオシンＢ（Ｇｅｎｂａｎｋ Ｎｏ．Ｕ０９１１９）をコードする遺伝子、ダイズ由来の低分子量高硫黄タンパク質をコードする遺伝子（Choi 1995）、ファセオリン遺伝子（ＵＳ５，５０４，２００, Bustos 1989; Murai 1983; Sengupta-Gopalan 1985）、２Ｓアルブミン遺伝子（Joseffson 1987）、レグミン遺伝子（Shirsat 1989）、ＵＳＰ（未知種子タンパク質）遺伝子（Baumlein 1991）、スクロース結合タンパク質遺伝子（ＷＯ ００／２６３８８）、レグミンＢ４遺伝子（ＬｅＢ４；Baumlein 1991a,b; 1992; Fiedler 1995）、アラビドプシス・オレオシン（Arabidopsis oleosin）遺伝子（ＷＯ ９８／４５４６１）、アブラナ属（Brassica）Ｂｃｅ４遺伝子（ＷＯ ９１／１３９８０）、「高分子量グルテニン」（ＨＭＷＧ）、グリアジン、分枝酵素、ＡＤＰ−グルコースピロホスファターゼ（ＡＧＰアーゼ）、またはデンプンシンターゼをコードする遺伝子。さらに好ましいプロモーターは、トウモロコシ、オオムギ、コムギ、ライムギ、イネなどのような単子葉植物において種子特異的発現を可能にするものである。有利に利用可能なプロモーターは、Ｉｐｔ２またはＩｐｔ１遺伝子（ＷＯ ９５／１５３８９、ＷＯ ９５／２３２３０）のプロモーターまたはＷＯ ９９／１６８９０に記載のプロモーター（ホルデイン遺伝子、グルテリン遺伝子、オリジン遺伝子、プロラミン遺伝子、グリアジン遺伝子、ゼイン遺伝子、カシリン遺伝子、またはセカリン遺伝子のプロモーター）である。さらに好ましいのは、葉特異的および光誘導性のプロモーター、たとえば、ｃａｂまたはルビスコに由来するもの（Simpson 1985; Timko 1985）；葯特異的プロモーター、たとえば、ＬＡＴ５２に由来するもの（Twell 1989b）；花粉特異的プロモーター、たとえば、Ｚｍｌ３に由来するもの（Guerrero 1993）；および小胞子優先的プロモーター、たとえば、ａｐｇに由来するもの（Twell 1993）である。さらなる好適なプロモーターは、たとえば、塊茎、貯蔵根、もしくは根に特異的なプロモーター、たとえば、クラスＩパタチンプロモーター（Ｂ３３）、ジャガイモカテプシンＤ阻害剤プロモーター、デンプンシンターゼ（ＧＢＳＳ１）プロモーター、またはスポラミンプロモーター、さらには果実特異的プロモーター、たとえば、トマト果実特異的プロモーターである（ＥＰ−Ａ ４０９ ６２５）。
さらに好適なプロモーターは、葉特異的発現を保証するものである。プロモーターとして挙げられうるのは、ジャガイモサイトゾルＦＢＰアーゼプロモーター（ＷＯ ９８／１８９４０）、ルビスコ（リブロース−１，５−ビスホスフェートカルボキシラーゼ）ＳＳＵ（小サブユニット）プロモーター、またはジャガイモＳＴ−ＬＳＩプロモーター（Stockhaus 1989）である。他の好ましいプロモーターは、種子および植物胚における発現を支配するものである。
さらなる好適なプロモーターは、たとえば、果実成熟特異的プロモーター、たとえば、トマト果実成熟特異的プロモーター（ＷＯ ９４／２１７９４）など、花特異的プロモーター、たとえば、フィトエンシンターゼプロモーター（ＷＯ ９２／１６６３５）もしくはＰ１−ｒｒ遺伝子のプロモーター（ＷＯ ９８／２２５９３）などであり、またはＥＰ−Ａ ２４９６７６に記載されているような他の節特異的プロモーターが有利に使用可能である。プロモーターはまた、ＷＯ ９３／０７２７８に記載されているような植物ＴｒｐＡ遺伝子から単離されたプロモーターのような髄特異的プロモーターでもありうる。とくに、発育調節性プロモーターが報告されている（Baerson 1993）。
発現カセットはまた、植物において外来遺伝子の発現を特定の時点で制御しうる化学的誘導性プロモーター（総説：Gatz 1997）を含有しうる。そのようなプロモーター、たとえば、ＰＲＰ１プロモーター（Ward 1993）、サリチル酸誘導性プロモーター（ＷＯ ９５／１９４４３）、ベンゼンスルホンアミド誘導性プロモーター（ＥＰ ０ ３８８ １８６６）、テトラサイクリン誘導性プロモーター（Gatz 1991, 1992）、アブシジン酸誘導性プロモーター（ＥＰ ０ ３３５ ５２８）、またはエタノールシクロヘキサノン誘導性プロモーター（ＷＯ ９３／２１３３４）なども、同様に使用することが可能である。同様に好適なのは、グルタチオン−Ｓ−トランスフェラーゼアイソフォームＩＩ遺伝子（ＧＳＴ−ＩＩ−２７）のプロモーターであり、これは、たとえば、Ｎ，Ｎ−ジアリル−２，２−ジクロロアセトアミドのような外因的に適用される薬害軽減剤により活性化可能であり（ＷＯ ９３／０１２９４）、単子葉植物および双子葉植物の両方の多数の組織において作用可能である。本発明で利用しうるさらなる代表的な誘導性プロモーターとしては、銅に応答するＡＣＥ１系に由来するもの（Mett 1993）；またはベンゼンスルホンアミド除草剤薬害軽減剤（Hershey 1991 ; Gatz 1994）に応答するトウモロコシ由来のＩｎ２プロモーターが挙げられる。植物が通常は応答しない誘導剤に応答するプロモーターを利用することが可能である。代表的な誘導性プロモーターは、ステロイドホルモン遺伝子に由来する誘導性プロモーターであり、その転写活性はグルココルチコステロイドホルモンにより誘導される（Schena 1991）。他の好ましいプロモーターは、生物的もしくは非生物的ストレスにより誘導されるプロモーター、たとえば、ＰＲＰ１遺伝子の病原体誘導性プロモーター（Ward 1993）、トマト熱誘導性ｈｓｐ８０プロモーター（ＵＳ５，１８７，２６７）、ジャガイモ低温誘導性α−アミラーゼプロモーター（ＷＯ ９６／１２８１４）、または創傷誘導性ｐｉｎＩＩプロモーター（ＥＰ−ＡＩ ０ ３７５ ０９１）である。
プロモーターはまた、発現特異的特性を改変しうるさらなるプロモーター、プロモーターエレメント、または最小プロモーターを包含しうる。したがって、たとえば、組織特異的発現はさらに、遺伝子制御配列に基づいて、特定のストレス因子の関数として行われうる。そのようなエレメントは、たとえば、水ストレス、アブシジン酸（Lam 1991）、および熱ストレス（Schoffl 1989）に関連して報告されている。
「機能しうる形の連結」または「機能しうる形で連結された」という用語は、各調節エレメントがその目標機能を発揮して、核酸配列の発現を可能にしたり、改変したり、促進したり、または他の形で発現に影響を及ぼしたりすることができるように、たとえば、調節エレメント（たとえばプロモーター）と、発現される核酸配列および適切であればさらなる調節エレメント（たとえばターミネーターなど）と、が連続的に配置されることを意味すると解釈されるものとする。発現は、センスＲＮＡまたはアンチセンスＲＮＡに関連する核酸配列の構成に応じて起こりうる。この目的のために、化学的意味の直接的結合が必ずしも必要とされるわけではない。たとえばエンハンサー配列のような遺伝子制御配列はまた、さらに離れた位置から、または実際には他のＤＮＡ分子から、標的配列に対してそれらの機能を発揮することも可能である。好ましい構成は、組換え発現される核酸配列をプロモーターとして作用する配列の後方に配置して２つの配列を互いに共有結合させたものである。プロモーター配列と組換え発現される核酸配列との間の距離は、好ましくは２００塩基対未満、とくに好ましくは１００塩基対未満、なかでもとくに好ましくは５０塩基対未満である。機能しうる形の連結および発現構築物は、報告されている慣用的な組換え技術およびクローニング技術により形成可能である（たとえば、Maniatis 1989; Silhavy 1984; Ausubel 1987; Gelvin 1990）。しかしながら、たとえば、制限酵素のための特定の切断部位を有するリンカーとしてまたはシグナルペプチドとして作用するさらなる配列を２つの配列間に配置することも可能である。また、配列の挿入により、融合タンパク質の発現を引き起こすことも可能である。好ましくは、プロモーターと発現される核酸配列との連結よりなる発現構築物は、ベクターに組み込まれた形態で存在し、たとえば、形質転換により植物ゲノム中に挿入することが可能である。
本明細書中で使用される「形質転換」という用語は、細胞内への遺伝物質（たとえばトランスジーン）の導入を意味する。細胞の形質転換は、安定的または一過的でありうる。「一過的形質転換」または「一過的に形質転換された」という用語は、宿主細胞のゲノム中へのトランスジーンの組込みの不在下における細胞内への１つ以上のトランスジーンの導入を意味する。一過的形質転換は、たとえば、１つ以上のトランスジーンによりコードされたポリペプチドの存在を検出する酵素結合免疫吸着アッセイ（ＥＬＩＳＡ）により、検出可能である。他の選択肢として、一過的形質転換は、本明細書中で実証されるように、トランスジーン（たとえば、ｕｉｄ Ａ遺伝子）によりコードされるタンパク質（たとえば、β−グルクロニダーゼ）の活性を検出することにより、検出可能である［たとえば、ＧＵＳ酵素の存在下で青色沈殿を与えるＸ−ｇｌｕｃで染色することによるＧＵＳ酵素活性の組織化学的アッセイ；およびＧＵＳ−Ｌｉｇｈｔキット（Ｔｒｏｐｉｘ）を用いるＧＵＳ酵素活性の化学発光アッセイ］。「一過的形質転換体」という用語は、一過的に組み込まれた１つ以上のトランスジーンを有する細胞を意味する。これとは対照的に、「安定的形質転換」または「安定的に形質転換された」という用語は、細胞のゲノム中への１つ以上のトランスジーンの導入および組込みを意味し、好ましくは、減数分裂を介して染色体内組込みおよび安定的遺伝力を生じる。細胞の安定的形質転換は、１つ以上のトランスジーンに結合しうる核酸配列を用いて細胞のゲノムＤＮＡのサザンブロットハイブリダイゼーションを行うことにより検出可能である。他の選択肢として、細胞の安定的形質転換はまた、細胞のゲノムＤＮＡのポリメラーゼ連鎖反応を行ってトランスジーン配列を増幅することにより検出することも可能である。「安定的形質転換体」という用語は、ゲノムＤＮＡ中に安定的に組み込まれた１つ以上のトランスジーンを有する細胞を意味する。したがって、安定的形質転換体に由来するゲノムＤＮＡは１つ以上のトランスジーンを含有するが、一過的形質転換体に由来するゲノムＤＮＡはトランスジーンを含有しないという点で、安定的形質転換体は、一過的形質転換体と区別される。形質転換はまた、減数分裂安定性に関してさまざまな性質を呈しうる染色体外での複製および遺伝子発現を含む植物ウイルスベクターの形態で植物細胞中に遺伝物質を導入することを含む。
細菌に関して「感染性」および「感染」という用語は、細菌中に含まれる核酸配列が標的生物学的サンプルの１つ以上の細胞中に導入されるような条件下における標的生物学的サンプル（たとえば、細胞、組織など）と細菌との共インキュベーションを意味する。
「成長点」または「分裂組織細胞」または「分裂組織」という用語は、同義的に使用可能であり、茎または根の先端で見いだされるように継続的に分裂して新しい細胞を形成する未分化植物組織を意味するものとする。
「節」という用語は、葉が結合されているかまたは結合されていた茎上の点を意味するものとする。「節間」という用語は、茎上の２つの節間の区画または部分を意味するものとする。
「葉柄（petiole）」という用語は、葉を茎に結合させる柄を意味するものとする。これは、葉柄（leaf-stalk）とも呼ばれる。
「腋芽」という用語は、保護鱗片で囲まれていることもありかつ未発育の苗条、葉、または花を含有する、茎または枝に沿った小突起を意味するものとする。これは、側芽とも呼ばれる。
「胚軸」という用語は、子葉（seed leaves（cotyledons））と根との間の茎の部分を意味するものとする。「葉腋」という用語は、葉と茎との間の角度を意味するものとする。腋芽は葉腋で生じる。
「子葉（cotyledon）」という用語は、種子植物の胚の葉を意味するものとする。これは、発芽時に種子中に残存するかまたは出芽し生長し緑色になる。これは、子葉（seed leaf）とも呼ばれる。ダイズ種子は、子葉（cotyledonsまたはseed leaves）である２つの半切り種子よりなる。２つの子葉は、苗立ちするまで苗を育てる養分および栄養素を含有する。子葉の色は、発育状態の莢中では緑色であるが、植物が成熟するにつれて黄色に変化する。胚軸は、子葉間に位置し、珠孔に最も近い端部近傍でそれらに結合されている。
本明細書中で使用される「アグロバクテリウム」という用語は、土壌のグラム陰性桿状植物病原性細菌を意味する。アグロバクテリウムは、リゾビウム、シノリゾビウム、およびアロリゾビウムと共に、リゾビウム細菌科の属であり（Kersters and De Ley. 1984）、リボソーム特性に基づいてプロテオバクテリアのα−２亜綱に組み入れられてきた（Willems and Collins. 1993）。この科のメンバーは、好気性グラム陰性である。細胞は、通常、桿状であり（０．６〜１．０μｍ×１．５〜３．０μｍ）、内生胞子を伴うことなく、単独でまたは対をなして存在し、１〜６本の周毛性鞭毛により運動性である。炭水化物含有培地で増殖中に、通常、多量の細胞外多糖粘液が産生される。アグロバクテリウム、アグロバクテリウム・ツメファシエンス（別名アグロバクテリウム・ラジオバクター）、アグロバクテリウム・リゾゲネス、アグロバクテリウム・ルビ、およびアグロバクテリウム・ビティスの種は、アロリゾビウム・ウンディコラと共に、比較１６Ｓ ｒＤＮＡ分析に基づいて、すべてのリゾビウム種を含む単系統群を形成する（Sawada 1993, Young 2003）。アグロバクテリウムは、植物病原性種を含む人工的な属である。アグロバクテリウム、アロリゾビウム、およびリゾビウムの単系統性およびそれらの一般的な表現型共通範囲は、それらが単一のリゾビウム属にまとめられることを支持する。アグロバクテリウム・ツメファシエンスおよびアグロバクテリウム・リゾゲネスならびにそれらの種々のオピン型クラスの分化を含めてアグロバクテリウム株の分類および特徴付けは、当技術分野で周知である（たとえば、Laboratory guide for identification of plant pathogenic bacteria, 3rd edition. (2001) N. W. Schaad, J. B. Jones, and W. Chun (編) ISBN 0890542635を参照されたい；たとえば、そこに記載されているMooreらの論説）。
最近の分析から、その植物病原性による分類が正しくないことが実証されている。したがって、種々の菌株の関係を解明するために、ゲノムの分析および比較に基づくより先進的な方法（たとえば、１６Ｓ ｒＲＮＡ配列決定；ＲＦＬＰ、Ｒｅｐ−ＰＣＲなど）が利用される（たとえば、Young 2003, Farrand 2003, de Bruijn 1996, Vinuesa 1998を参照されたい）。アグロバクテリアは、示差的生化学的生理学的試験に基づく種分類に対応する少なくとも３つの次亜種に細分することが可能である。アグロバクテリウムの病原性株は、共通した特徴を共有し；それらは、少なくとも１つの大型プラスミド、すなわち、腫瘍誘発性または根誘発性（それぞれＴｉおよびＲｉ）プラスミドを含有する。毒性は、移入ＤＮＡ（Ｔ−ＤＮＡ）および毒性（ｖｉｒ）遺伝子をはじめとするプラスミドのさまざまな領域により決定される。毒性遺伝子は、感染植物細胞中へのＴ−ＤＮＡの移入を媒介し、その際、Ｔ−ＤＮＡは、植物ＤＮＡ中に組み込まれる。「伝統的」分類によれば、アグロバクテリアは、限定されるものではないが、アグロバクテリウム・ツメファシエンス株（典型的には、その天然の「病害性」Ｔｉプラスミドにより、感染植物でクラウンゴールを誘発する）、およびアグロバクテリウム・リゾゲネス株（その天然の「病害性」Ｒｉプラスミドにより、感染宿主植物で毛状根病を誘発する）、アグロバクテリウム・ルビ株（その天然の「病害性」形態で、キイチゴでケインゴールを誘発する）、アグロバクテリウム・ビティス株、ならびにアグロバクテリウム・ラジオバクター株（非病原性アグロバクテリアとしてまとめられる）を包含する。
アグロバクテリウム株Ｋ５９９の関係を明らかにする２つの方法によるアグロバクテリウム属のメンバーの系統発生的関係を、図１Ａ（ＲＡＰＤ（ランダム増幅多型ＤＮＡ）に基づく；出典 Llob 2003; figure 2）および図１Ｂ（１６Ｓ ｒＲＮＡ配列決定に基づく）に示す。
Figure 2008511294
本明細書中で使用されるＴｉプラスミドという用語は、アグロバクテリウムにおいて複製可能でありかつその天然の「病害性」形態でアグロバクテリウム感染植物においてクラウンゴールを媒介するプラスミドを意味する。アグロバクテリウムのＴｉプラスミドが天然の「病害性」形態で植物細胞に感染すると、一般的には、感染細胞によりオピン（たとえば、ノパリン、アグロピン、オクトピンなど）が産生される。したがって、ノパリンの産生を引き起こすアグロバクテリウム株（たとえば、菌株ＬＢＡ４３０１、Ｃ５８、Ａ２０８）は、「ノパリン型」アグロバクテリウムと呼ばれ；オクトピンの産生を引き起こすアグロバクテリウム株（たとえば、菌株ＬＢＡ４４０４、Ａｃｈ５、Ｂ６）は、「オクトピン型」アグロバクテリウムと呼ばれ；そしてアグロピンの産生を引き起こすアグロバクテリウム株（たとえば、菌株ＥＨＡ１０５、ＥＨＡ１０１、Ａ２８１）は、「アグロピン型」アグロバクテリウムと呼ばれる。非病害性Ｔｉプラスミドとは、そのクラウンゴール媒介性は欠如しているが、植物感染に関する機能は提供するＴｉプラスミドとして解釈されるものである。好ましくは、前記「非病害性」プラスミドのＴ−ＤＮＡ領域は、境界配列を除いて機能的内部Ｔｉ配列が植物ゲノム中に移入されないように改変されたものである。好ましい実施形態では（バイナリーベクター系と併用した場合）、全Ｔ−ＤＮＡ領域（Ｔ−ＤＮＡ境界領域を含む）は欠失している。
本明細書中で使用されるＲｉプラスミドという用語は、アグロバクテリウムにおいて複製可能でありかつその天然の「病害性」形態でアグロバクテリウム感染植物において毛状根病を媒介するプラスミドを意味する。アグロバクテリウムのＲｉプラスミドが天然の「病害性」形態で植物細胞に感染すると、一般的には、感染細胞によりオピン（形質転換植物細胞において生成される特定のアミノ糖誘導体、たとえば、アグロピン、ククモピン、オクトピン、ミキモピンなど）が産生される。アグロバクテリウム・リゾゲネス株は、伝統的には、Ａ．ツメファシエンス株のときと同一の方法でサブクラスに分類される。最も一般的な菌株は、アグロピン型菌株（たとえば、ＲｉプラスミドｐＲｉ−Ａ４により特徴付けられる）、マンノピン型菌株（たとえば、ＲｉプラスミドｐＲｉ８１９６により特徴付けられる）、およびククモピン型菌株（たとえば、ＲｉプラスミドｐＲｉ２６５９により特徴付けられる）である。いくつかの他の菌株は、ミキモピン型（たとえば、ＲｉプラスミドｐＲｉ１７２４により特徴付けられる）である。ミキモピンおよびククモピンは、立体異性体であるが、ヌクレオチドレベルでは、ｐＲｉプラスミド間に相同性は見いだされていない（Suzuki 2001）。非病害性Ｒｉプラスミドとは、その毛状根病媒介性は欠如しているが、植物感染に関する機能は提供するＲｉプラスミドとして解釈されるものである。好ましくは、前記「非病害性」ＲｉプラスミドのＴ−ＤＮＡ領域は、境界配列を除いて機能的内部Ｒｉ配列が植物ゲノム中に移入されないように改変されたものである。好ましい実施形態では（バイナリーベクター系と併用した場合）、全Ｔ−ＤＮＡ領域（Ｔ−ＤＮＡ境界領域を含む）は欠失している。
ＴｉおよびＲｉプラスミドは菌株間で著しく異なるが、それらはすべて、類似のｖｉｒ遺伝子を保有する。
本明細書中で使用される「１６Ｓ−２３Ｓ ｒＲＮＡ遺伝子間配列」という用語は、１６Ｓ ｒＲＮＡおよび２３Ｓ ｒＲＮＡをコードする配列の間に位置するゲノムＤＮＡ領域を意味するものとする。前記遺伝子間配列は、１６Ｓ ｒＲＮＡおよび２３Ｓ ｒＲＮＡをコードする配列とオーバーラップしていてもよい。
発明の詳細な説明
本発明では、植物細胞中へのＴ−ＤＮＡ送達のためにアグロバクテリウム株Ｋ５９９（ＮＣＰＰＢ ２６５９）の「非病害性」変異株を使用する。これ以降では、「Ａ．リゾゲネス」株として菌株Ｋ５９９のこれまでの分類を利用しない。なぜなら、毛状根誘導性表現型（これは、細菌ゲノムに起因するのではなくＲｉプラスミドに起因する）のほかに、リボソームｒＤＮＡ配列の比較分析に基づいて、菌株は、他のＡ．リゾゲネス株にごくわずかに関連付けられるにすぎないと思われるからである。したがって、菌株は、ユニークであるとみなされ、一義的にＡ．ツメファシエンス型またはＡ．リゾゲネス型の菌株であるとみなされるものではない。
本発明の第１の実施形態は、以下のステップ：
ａ） アグロバクテリウム株Ｋ５９９（ＮＣＰＰＢ ２６５９）または該菌株の誘導体のトランスジェニック非病原性変異株の細菌を準備するステップ、ここで、該変異株は植物細胞に感染可能であるが、毛状根表現型誘発性を欠損し、かつ該変異株はさらにトランスジェニックＴ−ＤＮＡを含むものである、および
ｂ） 植物細胞を前記細菌と共培養するステップ、および
ｃ） 安定的にゲノムに組み込まれた前記トランスジェニックＴ−ＤＮＡを含んでなる植物細胞を単離または選択するステップ
を含む、トランスジェニック植物細胞の作製方法に関する。
本発明の他の実施形態は、以下のステップ：
ａ） アグロバクテリウム株Ｋ５９９（ＮＣＰＰＢ ２６５９）または該菌株の誘導体のトランスジェニック非病原性変異株の細菌を準備するステップ、ここで、該変異株は植物細胞に感染可能であるが、毛状根表現型誘発性を欠損し、かつ該変異株はさらにトランスジェニックＴ−ＤＮＡを含むものである、および
ｂ） 植物体、植物細胞または植物組織を前記細菌と共培養するステップ、および
ｃ） 安定的にゲノムに組み込まれた前記トランスジェニックＴ−ＤＮＡを含んでなる植物を単離または選択し、かつ任意により再生するステップ
を含む、トランスジェニック植物の作製方法に関する。
本発明に係る方法は、先行技術よりも優れた以下の利点のうちの１つ以上を有する：
ａ） 当技術分野で公知のアグロバクテリウム・ツメファシエンス株により媒介される形質転換に対して抵抗性のある植物種、特定的には、ダイズおよびポプラやクリのような高木の形質転換に非常に有効である。驚くべきことに、本明細書に提供されるアグロバクテリウム・リゾゲネスＫ５９９の非病害性誘導体（それぞれｐＲｉ２６５９ΔおよびｐＲｉ２６５９Δｔｅｔ）は、ダイズに対して高い感染率を示し、植物形質転換に関してアグロバクテリウムの従来の菌株よりも優れた改良を提供する。
ｂ） 感染性が強いので、アグロバクテリウム・ツメファシエンスよりもはるかに低い濃度で利用可能である。このため、通常のアグロバクテリウム・ツメファシエンス共培養に対して非常に感受性の高い標的組織（たとえば、コムギのような植物の接合体または未成熟胚など）が利用可能になる。
ｃ） 追加的に、ｐＲｉ２６５９プラスミドに由来するＴ−ＤＮＡ境界領域を使用して、新しいバイナリーベクターが作製される。これらの境界配列は、とくに、非病害性変異株アグロバクテリウム・リゾゲネスＫ５９９（ｐＲｉ２６５９Δ）と組み合わせたときに、慣用される境界配列よりも優れた利点を提供する。
ｄ） 最後に、本発明に係る方法は、他のアグロバクテリウムに基づく植物形質転換系と適合性がある。
本発明に係る方法を用いれば、実質的にすべての種類の植物を形質転換することが可能である。好ましい植物は、以上の一般的定義の節に列挙されている。単子葉植物、双子葉植物、および裸子植物からなる群より選択される植物に由来する植物細胞、植物組織、または植物体が好ましい。より好ましくは、植物は、ウマゴヤシ属（Medicago）、トマト属（Lycopersicon）、アブラナ属（Brassica）、キュウリ属（Cucumis）、ナス属（Solanum）、クルミ属（Juglans）、ワタ属（Gossypium）、リンゴ属（Malus）、ブドウ属（Vitis）、キンギョソウ属（Antirrhinum）、ハコヤナギ属（Populus）、イチゴ属（Fragaria）、シロイヌナズナ属（Arabidopsis）、トウヒ属（Picea）、トウガラシ属（Capsicum）、アカザ属（Chenopodium）、キク属（Dendranthema）、アサガオ属（Pharbitis）、マツ属（Pinus）、エンドウ属（Pisum）、イネ属（Oryza）、トウモロコシ属（Zea）、コムギ属（Triticum）、ライコムギ属（Triticale）、ライムギ属（Secale）、ドクムギ属（Lolium）、オオムギ属（Hordeum）、ダイズ属（Glycine）、トガサワラ属（Pseudotsuga）、リュウキュウベンケイソウ属（Kalanchoe）、フダンソウ属（Beta）、ヒマワリ属（Helianthus）、およびタバコ属（Nicotiana）からなる群より選択される属に由来する。
本発明の好ましい実施形態では、トランスジェニックＴ−ＤＮＡは、農学上有益な形質または少なくとも１つのマーカー遺伝子を前記植物に付与するための少なくとも１つの発現カセットを含む。ただし、該マーカー遺伝子は、形質転換された植物体、植物細胞、もしくは植物組織の選択および／または同定を可能にする。好ましいマーカー遺伝子は、以下に記載されている。
１． 「非病害性」アグロバクテリウム株Ｋ５９９（ＮＣＰＰＢ２６５９）
本発明の他の実施形態は、アグロバクテリウム株Ｋ５９９（ＮＣＰＰＢ ６５９）または該菌株の誘導体の非病原性変異株（これ以降では「非病害性」変異株）に関し、ただし、該変異株は、植物細胞に感染可能であるが、毛状根表現型誘発性を欠損している。
アグロバクテリウム株Ｋ５９９（ＮＣＰＰＢ２６５９）を参照するときの「誘導体」という用語は、
１． ５’−ＡＡＴＣＧＴＣＧＡＴＧＣＧＡＡＴＴＧＴＴＧ−３’ （モチーフＭ１、配列番号５）
２． ５’−ＧＴＴＴＴＧＴＣＣＴＧＡＣＧＣＴＧＴＣＧＣＧＡ−３’ （モチーフＭ２、配列番号６）
３． ５’−ＴＣＴＡＡＣＧＡＴＣＧＣＴＧＣＧＣＴＣＣＧＧＡ−３’ （モチーフＭ３、配列番号７）
４． ５’−ＣＧＣＣＡＣＧＡＧＧＣＧＣＧＡＣＧＧＡ−３’ （モチーフＭ４、配列番号８）
５． ５’−ＴＴＡＴＧＧＧＣＧＡＡＴＴＧＡＴＣＴＧＡ−３’ （モチーフＭ５、配列番号９）
６． ５’−ＧＴＣＣＴＧＣＴＡＡＧＧＡＴＴＧＡＴＧＣＣＴ−３’ （モチーフＭ６、配列番号１０）
７． ５’−ＡＧＡＣＣＡＧＴＣＣＴＴＧＴＧＡＡＡＣＣ−３’ （モチーフＭ７、配列番号１１）
８． ５’−ＣＣＴＧＧＧＣＡＴＴＴＴＴＧＴＴＧＴＴＧＧ−３’ （モチーフＭ８、配列番号１２）
９． ５’−ＡＡＴＧＧＴＡＴＧＧＣＴＴＣＧＡＧＧＴＧ−３’ （モチーフＭ９、配列番号１３）
１０． ５’−ＣＴＣＡＡＡＧＡＡＧＡＣＣＧＴＡＣＣＧＡＣＡ−３’ （モチーフＭ１０、配列番号１４）
からなる群より選択される少なくとも１つの配列モチーフを含む１６Ｓ−２３Ｓ ｒＲＮＡ遺伝子間配列により特徴付けられる土壌の植物病原性細菌を意味するものとする。
好ましくは、アグロバクテリウム株Ｋ５９９（ＮＣＰＰＢ２６５９）の誘導体は、配列番号５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、および１４により示されるモチーフからなる群より選択される少なくとも２または３個のモチーフ、好ましくは少なくとも４または５個のモチーフ、より好ましくは少なくとも６または７個のモチーフ、最も好ましくは少なくとも８、９、または１０個のモチーフを含む１６Ｓ−２３Ｓ ｒＲＮＡ遺伝子間配列により特徴付けられる。
さらなる特徴的配列モチーフは、公知の１６Ｓ−２３Ｓ ｒＲＮＡ遺伝子間配列可変領域の多重アライメントから特定可能である（アグロバクテリウムＫ５９９に最も類似したものが図１４Ａ〜Ｅで比較されている）。好ましくは、アグロバクテリウムＫ５９９の誘導体は、塩基対配列番号２０により示される配列またはその相補体に対して少なくとも９０％、より好ましくは少なくとも９５％、最も好ましくは少なくとも９８％の同一性を有する配列を含む１６Ｓ−２３Ｓ ｒＲＮＡ遺伝子間配列により特徴付けられる。とくに好ましいのは、配列番号２１により示される１６Ｓ ｒＲＮＡ配列によりさらに特徴付けられる菌株である。
非病原性変異株はさらに、突然変異型もしくはキメラ型のｖｉｒＡ遺伝子またはｖｉｒＧ遺伝子の存在あるいは強毒性プラスミドの存在からなる群より選択される１つ以上の特徴を含みうる。アグロバクテリウム株Ｋ５９９（ＮＣＰＰＢ２６５９）の非病原性変異株は、ｐＲｉ２６５９プラスミドの非病原性プラスミド変異体（以下に定義されるとおり）を含みうる。
本発明の他の実施形態は、アグロバクテリウム株Ｋ５９９（ＮＣＰＰＢ ２６５９）または該菌株の誘導体のトランスジェニック非病原性変異株に関し、ただし、該変異株は、植物細胞に感染可能であるが、毛状根表現型誘導性が欠如しており、かつ該変異株は、トランスジェニックＴ−ＤＮＡをさらに含む。本発明の好ましい実施形態では、トランスジェニックＴ−ＤＮＡは、農学上有益な形質または少なくとも１つのマーカー遺伝子を前記植物に付与するための少なくとも１つの発現カセットを含む。ただし、該マーカー遺伝子は、形質転換された植物体、植物細胞、もしくは植物組織の選択および／または同定を可能にする。好ましいマーカー遺伝子は、以下に記載されている。好ましいＴ−ＤＮＡは、以下に記載されている。
本発明の好ましい実施形態では、アグロバクテリウム株Ｋ５９９（ＮＣＰＰＢ ２６５９）（または該菌株の誘導体）の前記非病原性変異株は、植物細胞に感染可能であり、植物細胞中へのＴ−ＤＮＡ移入を媒介することが可能であり、かつ植物ゲノム中へのＴ−ＤＮＡ挿入を媒介することが可能であるが、毛状根表現型誘導性が欠如していている。より好ましくは、これは、ＲｉプラスミドｐＲｉ２６５９（アグロバクテリウム株Ｋ５９９；ＮＣＰＰＢ ２６５９中の天然のＲｉプラスミド）またはその誘導体の非病原性プラスミド変異体の存在により達成される（以下に規定されるとおり）。前記非病原性プラスミド変異体は、好ましくは植物細胞感染および形質転換に必要とされる機能をすべて提供するが、毛状根表現型を誘導する配列が欠如している。ＲｉプラスミドｐＲｉ２６５９の好ましい非病原性プラスミド変異体は、以下に記載されている。
本発明の他の好ましい実施形態では、本発明に係る非病原性アグロバクテリウム株はさらに、形質転換効率を増大させるために、たとえば、ｖｉｒ遺伝子発現および／またはその誘導を変化させることにより、改変されている。これは、たとえば、突然変異型もしくはキメラ型のｖｉｒＡ遺伝子またはｖｉｒＧ遺伝子の存在により、実現可能である（たとえば、Hansen 1994; Chen and Winans 1991; Scheeren-Groot et al., 1994に記載されているとおり）。強毒性プラスミドとのさらなる組合せにより、いわゆる強毒性菌株を作製することが可能である（たとえば、ｐＴＯＫ２４６に基づくベクター；Ishida 1996）。強毒性変異株はまた、ｐＳＢ１強毒性プラスミド由来のベクターを利用することにより作製することも可能である（Komari 1996）。
２． 「非病害性」ｐＲｉ２６５９プラスミド
プラスミドｐＲｉ２６５９の非病害性変種の単離された配列は、本明細書に提供されている。この配列および配列情報は、その全体が有用であるだけでなく、部分的にも有用である。多数のタンパク質の発現を行うプラスミドが示されており（表４参照）、これらのタンパク質のうちのいくつかは、当技術分野のものよりも新規であり、ほとんどは、ｐＲｉ２６５９プラスミドの優れた形質転換性能に関与する可能性が高い。配列および配列情報はまた、
ａ） プラスミドの優れた性能についての理解の向上、
ｂ） 他の植物形質転換法（たとえば、標準的アグロバクテリウム・ツメファシエンス利用形質転換に基づくもの）の性能を促進するためのプラスミド由来の単離された構成要素（たとえば、タンパク質）の利用、および
ｃ） 前記プラスミドの限定的変化および最適化
をはじめとする種々の使用に供することが可能であるが、これらに限定されるものではない。
したがって、本発明の好ましい実施形態は、
ａ） 配列番号２４により示される配列または配列番号２４により示される配列のうち少なくとも１００個の連続したヌクレオチド（好ましくは少なくとも２５０または５００個の連続したヌクレオチド、より好ましくは少なくとも１０００または２５００個の連続したヌクレオチド、さらにより好ましくは少なくとも５０００または１００００個の連続したヌクレオチド、最も好ましくはすべての連続したヌクレオチド）からなる配列、を含む配列、および
ｂ） 配列番号２４により示される配列または配列番号２４により示される配列のうち少なくとも１０００個の連続したヌクレオチド（好ましくは少なくとも２０００または４０００個の連続したヌクレオチド、より好ましくは少なくとも５０００または１００００個の連続したヌクレオチド、さらにより好ましくは少なくとも２００００または５００００個の連続したヌクレオチド、最も好ましくはすべての連続したヌクレオチド）からなる配列、に対して少なくとも９０％（好ましくは少なくとも９２％または９５％、より好ましくは少なくとも９７％または９８％、最も好ましくは少なくとも９９％）の配列同一性を有する配列、および
ｃ） ５×ＳＳＰＥ、１％ＳＤＳ、５×デンハルト試薬および１００μｇ／ｍＬの変性サケ精子ＤＮＡからなる溶液中、６８℃での結合またはハイブリダイゼーションと、それに続く、０．１×ＳＳＰＥおよび０．１％ＳＤＳを含む溶液中、６８℃での洗浄と、等価の条件下で、配列番号２４により示される配列もしくはその相補配列のうち少なくとも１００個の連続したヌクレオチド（好ましくは少なくとも２５０または５００個の連続したヌクレオチド、より好ましくは少なくとも１０００または２５００個の連続したヌクレオチド、さらにより好ましくは少なくとも５０００または１００００個の連続したヌクレオチド、最も好ましくはすべての連続したヌクレオチド）からなるプローブにハイブリダイズする配列、
により示される配列からなる群より選択される単離されたヌクレオチド配列に関する。
本発明の他の実施形態は、ｐＲｉ２６５９（アグロバクテリウム株Ｋ５９９；ＮＣＰＰＢ ２６５９中の天然のＲｉプラスミド）またはその誘導体の非病原性（「非病害性」）プラスミド変異体に関し、ただし、該プラスミド変異体は、植物細胞感染および形質転換に必要とされる機能を提供するが、毛状根表現型を誘発する配列を欠損している（これ以降では「非病害性」プラスミド変異体）。好ましくは、前記非病原性プラスミド変異体は、生来型の病原性ｐＲｉ２６５９またはその誘導体の植物細胞感染および形質転換に必要とされる配列を含んでいるが、毛状根表現型を媒介するＴ−ＤＮＡの配列を欠損している。
好ましくは、ｐＲｉ２６５９またはその誘導体の非病原性プラスミド変異体は、植物ゲノム中に移入されうるエレメント（たとえば、Ｔ−ＤＮＡエレメントなど）を含んでいる。これは、バイナリーベクター中に含まれるトランスジェニックＴ−ＤＮＡと組み合わせた場合、とくに有利である。そのような「非病害性」プラスミド変異体を提供する種々の手段が存在する。たとえば、これは、
１． Ｔ−ＤＮＡの境界領域を非機能的にすること（たとえば、突然変異誘発により）、または
２． Ｒｉプラスミドから全Ｔ−ＤＮＡを欠失させること、または
３． 天然の欠失または非病原性突然変異体に関してスクリーニングすること、または
４． ＤＮＡニックの誘導による欠失突然変異誘発を引き起こして（たとえば、アセトシリンゴンを利用して）Ｔ−ＤＮＡを切除すること、または
５． トランスポゾン突然変異誘発を行って非病原性突然変異体に関してスクリーニングすること、または
６． たとえば遺伝子置換ストラテジーを用いて、関連する遺伝子を限定的かつ特異的に欠失させること；ＲＢとＬＢとの間の遺伝子の野生型コピーを欠失代替物で置き換えることにより、欠失させる必要のある遺伝子だけを正確に切除することが可能である；
により実現可能である。
本発明のとくに好ましい一実施形態では、前記非病原性プラスミド変異体は、
ａ） 配列番号２４により示される配列または配列番号２４により示される配列のうち少なくとも１００個の連続したヌクレオチド（好ましくは少なくとも２５０または５００個の連続したヌクレオチド、より好ましくは少なくとも１０００または２５００個の連続したヌクレオチド、さらにより好ましくは少なくとも５０００または１００００個の連続したヌクレオチド、最も好ましくはすべての連続したヌクレオチド）からなる配列、を含む配列、および
ｂ） 配列番号２４により示される配列または配列番号２４により示される配列のうち少なくとも１０００個の連続したヌクレオチド（好ましくは少なくとも２０００または４０００個の連続したヌクレオチド、より好ましくは少なくとも５０００または１００００個の連続したヌクレオチド、さらにより好ましくは少なくとも２００００または５００００個の連続したヌクレオチド、最も好ましくはすべての連続したヌクレオチド）からなる配列、に対して少なくとも９０％（好ましくは少なくとも９２％または９５％、より好ましくは少なくとも９７％または９８％、最も好ましくは少なくとも９９％）の配列同一性を有する配列、および
ｃ） ５×ＳＳＰＥ、１％ＳＤＳ、５×デンハルト試薬および１００μｇ／ｍＬの変性サケ精子ＤＮＡからなる溶液中、６８℃での結合またはハイブリダイゼーションと、それに続く、０．１×ＳＳＰＥおよび０．１％ＳＤＳを含む溶液中、６８℃での洗浄と、等価の条件下で、配列番号２４により示される配列もしくはその相補配列のうち少なくとも１００個の連続したヌクレオチド（好ましくは少なくとも２５０または５００個の連続したヌクレオチド、より好ましくは少なくとも１０００または２５００個の連続したヌクレオチド、さらにより好ましくは少なくとも５０００または１００００個の連続したヌクレオチド、最も好ましくはすべての連続したヌクレオチド）からなるプローブにハイブリダイズする配列、
により示される配列からなる群より選択される少なくとも１つの配列を含んでいる。
より好ましくは、前記非病原性プラスミド変異体は、上述の非病害性ｐＲｉ２６５９プラスミドまたは誘導体（先に定義したとおり）を記述するヌクレオチド配列により記述される。さらにより好ましくはまたは他の選択肢として、誘導体は、配列番号１１２により記述される配列に対して少なくとも８５％（好ましくは少なくとも９０％または９２％、より好ましくは少なくとも９５％または９８％、最も好ましくは少なくとも９９％）アミノ酸配列同一性を有するｖｉｒＤ２タンパク質をコードしている。
当該ｖｉｒＤ２タンパク質は、非病害性ｐＲｉ２６５９プラスミドの形質転換の性能を向上させるのに重要な因子である。したがって、本発明の他の実施形態は、
ａ） 配列番号１１２により示される配列、またはそのうち少なくとも２００個の連続したアミノ酸（好ましくは少なくとも３００個の連続したアミノ酸、より好ましくは少なくとも４００個の連続したアミノ酸、好ましくはすべて連続したアミノ酸）からなる配列、
ｂ） 配列番号１１２により示される配列に対して少なくとも８５％（好ましくは少なくとも９０％または９２％、より好ましくは少なくとも９５％または９８％、最も好ましくは少なくとも９９％）の配列同一性を有する配列、
からなる群より選択されるアミノ酸配列を含むポリペプチドに関する。
しかしながら、非病害性ｐＲｉ２６５９プラスミドによりコードされる他のタンパク質もまた、形質転換過程の最適化に有用であると考えられるので、本発明の他の実施形態は、
ａ） 配列番号２５、２６、２７、２８、２９、３０、３１、３２、３３、３４、３５、３６、３７、３８、３９、４０、４１、４２、４３、４４、４５、４６、４７、４８、４９、５０、５１、５２、５３、５４、５５、５６、５７、５８、５９、６０、６１、６２、６３、６４、６５、６６、６７、６８、６９、７０、７１、７２、７３、７４、７５、７６、７７、７８、７９、８０、８１、８２、８３、８４、８５、８６、８７、８８、８９、９０、９１、９２、９３、９４、９５、９６、９７、９８、９９、１００、１０１、１０２、１０３、１０４、１１４、１１５、１１６、１１７、１１８、１１９、１２０、１２１、１２２、１２３、１２４、１２６、１２８、１２９、１３０、１３１、１３２、１３３、１３４、１３６、１３７、１３９、１４０、１４２、１４３、１４４、１４５、１４６、１４７、１４８、１４９、１５０、１５１、１５２、１５４、１５５、１５６、１５８、１５９、１６１、１６２、１６３、１６４、１６５、１６６、１６７、１６８、１６９、１７０、１７１、１７２、１７３、１７４、１７５、１７６、１７７、１７８、１７９、１８０、１８１、１８２、１８３、１８４、１８５、１８６、もしくは１８７のいずれか１つにより示される配列またはそのうちの少なくとも２００個の連続したアミノ酸（好ましくは少なくとも３００個の連続したアミノ酸、より好ましくは少なくとも４００個の連続したアミノ酸、好ましくはすべての連続したアミノ酸）からなる配列、
ｂ） 配列番号２５、２６、２７、２８、２９、３０、３１、３２、３３、３４、３５、３６、３７、３８、３９、４０、４１、４２、４３、４４、４５、４６、４７、４８、４９、５０、５１、５２、５３、５４、５５、５６、５７、５８、５９、６０、６１、６２、６３、６４、６５、６６、６７、６８、６９、７０、７１、７２、７３、７４、７５、７６、７７、７８、７９、８０、８１、８２、８３、８４、８５、８６、８７、８８、８９、９０、９１、９２、９３、９４、９５、９６、９７、９８、９９、１００、１０１、１０２、１０３、１０４、１１４、１１５、１１６、１１７、１１８、１１９、１２０、１２１、１２２、１２３、１２４、１２６、１２８、１２９、１３０、１３１、１３２、１３３、１３４、１３６、１３７、１３９、１４０、１４２、１４３、１４４、１４５、１４６、１４７、１４８、１４９、１５０、１５１、１５２、１５４、１５５、１５６、１５８、１５９、１６１、１６２、１６３、１６４、１６５、１６６、１６７、１６８、１６９、１７０、１７１、１７２、１７３、１７４、１７５、１７６、１７７、１７８、１７９、１８０、１８１、１８２、１８３、１８４、１８５、１８６、または１８７のいずれか１つにより示される配列に対して少なくとも８５％（好ましくは少なくとも９０％もしくは９２％、より好ましくは少なくとも９５％もしくは９８％、最も好ましくは少なくとも９９％）の配列同一性を有する配列、
からなる群より選択されるアミノ酸配列を含むポリペプチドに関する。
本発明のさらに他の実施形態は、前記ポリペプチドをコードする単離された核酸配列に関する。これらの配列は、単離された天然の配列（ｐＲｉ２６５９プラスミド中に含まれる配列）または遺伝暗号の縮重に基づいて誘導される他の配列でありうる。
最も好ましくは、そこに提供されるｖｉｒＤ２タンパク質のこれらの誘導配列は、図１６に指定されるｖｉｒＤ２タンパク質の少なくとも１つのユニークなアミノ酸残基（アステリスク（＊）で示される）を含んでいる。
好ましくは、非病原性プラスミド変異体は、境界領域を含めて全Ｔ−ＤＮＡを生来型のプラスミドから欠失させることにより取得される。より好ましくは、本発明に係る非病原性プラスミド変異体に関して、欠失されたＴ−ＤＮＡは、配列番号４の塩基５３８付近から塩基１５，５１９付近までの配列または配列番号２６の塩基３６４４付近から塩基１８５７７付近までの配列により示される配列に対応する。
好ましくは、全Ｔ−ＤＮＡは、Ｒｉプラスミドから欠失されている（より好ましくは、全右境界領域および全左境界領域を含めて）。両方の境界領域部分がＴｉプラスミド上にインタクトな状態で残存する従来の非病害性Ｔｉプラスミドの場合、この境界領域の後方のＤＮＡおよびバイナリープラスミドに由来するＤＮＡが組み込まれる可能性があるので、全ＲＢおよび全ＬＢを含めて全Ｔ−ＤＮＡをＲｉプラスミド（たとえばｐＲｉ２６５９）から欠失させることが好ましい。本発明の好ましい実施形態で利用される方法では、無関係なＤＮＡ組込みの可能性が排除される。したがって、本発明に係る好ましい実施形態は、ｐＲｉ２６５９またはその誘導体の非病原性プラスミド変異体に関し、ただし、該プラスミド変異体は、生来型の病原性ｐＲｉ２６５９またはその誘導体の植物細胞感染および形質転換に必要とされる配列を含むが、Ｔ−ＤＮＡ、好ましくは、ＧｅｎＢａｎｋ登録番号ＡＪ２７１０５０（配列番号４）により特徴付けられる配列の塩基５３８付近から塩基１５，５１９付近までの配列または配列番号２６により特徴付けられる配列の塩基３６４４付近から塩基１８５７７付近までの配列を欠損している。この配列は、病原性アグロバクテリウム株Ｋ５９９（ＮＣＰＰＢ ２６５９）中に提供される元の病原性ＲｉプラスミドｐＲｉ２６５９のＴ−ＤＮＡに対応する。より好ましくは、前記非病原性プラスミド変異体は、高ストリンジェンシーの条件下（たとえば、５×ＳＳＰＥ、１％ＳＤＳ、５×デンハルト試薬および１００μｇ／ｍＬの変性サケ精子ＤＮＡからなる溶液中、６８℃での結合またはハイブリダイゼーションと、それに続く、０．１×ＳＳＰＥおよび０．１％ＳＤＳを含む溶液中、６８℃での洗浄と、等価の条件下）で、病原性アグロバクテリウム株Ｋ５９９（ＮＣＰＰＢ ２６５９）中に提供される元の（生来型の）病原性ＲｉプラスミドｐＲｉ２６５９とハイブリダイズするが、該高ストリンジェンシーの条件下で、ＧｅｎＢａｎｋ登録番号ＡＪ２７１０５０（配列番号４）により特徴付けられる配列の塩基５３８付近から塩基１５，５１９付近までの配列、配列番号２６により特徴付けられる配列の塩基３６４４付近から塩基１８５７７付近までの配列のいずれともハイブリダイズしない配列である。
より好ましくは、ｐＲｉ２６５９の誘導体は、植物細胞への土壌細菌由来のＴ−ＤＮＡの移入を媒介することができ、
ａ） 生来型のｐＲｉ２６５９プラスミド（アグロバクテリウム株Ｋ５９９（ＮＣＰＰＢ２６５９）に含まれるものと同様）をコードするＤＮＡに対して少なくとも９０％（好ましくは少なくとも９１％もしくは９２％、より好ましくは少なくとも９５％もしくは９８％、最も好ましくは少なくとも９９％）の配列同一性を有すること、または
ｂ） 高ストリンジェンシーの条件下（たとえば、５×ＳＳＰＥ、１％ＳＤＳ、５×デンハルト試薬および１００μｇ／ｍＬの変性サケ精子ＤＮＡからなる溶液中、６８℃での結合またはハイブリダイゼーションと、それに続く、０．１×ＳＳＰＥおよび０．１％ＳＤＳを含む溶液中、６８℃での洗浄と、等価の条件下）で、生来型のｐＲｉ２６５９プラスミド（配列番号１１１により示されるのと同様）とハイブリダイズすること、
によりさらに特徴付けられるプラスミドである。
好ましい実施形態では、本発明に係る非病原性プラスミド変異体は、高ストリンジェンシーの条件下で、病原性アグロバクテリウム株Ｋ５９９（ＮＣＰＰＢ ２６５９）の生来型病原性ＲｉプラスミドｐＲｉ２６５９の全体とハイブリダイズするが、高ストリンジェンシーの条件下で、配列番号４により特徴付けられる配列の塩基５３８付近から塩基１５，５１９付近までの配列、配列番号２６により特徴付けられる配列の塩基３６４４付近から塩基１８５７７付近までの配列のいずれともハイブリダイズしない。
ｐＲｉ２６５９を参照するときの「誘導体」という用語は、植物細胞中への土壌細菌由来のＴ−ＤＮＡの移入を媒介することが可能であり、かつ
ａ） 生来型のｐＲｉ２６５９プラスミド（アグロバクテリウム株Ｋ５９９（ＮＣＰＰＢ２６５９）に含まれるものと同様）をコードするＤＮＡに対して少なくとも９０％、より好ましくは少なくとも９５％、最も好ましくは少なくとも９８％の配列同一性を有すること、または
ｂ） 高ストリンジェンシーの条件下（以上に定義したとおり）で生来型のｐＲｉ２６５９プラスミドとハイブリダイズすること、
によりさらに特徴付けられるプラスミドを意味するものとする。
より好ましくは、ｐＲｉ２６５９のそのような誘導体は、その天然の病原性形態で、オピン合成のククモピン型表現型を媒介している。
３． トランスジェニックＴ−ＤＮＡ
好ましくは、アグロバクテリウム株Ｋ５９９（ＮＣＰＰＢ ２６５９）またはその誘導体の前記トランスジェニック非病原性変異株中のＴ−ＤＮＡは、植物感染に必要とされる特徴を提供するプラスミドとは分離してバイナリーベクタープラスミド（たとえば、新生物誘発性もしくは毛状根誘発性を欠損しているＴｉプラスミドまたはＲｉプラスミド）に含まれる。したがって、本発明の他の実施形態は、アグロバクテリウム・リゾゲネスｐＲｉ２６５９プラスミドに由来する少なくとも１つのＴ−ＤＮＡ境界領域がつなげられたトランスジェニックＴ−ＤＮＡに関し、ただし、該トランスジェニックＴ−ＤＮＡは、毛状根表現型を誘発する配列を含まない。
好ましくは、Ｔ−ＤＮＡは、少なくとも右境界配列（より好ましくは右境界配列および左境界配列）がつなげられている。好ましいのは、Ｔｉおよび／またはＲｉ境界領域である。Ｔ−ＤＮＡ境界領域は、当技術分野で報告されているように（Zupan 2000）、明確に定義された約２５ｂｐの反復配列である。いわゆるｖｉｒ遺伝子（元のＴｉまたはＲｉプラスミドの一部分）の併用作用により、境界領域は、Ｔ−ＤＮＡ移入を媒介する。
好ましい実施形態では、前記トランスジェニックＴ−ＤＮＡは、農学上有益な形質を前記植物に付与するための少なくとも１つの発現カセットを含んでいる。他の好ましい実施形態では、前記Ｔ−ＤＮＡは、形質転換された植物体、植物細胞、もしくは植物組織の選択および／または同定を可能にする少なくとも１つのマーカー遺伝子をさらに含んでいる。
プラスミドｐＲｉ２６５９のＴ−ＤＮＡ境界領域は、Ｔ−ＤＮＡの移入ひいてはトランスジェニック植物（特定的にはトランスジェニックダイズ植物）の生産にとくに有効であることが実証されている。したがって、好ましくは、Ｔ−ＤＮＡは、ｐＲｉ２６５９プラスミドに由来するＴ−ＤＮＡ境界領域を含む（たとえば、バイナリーベクターに組み込まれる）。右境界領域は、オーバードライブ配列と機能的に等価な１６個の８ｂｐの反復配列を有する（Hansen 1992）。これらの境界配列は、慣用される境界配列よりも優れた利点を提供する。とくに好ましいのは、アグロバクテリウム株Ｋ５９９（ＢＣＰＰＢ２６５９）の非病害性変異株または誘導体と、Ｒｉプラスミド、より好ましくはｐＲｉ２６５９プラスミドの境界領域を含むトランスジェニックＴ−ＤＮＡとの組合せであり、この組合せは、たとえばダイズで、高い形質転換効率に寄与する。とくに好ましいのは、配列番号４（ｐＲｉ２６５９のＴ−ＤＮＡ領域）の塩基５３８−５６１を表す配列番号１８：
５’−ｔｇｇｃａｇｇａｔａ ｔａｔｔｇｔｇｇｔｇ ｔａａａ−３’ （配列番号１８）
により示される配列を含む左境界配列である。
とくに好ましいのは、配列番号４（ｐＲｉ２６５９のＴ−ＤＮＡ領域）の塩基１５，４９６−１５，５１９を表す配列番号１９：
５’−ｔｇａｃａｇｇａｔａ ｔａｔｃｃｃｃｔｔｇ ｔｃｔａ−３’ （配列番号１９）
により示される配列を含む右境界配列である。
したがって、本発明の他の実施形態は、アグロバクテリウム・リゾゲネスｐＲｉ２６５９プラスミドに由来する少なくとも１つのＴ−ＤＮＡ境界領域がつなげられたトランスジェニックＴ−ＤＮＡを含むプラスミドベクターに関する。好ましくは、これらの境界領域は、配列番号１８または１９により示される。より好ましくは、プラスミドは、配列番号１９により示される配列を含む右境界領域を含んでいる。最も好ましくは、プラスミドは、配列番号１８および１９によりそれぞれ示される配列を含む両方の境界配列を含んでいる。好ましくは、前記プラスミドは、毛状根表現型を誘発する配列を含んでおらず、より好ましくは、前記プラスミドは、内部Ｔ−ＤＮＡタンパク質コード配列を含んでおらず、最も好ましくは、前記プラスミドは、内部Ｔ−ＤＮＡ配列を実質的に含んでいない。これに関連して「内部」という用語は、境界領域がつなげられたＤＮＡを意味する（ただし、Ｔ−ＤＮＡ境界領域を除く）。Ｔ−ＤＮＡ境界領域とは、配列番号１８および１９によりそれぞれ示される配列を少なくとも含む配列として解釈されるものである。「実質的に」という用語は、病原性表現型に連結されていないいくつかの内部配列が含まれうることを意味するものとし、好ましくは、これらの配列は、２００塩基対以下、好ましくは１００塩基対以下、最も好ましくは５０塩基対以下であり、好ましくは境界配列に直接的に連続している。
非病原性変異株により植物ゲノム中に組み込まれるＴ−ＤＮＡは、種々の形態で提供可能である。Ｔ−ＤＮＡは、ＤＮＡ構築物として、好ましくは、シャトルベクターもしくは中間ベクターまたはバイナリーベクターのいずれかの特定のプラスミドに組み込んで、提供可能である。たとえば、以下の手段により提供可能である（ただし、これらに限定されるものではない）：
ａ） Ｔ−ＤＮＡが、非病原性変異株の染色体ＤＮＡ中に組み込まれる；
ｂ） Ｔ−ＤＮＡが、非病原性変異株に含まれる非病害性ＲｉプラスミドＤＮＡ中に組み込まれる；
ｃ） Ｔ−ＤＮＡが、非病害性Ｒｉプラスミドとは分離してプラスミドの形態で非病原性変異株中に含まれる。
好ましくは、前記非病原性変異株中のＴ−ＤＮＡは、非病害性Ｒｉプラスミドとは分離してバイナリーベクタープラスミド上に含まれうる。
他の好ましい実施形態では、前記Ｔ−ＤＮＡは、形質転換された植物体、植物細胞、もしくは植物組織の選択および／または同定を可能にする少なくとも１つのマーカー遺伝子をさらに含んでいる。
本発明の他の実施形態は、本発明に係るヌクレオチド配列、非病原性プラスミド変異体、またはトランスジェニックＴ−ＤＮＡを含む、細胞または非ヒト生物に関する。好ましくは、前記細胞または非ヒト生物は、細菌、酵母、植物、哺乳動物、および昆虫からなる群より選択される。好ましい一実施形態では、前記細胞または生物は、リゾビウム科（genus Rhizobiaceae）の土壌細菌である。他の好ましい実施形態では、前記細胞または生物は、植物細胞または植物生物、より好ましくは、単子葉植物および双子葉植物からなる群より選択される。最も好ましいのは、ダイズ、トウモロコシ（メイズ）、コムギ、アブラナ（カノーラ）、マンジュギク、ジャガイモ、イネ、オオムギ、およびトマトからなる群より選択される植物である。
本発明の他の実施形態は、本発明に係るトランスジェニックＴ−ＤＮＡを含むトランスジェニックベクターに関する。好ましくは、Ｔ−ＤＮＡは、バイナリーベクターの形態で提供される。いわゆる「バイナリーベクター系」では、Ｔ−ＤＮＡは、シャトルベクター中に組み込まれることにより、Ｒｉプラスミドの他の機能的エレメント（たとえば、ｖｉｒ遺伝子）から物理的に分離されるので、取扱いがより容易になる（Ｔｉプラスミドに基づくバイナリー系の解説については、ＥＰ−Ａ １２０ ５１６；ＵＳ４，９４０，８３８を参照されたい）。これらのバイナリーベクターは、（境界配列を有する非病害性Ｔ−ＤＮＡのほかに）、アグロバクテリウムおよび大腸菌（E. coli）の両方で複製できるように原核配列を含む。この場合、形質転換のために利用される非病害性アグロバクテリウム・リゾゲネス株は、その非病害性Ｒｉプラスミドに加えて、移入されるＴ−ＤＮＡを有するバイナリープラスミドを含み、バイナリープラスミドは、好ましくは、形質転換アグロバクテリウム細胞の選択用の遺伝子（一般的にはＴ−ＤＮＡの外側）、形質転換植物細胞を選択するためのマーカー、および転写させる対象の核酸配列を含む（後者の２つは、一般的には、Ｔ−ＤＮＡ内に含まれる）。バイナリープラスミドは、たとえば、エレクトロポレーションまたは他の形質転換法により、非病害性アグロバクテリウム・リゾゲネス株に移入可能である（Mozo 1991）。バイナリーベクターは、大腸菌およびアグロバクテリウムの両方において複製可能である。それらは、アグロバクテリウム中に直接的に形質転換導入することが可能である（たとえば、Holsters 1978に記載のとおり）。この場合、宿主生物として作用するアグロバクテリウムは、ｖｉｒ領域を有するプラスミドをすでに含有していなければならない。後者は、Ｔ−ＤＮＡを植物細胞に移入するために必要とされる。このように形質転換されたアグロバクテリウムは、植物細胞を形質転換するために使用することが可能である。形質転換アグロバクテリウムの選択を可能にする選択マーカーは、たとえば、カナマイシンに対する耐性を付与するｎｐｔＩ遺伝子もしくはｎｐｔＩＩ遺伝子、またはストレプトマイシン、スペクチノマイシンに対する耐性を付与するａａｄＡ遺伝子である。形質転換された植物細胞、組織、または植物体の特定および／または選択のために、種々のマーカー（選択マーカーおよびレポーター遺伝子）が好適である（詳細については下記参照）。アグロバクテリウムベクター系およびアグロバクテリウム媒介形質転換法の内容については、当技術分野で公知である（Miki 1993; Gruber 1993; Moloney 1989）。種々のバイナリーベクターが公知であり、そのうちのいくつかは、たとえば、ｐＢＩＮ１９（Clontech Laboratories, Inc. USA）のように市販されている。アグロバクテリウム・ツメファシエンスに基づく形質転換に好適なベクターはすべて、本発明に係る方法で利用することも可能である。一般的なバイナリーベクターは、Ｐ型プラスミドＲＫ２に由来するｐＲＫ２５２（Bevan 1984）またはｐＴＪＳ７５（Watson 1985）のような「広い宿主域」のプラスミドに基づく。これらのベクターのほとんどは、ｐＢＩＮ１９の誘導体である（Bevan 1984）。種々のバイナリーベクターが公知であり、そのうちのいくつかは、たとえば、ｐＢＩ１０１．２またはｐＢＩＮ１９（Clontech Laboratories, Inc. USA）のように市販されている。さらなるベクターは、サイズおよび取扱いに関して改良されたものである（たとえば、ｐＰＺＰ；Hajdukiewicz 1994）。改良されたベクター系はまた、ＷＯ ０２／００９００に記載されている。バイナリーベクターまたは任意の他のベクターは、一般的なＤＮＡ組換え技術による改変、大腸菌における増殖、およびたとえばエレクトロポレーションまたは他の形質転換技術によるアグロバクテリウム中への導入が可能である（Mozo 1991）。
したがって、本発明の他の実施形態は、本発明に係る非病原性プラスミド変異体を含む細胞もしくは非ヒト生物（先に指定したとおり）または本発明に係る前記Ｔ−ＤＮＡを含むトランスジェニックＴ−ＤＮＡもしくはベクターに関する。好ましくは、前記細胞または非ヒト生物は、細菌、酵母、植物、哺乳動物、および昆虫からなる群より選択される。より好ましくは、前記細胞または非ヒト生物は、リゾビウム科（genus Rhizobiaceae）の土壌細菌である。とくに好ましいのは、シノリゾビウム・メリロティ（Sinorhizobium meliloti）、シノリゾビウム・メディカエ（Sinorhizobium medicae）、シノリゾビウム・フレディイ（Sinorhizobium fredii）、リゾビウム・ｓｐ．ＮＧＲ２３４（Rhizobium sp. NGR234）、リゾビウム・ｓｐ．ＢＲ８１６（Rhizobium sp. BR816）、リゾビウム・ｓｐ．Ｎ３３（Rhizobium sp. N33）、リゾビウム・ｓｐ．ＧＲＨ２（Rhizobium sp. GRH2）、シノリゾビウム・サヘリ（Sinorhizobium saheli）、シノリゾビウム・テランガエ（Sinorhizobium terangae）、リゾビウム・レグミノサルム・ビオバル・トリフォリイ（Rhizobium leguminosarum biovar trifolii）、リゾビウム・レグミノサルム・ビオバル・ビシアエ（Rhizobium leguminosarum biovar viciae）、リゾビウム・レグミノサルム・ビオバル・ファセオリ（Rhizobium leguminosarum biovar phaseoli）、リゾビウム・トロピシ（Rhizobium tropici）、リゾビウム・エトリ（Rhizobium etli）、リゾビウム・ガレガエ（Rhizobium galegae）、リゾビウム・ガリカム（Rhizobium gallicum）、リゾビウム・ギアルディニイ（Rhizobium giardinii）、リゾビウム・ハイナネンセ（Rhizobium hainanense）、リゾビウム・モンゴレンセ（Rhizobium mongolense）、リゾビウム・ルピニ（Rhizobium lupini）、メソリゾビウム・ロティ（Mesorhizobium loti）、メソリゾビウム・フアクイイ（Mesorhizobium huakuii）、メソリゾビウム・シセリ（Mesorhizobium ciceri）、メソリゾビウム・メディテラネイウム（Mesorhizobium mediterraneium）、メソリゾビウム・ティアンシャネンセ（Mesorhizobium tianshanense）、ブラディリゾビウム・エルカンニ（Bradyrhizobium elkanni）、ブラディリゾビウム・ジャポニカム（Bradyrhizobium japonicum）、ブラディリゾビウム・リアオニンゲンセ（Bradyrhizobium liaoningense）、アゾリゾビウム・カウリノダンス（Azorhizobium caulinodans）、アロバクテリウム・ウンディコラ（Allobacterium undicola）、フィロバクテリウム・ミルシナセアルム（Phyllobacterium myrsinacearum）、アグロバクテリウム・ツメファシエンス（Agrobacterium tumefaciens）、アグロバクテリウム・ラジオバクター（Agrobacterium radiobacter）、アグロバクテリウム・リゾゲネス（Agrobacterium rhizogenes）、アグロバクテリウム・ビティス（Agrobacterium vitis）、およびアグロバクテリウム・ルビ（Agrobacterium rubi）のような土壌細菌である。
本発明の好ましい実施形態では、本発明に係る非病害性アグロバクテリウム・リゾゲネス株により植物ゲノムに組み込まれるＴ−ＤＮＡは、前記植物に農学上有益な形質を付与するための少なくとも１つの発現カセットを含んでいる。他の好ましい実施形態では、前記Ｔ−ＤＮＡは、形質転換された植物体、植物細胞、もしくは植物組織の選択および／または同定を可能にする少なくとも１つのマーカー遺伝子をさらに含んでいる。したがって、標的植物のゲノムに挿入されるＴ−ＤＮＡは、少なくとも１つの発現カセットを含み、発現カセットは、たとえば、選択マーカー遺伝子、形質遺伝子、アンチセンスＲＮＡ、または二本鎖ＲＮＡの発現を促進しうる。好ましくは、該発現カセットは、発現時に有利な表現型を形質転換植物に付与する核酸配列に機能的に連結された、植物細胞において機能的であるプロモーター配列を含む。当業者であれば、これに関連して、たとえば、食品および飼料の品質を向上させたり、化学物質、ファインケミカル、もしくは医薬（たとえば、ビタミン、油脂、炭水化物；Dunwell 2000）を生成させたり、除草剤に対する耐性を付与したり、または雄性不稔性を付与したりするために利用可能な多数の配列を熟知している。さらに、増殖、収量、ならびに非生物的および生物的ストレス因子（たとえば、真菌、ウイルス、または昆虫など）に対する耐性を増大させることが可能である。有利な性質は、タンパク質を過剰発現させることにより、またはたとえば、対応するアンチセンス（Sheehy 1988；ＵＳ４，８０１，３４０；Mol 1990）もしくは二本鎖ＲＮＡ（Matzke 2000；Fire 1998；Waterhouse 1998；ＷＯ ９９／３２６１９；ＷＯ ９９／５３０５０；ＷＯ ００／６８３７４；ＷＯ ００／４４９１４；ＷＯ ００／４４８９５；ＷＯ ００／４９０３５；ＷＯ ００／６３３６４）を発現させて、内因性タンパク質の発現を低減させることにより、付与することが可能である。
植物で発現させるために、植物特異的プロモーターが好ましい。「植物特異的プロモーター」という用語は、原理的には、植物もしくは植物の一部分、植物細胞、植物組織、または植物培養物において、遺伝子、特定的には外来遺伝子の発現を支配しうる任意のプロモーターを意味するものと解釈される。これに関連して、発現は、たとえば、構成的、誘導的、または発育依存的でありうる（以上に定義および明記したとおり）。
遺伝的成分および／または発現カセットは、プロモーターに加えて遺伝子制御配列をさらに含みうる。「遺伝子制御配列」という用語は、広義に解釈されるものとし、本発明に係るＤＮＡ構築物またはそれに含まれる発現カセットの作製または機能に影響を及ぼすすべての配列を意味する。たとえば、遺伝子制御配列は、原核生物または真核生物において転写および翻訳を調節する。好ましくは、本発明に係る発現カセットには、組換え発現される対象の核酸配列の５’上流に植物において機能的なプロモーターならびに３’下流に追加の遺伝子制御配列としてターミネーター配列および適切であればさらなる慣用的調節エレメントが、いずれの場合にも組換え発現される核酸配列に機能しうる形で連結されて含まれる。
遺伝子制御配列については、たとえば、"Goeddel; Gene Expression Technology: Methods in Enzymology 185, Academic Press, San Diego, CA (1990)"または"Gruber and Crosby, in: Methods in Plant Molecular Biology and Biotechnolgy, CRC Press, Boca Raton, Florida（編）: Glick and Thompson, Chapter 7, 89-108"およびそこに引用されている参考文献に記載されている。
そのような制御配列の例は、インダクターまたはリプレッサーが結合されることにより核酸の発現を調節する配列である。遺伝子制御配列はさらに、遺伝子の５’非翻訳領域、イントロン、または非コード３’領域、たとえば、アクチン−１イントロン、またはＡｄｈ１−Ｓイントロン１、２、および６などをも含む（一般的参考文献：The Maize Handbook, Chapter 116, Freeling and Walbot (編), Springer, New York (1994)）。それらは、遺伝子発現の調節において重要な役割を果たしうることが実証されている。この際、５’非翻訳配列は、異種遺伝子の一過的発現を促進しうることが実証されている。翻訳エンハンサーとして挙げられうる例は、タバコモザイクウイルス５’リーダー配列（Gallie 1987）などである。さらに、それらは、組織特異性を向上させうる（Rouster 1998）。さらに、それらは、組織特異性を向上させうる（Rouster 1998）。逆に、ｏｐａｑｕｅ−２遺伝子の５’非翻訳領域は、発現を抑制する。該当する領域を欠失させると、遺伝子の活性が増大される（Lohmer 1993）。遺伝子制御配列はまた、翻訳を開始するためのリボソーム結合性配列を含みうる。発現される核酸配列が好適な配列を提供しない場合またはそれらが発現系に適合しない場合、このことはとくに好ましい。
発現カセットは、有利には、プロモーターに機能しうる形で連結されて核酸配列の組換え発現の増大を可能にする１つ以上のエンハンサー配列を含みうる。さらなる調節エレメントやターミネーターのような追加の有利な配列を組換え発現される核酸配列の３’末端に挿入することも可能である。制御配列として好適なポリアデニル化シグナルは、植物ポリアデニル化シグナル、好ましくは、アグロバクテリウム・ツメファシエンスに由来するＴ−ＤＮＡポリアデニル化シグナルに本質的に対応するもの、特定的には、オクトピンシンターゼ（ＯＣＳ）ターミネーターおよびノパリンシンターゼ（ＮＯＳ）ターミネーターである。
組換え発現される核酸配列の１つ以上のコピーを遺伝子構築物中に存在させることが可能である。遺伝子制御配列はさらに、シグナルペプチド配列からなる融合タンパク質をコードする配列を意味するものと解釈される。
制御配列はさらに、ゲノムから挿入配列を除去できるようする配列と解釈されるものとする。ｃｒｅ／ｌｏｘ系（Sauer B 1998; Odell 1990; Dale 1991）、ＦＬＰ／ＦＲＴ系（Lysnik 1993）、またはＡｃ／Ｄｓ系（Wader 1987; ＵＳ５，２２５，３４１; Baker 1987; Lawson 1994）に基づく方法を用いると、適切であれば、組織特異的におよび／または誘導可能に、宿主生物のゲノムから特定のＤＮＡ配列を除去することが可能である。これに関連して、制御配列は、（たとえばｃｒｅリコンビナーゼにより）後で除去できるようにする特定の隣接配列（たとえばｌｏｘ配列）を意味しうる。
本発明に係る遺伝的成分および／または発現カセットは、さらなる機能的エレメントを含みうる。機能的エレメントという用語は、広義に解釈されるものとし、本発明に係る遺伝的成分、発現カセット、または組換え生物の作製、増幅、または機能に影響を与えるすべてのエレメントを意味する。機能的エレメントとしては、たとえば、以下のものが挙げられる（ただし、これらに限定されるものではない）：
１． 選択マーカー遺伝子
選択マーカー遺伝子は、形質転換細胞または相同的組換え細胞をうまく選択し分離するのに有用である。好ましくは、本発明に係る方法の範囲内で、原核宿主における選択のために１種のマーカーを利用することが可能であり、真核宿主、とくに植物種宿主における選択のために、他のマーカーを利用することが可能である。マーカーは、抗生物質、トキシン、重金属などのような殺生物剤に対する保護でありうるか、または相補性により栄養要求性宿主に原栄養性を付与するように機能しうる。植物に好ましい選択性マーカー遺伝子としては、以下のものが挙げられる：
１．１ ネガティブ選択マーカー
ネガティブ選択マーカーは、代謝阻害剤（たとえば、２−デオキシグルコース−６−ホスフェート、ＷＯ９８／４５４５６）、抗生物質（たとえば、カナマイシン、Ｇ４１８、ブレオマイシン、もしくはハイグロマイシン）、または除草剤（たとえば、ホスフィノトリシンもしくはグリホセート）のような殺生物性化合物に対する耐性を付与する。とくに好ましいネガティブ選択マーカーは、除草剤に対する耐性を付与するものである。例として挙げられるのは、以下のとおりである：
・ ホスフィノトリシンアセチルトランスフェラーゼ（ＰＡＴ；ビアラホス（Bialophos）耐性；ｂａｒとも呼ばれる；De Block 1987；ＥＰ ０ ３３３ ０３３；ＵＳ４，９７５，３７４）
・ ５−エノールピルビルシキミ酸−３−リン酸シンターゼ（ＥＰＳＰＳ；ＵＳ５，６３３，４３５）またはグリホセート（Ｎ−ホスホノメチルグリシン）（Shah 1986）に対する耐性を付与するグリホセートオキシドレダクターゼ遺伝子（ＵＳ５，４６３，１７５）
・ グリホセート分解酵素（グリホセートオキシドレダクターゼ；ｇｏｘ）、
・ ダラポン不活性化デハロゲナーゼ（ｄｅｈ）
・ スルホニルウレア不活性化アセト乳酸シンターゼおよびイミダゾリノン不活性化アセト乳酸シンターゼ（たとえば、Ｓ４および／またはＨｒａ突然変異などを有する突然変異型ＡＬＳ変異体）
・ ブロモキシニル分解ニトリラーゼ（ｂｘｎ）
・ ネオマイシンホスホトランスフェラーゼ（Fraley 1983）などをコードし、抗生物質カナマイシンならびに関連抗生物質ネオマイシン、パロモマイシン、ゲンタマイシン、およびＧ４１８に対する耐性を付与する酵素を発現する、カナマイシン耐性遺伝子またはＧ４１８耐性遺伝子（ＮＰＴＩＩ；ＮＰＴＩ）
・ ２−デスオキシグルコース（Randez-Gil 1995）に対する耐性を付与する２−デオキシグルコース−６−リン酸ホスファターゼ（ＤＯＧＲ１遺伝子産物；ＷＯ ９８／４５４５６；ＥＰ ０ ８０７ ８３６）
・ ハイグロマイシン耐性を媒介するハイグロマイシンホスホトランスフェラーゼ（ＨＰＴ）（Vanden Elzen 1985）
・ ジヒドロ葉酸レダクターゼ（Eichholtz 1987）
抗生物質耐性を付与する細菌起源のさらなるネガティブ選択マーカー遺伝子としては、抗生物質スペクチノマイシンに対する耐性を付与するａａｄＡ遺伝子、ゲンタマイシンアセチルトランスフェラーゼ、ストレプトマイシンホスホトランスフェラーゼ（ＳＰＴ）、アミノグリコシド−３−アデニルトランスフェラーゼ、およびブレオマイシン耐性デターミナントが挙げられる（Hayford 1988; Jones 1987; Svab 1990; HiIIe 1986）。
とくに好ましいのは、Ｄ−アラニンやＤ−セリンなどのようなＤ−アミノ酸によりもたらされる毒性作用に対する耐性を付与するネガティブ選択マーカーである（ＷＯ ０３／０６０１３３）。これに関連してとくに好ましいネガティブ選択マーカーは、酵母ロドトルラ・グラシリス（Rhodotorula gracilis）（ロドスポリジウム・トルロイデス（Rhodosporidium toruloides））由来のｄａｏｌ遺伝子（ＥＣ：１．４．３．３：ＧｅｎＢａｎｋ登録番号：Ｕ６００６６）および大腸菌遺伝子ｄｓｄＡ（Ｄ−セリンデヒドラターゼ（Ｄ−セリンデアミナーゼ）［ＥＣ：４．３．１．１８；ＧｅｎＢａｎｋ登録番号：Ｊ０１６０３］）である。
１．２） ポジティブ選択マーカー
ポジティブ選択マーカーは、非形質転換植物と比較して形質転換植物に増殖優位性を付与する。アグロバクテリウム・ツメファシエンス（菌株：ＰＯ２２；Ｇｅｎｂａｎｋ登録番号：ＡＢ０２５１０９）に由来するイソペンテニルトランスフェラーゼのような遺伝子は、サイトカイニン生合成の主要な酵素として形質転換植物（たとえば、サイトカイニン非含有培地に基づく選択による）の再生を促進しうる。対応する選択方法は、報告されている（Ebinuma 2000a, b）。非形質転換植物と比較して形質転換植物に増殖優位性を付与するさらなるポジティブ選択マーカーは、たとえば、ＥＰ−Ａ ０ ６０１ ０９２に記載されている。増殖刺激選択マーカーとしては、β−グルクロニダーゼ（たとえばサイトカイニングルクロニドとの組合せで）、マンノース−６−リン酸イソメラーゼ（マンノースとの組合せで）、ＵＤＰ−ガラクトース−４−エピメラーゼ（たとえばガラクトースとの組合せで）が挙げられうるが（ただし、これらに限定されるものではない）、マンノースと組み合わされるマンノース−６−リン酸イソメラーゼは、とくに好ましい。
１．２） カウンター選択マーカー
カウンター選択マーカーは、前記マーカーを含み所定の欠失配列を有する生物を選択するのにとくに好適である（Koprek 1999）。ネガティブ選択マーカーの例としては、チミジンキナーゼ（ＴＫ）、シトシンデアミナーゼ（Gleave 1999; Perera 1993; Stougaard 1993）、シトクロムＰ４５０タンパク質（Koprek 1999）、ハロアルカンデハロゲナーゼ（Naested 1999）、ｉａａＨ遺伝子産物（Sundaresan 1995）、シトシンデアミナーゼｃｏｄＡ（Schlaman & Hooykaas 1997）、またはｔｍｓ２遺伝子産物（Fedoroff & Smith 1993）が挙げられる。
２） レポーター遺伝子
レポーター遺伝子は、容易に定量可能なタンパク質をコードし、それらの色または酵素活性を介して、形質転換効率、発現部位、または発現時期の評価を可能にする。これに関連してなかでもとくに好ましいのは、レポータータンパク質をコードする遺伝子（Schenborn 1999）、たとえば、緑色蛍光タンパク質遺伝子（Sheen 1995; Haseloff 1997; Reichel 1996; Tian 1997; ＷＯ ９７／４１２２８; Chui 1996; Leffel 1997）、クロラムフェニコールトランスフェラーゼ遺伝子、ルシフェラーゼ遺伝子（Ow 1986; Millar 1992）、エクオリン遺伝子（Prasher 1985）、β−ガラクトシダーゼ遺伝子、Ｒ座遺伝子（植物組織においてアントシアニン色素（赤色着色）の産生を調節するタンパク質をコードし、したがって、さらなる補助物質または色素原性物質を添加することなくプロモーター活性の直接分析を可能にする）（Dellaporta 1988; Ludwig 1990）であるが、β−グルクロニダーゼ（ＧＵＳ）遺伝子がなかでもとくに好ましい（Jefferson 1987a,b）。β−グルクロニダーゼ（ＧＵＳ）発現は、５−ブロモ−４−クロロ−３−インドリル−β−Ｄ−グルクロン酸と共に組織をインキュベートしたときの青色により検出され、細菌ルシフェラーゼ（ＬＵＸ）発現は、発光により検出され；ホタルルシフェラーゼ（ＬＵＣ）発現は、ルシフェリンと共にインキュベートした後の発光により検出され；そしてガラクトシダーゼ発現は、組織を５−ブロモ−４−クロロ−３−インドリル−β−Ｄ−ガラクトピラノシドで染色した後の鮮青色により検出される。レポーター遺伝子はまた、抗生物質耐性マーカーの代わりにスコア付け可能なマーカーとして使用することも可能である。そのようなマーカーは、移入された遺伝子の存在を検出したりまたはその発現レベルを測定したりするために使用される。遺伝子改変細胞の特定またはタグ付けのための植物におけるスコア付け可能なマーカーの使用は、細胞の改変効率が高い場合にかぎり良好に機能する。
３） 大腸菌などにおける本発明に係る発現カセットまたは発現ベクターの増幅を保証する複製起点。例として挙げられるのは、ＯＲＩ（ＤＮＡ複製起点）、ｐＢＲ３２２ ｏｒｉ、またはＰ１５Ａ ｏｒｉである（Maniatis 1989）。大腸菌で機能する複製系のさらなる例は、ＣｏｌＥＩ、ｐＳＣ１０１、ｐＡＣＹＣ１８４などである。大腸菌複製系に加えてまたはその代わりに、Ｐ−１不和合性（incompatibility）プラスミド（たとえばｐＲＫ２９０）の複製系のような広い宿主域の複製系を利用することが可能である。これらのプラスミドは、病害性および非病害性のＴｉプラスミドを用いてＴ−ＤＮＡを植物宿主に移入するのにとくに効果的である。
４） アグロバクテリウム媒介形質転換に必要なエレメント。たとえば、Ｔ−ＤＮＡ領域またはｖｉｒ領域の左境界領域および／または任意により右境界領域。
５） １つ以上の核酸配列の挿入を可能および容易にするための多重クローニング部位（ＭＣＳ）。
典型的には、トランスジーン発現技術を用いて、Ｔ−ＤＮＡを含む構築物（または本発明の範囲内で利用される任意の他のＤＮＡ構築物）を調製する。組換え発現技術は、組換え核酸の構築および形質転換細胞における遺伝子の発現を含む。これらの目的を達成するための分子クローニング技術は、当技術分野で公知である。組換え核酸の構築に好適な多種多様なクローニング方法およびｉｎ ｖｉｔｒｏ増幅方法が当業者に周知である。多くのクローニング作業を介して当業者に指針を与えるのに十分なこれらの技術の例および説明は、Berger and Kimmel (1987)、Maniatis 1989、ilhavy 1984、Ausubel 1998に見いだされる。好ましくは、本発明に係るＤＮＡ構築物は、当業者の熟知した組換えおよびクローニングの技術を用いて上述の配列中でＤＮＡ構築物の上述の必須の成分を連結させることにより作製される。
ポリヌクレオチド構築物の構築は、一般的には、細菌中で複製可能なベクターの使用を必要とする。細菌由来のプラスミドを精製するためのキットは、多数市販されている。それらを適切に使用するために、製造業者の説明書に準拠されたい（たとえば、いずれもPharmacia Biotech製のEasyPrepTM、FlexiPrepTM; Stratagene製のStrataCleanTM; およびQiagen製のQIAexpressTM Expression Systemを参照されたい）。単離および精製されたプラスミドは、次に、他のプラスミドを作製するためにさらに操作されうるか、細胞にトランスフェクトするために使用されうるか、または植物に感染させて形質転換するためにアグロバクテリウム・ツメファシエンスに組み込まれうる。アグロバクテリウムが形質転換の手段である場合、シャトルベクターが構築される。
４． 形質転換手順
本発明に係る方法は、トランスジェニック植物、またはそれに由来する細胞、一部分、組織、収穫物質を取得するのに有用である。
したがって、本発明の他の対象は、ゲノム中に、好ましくは核染色体ＤＮＡ中に本発明に係るＤＮＡ構築物（たとえば、ＲｉプラスミドｐＲｉ２６５９の境界領域を含むＴ−ＤＮＡ）を含むトランスジェニック植物体または植物細胞、およびそのような植物に由来する細胞、細胞培養物、組織、一部分、または増殖物質、たとえば、植物生物の場合、葉、根、種子、果実、花粉などに関する。本発明の他の重要な態様は、開示された方法により作製されるトランスジェニック植物の後代、さらにはそのような後代に由来する細胞およびそのような後代から得られる種子を包含する。
植物品種は、植物育種者権利法（Plant Breeders Rights）に基づく排他的植物品種、とくに登録可能植物品種であってもよい。植物体の細胞またはその原細胞に導入されたトランスジーンをゲノム中に安定的に含有するというだけの理由で、植物体が「植物品種」を構成すると考える必要はないことに留意されたい。植物体に加えて、本発明は、そのような植物体の任意のクローン、結実、自己増殖、または異種交配による後代および子孫、ならびにこれらのいずれかの任意の一部分または繁殖体、たとえば、有性もしくは無性の生殖または増殖に使用されうる挿穂および種子を提供する。このほかに本発明に包含されるのは、そのような植物体の有性的もしくは無性的に増殖された後代、クローン、または子孫である植物体、あるいは該植物体、後代、クローン、または子孫の任意の一部分または繁殖体である。また、ヒトまたは動物により摂取可能な本発明に係る遺伝子改変植物は、たとえば、直接的にまたは当技術分野で公知の処理に従って食品または飼料として使用可能である。
本発明に係る方法は、実質上、さまざまな単子葉植物および双子葉植物を含めてすべての植物品種（以上に定義および明記したとおり）で利用可能である。驚くべきことに、本発明に係る非病害性アグロバクテリウム・リゾゲネス株を用いたところ、トウモロコシ（Zea mays）などのような単子葉植物で高い形質転換効率が得られた。単子葉植物の形質転換法は、種々存在する。多くの場合、微粒子銃は、その効率の点でおよび宿主域制限がない点で有利である（Christou 1995; Jahne 1995）。しかしながら、形質転換事象の構造および数が不規則であるため（たとえば、複数のコピーまたは断片化されたコピー）、多数の得られるトランスジェニック生物のスクリーニングおよび詳細分析が必要となる（Hadi 1996; Trick 1997）。一方、アグロバクテリウムにより媒介される単子葉植物の形質転換系の樹立は、困難であると考えられてきた。なぜなら、アグロバクテリウムによる単子葉植物の感染は、非常にまれな事象であり、妥当な効率は、「強毒性」Ａ．ツメファシエンス株および／またはアセトシリンゴン（Ｔｉプラスミド上のｖｉｒ遺伝子の発現を引き起こすフェノール系化合物）を用いて達成しうるにすぎないからである（Belarmino 2000; Eady 2000; Hiei 1994; Smith and Hood 1995; Wilmink 1992）。しかしながら、非病害性Ａ．リゾゲネス菌株により媒介される単子葉植物の形質転換に関する報告は、本発明以前には存在しない。
また、共培養法の標的物質として、多数の外植片、植物組織、または植物細胞培養物を利用することが可能である。当業者であればわかるであろうが、ＤＮＡ構築物がトランスジェニック植物体に安定的に組み込まれて機能しうることが確認された後、有性交雑により他の植物体に導入することが可能である。交雑される種に応じて、いくつかの標準的交配技術のいずれかを使用することが可能である。
植物細胞にＤＮＡを移入するために、トランスジェニックＴ−ＤＮＡを含む本発明に係る非病害性アグロバクテリウム・リゾゲネスと共に、植物外植片が共培養される。感染植物材料（たとえば、葉、根、柄の切片、さらには植物細胞のプロトプラストまたは懸濁液）から出発して、形質転換細胞を選択するための抗生物質や殺生物剤などを含有しうる好適な培地を用いて、インタクトな植物体を再生することが可能である。次に、導入されたＤＮＡ（この場合、本発明に係るＤＮＡ構築物）の存在下で、得られた植物体をスクリーニングすることが可能である。ＤＮＡが宿主ゲノムに組み込まれた直後から、該当する遺伝子型は、原則として安定的であり、該当する挿入断片はまた、後続の世代でも見いだされる。好ましくは、安定的に形質転換された植物体は、トランスジェニックＴ−ＤＮＡに含まれる選択マーカーを利用して選択される。得られた植物体は、慣用的方法で培養され交雑されうる。ゲノム中への組込みが安定的かつ遺伝的であることを保証するために、二世代以上増殖させなければならない。
カルス（ＵＳ５，５９１，６１６；ＥＰ−Ａ１ ６０４ ６６２）、未成熟胚（ＥＰ−Ａ１ ６７２ ７５２）、花粉（ＵＳ５４，９２９，３００）、茎頂（ＵＳ５，１６４，３１０）をはじめとする種々の組織が、アグロバクテリウム媒介形質転換法またはｉｎ ｐｌａｎｔａ形質転換（ＵＳ５，９９４，６２４）の出発材料（外植片）として好適であるが、これらに限定されるものではない。本明細書に記載の方法および材料は、当技術分野で公知の実質的にすべてのアグロバクテリウム媒介形質転換法と組み合せることが可能である。好ましい組合せは、以下の出発材料および方法を包含するが、これらに限定されるものではない：
Figure 2008511294
アグロバクテリウムによる形質転換の効率は、たとえば、創傷形成、真空浸潤（ＷＯ００／５８４８４）、熱ショックおよび／または遠心分離、硝酸銀添加、超音波処理などのような当技術分野で公知の多数の他の方法により、向上させることが可能である。本発明の好ましい実施形態では、外植片材料は、アグロバクテリウムの接種（共培養）前に創傷が形成される。たとえば、切断、研磨、穿刺、ポーキング、微粉粒子もしくは加圧流体の貫通、プラズマ創傷形成、高圧適用、または超音波処理をはじめとする多くの創傷形成方法を使用することが可能である。創傷形成は、たとえば、メス、ハサミ、針、研磨材、エアブラシ、粒子、電気遺伝子銃、または音波のような手段を用いて実施可能であるが、これらに限定されるものではない。このほかの選択肢は、真空浸潤である（ＥＰ−Ａ１ １，１４１，３５６；ＥＰ−Ａ１ １，１７１，６１８）。当技術分野で公知の他のアグロバクテリウム形質転換効率増大法は、超音波処理（ＥＰ−Ａ１ ９０４，３６２）または標的組織の減量（ＥＰ−Ａ１ １，１３７，７９０）と組み合わせることが可能であるが、これらに限定されるものではない。
本発明に係る非病害性アグロバクテリア・リゾゲネス細菌は、当技術分野で公知の方法により増殖および使用される。アグロバクテリウム株を含むベクターは、たとえば、適切な抗生物質（たとえば、５０ｍｇ／Ｌスペクチノマイシン）が追加されたＹＥＢ培地（実施例２．６参照）で３日間増殖される。細菌は、固体培地からループで捕集され再懸濁される。本発明の好ましい実施形態では、アグロバクテリウム培養は、−８０℃で凍結されたアリコートを用いて開始される。単離された葉柄をアグロバクテリウム処理するために、細菌は、葉柄培養に用いられる培地中に再懸濁される。
感染および共培養に用いられるアグロバクテリウムの濃度は、変化させる必要があることもある。この場合、１０５〜１０１０ｃｆｕ／ｍＬの範囲内のアグロバクテリウム濃度および数時間〜７日間の範囲内の共培養時間を使用することが可能である。アグロバクテリウムと単離された葉柄との共培養は、一般的には１〜５日間、好ましくは２〜４日間行われる。
次に、外植片は、数分間〜数時間、典型的には約１０分間〜３時間、好ましくは約０．５時間〜１時間かけてアグロバクテリウム培養物の接種を受ける。過剰の培地は取り除かれ、アグロバクテリウムは、数日間、典型的には３日間かけて暗所で標的組織と共培養される。このステップの間、アグロバクテリウムは、標的組織のいくつかの細胞中に外来の遺伝的構築物を移入する。通常、このステップの間、選択剤は存在しない。
アグロバクテリウム共培養の前または共培養の間、培地中で１種以上のフェノール系化合物を利用することが可能であるが、必ずしもそれが必要というわけではない。本発明の範囲内で好適な「植物フェノール系化合物」または「植物フェノール類」は、陽性の化学走性応答を誘発しうる単離された置換フェノール系分子、特定的には、Ｒｉプラスミド含有アグロバクテリウム種においてｖｉｒ遺伝子発現の増大を誘発しうるものである。好ましいのは、アセトシリンゴンである。さらに、浸透圧保護剤（たとえば、好ましくは約７００ｍｇ／Ｌの濃度のＬ−プロリン、またはベタイン）、植物ホルモン（とくにＮＡＡ）、オピン、または糖のような特定の化合物は、植物フェノール系化合物と組み合わせて添加したときに相乗的に作用すると予想される。植物フェノール系化合物、特定的にはアセトシリンゴンは、単離された葉柄とアグロバクテリアとの接触（たとえば、数時間〜１日）の前に培地に添加することが可能である。培地中の植物フェノール系化合物の可能な濃度は、約２５μＭ〜７００μＭの範囲内である。しかしながら、本発明に係る方法では、好ましくは、アセトシリンゴンを利用しない。アグロバクテリウム・ツメファシエンスにとくに適した誘発条件は、Vernade et al. (1988)に記載されている。
植物防御応答（たとえばフェノール酸化）に基づく組織壊死を減少させうる抗酸化剤（たとえばジチオトレイトール）またはチオール化合物（たとえばＬ−システイン、Olhoft 2001）を共培養培地に追加すると、アグロバクテリウム媒介形質転換の効率がさらに改善される可能性がある。
共培養の後、アグロバクテリウム・リゾゲネスを除去するか、増殖を抑制するか、または死滅させるためのステップを含めることが可能である。このステップは、１回以上の洗浄ステップを含みうる。共培養ステップの後に利用される培地は、好ましくは、殺細菌剤（抗生物質）を含有する。このステップは、非形質転換細胞の増殖を停止させるかまたは少なくとも遅延させて残存するアグロバクテリウム細胞を死滅させることが目的である。利用される好ましい抗生物質は、たとえば、カルベニシリン（５００ｍｇ／Ｌ）またはチメンチン（Timentin）ＴＭ［GlaxoSmithKline；チカルシリンジナトリウムとクラブラン酸カリウムとの混合物；０．８ｇのチメンチン（Timentin）ＴＭは、７５０ｍｇのチカルシリンと共に５０ｍｇのクラブラン酸を含有する。化学的には、チカルシリンジナトリウムは、Ｎ−（２−カルボキシ−３，３−ジメチル−７−オキソ−４−チア−１−アザビシクロ［３．２．０］ヘプト−６−イル）−３−チオフェンマロンアミド酸ジナトリウム塩である。化学的には、クラブラン酸カリウムは、（Ｚ）−（２Ｒ，５Ｒ）−３−（２−ヒドロキシエチリデン）−７−オキソ−４−オキサ−１−アザビシクロ［３．２．０］ヘプタン−２−カルボン酸カリウムである］である。
共培養ステップの後、共培養された外植片は、好ましくは、少なくとも１種の植物成長因子を含む再生培地でインキュベートされる。利用される培地は、植物細胞の特定および／または選択を可能にする選択マーカー遺伝子と組み合わせて適用可能である少なくとも１種の化合物（たとえば選択剤）をさらに含有しうる。しかしながら、共培養ステップの後、特定の時間にわたり、好ましくは５〜１４日間にわたり、選択化合物が欠如している培地で外植片をインキュベートすることが好ましい。さらには形質転換体細胞および組織に対する選択化合物による意図せぬ損傷を阻止するために、前記選択化合物に対する信頼性の高い耐性レベルの確立に、ある程度の時間が必要である。
形質転換細胞（すなわち、宿主細胞のＤＮＡに組み込まれたＤＮＡを含む細胞）は、好ましくは、本発明に係る選択方法を用いて、非形質転換細胞から選択可能である。形質転換植物細胞が作製されれば、当業者に公知の方法を用いてインタクトな植物体を得ることが可能である。たとえば、カルス培養物が出発材料として使用される。苗条および根の形成は、このいまだに未分化の細胞バイオマスにおいて公知の方式により誘導可能である。得られた苗条は、植付けおよび栽培が可能である。
アグロバクテリウム媒介技術では、典型的には、標的組織において限定数の細胞中への遺伝子送達が起こりうる。したがって、本発明の好ましい実施形態では、形質転換されていない標的組織中の細胞をすべて死滅させるかまたは選択有利性を介して形質転換細胞を同定するために、形質転換後、選択剤が適用される。培養時間は、部分的には、非形質転換細胞に対する選択剤の毒性に依存する。前記選択またはスクリーニングに用いられる選択マーカー遺伝子および対応する選択化合物は、抗生物質、除草剤、またはＤ−アミノ酸のようなさまざまな周知の選択化合物のいずれであってもよい（詳細については下記参照）。この培養ステップの時間は、さまざまであり（選択化合物およびその濃度、選択マーカー遺伝子に依存する）、１日間から１２０日間までに及ぶ。選択可能および／またはスクリーニング可能なマーカー遺伝子の挿入断片は、本発明に係る方法の範囲内に包含される。これは、たとえば、除草剤耐性形質として後で使用に対するのに有利でありうる。
たとえば、選択マーカーとしてカナマイシン耐性遺伝子（ネオマイシンホスホトランスフェラーゼＮＰＴＩＩ）を用いる場合、約３〜２００ｍｇ／Ｌの濃度のカナマイシンが培地に含まれうる。選択に用いられる典型的な濃度は、５〜５０ｍｇ／Ｌである。苗条が発育するまで、組織は、１〜３週間、好ましくは約７日間にわたりこの培地で増殖される。
たとえば、選択マーカーとしてのホスフィノトリシン耐性遺伝子（ｂａｒ）を用いる場合、約３〜２００ｍｇ／Ｌの濃度のホスフィノトリシンが培地に含まれうる。選択に用いられる典型的な濃度は、５〜５０ｍｇ／Ｌである。苗条が発育するまで、組織は、１〜３週間、好ましくは約７日間にわたりこの培地で増殖される。
たとえば、選択マーカーとしてｄａｏ１遺伝子を用いる場合、約３〜１００ｍｇ／Ｌの濃度のＤ−セリンまたはＤ−アラニンが培地に含まれうる。選択に用いられる典型的な濃度は、２０〜４０ｍｇ／Ｌである。苗条が発育するまで、組織は、１〜３週間、好ましくは約７日間にわたりこの培地で増殖される。
上記の形質転換技術のいずれかにより誘導される形質転換植物細胞は、形質転換遺伝子型ひいては所望の表現型を有する全植物体を再生するように培養可能である。そのような再生技術は、組織培養増殖培地における特定の植物ホルモンの操作に依拠し、この操作は、典型的には、所望のヌクレオチド配列と共に導入される殺生物剤マーカーおよび／または除草剤マーカーに依拠する。培養されたプロトプラストからの植物再生については、報告されている（Evans 1983; Binding, 1985）。再生はまた、植物カルス、外植片、体細胞不定胚（Dandekar 1989; McGranahan 1990）、器官、またはそれらの一部分から達成することも可能である。そのような再生技術については、報告されている（概説、Klee 1987）。他の利用可能な再生技術については、報告されている（Vasil 1984; Weissbach 1989）。
再生および／または選択のための本発明に係る方法で利用される培地は、場合により、たとえば、サイトカイニン化合物（たとえば６−ベンジルアミノプリン）および／またはオーキシン化合物（たとえば２，４−Ｄ）のような１種以上の植物成長調節剤を追加することが可能である。本明細書中で使用される「植物成長調節剤」（ＰＧＲ）という用語は、植物の増殖および発育をレギュレートしうる天然に存在するかまたは合成の（天然に存在しない）化合物を意味する。ＰＧＲは、単独で、または互いと協同して、または他の化合物（たとえば、糖、アミノ酸）と協同して、作用しうる。「オーキシン」または「オーキシン化合物」という用語は、細胞伸長および細胞分裂、維管束組織の分化、果実の発育、不定根の形成、エチレンの産生を刺激し、（高濃度で）脱分化（カルス形成）を引き起こす化合物を包含する。最も一般的な天然に存在するオーキシンは、極の方向に根および茎に輸送されるインドール酢酸（ＩＡＡ）である。合成オーキシンは、現代の農業で広範囲に使用される。オーキシン化合物は、インドール−３−酪酸（ＩＢＡ）、ナフチル酢酸（ＮＡＡ）、および２，４−ジクロルフェノキシ酢酸（２，４−Ｄ）を包含する。苗条形成を引き起こす化合物としては、ＩＡＡ、ＮＡＡ、ＩＢＡ、サイトカイニン、オーキシン、カイネチン、グリホセート、およびチアジアズロン（thiadiazorun）が挙げられるが、限定されるものではない。
「サイトカイニン」または「サイトカイニン化合物」という用語は、細胞分裂、子葉拡張、および側芽成長を刺激する化合物を包含する。それらは、オーキシン（たとえばＩＡＡ）と共同して切断葉の老化を遅延させ、根および苗条の形成に影響を与えうる。サイトカイニン化合物は、たとえば、６−イソペンテニルアデニン（ＩＰＡ）および６−ベンジルアデニン／６−ベンジルアミノプリン（ＢＡＰ）を包含する。
子孫は、有性増殖または無性増殖により作製可能である。無性増殖は、当技術分野で周知の技術を用いて体細胞胚形成を導入することにより実現可能である。好ましくは、子孫は、有性増殖／受精により作製される。受精は、自殖（自家受粉）によりまたは他のトランスジェニック植物もしくは非トランスジェニック植物との交雑により実現可能である。本発明に係るトランスジェニック植物は、この点に関して、雌性植物または雄性植物のいずれかとして機能しうる。子孫は、農学上有益な形質遺伝子の１つ以上のコピーを含みうる。好ましくは、前記形質遺伝子の１コピーだけを含む子孫を単離する。
本明細書に開示されかつ特許を受けようとする組成物および方法はすべて、本明細書の開示に照らして過度の実験を行わなくとも構築および実施が可能である。好ましい実施形態により本発明に係る組成物および方法について説明してきたが、本発明の概念、精神、および範囲から逸脱することなく、本明細書に記載の組成物、方法、および方法の工程または順序に変更を加えうることは、当業者には自明であろう。より特定的には、同一または類似の結果が達成されているように、化学的にも生理学的にも関連する特定の薬剤を本明細書に記載の薬剤と置き換えうることは、自明であろう。当業者に自明なそのような類似の代替形態および変更形態はすべて、添付の特許請求の範囲に規定されている本発明の精神、範囲、および概念に包含されるものとみなされる。本明細書に挙げた出版物および特許出願はすべて、本発明が関係する当業者の技術レベルを示唆するものである。出版物および特許出願はすべて、あたかも個々の出版物および特許出願が具体的かつ個別的に示されて参照により組み入れられたのと同一程度まで参照により組み入れられるものとする。次に、本発明の特定の態様および実施形態について、実施例を介しておよび以下に記載の図を参照しながら具体的に説明する。
配列
１． 配列番号１：ｐＲｉ２６５９の右隣接配列をコードする核酸配列
２． 配列番号２：ｐＲｉ２６５９の左隣接配列をコードする核酸配列
３． 配列番号３：クローニングベクターｐＲＬ２７８（ＧｅｎＢａｎｋ登録番号：Ｌ０５０８３）の核酸配列
４． 配列番号４：ｐＲｉ２６５９（ＧｅｎＢａｎｋ登録番号：ＡＪ２７１０５０）のＴ−ＤＮＡ領域をコードする核酸配列
５． 配列番号５：アグロバクテリウム株Ｋ５９９ １６Ｓ−２３Ｓ ｒＲＮＡ遺伝子間配列モチーフＭ１：５’−ＡＡＴＣＧＴＣＧＡＴＧＣＧＡＡＴＴＧＴＴＧ−３’
６． 配列番号６：アグロバクテリウム株Ｋ５９９ １６Ｓ−２３Ｓ ｒＲＮＡ遺伝子間配列モチーフＭ２：５’−ＧＴＴＴＴＧＴＣＣＴＧＡＣＧＣＴＧＴＣＧＣＧＡ−３’
７． 配列番号７：アグロバクテリウム株Ｋ５９９ １６Ｓ−２３Ｓ ｒＲＮＡ遺伝子間配列モチーフＭ３：５’−ＴＣＴＡＡＣＧＡＴＣＧＣＴＧＣＧＣＴＣＣＧＧＡ−３’
８． 配列番号８：アグロバクテリウム株Ｋ５９９ １６Ｓ−２３Ｓ ｒＲＮＡ遺伝子間配列モチーフＭ４：５’−ＣＧＣＣＡＣＧＡＧＧＣＧＣＧＡＣＧＧＡ−３’
９． 配列番号９：アグロバクテリウム株Ｋ５９９ １６Ｓ−２３Ｓ ｒＲＮＡ遺伝子間配列モチーフＭ５：５’−ＴＴＡＴＧＧＧＣＧＡＡＴＴＧＡＴＣＴＧＡ−３’
１０． 配列番号１０：アグロバクテリウム株Ｋ５９９ １６Ｓ−２３Ｓ ｒＲＮＡ遺伝子間配列モチーフＭ６：５’−ＧＴＣＣＴＧＣＴＡＡＧＧＡＴＴＧＡＴＧＣＣＴ−３’
１１． 配列番号１１：アグロバクテリウム株Ｋ５９９ １６Ｓ−２３Ｓ ｒＲＮＡ遺伝子間配列モチーフＭ７：５’−ＡＧＡＣＣＡＧＴＣＣＴＴＧＴＧＡＡＡＣＣ−３’
１２． 配列番号１２：アグロバクテリウム株Ｋ５９９ １６Ｓ−２３Ｓ ｒＲＮＡ遺伝子間配列モチーフＭ８：５’−ＣＣＴＧＧＧＣＡＴＴＴＴＴＧＴＴＧＴＴＧＧ−３’
１３． 配列番号１３：アグロバクテリウム株Ｋ５９９ １６Ｓ−２３Ｓ ｒＲＮＡ遺伝子間配列モチーフＭ９：５’−ＡＡＴＧＧＴＡＴＧＧＣＴＴＣＧＡＧＧＴＧ−３’
１４． 配列番号１４：アグロバクテリウム株Ｋ５９９ １６Ｓ−２３Ｓ ｒＲＮＡ遺伝子間配列モチーフＭ１０：５’−ＣＴＣＡＡＡＧＡＡＧＡＣＣＧＴＡＣＣＧＡＣＡ−３’
１５． 配列番号１５：バイナリーベクターｐＢＰＳＥＷ００８ ［ｐ−ＮＯＳ：：ｃ−ｂａｒ：：ｔ−ＮＯＳ ｐ−ＰｃＵＢＩ：：ｃ−ｇｕｓＩＮＴ：：ｔ−ＮＯＳ］
１６． 配列番号１６：バイナリーベクターｐＢＰＳＭＭ１９２ｂ ［ｐ−ＡｔＡｈａｓ：：ｃ−ｃｓｒ１−２：：ｔ−ＡｔＡＨＡＳ ｔ−ＮＯＳ：：ｃ−ｇｕｓＩＮＴ：：ｐ−ＳＵＰＥＲ］
１７． 配列番号１７：ＪＴバイナリーベクターｐＢＰＳＭＭ２３２ ［ｐ−ＺｍＵｂｉ１：：ｃ−ＺｍＡＨＡＳＬ／Ｘｉ１２：：ｔ−ＺｍＡＨＡＳ ｔ−ＮＯＳ：：ｃ−ｇｕｓＩＮＴ：：ｐ−ＺｍＵｂｉ１］ ｐＢＰＳＭＭ２３２は、そのままの状態ではアグロバクテリウム中で複製可能でないが大腸菌でのみ複製可能であるベクターである。スーパーバイナリープラスミドｐＳＢ１を含むアグロバクテリウム中への形質転換では、ｐＢＰＳＭＭ２３２とｐＳＢ１との間の選択媒介融合によりキメラプラスミド（ｐＳＢ１／ｐＢＰＳＭＭ２３２）が得られる；Komari 1996。
１８． 配列番号１８：ｐＲｉ２６５９の左境界配列 ５’−ＴＧＧＣＡＧＧＡＴＡ ＴＡＴＴＧＴＧＧＴＧ ＴＡＡＡ−３’
１９． 配列番号１９：ｐＲｉ２６５９の右境界配列 ５’−ＴＧＡＣＡＧＧＡＴＡ ＴＡＴＣＣＣＣＴＴＧ ＴＣＴＡ−３’
２０． 配列番号２０：アグロバクテリウム株Ｋ５９９の１６Ｓ−２３Ｓ ｒＲＮＡ遺伝子間配列
２１． 配列番号２１：アグロバクテリウム株Ｋ５９９の１６Ｓ ｒＲＮＡをコードするゲノムＤＮＡ
２２． 配列番号２２：欠失ベクターｐＢＰＳＳＨ００９
２３． 配列番号２３：欠失ベクターｐＲＬ２７８ ＬＦ／ＲＦ（ｐＢＰＳＳＨ００９ｂとも呼ばれる）
２４． 配列番号２４：ｐＲｉ２６５９Δをコードする核酸配列（テトラサイクリン選択マーカー（ｔｅｔ）を含まない）
２５． 配列番号２５：ｍｌｌ６３７４様遺伝子（インテグラーゼ／リコンビナーゼ［メソリゾビウム・ロティ（Mesorhizobium loti）ＭＡＦＦ３０３０９９］）に類似したｒｃｏｒｆ１によりコードされるアミノ酸配列
２６． 配列番号２６：ｐＲｉ１７２４中のｒｉｏｒｆ２２にやや類似したｒｃｏｒｆ１３によりコードされるアミノ酸配列（仮定的タンパク質Ｂｃｅｐ０２０００３３７［バークホルデリア・フンゴルム（Burkholderia fungorum）ＬＢ４００］に類似）
２７． 配列番号２７：ｐＲｉ１７２４中のｒｉｏｒｆ３７（推定的ミキモピントランスポーター）に類似した推定的ククモピントランスポーター遺伝子ｒｃｏｒｆ１４によりコードされるアミノ酸配列
２８． 配列番号２８：ｒｃｏｒｆ１６（ＳＭａ２２０５シノリゾビウム・メリロティ（Sinorhizobium meliloti）１０２１（菌株：１０２１）のＣＯＧ１１７６［Ｅ］ＡＢＣ型スペルミジン／プトレシン輸送系パーミアーゼ成分Ｉに類似）によりコードされるアミノ酸配列
２９． 配列番号２９：ｐＲｉ１７２４中のｒｉｏｒｆ３９（ＫＥＧＧ経路：ヒスチジン代謝００３４０）に少し類似したｈｕｔｌ（イミダゾロン−５−プロピオン酸ヒドロラーゼ［アグロバクテリウム・ツメファシエンス（Agrobacterium tumefaciens）株Ｃ５８］）に類似したｒｃｏｒｆ１９によりコードされるアミノ酸配列
３０． 配列番号３０：ｐＲｉ１７２４中のｒｉｏｒｆ４１（仮定的タンパク質）に類似したｒｃｏｒｆ２０によりコードされるアミノ酸配列
３１． 配列番号３１：ｐＲｉ１７２４中のｈｕｔＵ遺伝子相同体ｒｉｏｒｆ４２（ウロカナーゼ、ＥＣ番号４．２．１．４９）に類似したｒｃｏｒｆ２１によりコードされるアミノ酸配列
３２． 配列番号３２：未知機能のタンパク質ＤＵＦ８８６［メソリゾビウム（Mesorhizobium）ｓｐ．ＢＮＣ１］に類似し、かつシュードモナス・プチダ（Pseudomonas putida）のｈｕｔＲ遺伝子に隣接する不明な遺伝子に類似したｐＲｉ１７２４中のｒｉｏｒｆ４３に少し類似したｒｃｏｒｆ２２によりコードされるアミノ酸配列
３３． 配列番号３３：ｒｃｏｒｆ２３によりコードされるアミノ酸配列（ＩＳ３０ファミリーのトランスポザーゼに類似した類似Ｃ末端）
３４． 配列番号３４：ｇａｔＡ−１遺伝子［グルタミル−ｔＲＮＡアミドトランスフェラーゼ、サブユニットＡ（ｇａｔＡ−１） スルフォロブス・ソルファタリクス（Sulfolobus solfataricus）Ｐ２］に類似したｐＲｉ１７２４中のｒｉｏｒｆ６０に類似したｒｃｏｒｆ３２によりコードされるアミノ酸配列
３５． 配列番号３５：ａｇａＢ遺伝子（アグロピン酸パーミアーゼｐｆａｍ００５２８：ＢＰＤ＿ｔｒａｎｓｐ＿１；結合タンパク質依存性輸送系内膜成分）に類似した仮定的ＡＢＣトランスポーター遺伝子であるｐＲｉ１７２４中のｒｉｏｒｆ６２に類似したｒｃｏｒｆ３４によりコードされるアミノ酸配列
３６． 配列番号３６：ｄｐｐＣ遺伝子（ｐｆａｍ００５２８：ＢＰＤ＿ｔｒａｎｓｐ＿１；結合タンパク質依存性輸送系内膜成分）に類似した仮定的ＡＢＣトランスポーター遺伝子であるｐＲｉ１７２４中のｒｉｏｒｆ６３に類似したｒｃｏｒｆ３５によりコードされるアミノ酸配列
３７． 配列番号３７：ｍｏａＤ遺伝子（マンノピニン酸パーミアーゼＣＯＧ１１２３：種々のＡＢＣ型輸送系のＡＴＰアーゼ成分）に類似した仮定的ＡＢＣトランスポーター遺伝子であるｐＲｉ１７２４中のｒｉｏｒｆ６４に類似したｒｃｏｒｆ３６によりコードされるアミノ酸配列
３８． 配列番号３８：ａｍａＢ遺伝子（Ｎ−カルバモイル−β−アラニンアミドヒドロラーゼ）に類似したｐＲｉ１７２４中のｒｉｏｒｆ６６に類似したｒｃｏｒｆ３７によりコードされるアミノ酸配列
３９． 配列番号３９：ｐｃｋ遺伝子（ｐｆａｍ０１６３３：Ｃｈｏｌｉｎｅ＿ｋｉｎａｓｅ；コリン／エタノールアミンキナーゼ）にやや類似したｐＲｉ１７２４中のｒｉｏｒｆ６８に類似したｒｃｏｒｆ３９によりコードされるアミノ酸配列
４０． 配列番号４０：マイコバクテリウム・レプレ（Mycobacterium leprae）のＭＬＣＢ１７７９．２９（推定的モノホスファターゼ遺伝子）（ｃｄ０１６４１：Ｂａｃｔｅｒｉａｌ＿ＩＭＰａｓｅ＿ｌｉｋｅ＿１；イノシトールモノホスファターゼに関連付けられる主に細菌性ファミリーのＭｇ＋＋依存性ホスファターゼ）に類似したｐＲｉ１７２４中のｒｉｏｒｆ６９に類似したｒｃｏｒｆ４０によりコードされるアミノ酸配列
４１． 配列番号４１：ｐＴｉ１５９５５中のｏｒｆ２遺伝子に類似した仮定的ケモレセプター遺伝子であるｐＲｉ１７２４中のｒｉｏｒｆ７１に類似したｒｃｏｒｆ４１によりコードされるアミノ酸配列
４２． 配列番号４２：ｔｅｕＢ（ペリプラズム糖結合タンパク質）遺伝子（ＣＯＧ１８７９：ＲｂｓＢ；ＡＢＣ型糖輸送系ペリプラズム成分［炭水化物の輸送および代謝］）に類似したｒｉｏｒｆ７４に類似したｒｃｏｒｆ４４によりコードされるアミノ酸配列
４３． 配列番号４３：仮定的ＡＢＣトランスポーター遺伝子であるｔｅｕＡ（ＡＴＰ結合糖ＡＢＣトランスポーター）遺伝子（ＣＯＧ１１２９：ＭｇｌＡ；ＡＢＣ型糖輸送系ＡＴＰアーゼ成分［炭水化物の輸送および代謝］）に類似したｐＲｉ１７２４中のｒｉｏｒｆ７５に類似したｒｃｏｒｆ４５によりコードされるアミノ酸配列
４４． 配列番号４４：仮定的ＡＢＣトランスポーター遺伝子であるｔｅｕＣ１（糖ＡＢＣトランスポーターパーミアーゼ）遺伝子（ｐｆａｍ０２６５３：ＢＰＤ＿ｔｒａｎｓｐ＿２；分枝鎖状アミノ酸輸送系／パーミアーゼ成分）に類似したｐＲｉ１７２４中のｒｉｏｒｆ７６に類似したｒｃｏｒｆ４６によりコードされるアミノ酸配列
４５． 配列番号４５：仮定的ＡＢＣトランスポーター遺伝子であるｔｅｕＣ２（糖ＡＢＣトランスポーターパーミアーゼ）遺伝子（ｐｆａｍ０２６５３：ＢＰＤ＿ｔｒａｎｓｐ＿２；分枝鎖状アミノ酸輸送系／パーミアーゼ成分）に類似したｐＲｉ１７２４中のｒｉｏｒｆ７７に類似したｒｃｏｒｆ４７によりコードされるアミノ酸配列
４６． 配列番号４６：ｐＲｉ１７２４中のｒｉｏｒｆ７８（ＣＯＧ２７５５［Ｅ］リゾホスホリパーゼＬ１および関連エステラーゼ）に類似したｒｃｏｒｆ４８によりコードされるアミノ酸配列
４７． 配列番号４７：ｇｌｐＤ遺伝子相同体であるｐＲｉ１７２４のｒｉｏｒｆ８０（グリセロール−３−リン酸デヒドロゲナーゼ［アグロバクテリウム・ツメファシエンス（Agrobacterium tumefaciens）株Ｃ５８］）に類似したｒｃｏｒｆ５０によりコードされるアミノ酸配列
４８． 配列番号４８：ａｃｓ（アセチル−ＣｏＡシンテターゼ）（ＥＣ６．２．１．１）遺伝子相同体であるｐＲｉ１７２４中のｒｉｏｒｆ８１に類似したｒｃｏｒｆ５１によりコードされるアミノ酸配列
４９． 配列番号４９：ａｄｋ遺伝子相同体であるｐＲｉ１７２４のｒｉｏｒｆ８２（ｐｆａｍ００４０６：ＡＤＫ；アデニル酸キナーゼＥＣ２．７．４．３）に類似したｒｃｏｒｆ５２によりコードされるアミノ酸配列
５０． 配列番号５０：ｐＴｉ１５９５５中のｏｒｆ２遺伝子に類似した仮定的ケモレセプター遺伝子であるｐＲｉ１７２４中のｒｉｏｒｆ８３に類似したｒｃｏｒｆ５３によりコードされるアミノ酸配列
５１． 配列番号５１：ｃｂｂＦ遺伝子相同体であるｒｉｏｒｆ８４（ｃｄ００３５４：ＦＢＰアーゼ；フルクトース−１，６−ビスリン酸からフルクトース−６−リン酸への加水分解を触媒し糖新生経路に重要である酵素フルクトース−１，６−ビスホスファターゼ）に類似したｒｃｏｒｆ５４によりコードされるアミノ酸配列
５２． 配列番号５２：ｃｂｂＡ遺伝子相同体であるｒｃｏｒｆ５５（ａｃｄ００９４７：ＴＢＰ＿ａｌｄｏｌａｓｅ＿ＩＩＢ；タガトース−１，６−ビスリン酸（ＴＢＰ）アルドラーゼおよび関連タイプＢクラスＩＩアルドラーゼ）によりコードされるアミノ酸配列
５３． 配列番号５３：ｐｄｂのＡ鎖（酵母トリオースリン酸イソメラーゼ（ｔｒｉ１））に類似したｒｃｏｒｆ５６によりコードされるアミノ酸配列
５４． 配列番号５４：ｐＲｉ１７２４中のｒｉｏｒｆ８８とｐｈｒＲ遺伝子（ＤＮＡ結合タンパク質、ヘリックス・ターン・ヘリックスＸＲＥファミリー）とに類似したｒｃｏｒｆ５７によりコードされるアミノ酸配列
５５． 配列番号５５：ｐＲｉ１７２４中のｒｉｏｒｆ８９とｔｈｃＲ遺伝子（保存ドメインＨＴＨ−ＡＲＡＣ；ヘリックス・ターン・ヘリックスアラビノースオペロン制御タンパク質）とに類似したｒｃｏｒｆ５８によりコードされるアミノ酸配列
５６． 配列番号５６：ｐＲｉ１７２４中のｒｉｏｒｆ９０とｐＴｉＣ５８中のＡｔｕ６０９６（メソリゾビウム（Mesorhizobium）種およびアグロバクテリウム（Agrobacterium）種で保存されている）とに類似したｒｃｏｒｆ５９によりコードされるアミノ酸配列
５７． 配列番号５７：アグロバクテリウム（Agrobacterium）種、メソリゾビウム（Mesorhizobium）種、およびニトロバクター（Nitrobacter）種のいくつかの仮定的タンパク質にも類似したｐＲｉ１７２４中のｒｉｏｒｆ９１に類似したｒｃｏｒｆ６０によりコードされるアミノ酸配列
５８． 配列番号５８：ｐＲｉ１７２４中のｒｉｏｒｆ９２（いくつかのアグロバクテリウム（Agrobacterium）株およびメソリゾビウム（Mesorhizobium）株で保存されている仮定的タンパク質）に類似したｒｃｏｒｆ６１によりコードされるアミノ酸配列
５９． 配列番号５９：ヘリコバクター・ピロリ（Helicobacter pylori）のｊｈｐ０９２８遺伝子（ＣＯＧ０８２７；アデニン特異的ＤＮＡメチラーゼ［ＤＮＡの複製、組換え、および修復］）に類似したｒｉｏｒｆ９３に類似したｒｃｏｒｆ６２によりコードされるアミノ酸配列
６０． 配列番号６０：ＡＧＲ＿ｐＴｉ＿１９１分配タンパク質（アグロバクテリウム・ツメファシエンス（Agrobacterium tumefaciens）株Ｃ５８、分配タンパク質、ＣＯＧ１４７５［Ｋ］予測される転写レギュレーター）に類似したｒｃｏｒｆ６３によりコードされるアミノ酸配列
６１． 配列番号６１：アグロバクテリウム（Agrobacterium）種、メソリゾビウム（Mesorhizobium）種、およびニトロバクター（Nitrobacter）種で保存されている仮定的タンパク質ＭｅｓｏＤＲＡＦＴ＿１０４１［メソリゾビウム（Mesorhizobium）ｓｐ．ＢＮＣ１］に類似したｒｃｏｒｆ６４によりコードされるアミノ酸配列
６２． 配列番号６２：アグロバクテリウム（Agrobacterium）種、メソリゾビウム（Mesorhizobium）種、およびニトロバクター（Nitrobacter）種で保存されている仮定的タンパク質ＭｅｓｏＤＲＡＦＴ＿１０４３［メソリゾビウム（Mesorhizobium）ｓｐ．ＢＮＣ１］に類似したｒｃｏｒｆ６６によりコードされるアミノ酸配列
６３． 配列番号６３：チオカプサ・ロセオペルシシナ（Thiocapsa roseopersicina）のｈｙｄＬ遺伝子の下流領域にやや類似したｐＲｉ１７２４中のｒｉｏｒｆ９６（仮定的タンパク質）に類似したｒｃｏｒｆ６７によりコードされるアミノ酸配列
６４． 配列番号６４：ＡＧＲ＿ｐＴｉ＿２０４［アグロバクテリウム・ツメファシエンス（Agrobacterium tumefaciens）株Ｃ５８］およびストレプトマイセス・クラブリゲルス（Streptomyces clavuligerus）由来のａｒｇＧ（アルギニノコハク酸シンターゼ）に類似したｒｃｏｒｆ６８によりコードされるアミノ酸配列
６５． 配列番号６５：ｐＳａ（ｌｎｃＷプラスミド）中のａｒｄＣ遺伝子（ＣＯＧ４２２７推定的接合移入タンパク質（抗制限タンパク質））に類似したｐＲｉ１７２４中のｒｉｏｒｆ１００に類似したｒｃｏｒｆ６９によりコードされるアミノ酸配列
６６． 配列番号６６：ｍｌｌ９０９３（アスパラギン酸１−デカルボキシラーゼ［メソリゾビウム・ロティ（Mesorhizobium loti）ＭＡＦＦ３０３０９９］）およびキサントモナス・シトリ（Xanthomonas citri）のｐｇｉ遺伝子（ＣＯＧ０８５３［Ｈ］アスパラギン酸１−デカルボキシラーゼ）に類似したｐＲｉ１７２４中のｒｉｏｒｆ１０１に類似したｒｃｏｒｆ７０によりコードされるアミノ酸配列
６７． 配列番号６７：ｐＲｔｒＣＦＮ２９９ａ中のｔｅｕＢ遺伝子（ＣＯＧ１８７９：ＲｂｓＢ；ＡＢＣ型糖輸送系ペリプラズム成分［炭水化物の輸送および代謝］）に類似したｐＲｉ１７２４中のｒｉｏｒｆ１０６に類似したｒｃｏｒｆ７１によりコードされるアミノ酸配列
６８． 配列番号６８：リゾビウム・レグミノサルム（Rhizobium leguminosarum）のｍｃｐＣ（リゾビウム（Rhizobium）のｍｃｐＣ遺伝子）遺伝子（ｓｍａｒｔ００２８３：ＭＡ；メチル受容化学走性様ドメイン（化学走性感覚トランスデューサー））に類似したｐＲｉ１７２４中のｒｉｏｒｆ１０７に類似したｒｃｏｒｆ７２によりコードされるアミノ酸配列
６９． 配列番号６９：ｐＲｉ１７２４中のｒｉｏｒｆ１１２（ＣＯＧ０５０７：ＲｅｃＤ；ＡＴＰ依存性エキソＤＮアーゼ（エキソヌクレアーゼＶ）αサブユニット−ヘリカーゼスーパーファミリーＩメンバー［ＤＮＡの複製、組換え、および修復］）に類似した推定的ｔｒａＡ遺伝子ｒｃｏｒｆ７７によりコードされるアミノ酸配列
７０． 配列番号７０：ｐＲｉ１７２４中のｒｉｏｒｆ１１４に類似した推定的ｔｒａＢ遺伝子ｒｃｏｒｆ７９によりコードされたアミノ酸配列
７１． 配列番号７１：ｐＲｉ１７２４中のｒｉｏｒｆ１１５（アグロバクテリウム・リゾゲネス（Agrobacterium rhizogenes）（菌株：ＭＡＦＦ０３−０１７２４）の仮定的タンパク質）に類似したｒｃｏｒｆ８０によりコードされるアミノ酸配列
７２． 配列番号７２：ｐＲｉ１７２４中のｒｉｏｒｆ１１８（ＴｒａＲアンタゴニスト）に類似した推定的ｔｒａＭ遺伝子ｒｃｏｒｆ８２によりコードされるアミノ酸配列
７３． 配列番号７３：ｒｉｏｒｆ１３２（アグロバクテリウム・リゾゲネス（Agrobacterium rhizogenes）（菌株：ＭＡＦＦ０３−０１７２４）、ｃｄ００５５０：ＡｒｓＡ＿ＡＴＰａｓｅ；オキシアニオン転位ＡＴＰアーゼ（ＡｒｓＡ）およびｃｄ００５９２：ＨＴＨ＿ＭＥＲＲ；ヘリックス・ターン・ヘリックス転写レギュレーターＭＥＲＲ、Ｎ末端ドメイン）に類似した推定的ｒｅｐＡ遺伝子ｒｃｏｒｆ９６によりコードされるアミノ酸配列
７４． 配列番号７４：ｐＲｉ１７２４中のｒｉｏｒｆ１３３（ｓｍａｒｔ００４７０：ＰａｒＢ；ＰａｒＢ様ヌクレアーゼドメインタンパク質）に類似した推定的ｒｅｐＢ遺伝子ｒｃｏｒｆ９７によりコードされるアミノ酸配列
７５． 配列番号７５：栄養複製に不可欠であるｐＲｉ１７２４中のｒｉｏｒｆ１３４に類似した推定的ｒｅｐＣ遺伝子ｒｃｏｒｆ９８によりコードされるアミノ酸配列
７６． 配列番号７６：ｐＮＧＲ２３４ａ中のｙ４ａＯ遺伝子にやや類似したｐＲｉ１７２４中のｒｉｏｒｆ１３５に類似したｒｃｏｒｆ９９によりコードされるアミノ酸配列
７７． 配列番号７７：ｐＲｉ１７２４中のｒｉｏｒｆ１３７遺伝子およびｐＴｉＡ６ＮＣ中のｏｒｆ４遺伝子に類似したｒｃｏｒｆ１０３によりコードされるアミノ酸配列
７８． 配列番号７８：ｐＮＧＲ２３４ａ中のｙ４ｊＦ遺伝子とｙ４ｊＧ遺伝子との間の特性付けされていない領域に類似したｐＲｉ１７２４中のｒｉｏｒｆ１３９に類似したｒｃｏｒｆ１０５によりコードされるアミノ酸配列
７９． 配列番号７９：ｐＲｉ１７２４中のｒｉｏｒｆ１４０と大腸菌のｏｒｆ３００遺伝子（ｐｆａｍ００００４：ＡＡＡ；種々の細胞活性に関連するＡＴＰアーゼファミリー（ＡＡＡ））とに類似したｒｃｏｒｆ１０６によりコードされるアミノ酸配列
８０． 配列番号８０：ｐＲｉ１７２４中のｒｉｏｒｆ１４１（仮定的タンパク質）のＮ末端に類似したｒｃｏｒｆ１０７によりコードされるアミノ酸配列
８１． 配列番号８１：ＳＥＲＰ１６５３（スタフィロコッカス・エピデルミディス（Staphylococcus epidermidis）ＲＰ６２Ａ（菌株：ＲＰ６２Ａ）の仮定的タンパク質）にやや類似したｒｃｏｒｆ１０９によりコードされるアミノ酸配列
８２． 配列番号８２：シロイヌナズナ（Arabidopsis thaliana）のルミナール結合タンパク質に対する遺伝子エキソン６に類似したｐＲｉ１７２４中のｒｉｏｒｆ１４２に類似したｒｃｏｒｆ１１０によりコードされるアミノ酸配列
８３． 配列番号８３：ｐＲｉ１７２４中のｒｉｏｒｆ１４３とｐＳＧ５中のｓｐｄＢ３遺伝子とに類似したｒｃｏｒｆ１１１によりコードされるアミノ酸配列
８４． 配列番号８４：ｐＲｉ１７２４中のｒｉｏｒｆ１４４に類似したｒｃｏｒｆ１１２によりコードされるアミノ酸配列
８５． 配列番号８５：ｐＲｉ１７２４中のｒｉｏｒｆ１４６とｐＴｉＳＡＫＵＲＡ中のｔｉｏｒｆ１３３とに類似したｒｃｏｒｆ１１４（推定ｖｉｒＦ遺伝子）によりコードされるアミノ酸配列
８６． 配列番号８６：ａａｔＡ（ａｔｕ２１９６）（アスパラギン酸アミノトランスフェラーゼＡ［アグロバクテリウム・ツメファシエンス（Agrobacterium tumefaciens）株Ｃ５８］）のＮ末端に類似したｐＲｉ１７２４中のｒｉｏｒｆ１４９に類似したｒｃｏｒｆ１１７によりコードされるアミノ酸配列
８７． 配列番号８７：ｐＲｉ１７２４中のｒｉｏｒｆ１５１（シトクロムＰ４５０型オキシダーゼ、おそらくｖｉｒＢ／Ｄ４を介するＩＶ型分泌タンパク質）に類似したｒｃｏｒｆ１１９（推定的ｖｉｒＨ）によりコードされるアミノ酸配列
８８． 配列番号８８：ｐＲｉ１７２４中のｒｉｏｒｆ１５２（二成分ｖｉｒＡ／Ｇ調節系のレセプター）に類似したｒｃｏｒｆ１２０（推定的ｖｉｒＡ）によりコードされるアミノ酸配列
８９． 配列番号８９：ｐＲｉ１７２４中のｒｉｏｒｆ１５３（Ｔ−複合体移入に必要とされるＩＶ型分泌系）に類似したｒｃｏｒｆ１２１（推定的ｖｉｒＢ１）によりコードされるアミノ酸配列
９０． 配列番号９０：ｐＲｉ１７２４中のｒｉｏｒｆ１５５（Ｔ−複合体移入に必要とされるＩＶ型分泌系）に類似したｒｃｏｒｆ１２３（推定的ｖｉｒＢ３）によりコードされるアミノ酸配列
９１． 配列番号９１：ｐＲｉ１７２４中のｒｉｏｒｆ１５７（Ｔ−複合体移入に必要とされるＩＶ型分泌系）に類似したｒｃｏｒｆ１２５（推定的ｖｉｒＢ５）によりコードされるアミノ酸配列
９２． 配列番号９２：ｐＲｉ１７２４中のｒｉｏｒｆ１５８（Ｔ−複合体移入に必要とされるＩＶ型分泌系）に類似したｒｃｏｒｆ１２６（推定的ｖｉｒＢ６）によりコードされるアミノ酸配列
９３． 配列番号９３：ｐＲｉ１７２４中のｒｉｏｒｆ１５９（Ｔ−複合体移入に必要とされるＩＶ型分泌系）に類似したｒｃｏｒｆ１２７（推定的ｖｉｒＢ７）によりコードされるアミノ酸配列
９４． 配列番号９４：ｐＲｉ１７２４中のｒｉｏｒｆ１６１（Ｔ−複合体移入に必要とされるＩＶ型分泌系）に類似したｒｃｏｒｆ１２９（推定的ｖｉｒＢ９）によりコードされるアミノ酸配列
９５． 配列番号９５：ｐＲｉ１７２４中のｒｉｏｒｆ１６３（Ｔ−複合体移入に必要とされるＩＶ型分泌系）に類似したｒｃｏｒｆ１３１（推定的ｖｉｒＢ１１）によりコードされるアミノ酸配列
９６． 配列番号９６：ｐＲｉ１７２４中のｒｉｏｒｆ１６４（二成分ｖｉｒＡ／Ｇ調節系のアクチベーター）に類似したｒｃｏｒｆ１３２（推定的ｖｉｒＧ）によりコードされるアミノ酸配列
９７． 配列番号９７：ＩＳＢｍ１トランスポザーゼｏｒｆＢ［ブルセラ・スイス（Brucella suis）１３３０］（ＮＰ ６９７５５２）のａａ１−１０３に類似したｒｃｏｒｆ１３３（仮定的タンパク質）によりコードされるアミノ酸配列
９８． 配列番号９８：ｐＲｉ１７２４中のｒｉｏｒｆ１６７（ｖｉｒＡ／Ｇ調節Ｔ−ＤＮＡ境界領域エンドヌクレアーゼアクセサリータンパク質）に類似したｒｃｏｒｆ１３７（推定的ｖｉｒＤ１）によりコードされるアミノ酸配列
９９． 配列番号９９：ｐＲｉ１７２４中のｒｉｏｒｆ１６８（ｖｉｒＡ／Ｇ調節Ｔ−ＤＮＡ境界領域エンドヌクレアーゼ）に類似したｒｃｏｒｆ１３８（推定的ｖｉｒＤ２）によりコードされるアミノ酸配列
１００． 配列番号１００：ｐＲｉ１７２４中のｒｉｏｒｆ１７０（ｖｉｒＢ／Ｄ４ ＩＶ型分泌系のｖｉｒＡ／Ｇ調節成分）に類似したｒｃｏｒｆ１４０（推定的ｖｉｒＤ４）によりコードされるアミノ酸配列
１０１． 配列番号１０１：ｐＲｉ１７２４中のｒｉｏｒｆ１７２に類似しかつｐＴｉ−ＳＡＫＵＲＡ（ｖｉｒＢ／Ｄ４複合体を介するＩＶ型分泌タンパク質）中のｔｉｏｒｆ１３３に少し類似したｒｃｏｒｆ１４２（推定的ｖｉｒＦ）によりコードされるアミノ酸配列
１０２． 配列番号１０２：Ａ．ツメファシエンス（A. tumefaciens）のｖｉｒＥ２およびＩＭＰＡ１（ＡｔＫＡＰα）（ｖｉｒＢ／Ｄ４ ＩＶ型分泌タンパク質）と相互作用するｐＲｉ１７２４中のｒｉｏｒｆ１７３およびｐＲｉＡ６ＮＣ中のｖｉｒＥ３に類似したｒｃｏｒｆ１４３（推定的ｖｉｒＥ３）によりコードされるアミノ酸配列
１０３． 配列番号１０３：メソリゾビウム・ロティ（Mesorhizobium loti）ＭＡＦＦ３０３０９９ ｍｌｒ１６２６（予測マンノース−６−リン酸イソメラーゼ）に類似したｒｃｏｒｆ１４４によりコードされるアミノ酸配列
１０４． 配列番号１０４：ファージインテグラーゼに類似したｒｃｏｒｆ１４５によりコードされるアミノ酸配列
１０５． 配列番号１０５：ｐＲｉ２６５９Δｔｅｔ（テトラサイクリン選択マーカー（ｔｅｔ）を含む）のＲＦ：：ｔｅｔ：：ＬＦ領域をコードする核酸配列
１０６． 配列番号１０６：ｐＲｉ２６５９をコードする核酸配列
１０７． 配列番号１０７：ｖｉｒＧ ＣＤＳ内のＰＣＲプライマー ５’−ＴＡＣＴＴＣＣＴＣＣ ＴＣＡＣＧＣＡＣＴＣ−３’
１０８． 配列番号１０８：ｖｉｒＢオペロン内のＰＣＲプライマー ５’−ＧＣＣＡＧＣＡＡＴＧ ＡＴＣＡＡＧＡＡＴＴ ＴＧＴＴＴ−３’
１０９． 配列番号１０９：ＰＣＲ Ｇ１０９フォワードプライマー ５’−ＴＴＧＧＴＧＣＧＡＣ ＡＡＣＴＣＣＴＣＧＧ ＣＧ−３’
１１０． 配列番号１１０：ＰＣＲ Ｇ１１２リバースプライマー ５’−ＧＧＴＧＡＧＣＴＣＧ ＡＴＣＡＧＣＴＴＣＧ ＧＣ−３’
１１１． 配列番号１１１：ｐＲｉ２６５９のｖｉｒＤ２をコードする核酸配列
１１２． 配列番号１１２：ｒｃｏｒｆ１３８としても知られるｐＲｉ２６５９のｖｉｒＤ２タンパク質に対するアミノ酸配列
１１３． 配列番号１１３：ｒｃｏｒｆ２〜ｒｃｏｒｆ１２を含有するｐＲｉ２６５９の相補的核酸配列
１１４． 配列番号１１４：仮定的タンパク質Ｂｃｅｐ０２０００３３８［バークホルデリア・フンゴルム（Burkholderia fungorum）ＬＢ４００］に類似したｐＲｉ１７２４中のｒｉｏｒｆ２０にやや類似したｒｃｏｒｆ１２によりコードされるアミノ酸配列
１１５． 配列番号１１５：ｈｕｔＨ遺伝子相同体であるｐＲｉ１７２４中のｒｉｏｒｆ４０（ｃｄ０１４４１：ＨＡＬ；ヒスチジンアンモニアリアーゼ（ＨＡＬ）はヒスチジンからグルタミン酸への分解の第一段階を触媒する）に類似したｒｃｏｒｆ１１によりコードされるアミノ酸配列
１１６． 配列番号１１６：転写調節タンパク質［ブラディリゾビウム・ジャポニカム（Bradyrhizobium japonicum）ＵＳＤＡ １１０］ヘリックス・ターン・ヘリックスグルコネートオペロン転写リプレッサーに類似したｒｃｏｒｆ１０によりコードされるアミノ酸配列
１１７． 配列番号１１７：Ａ．ツメファシエンス（A. tumefaciens）Ｃ５８ヒダントイン利用タンパク質ｈｙｕＡに類似したｒｃｏｒｆ９によりコードされるアミノ酸配列
１１８． 配列番号１１８：Ａ．ツメファシエンス（A. tumefaciens）Ｃ５８ヒダントイン利用タンパク質ｈｙｕＢに類似したｒｃｏｒｆ８によりコードされるアミノ酸配列
１１９． 配列番号１１９：ＳＴＨ１０６０（グルタミンＡＢＣトランスポーター基質結合タンパク質［シンビオバクテリウム・サーモフィラム（Symbiobacterium thermophilum）ＩＡＭ １４８６３］）に類似したＣＯＧ０８３４（バークホルデリア・フンゴルム（Burkholderia fungorum）ＬＢ４００ ＣＯＧ０８３４）に類似したｒｃｏｒｆ７によりコードされるアミノ酸配列
１２０． 配列番号１２０：ＰＳＰＴＯ５１８１（推定シスチンＡＢＣトランスポーターパーミアーゼタンパク質［シュードモナス・シリンガエ（Pseudomonas syringae）ｐｖ．トマト菌株ＤＣ３０００］）に類似したＣＯＧ０７６５［バークホルデリア・フンゴルム（Burkholderia fungorum）ＬＢ４００］に類似したｒｃｏｒｆ６によりコードされるアミノ酸配列
１２１． 配列番号１２１：ｂｌｒ３３１０（ＣＯＧ０７６５：ＡＢＣトランスポーターパーミアーゼタンパク質［ブラディリゾビウム・ジャポニカム（Bradyrhizobium japonicum）ＵＳＤＡ １１０］）に類似したＢｃｅｐ０２０００３３９［バークホルデリア・フンゴルム（Burkholderia fungorum）ＬＢ４００］に類似したｒｃｏｒｆ５によりコードされるアミノ酸配列
１２２． 配列番号１２２：グルタミンＡＢＣトランスポーターＡＴＰ結合タンパク質［シンビオバクテリウム・サーモフィラム（Symbiobacterium thermophilum）ＩＡＭ １４８６３］に類似したＳＴＨ１０６２にＮ末端が類似し；ブラディリゾビウム・ジャポニカム（Bradyrhizobium japonicum）ＵＳＤＡ １１０の仮定的タンパク質ｂｌｌ６３６２（プロピオン酸異化に関与する特性付けされていないタンパク質ＣＯＧ２０７９［Ｒ］）にＣ末端が類似したｒｃｏｒｆ４によりコードされるアミノ酸配列
１２３． 配列番号１２３：ｍｌｒ６０９７（窒素同化制御タンパク質［メソリゾビウム・ロティ（Mesorhizobium loti）ＭＡＦＦ３０３０９９］、転写レギュレーターＣＯＧ０５８３［Ｋ］）にやや類似したｒｃｏｒｆ３によりコードされるアミノ酸配列
１２４． 配列番号１２４：ＩＳ６６中のｏｒｆ３遺伝子相同体であるｐＲｉ１７２４中のｒｉｏｒｆ１に類似したｒｃｏｒｆ２によりコードされるアミノ酸配列
１２５． 配列番号１２５：ｒｃｏｒｆ１８を含有するｐＲｉ２６５９の相補的核酸配列
１２６． 配列番号１２６：仮定的タンパク質ＡＧＲ＿Ｌ＿１８２１［アグロバクテリウム・ツメファシエンス（Agrobacterium tumefaciens）株Ｃ５８］（ｓｄｅＢ遺伝子相同体、ｃｄ０１２９８：ＡＴＺ＿ＴＲＺ＿ｌｉｋｅ；ＴＲＺ／ＡＴＺファミリーはアトラジン分解経路の酵素および関連ヒドロラーゼを含む）に類似したｒｃｏｒｆ１８によりコードされるアミノ酸配列
１２７． 配列番号１２７：ｒｃｏｒｆ２４〜ｒｃｏｒｆ３１を含有するｐＲｉ２６５９の相補的核酸配列
１２８． 配列番号１２８：メチロバクテリウム・エクストルクエンス（Methylobacterium extorquens）のｏｒｆ３遺伝子（予測Ｎ−ホルミルグルタメートＣＯＧ３９３１［Ｅ］）に類似したｐＲｉ１７２４中のｒｉｏｒｆ５９に類似したｒｃｏｒｆ３１によりコードされるアミノ酸配列
１２９． 配列番号１２９：ｅｕｔＢ相同体であるｐＲｉ１７２４中のｒｉｏｒｆ５８（エタノールアミンアンモニアリアーゼ重鎖）に類似したｒｃｏｒｆ３０によりコードされるアミノ酸配列
１３０． 配列番号１３０：ｐＲｉ１７２４中のｒｉｏｒｆ５５（ｖｉｒＥ２を補完する。効率的な安定的植物形質転換に必要とされるが、機序不明）に類似したｒｃｏｒｆ２８（推定的ＧＡＬＬＳ遺伝子）によりコードされるアミノ酸配列
１３１． 配列番号１３１：ｐＲｉ１７２４中のｒｉｏｒｆ５４に類似したｒｃｏｒｆ２７（推定的トランスゼアチンシンターゼ（ＥＣ ２．５．１．−））によりコードされるアミノ酸配列
１３２． 配列番号１３２：ｉｄｉ（イソペンテニル二リン酸δ−イソメラーゼ［マイコバクテリウム・ツベルクロシス（Mycobacterium tuberculosis）ＣＤＣ１５５１］ＥＣ ５．３．３．２）に類似したｐＲｉ１７２４中のｒｉｏｒｆ５３に類似した推定的ｉｄｉ遺伝子であるｒｃｏｒｆ２６によりコードされるアミノ酸配列
１３３． 配列番号１３３：デカルボキシラーゼファミリータンパク質ＭＣＡ２１８２［メチロコッカス・カプスラタス（Methylococcus capsulatus）株Ｂａｔｈ］に類似したｐＲｉ１７２４中のｒｉｏｒｆ５２に類似したｒｃｏｒｆ２５によりコードされるアミノ酸配列
１３４． 配列番号１３４：ｔｅｔＲ細菌性調節ファミリーのｍｔｒＲ遺伝子にやや類似したｐＲｉ１７２４中のｒｉｏｒｆ５１に類似したｒｃｏｒｆ２４によりコードされるアミノ酸配列
１３５． 配列番号１３５：ｒｃｏｒｆ４２〜ｒｃｏｒｆ４３を含有するｐＲｉ２６５９の相補的核酸配列
１３６． 配列番号１３６：ＳＭａ２００２［シノリゾビウム・メリロティ（Sinorhizobium meliloti）１０２１］（ＣＯＧ２７５５［Ｅ］ リゾホスホリパーゼＬ１および関連エステラーゼ）に類似したｐＲｉ１７２４中のｒｉｏｒｆ７３に類似したｒｃｏｒｆ４３によりコードされるアミノ酸配列
１３７． 配列番号１３７：ＳＭａ２００４［シノリゾビウム・メリロティ（Sinorhizobium meliloti）１０２１］（推定ＲＯＫファミリー転写レギュレーター）に類似した仮定的リプレッサー遺伝子であるｐＲｉ１７２４中のｒｉｏｒｆ７３に類似したｒｃｏｒｆ４２によりコードされるアミノ酸配列
１３８． 配列番号１３８：ｒｃｏｒｆ７４〜ｒｃｏｒｆ７６を含有するｐＲｉ２６５９の相補的核酸配列
１３９． 配列番号１３９：ｐＲｉ１７２４中のｒｉｏｒｆ１１１に類似した推定的ｔｒａＣ遺伝子（Ｔｉプラスミド接合ＤＮＡプロセシング）であるｒｃｏｒｆ７６によりコードされるアミノ酸配列
１４０． 配列番号１４０：ｐＲｉ１７２４中のｒｉｏｒｆ１０９（ｃｄ０１１２６：ＴｒａＧ＿ＶｉｒＤ４；ＴｒａＧ／ＴｒａＤ／ＶｉｒＤ４ファミリーは細菌接合タンパク質である）に類似した推定的ｔｒａＧ遺伝子であるｒｃｏｒｆ７４によりコードされるアミノ酸配列
１４１． 配列番号１４１：ｒｃｏｒｆ８３〜ｒｃｏｒｆ９５を含有するｐＲｉ２６５９の相補的核酸配列
１４２． 配列番号１４２：ｐＲｉ１７２４中のｒｉｏｒｆ１３１（ＬｕｘＩ型菌体数感知レギュレーター、３−オキソオクタノイルホモセリンラクトン合成、ｐｆａｍ００７６５：Ａｕｔｏｉｎｄ＿ｓｙｎｔｈ；オートインデューサーシンテターゼ）に類似した推定的ｔｒａＩ遺伝子ｒｃｏｒｆ９５によりコードされるアミノ酸配列
１４３． 配列番号１４３：ｐＲｉ１７２４中のｒｉｏｒｆ１３０（Ｒｉ／Ｔｉプラスミド接合に必要とされるＩＶ型移入系）に類似した推定的ｔｒｂＢ遺伝子であるｒｃｏｒｆ９４によりコードされるアミノ酸配列
１４４． 配列番号１４４：ｐＲｉ１７２４中のｒｉｏｒｆ１２９（Ｒｉ／Ｔｉプラスミド接合に必要とされるＩＶ型移入系）に類似した推定的ｔｒｂＣ遺伝子であるｒｃｏｒｆ９３によりコードされるアミノ酸配列
１４５． 配列番号１４５：ｐＲｉ１７２４中のｒｉｏｒｆ１２７（Ｒｉ／Ｔｉプラスミド接合に必要とされるＩＶ型移入系）に類似した推定的ｔｒｂＥ遺伝子であるｒｃｏｒｆ９１によりコードされるアミノ酸配列
１４６． 配列番号１４６：ｐＲｉ１７２４中のｒｉｏｒｆ１２５（Ｒｉ／Ｔｉプラスミド接合に必要とされるＩＶ型移入系）に類似したｔｒｂＫ遺伝子相同体であるｒｃｏｒｆ８９によりコードされるアミノ酸配列
１４７． 配列番号１４７：ｐＲｉ１７２４中のｒｉｏｒｆ１２３（Ｒｉ／Ｔｉプラスミド接合に必要とされるＩＶ型移入系）に類似した推定的ｔｒｂＦ遺伝子であるｒｃｏｒｆ８８によりコードされるアミノ酸配列
１４８． 配列番号１４８：ｐＲｉ１７２４中のｒｉｏｒｆ１２３（Ｒｉ／Ｔｉプラスミド接合に必要とされるＩＶ型移入系）に類似した推定的ｔｒｂＦ遺伝子であるｒｃｏｒｆ８７によりコードされるアミノ酸配列
１４９． 配列番号１４９：ｐＲｉ１７２４中のｒｉｏｒｆ１２２（Ｒｉ／Ｔｉプラスミド接合に必要とされるＩＶ型移入系）に類似した推定的ｔｒｂＧ遺伝子であるｒｃｏｒｆ８６によりコードされるアミノ酸配列
１５０． 配列番号１５０：ｐＲｉ１７２４中のｒｉｏｒｆ１２１（Ｒｉ／Ｔｉプラスミド接合に必要とされるＩＶ型移入系）に類似した推定的ｔｒｂＨ遺伝子であるｒｃｏｒｆ８５によりコードされるアミノ酸配列
１５１． 配列番号１５１：ｐＲｉ１７２４中のｒｉｏｒｆ１２０（ｐｆａｍ０３７４３：Ｔｒｂｌ；細菌接合ＴｒｂＩ様タンパク質）に類似した推定的ｔｒｂＩ遺伝子であるｒｃｏｒｆ８４によりコードされるアミノ酸配列
１５２． 配列番号１５２：ｐＲｉ１７２４中のｒｉｏｒｆ１１９とｐＴｉＣ５８中のｔｒａＲ／ＡＧＲ ｐＴｉ２４９とに類似した推定的ｔｒａＲ遺伝子であるｒｃｏｒｆ８３によりコードされるアミノ酸配列
１５３． 配列番号１５３：ｒｃｏｒｆ１００〜ｒｃｏｒｆ１０２を含有するｐＲｉ２６５９の相補的核酸配列
１５４． 配列番号１５４：ｐＴｉＡ６ＮＣ中の仮定的インテグラーゼ遺伝子ｏｒｆ２（シュードモナス（Pseudomonas）のインテグラーゼ様遺伝子に類似する）に類似したｒｃｏｒｆ１０２によりコードされるアミノ酸配列
１５５． 配列番号１５５：ｐＡＴ２２（アグロバクテリウム・ツメファシエンス（Agrobacterium tumefaciens）株Ｃ５８（菌株：Ｃ５８、単離株：Ｃｅｒｅｏｎ）、ＣＯＧ０５８２［Ｌ］インテグラーゼタンパク質）のＮ末端断片に類似したｒｃｏｒｆ１０１によりコードされるアミノ酸配列
１５６． 配列番号１５６：ｐＡＴ２２（アグロバクテリウム・ツメファシエンス（Agrobacterium tumefaciens）株Ｃ５８（菌株：Ｃ５８、単離株：Ｃｅｒｅｏｎ）、ＣＯＧ０５８２［Ｌ］インテグラーゼタンパク質）のＣ末端に類似したｒｃｏｒｆ１００によりコードされるアミノ酸配列
１５７． 配列番号１５７：ｒｃｏｒｆ１１５〜ｒｃｏｒｆ１１６を含有するｐＲｉ２６５９の相補的核酸配列
１５８． 配列番号１５８：Ａｔｕ０７１１（アグロバクテリウム・ツメファシエンス（Agrobacterium tumefaciens）株Ｃ５８）およびｐＲｉ１７２４中のｒｉｏｒｆ１４８と、ｋｕｐ遺伝子（ｐｆａｍ０２７０５：Ｋ＿Ｔｒａｎｓ；Ｋ＋カリウムトランスポータータンパク質）とに類似した推定的カリウム取込みタンパク質であるｒｃｏｒｆ１１６によりコードされるアミノ酸配列
１５９． 配列番号１５９：ｐＲｉ１７２４中のｒｉｏｒｆ１４７とｐＮＧＲ２３４ａ中のｙ４ｍＣ遺伝子相同体（ｖｉｒ誘導遺伝子）とに類似したｒｃｏｒｆ１１５によりコードされるアミノ酸配列
１６０． 配列番号１６０：ｒｃｏｒｆ１３４〜ｒｃｏｒｆ１３６を含有するｐＲｉ２６５９の相補的核酸配列
１６１． 配列番号１６１：ｐＲｉ１７２４中のｒｉｏｒｆ１６６（毒性ｖｉｒＡ／Ｇ調節タンパク質、ＡＧＲ＿ｐＴｉ＿１８ｐ；ＶｉｒＣ１；Ｔ−ＤＮＡの右境界領域に隣接するオーバードライブ配列に結合；Ｔ−ＤＮＡプロセシングのレベルを増大）に類似した推定的ｖｉｒＣ１であるｒｃｏｒｆ１３６によりコードされるアミノ酸配列
１６２． 配列番号１６２：ｐＲｉ１７２４中のｒｉｏｒｆ１６５（Ｔ−ＤＮＡプロセシング毒性ｖｉｒＡ／Ｇ調節タンパク質）に類似した推定的ｖｉｒＣ２であるｒｃｏｒｆ１３５によりコードされるアミノ酸配列
１６３． 配列番号１６３：ＩＳＢｍ１トランスポザーゼｏｒｆＡ［ブルセラ・スイス（Brucella suis）１３３０］（ＮＰ ６９７５５１）のａａ４−１２２／１４２に類似した仮定的タンパク質であるｒｃｏｒｆ１３４によりコードされるアミノ酸配列
１６４． 配列番号１６４：ＳＭａ２２０７（推定ＡＢＣトランスポーター、ＡＴＰ結合タンパク質［シノリゾビウム・メリロティ（Sinorhizobium meliloti）１０２１］、ＣＯＧ３８４２：ＰｏｔＡ；ＡＢＣ型スペルミジン／プトレシン輸送系ＡＴＰアーゼ成分［アミノ酸の輸送および代謝］）に類似したｒｃｏｒｆ１５によりコードされるアミノ酸配列
１６５． 配列番号１６５：ｒｉｏｒｆ３４（仮定的タンパク質［アグロバクテリウム・リゾゲネス（Agrobacterium rhizogenes）］、推定的ミキモピントランスポーター遺伝子）に類似した推定的ククモピントランスポーターであるｒｃｏｒｆ１７によりコードされるアミノ酸配列
１６６． 配列番号１６６：ｐＲｉ１７２４中のｒｉｏｒｆ５７（ｅｕｔＣ相同体、エタノールアミンアンモニアリアーゼ軽鎖）に類似したｒｃｏｒｆ２９によりコードされるアミノ酸配列
１６７． 配列番号１６７：ＰＨ０８０７（ｐｆａｍ００４９６：ＳＢＰ＿ｂａｃ＿５；細菌細胞外溶質結合タンパク質ファミリー５）に類似した仮定的ＡＢＣトランスポーター遺伝子であるｐＲｉ１７２４中のｒｉｏｒｆ６１に類似したｒｃｏｒｆ３３によりコードされるアミノ酸配列
１６８． 配列番号１６８：ｐｃｋ遺伝子（ｓｍａｒｔ００５８７：ＣＨＫ；キナーゼドメインを含有するＺｎＦ＿Ｃ４ ａｂｄ ＨＬＨドメイン）にやや類似したｐＲｉ１７２４中のｒｉｏｒｆ６７に類似したｒｃｏｒｆ３８によりコードされるアミノ酸配列
１６９． 配列番号１６９：ｇｌｐＫ（グリセロールキナーゼ（ＥＣ ２．７．１．３０））遺伝子相同体であるｐＲｉ１７２４中のｒｉｏｒｆ７９に類似したｒｃｏｒｆ４９によりコードされるアミノ酸配列
１７０． 配列番号１７０：ｐＯＡＤ２中のｎｙｌＡ遺伝子の下流領域に類似したｐＲｉ１７２４中のｒｉｏｒｆ９５に類似したｒｃｏｒｆ６５によりコードされるアミノ酸配列
１７１． 配列番号１７１：ＡＧＲ＿ｐＴｉ＿２２５ヌクレアーゼ［アグロバクテリウム・ツメファシエンス（Agrobacterium tumefaciens）株Ｃ５８］（ＣＯＧ１５２５［Ｌ］ミクロコッカスヌクレアーゼ（サーモヌクレアーゼ）相同体）に類似したｒｃｏｒｆ７３によりコードされるアミノ酸配列
１７２． 配列番号１７２：ｐＲｉ１７２４中のｒｉｏｒｆ１１０に類似した推定的ｔｒａＤ遺伝子であるｒｃｏｒｆ７５（接合移入タンパク質）によりコードされるアミノ酸配列
１７３． 配列番号１７３：ｐＲｉ１７２４中のｒｉｏｒｆ１１３（ＣＯＧ４９５９：ＴｒａＦ；ＩＶ型分泌経路プロテアーゼＴｒａＦ［翻訳後修飾、タンパク質代謝回転、シャペロン／細胞内輸送および分泌］）に類似した推定的ｔｒａＦ遺伝子であるｒｃｏｒｆ７８によりコードされるアミノ酸配列
１７４． 配列番号１７４：ｐＲｉ１７２４中のｒｉｏｒｆ１１７（仮定的タンパク質）またはアグロバクテリウム・リゾゲネス（Agrobacterium rhizogenes）（菌株：ＭＡＦＦ０３−０１７２４）ｃｄ０００９３：ＨＴＨ−ＸＲＥ；ヘリックス・ターン・ヘリックスＸＲＥファミリー様タンパク質に類似したｒｃｏｒｆ８１によりコードされるアミノ酸配列
１７５． 配列番号１７５：ｐＲｉ１７２４中のｒｉｏｒｆ１２６（Ｒｉ／Ｔｉプラスミド接合に必要とされるＩＶ型移入系、ＣＯＧ５３１４；接合移入／侵入排除タンパク質［細胞内輸送および分泌］）に類似した推定的ｔｒｂＪ遺伝子であるｒｃｏｒｆ９０によりコードされるアミノ酸配列
１７６． 配列番号．１７６：ｐＲｉ１７２４中のｒｉｏｒｆ１２８（Ｒｉ／Ｔｉプラスミド接合に必要とされるＩＶ型移入系）に類似した推定的ｔｒｂＤ遺伝子であるｒｃｏｒｆ９２によりコードされるアミノ酸配列
１７７． 配列番号１７７：ｐＲｉ１７２４中のｒｉｏｒｆ１３８とｐＨＨ１中のｇｖｐ１遺伝子（ｐｆａｍ０４０７９：ＤＵＦ３８７；推定転写レギュレーター（Ｙｐｕｈ様）タンパク質）とに類似したｒｃｏｒｆ１０４によりコードされるアミノ酸配列
１７８． 配列番号１７８：ｐＲｉ１７２４中のｒｉｏｒｆ１４１（仮定的タンパク質）のＣ末端に類似したｒｃｏｒｆ１０８によりコードされるアミノ酸配列
１７９． 配列番号１７９：ブラディリゾビウム・ジャポニカム（Bradyrhizobium japonicum）ＵＳＤＡ １１０（菌株：ＵＳＤＡ １１０）のｂｌｒ８１８０（ＣＯＧ１７６０［Ｅ］Ｌ−セリンデアミナーゼ）に７９ａａにわたりやや類似したｒｃｏｒｆ１１３によりコードされるアミノ酸配列
１８０． 配列番号１８０：ｐＲｉ１７２４（リゾビウム・レグミノサルム（Rhizobium leguminosarum）のａａｔＡ遺伝子相同体（フレームシフトにより生じる仮定的偽遺伝子）であるｒｉｏｒｆ１５０に類似したｒｃｏｒｆ１１８によりコードされるアミノ酸配列
１８１． 配列番号１８１：ｐＲｉ１７２４中のｒｉｏｒｆ１５４（Ｔ−複合体移入に必要とされるＩＶ型分泌系）に類似した推定的ｖｉｒＢ２であるｒｃｏｒｆ１２２によりコードされるアミノ酸配列
１８２． 配列番号１８２：ｐＲｉ１７２４中のｒｉｏｒｆ１５６（Ｔ−複合体移入に必要とされるＩＶ型分泌系）に類似した推定的ｖｉｒＢ４であるｒｃｏｒｆ１２４によりコードされるアミノ酸配列
１８３． 配列番号１８３：ｐＲｉ１７２４中のｒｉｏｒｆ１６０（Ｔ−複合体移入に必要とされるＩＶ型分泌系）に類似した推定的ｖｉｒＢ８であるｒｃｏｒｆ１２８によりコードされるアミノ酸配列
１８４． 配列番号１８４：ｐＲｉ１７２４中のｒｉｏｒｆ１６２（Ｔ−複合体移入に必要とされるＩＶ型分泌系）に類似した推定的ｖｉｒＢ１０であるｒｃｏｒｆ１３０によりコードされるアミノ酸配列
１８５． 配列番号１８５：ｐＲｉ１７２４中のｒｉｏｒｆ１６９（ｖｉｒＡ／Ｇにより調節され、毒性に必要とされない、考えられる宿主域因子）に類似した推定的ｖｉｒＤ３であるｒｃｏｒｆ１３９によりコードされるアミノ酸配列
１８６． 配列番号１８６：ｐＲｉ１７２４中のｒｉｏｒｆ１７１（ｖｉｒＢ／Ｄ４ ＩＶ型分泌系のｖｉｒＡ／Ｇにより調節される成分）に類似した推定的ｖｉｒＤ５であるｒｃｏｒｆ１４１によりコードされるアミノ酸配列
１８７． 配列番号１８７：Ｙ４ｒＢ（リゾビウム（Rhizobium）ｓｐ．ＮＧＲ２３４）に類似したｒｃｏｒｆ１４６によりコードされるアミノ酸配列
１８８． 配列番号１８８：アグロバクテリウム株Ｋ５９９の左側Ｔ−ＤＮＡ隣接配列をコードするヌクレオチド配列
実施例
とくに指示がないかぎり、実施例中の化学物質および試薬は、Sigma Chemical Company (St. Louis, MO)から入手したものであり、制限エンドヌクレアーゼは、New England Biolabs (Beverly, MA)またはRoche (Indianapolis, IN)から入手したものであり、オリゴヌクレオチドは、MWG Biotech Inc. (High Point, NC)により合成されたものであり、そして生化学物質および分子生物学的アッセイに関連する他の修飾酵素またはキットは、Clontech (Palo Alto, CA)、Pharmacia Biotech (Piscataway, NJ)、Promega Corporation (Madison, Wl)、またはStratagene (La JoIIa, CA)から入手したものである。細胞培養培地用の材料は、Gibco/BRL (Gaithersburg, MD)またはDIFCO (Detroit, Ml)から入手したものである。本発明の目的で実施されるクローニングステップ、たとえば、制限切断、アガロースゲル電気泳動、ＤＮＡ断片の精製、ニトロセルロース膜およびナイロン膜への核酸の転写、ＤＮＡ断片の連結、大腸菌（E. coli）細胞の形質転換、細菌増殖、ファージ増殖、組換えＤＮＡの配列解析は、Sambrook (1989)に記載されているように行われる。組換えＤＮＡ分子の配列決定は、とくに記載がないかぎり、Sanger (Sanger 1977)の方法に従ってＡＢＩレーザー蛍光ＤＮＡシークエンサーを用いて行われる。実例として以下の実施例を提供するが、これらに限定されるものではない。
実施例１： アグロバクテリウム株Ｋ５９９の非病害化
アグロバクテリウム株Ｋ５９９は、ダイズをはじめとする多くの双子葉植物で毛状根病を引き起こす土壌細菌である。菌株Ｋ５９９は、ダイズの根にきわめて感染し易いことが明らかにされている。アグロバクテリウム株Ｋ５９９（British NCPPB stock center; www.ncppb.com National Collection of Plant Pathogenic Bacteria Central Science Laboratory, Sand Hutton, York YO41 1LZ Englandに寄託番号ＮＣＰＰＢ２６５９で寄託されている）を２８℃で液体培養（ＬＢ培地）により増殖させ、ｐＲｉプラスミドを精製するように改変されたＤＮＡ抽出プロトコルをQiagen Large Construct kit（catalog No. 12462）を用いて実施し、ｐＲｉ２６５９プラスミドのＤＮＡ調製物を富化した。
右境界プローブ（２８５ｂｐ）または左境界プローブ（２４０ｂｐ）を用いてサザンハイブリダイゼーションを実施し、ｐＲｉ２６５９のＴ−ＤＮＡ領域の物理的制限地図の妥当性を確認した（図６参照）。欠失ベクターに対する相同領域として使用するのに許容しうる（２ｋｂ超の隣接部）断片が制限酵素ＳｐｈＩにより生成されることを確認した。Ｋ５９９ ｐＲｉ２６５９ ＳｐｈＩ断片のサブゲノムクローンバンクをｐＵＣ１９中に構築した。ｐＲｉ２６５９プラスミドを富化して単離されたアグロバクテリウム株Ｋ５９９ ＤＮＡをＳｐｈＩで消化し、０．８％アガロースゲルで泳動した。右隣接部ＤＮＡを含有する２９０５ｂｐ断片および左隣接部ＤＮＡを含有する７，４９８ｂｐ断片に相当する断片領域をアガロースゲルから切り出し、Qiagen QIAquick gel extraction kit（catalog No. 28706）を用いて精製した。これらの精製ゲル断片をｐＵＣ１９中にライゲーションしてサブゲノムクローンバンクを作製した。
クローンバンクに由来するコロニーリフトを右境界断片または左境界断片でプローブし、隣接部ＤＮＡを含有するクローンを特定した。２つのクローンが特定された：右隣接部ＤＮＡを含有する２，９０５ｂｐ断片および左隣接部ＤＮＡを含有する７，４９８ｂｐ断片。これらの各クローンをさらにサブクローニングし、標準的なフォワードプライマーおよびリバースプライマー（それぞれ、配列番号１および２）を用いて配列を決定した。
隣接部を有する各クローンに由来する２．１ｋｂの断片を用いてアグロバクテリウム欠失カセットを構築した。相同領域は、二重相同的組換えが起こるのに十分なスペースを提供する。ＲＦ断片とＬＦ断片との間にテトラサイクリン耐性遺伝子を含有する類似のカセットを構築した（フローチャートに関して図１２を参照されたい）。これらの構築物の配列を確認した。ＲＦ／ＬＦカセットおよびＲＦ／Ｔｅｔ／ＬＦカセットをｐＲＬ２７８（配列番号３；Peter Wolk, Michigan State University）のリンカー改変体中にクローニングし、それぞれプラスミドベクターｐＲＬ２７８ＬＦ／ＲＦ（配列番号２３；Ｔｅｔなしカセット）およびプラスミドベクターｐＢＰＳＳＨ００９（配列番号２２；Ｔｅｔありカセット）を得た。これらのベクターは、ｓａｃＢ遺伝子を用いることにより二重相同的組換え体の効率的な選択を可能にする。単一相同的組換え体を含有する増殖培地にスクロースを添加すると、毒性化合物レバンが生成される。この化合物は、プラスミドを含有する菌株に対してカウンター選択として作用するので、ダブルクロスオーバー体から野生型の表現型または所望の欠失が分離される。ｐＢＰＳＳＨ００９およびｐＲＬ２７８ＬＦ／ＲＦをそれぞれエレクトロポレーションにより菌株Ｋ５９９に導入し、カナマイシン１００μｇ／ｍＬを用いて選択した。Ｒｉプラスミド中に組み込まれた欠失プラスミドを含有するシングルクロスオーバー体を回収し、スクロースに基づくカウンター選択を行った。スクロース／ｓａｃＢ選択は、次のように行った。ｓａｃＢおよび欠失構築物を有するカナマイシン耐性ベクターを含有する確認された（サザンハイブリダイゼーションにより）シングルクロスオーバー事象を選択に付すことなく一晩増殖させて組換えを行わせた。５％（ｖ／ｖ）スクロースを含有するＬＢ寒天カウンター選択培地上に培養物の逐次希釈物をプレーティングした。２日後、出現したコロニーを増殖させ、ゲノムＤＮＡを単離し、それを用いてサザンハイブリダイゼーションによりＴ−ＤＮＡ領域の欠失を確認した。ダブルクロスオーバー体を単離し、サザンハイブリダイゼーションによりＴ−ＤＮＡ欠失の分子確認を行った（図６）。サザンハイブリダイゼーションで使用したプローブは、ｐＲｉ２６５９の右隣接領域を含有する断片を単離するために先に使用したものと同一であった。それは、右境界領域と境界領域の上流および下流の両方の隣接配列とを含有する２００ｂｐ断片である。サザンブロットのために、ゲノムＤＮＡサンプルをＳｐｈＩで消化し、０．８％アガロースゲルで泳動した。
得られた菌株を以下のように命名した：
・ アグロバクテリウムＫ５９９［ｐＲｉ２６５９Δｔｅｔ］株：ＳＨＡ００１およびＳＨＡ０１６は、Ｔ−ＤＮＡ領域を欠損しテトラサイクリン（ｔｅｔ）発現カセットを含む非病害性アグロバクテリウムＫ５９９株である（ｐＢＰＳＳＨ００９を用いて取得した）。アグロバクテリウム株ＳＨＡ００１およびＳＨＡ０１６はいずれも、非病害性テトラサイクリン耐性型の（すなわちｐＲｉ２６５９Δｔｅｔプラスミドを含む）機能的に等価な菌株である。
・ アグロバクテリウムＫ５９９［ｐＲｉ２６５９Δ］株：ＳＨＡ０１７は、Ｔ−ＤＮＡ領域が欠如している非病害性アグロバクテリウムＫ５９９株である（ｐＢＰＳＳＨ００９ｂとしても知られるｐＲＬ２７８ＬＦ／ＲＦを用いて取得した）。
ダイズ子葉を用いる毛状根症候群に関する機能試験（以下の実施例２を参照されたい）により、病害表現型の喪失を確認した。ダイズ、トウモロコシ、トマト、およびシロイヌナズナで植物形質転換実験を行って（下記参照）、非病害性菌株の植物感染性を確認した。すべての植物種において、一過的β−グルクロニダーゼ（ＧＵＳ）発現が検出された。さらに、ダイズ、トウモロコシ、およびトマトの組織をはじめとする種々の植物種で安定的ＧＵＳ発現が検出された。安定的ＰｕｒｓｕｉｔＴＭ耐性およびグルホシネート耐性シロイヌナズナ植物もまた回収された。強毒性ｐＳＢ１プラスミド（Komari 1996）を非病害性Ｋ５９９株中に移し、トウモロコシ形質転換に有効であることを立証した。
実施例２： 毛状根アッセイ
ダイズ種子（栽培品種Ｗｉｌｌｉａｍｓ ８２）を以下のアッセイ１に使用した。接種の６日前、ダイズ種子を滅菌する。表面上に創傷／亀裂のない種子を滅菌ビーカーに入れる。評価対象の各アグロバクテリウム株に対して３０個の種子を使用し、９５％エタノールに１分間浸す。エタノールを除去し、０．０００５％ ＴｒｉｔｏｎＸ−１００を含む新たに調製された１０％漂白液で種子を１０分間処理する。漂白液を３分間ごとに交換する。その後、漂白液を排出し、種子を滅菌水で４回洗浄する。それぞれ１０個の種子を１％寒天プレート上に配置し、ＰａｒａｆｉｌｍＴＭで密閉し、２５℃で１６時間／日の照明下（７０〜１００μＥ／ｍ２ｓ）に配置する。
毛状根アッセイのためのアグロバクテリウム接種：
接種前、発芽したダイズを層状フード下に配置する。新たな一晩アグロバクテリウム培養物を振盪機から取り出し、ＯＤ６５０を測定する。１ｍＬのアリコートを滅菌微量遠心管に入れ、１２，０００ｒｐｍで３分間、アグロバクテリウムを沈澱させる。上清を除去し、感染培地（１×ＭＳ塩、３．６％グルコース、６．９％スクロース、１００ｍｇ／Ｌ ｍｙｏ−イノシトール、１．５ｍｇ／Ｌ ２，４−Ｄ、１ｍｇ／Ｌ カザミノ酸、１ｍｇ／Ｌ チアミンＨＣｌ、０．５ｍｇ／Ｌ ニコチン酸、０．５ｍｇ／Ｌ ピリドキシンＨＣｌ）でアグロバクテリウムを再懸濁する。
ＯＤ６５Ｏを１．０に調整する。感染培地中でアグロバクテリウムを１時間インキュベートしてから感染させ、ｖｉｒ遺伝子カスケードを誘発する。緑色子葉だけを苗から切り取り、向軸面にメスで創傷を形成する。背軸面を上に向けて子葉を寒天プレート上に配置する。各子葉の創傷表面に１７〜２０μＬのアグロバクテリウムを接種する。プレートをＰａｒａｆｉｌｍで密閉し、２５℃で１６時間／日の照明条件下（７０〜１００μＥ／ｍ２ｓ）に配置して共培養に供する。接種の３日後、選択培地（１×ＭＳ塩、１×Ｇａｍｂｏｒｇｓ Ｂ５ビタミン、３％スクロース、１００ｍｇ／Ｌ カルベニシリン（carbinicillin）、ＫＯＨでｐＨ６．２に調整）上に子葉を移す。プレートを密閉し、同一の培養条件下に戻す。２週間後、培地の表面中に成長する毛状根を検出し採取することが可能である（毛状根誘導性菌株の場合）。採取された根を選択培地上に配置する。さらに２〜３週間後、選択培地で成長する根株を、選択剤を含まない培地で継代培養する。４週間ごとに継代培養しなければならない。根は暗所で培養しなければならない。
実施例３： 植物形質転換のためのアグロバクテリウムの増殖および調製
所望のバイナリーベクターを保有する細菌を固体ＹＥＰ増殖培地上に塗ることによりアグロバクテリウム培養物を調製し、コロニーが出現するまで（約２日間）、２５℃でインキュベートする。Ｒｉプラスミド、バイナリーベクター、および細菌染色体に存在する選択マーカー遺伝子に応じて、さまざまな選択剤をＹＥＰ固体培地およびＹＥＰ液体培地におけるＡ．ツメファシエンス（A. tumefaciens）およびＡ．リゾゲネス（A. rhizogenes）の選択のために使用することが可能である。約２日後、単一コロニーを単離し（滅菌楊枝を使用）、抗生物質を含む５０ｍｌの液体ＹＥＰ中に接種して０．８〜１．０のＯＤ６５０に達するまで（約２日間）、振盪下（１７５ｒｐｍ、２５℃）に置く。形質転換用のグリセロールストック液（１５％）を調製し、−７０℃で１．５ｍＬのエッペンドルフ管中に１ｍｌのアグロバクテリウムストック液として貯蔵する。
ＹＥＰ増殖培地（アグロバクテリウム培地）：
１０ｇ／Ｌ バクトペプトン、５ｇ／Ｌ 酵母抽出物、５ｇ／Ｌ ＮａＣｌ、１２ｇ／Ｌ 寒天（Ｄｉｆｃｏ）、適切な抗生物質；ｐＨ７．０。
外植片接種の前日、５００ｍＬエルレンマイヤーフラスコ中で２００ｍＬのＹＥＰに５μＬ〜３ｍＬのアグロバクテリウムストック液を接種する。ＯＤ６５０が０．８〜１．０になるまで、２５℃でフラスコを一晩振盪する。ダイズ外植片の作製前、２０℃および５，５００×ｇで１０分間遠心することにより、アグロバクテリウムをペレット化する。所望の濃度（ＯＤ６５０ ０．５〜０．８）になるようにペレットを液体ＣＣＭ培地中に再懸濁し、使用前、室温で少なくとも３０分間置く。
液体ＣＣＭ培地（＝共培養培地）：
１／１０ Ｂ５塩、１／１０ ＭＳ鉄ストック液、３％ スクロース、２０ｍＭ ＭＥＳ、１×Ｂ５ビタミン、２００μＭ アセトシリンゴン、０．７μＭ ジベレリン酸、７．５μＭ ６−ベンジル−アミノプリン；ｐＨ５．４。
実施例４： 植物形質転換
実施例４ａ： ダイズ形質転換
苗およびアグロバクテリウムの調製
密閉蓋付きデシケーター中の１００ｍＬの漂白液（５．２５％次亜塩素酸ナトリウム）に３．５ｍＬのＨＣｌを添加することにより、種々の栽培品種のダイズ種子を塩素ガスで２４〜４８時間滅菌する。滅菌後、種子を取り出し、ＰｌａｎｔＣｏｎ容器中の発芽培地［１×Ｂ５主要塩、１×Ｂ５副次塩、１×ＭＳＩＩＩ鉄、２％スクロース、１×Ｂ５ビタミン、０〜５μＭ ＢＡＰ、０．８％ 精製寒天（Ｓｉｇｍａ）；ｐＨ５．８］に約２０粒の種子を蒔く。子葉が緑色になり、種皮が開裂し、そして葉外植片の場合は上胚軸が約０．５ｃｍの長さに拡張するまで（約７日間）、苗外植片の場合は１〜４ｃｍに拡張するまで、明所（１５０μｍ２ｓ）で苗を成長させる。
バイナリーベクターｐＢＰＳＥＷ００８［p-NOS::c-bar::t-NOS p-PcUBI::c-gusINT::t-NOS］（配列番号１５）またはｐＢＰＳＭＭ１９２ｂ［pAtAhas::c-csr1-2::t-AtAHAS t-NOS::c-gusINT::p-SUPER］（配列番号１６）を保有する非病害性アグロバクテリウム株Ｋ５９９（ｐＲｉ２６５９Δｔｅｔ）またはＡ．ツメファシエンス株ＡＧＬ１を、固体ＹＥＰ［１０ｇ／Ｌ バクトペプトン（Difco; Becton, Dickinson, and Co., Cockeysville, MD1 USA）、５ｇ／Ｌ 酵母抽出物（Ｄｉｆｃｏ）、５ｇ／Ｌ ＮａＣｌ、５０ｍｇ／Ｌ カナマイシン、１．２％ 顆粒化寒天（Ｄｉｆｃｏ）固体のみ；ｐＨ７．０］に塗り、そして２５℃で２日間インキュベートした。単一コロニーを滅菌楊枝で採取し、抗生物質を含む５０ｍＬの液体ＹＥＰ中に配置し、そして２５℃で１６時間振盪した（１７５ｒｐｍ）。０．８〜１．０のＯＤ６５０に達した後、１５％のグリセロールストック液を作製し、−８０℃で貯蔵した。外植片接種の１日前、アグロバクテリウム株＋５０ｍｇ／Ｌ カナマイシンの処理用ストック液（アグロバクテリウムの増殖およびストック液濃度に応じて５μＬ〜５０μＬの間の任意の量）をエルレンマイヤーフラスコ中のＹＥＰ液体培地に添加した。ＯＤ６５０が０．８に達するまで、フラスコを２５℃で一晩振盪した。ダイズ外植片を作製する前、２０℃および５，５００×ｇで１０分間遠心することにより、アグロバクテリウムをペレット化し、所望の濃度（たとえば、ＯＤ６５０ ０．５）になるように液体共培養培地［１／１０× Ｂ５主要塩、１／１０× Ｂ５副次塩、１／１０× ＭＳＩＩＩ鉄、１×Ｂ５ビタミン、３％ スクロース、２０ｍＭ ＭＥＳ、２００μＭ アセトシリンゴン、０．７２μＭ ＧＡ３、７．５μＭ ＢＡＰ；ｐＨ５．４］中に再懸濁し、そして室温で３０分間インキュベートした。
外植片の作製および接種
葉外植片： 子葉節の２ｍｍ下の位置で胚軸から子葉および上胚軸を切り離した。上胚軸および単葉を露出させるために、子葉同士を分離させ、次に、上胚軸を子葉節の上で切り離した。腋成長点が外植片に含まれるように、托葉の基部で注意深く切断することにより、葉身、葉柄、および托葉からなる初生葉を初生節から切り離した。鋭利なメスで托葉間の領域を３〜５回カットすることにより、外植片に創傷を形成し、すでに形成されている苗条をすべて切り離した。
苗外植片： 胚軸／上胚軸接合部または胚軸上部（胚軸が非常に長い場合）で大多数の根を、この節で１枚の子葉および任意の腋生組織増殖部を、初生節のすぐ上で頂端を含めて上胚軸を、さらには初生節からすでに形成されているすべての葉を、除去することにより、外植片を作製する。次に、腋成長点が位置する上胚軸の先端中に鋭利なメスで５〜１０回突き刺すことにより、初生節に損傷を与える。
外植片の作製後、外植片をアグロバクテリア懸濁液中に完全に３０分間浸漬した。インキュベーション後、過剰のアグロバクテリウム培養物を除去するために葉外植片を滅菌濾紙上に置いて水分を吸収させてから、固体共培養培地［１／１０× Ｂ５主要塩、１／１０× Ｂ５副次塩、１／１０× ＭＳＩＩＩ鉄、１× Ｂ５ビタミン、３％ スクロース、２０ｍＭ ＭＥＳ、２００μＭ ＡＳ、０．７２μＭ ＧＡ３、７．５μＭ ＢＡＰ、（０．８２５〜８．２５ｍＭ Ｌ−システイン、Ｓｉｇｍａ、０〜１ｍＭ ジチオトレイトール（dithiothrietol）、０〜１ｍＭ チオ硫酸ナトリウム）、０．５％ 精製寒天；ｐＨ ５．４］に重畳されている丸形７ｃｍ濾紙に創傷面を接触させて配置した。苗外植片は、水分の吸収を行わずに共培養培地に重畳されている濾紙上に移した。この濾紙は、ダイズ外植片でアグロバクテリウムが過剰増殖するのを阻止する。５枚のプレートをＰａｒａｆｉｌｍ「Ｍ」（American National Can, Chicago, Illinois, USA）で覆った。葉外植片は、２日間インキュベートし、苗外植片は、２５℃の暗所で５日間インキュベートした。
選択および植物再生
インキュベーション後、液体苗条誘導培地［１× Ｂ５主要塩、１× Ｂ５副次塩、１× ＭＳＩＩＩ鉄、１× Ｂ５ビタミン、３％ スクロース、３ｍＭ ＭＥＳ、１．０μＭ ＢＡＰ（苗外植片）または２．５μＭ ＢＡＰ（葉外植片）、５μＭ カイネチン、２５０ｍｇ／ｌ チカルシリン；ｐＨ ５．６］中で外植片を洗浄することにより、過剰のアグロバクテリウムを除去し、そして水による損傷（とくに葉身上）を防止するために、葉外植片を滅菌濾紙上で水分を吸収・乾燥させた。次に、グルホシネート選択を行うことなく約１０個の葉外植片および５個の苗外植片を固体苗条誘導培地［０．８％ 精製寒天（Sigma）］上に移して７日間置いた。葉柄が培地中に埋め込まれ、かつ葉身が培地外に置かれた状態で、葉が培地の表面に垂直に位置するように、葉外植片を培地中に配置し、そして上胚軸全体が培地に接触した状態で、苗外植片を配置した。プレートをＳｃｏｔｃｈ ３９４ ｖｅｎｔｉｎｇ ｔａｐｅ（3M, St. Paul, Minnesota, USA）でラッピングし、平均温度２５℃、明所１８時間／暗所６時間のサイクル、７０〜１００μＥ／ｍ２ｓの条件で、増殖チャンバー内に配置した。
７日後、３．０ｍｇ／Ｌのグルホシネートを含む苗条誘導培地に葉外植片を移し、５．０ｍｇ／Ｌのグルホシネートを含む苗条誘導培地に苗外植片を移した。この時点で、葉外植片では葉柄の基部で、苗外植片では初生節の上胚軸の先端で、かなりのｄｅ ｎｏｖｏ苗条発育があった。選択を有する苗条誘導培地上に２週間置いた後、３ｍｇ／Ｌのグルホシネート選択を有する苗条伸長培地［１×ＭＳ 主要塩、１×ＭＳ 副次塩、１× ＭＳＩＩＩ鉄、１× Ｂ５ビタミン、３％ スクロース、３ｍＭ ＭＥＳ、０．３７８ｍＭ Ｌ−アスパラギン、０．７７５ｍＭ Ｌ−ピログルタミン酸、０．０５７μＭ ＩＡＡ、１．４４μＭ ＧＡ３、２．８５μＭ トランス−ゼアチンリボシド、２５０ｍｇ／Ｌ チカルシリン、０．８％ 精製寒天（Ｓｉｇｍａ）；ｐＨ ５．６］に葉外植片を移して苗条原基の苗条伸長を刺激した。苗外植片では、外植片の上胚軸の先端から苗条パッド（shoot pad）を切り取って、同じ苗条伸長培地に移す。次に、外植片が死滅するかまたは健康な苗条が伸長するまで、３週間ごとに新たなＳＥＭ培地中に外植片を移した。移動させる間、死滅苗条を除去し、カルス組織が形成される外植片の基部をカットして、上述の苗条への栄養素や水の移動を促進させた。次に、伸長した苗条を発根培地（１／２× Ｂ５塩、１／２× ＭＳ鉄ストック液、２％ スクロース、３ｍＭ ＭＥＳ、５μＭ インドール酪酸、２５０ｍｇ／Ｌ Ｔｉｍｅｎｔｉｎ、０．８％ Ｎｏｂｌｅ寒天；ｐＨ ５．６）に移し、根が形成されるまで置いた。次に、発根した苗条を成長チャンバー中の土壌（1:1 (w/w) Carolina soil:Metro mix）に移し、第３の三葉が伸長するまで２０時間にわたり明所下に置いた。次に、温室内で成熟するまで明所１６時間／暗所８時間のレジームで植物を成長させた。
ＧＵＳ組織化学的アッセイ
ＧＵＳ組織化学的染色液［８０ｍＭ Ｎａ２ＨＰＯ４（ｐＨ８．０）、８ｍＭ Ｎａ２ＥＤＴＡ、０．８％（ｖ／ｖ） Ｔｒｉｔｏｎ Ｘ、１．６％（ｖ／ｖ） ジメチルスルホキシド、２０％（ｖ／ｖ） メタノール、０．３８ｍＭ Ｋ４Ｆｅ（ＣＮ）６，１ｍＭ Ｘ−ｇｌｕｃｕｒｏ ＣＨＡ塩（Inalco, Milan, Italy）］中に３７℃で１日配置することにより、ＧＵＳ活性に関して葉外植片を評価し、その後、葉組織を７０％（ｖ／ｖ）エタノール中で洗浄し、そして９５％エタノール中で透明化した（Jefferson 1987; Kosugi 1990）。
実験設計
実験１では、バイナリーｐＢＰＳＭＭ１９２ｂ（配列番号１６）を保有するＡＧＬ１またはＳＨＡ０１６を接種すべく４０個の外植片を作製し、共培養の５日後、一過的ＧＵＳ発現に関してアッセイした。第２の３回反復実験では、さまざまな濃度（ＯＤ６５０：０、０．１２５、０．２５、０．５）のアグロバクテリウムＡＧＬ１またはＳＨＡ０１６（両方ともｐＢＰＳＥＷ００８（配列番号１５）を保有する）が接種された合計１２０個の外植片を用いて、苗条再生を試験した。第３の実験では、ＳＨＡ０１６またはＡＧＬ１（両方ともｐＢＰＳＥＷ００８（配列番号１５）を保有する）を接種すべく１２０個の外植片を作製し、共培養の３６日後、安定的ＧＵＳ発現を調べるために一部を染色した。第４の実験では、アグロバクテリウム株ＳＨＡ０１７（ｐＳＢ１）またはＡＧＬ１（両方ともｐＢＰＳＥ００８（配列番号１５）を保有する）のいずれかで形質転換された苗外植片から伸長した苗条を用いてＧＵＳ組織学的染色をアッセイすることにより、推定形質転換頻度を決定した。この実験は、５つの異なる接種日から構成した。
第１の実験において、Ａ．ツメファシエンスＡＧＬ１および非病害性アグロバクテリウム株Ｋ５９９（ＳＨＡ０１６）のいずれの場合も、葉外植片の葉柄中にＴ−ＤＮＡがうまく移入された（図３）。ＡＧＬ１を感染させた外植片の４２．５パーセントは、標的領域でＧＵＳ＋フォーカスを示し、一方、ＳＨＡ０１６は、標的領域の１０％でＧＵＳ＋フォーカスを示した（表１）。ＳＨＡ０１６を感染させた外植片における一過的ＧＵＳ発現の低減は、主に、共培養中の組織死が原因であった。
Figure 2008511294
第２の実験において、さまざまな濃度の非病害性Ｋ５９９が接種された外植片の再生能力は、この試験では互いに顕著に異なることはなかった。
Figure 2008511294
第３の実験において、ＧＵＳ組織化学的染色に供された外植片はすべて、接種の３５日後、葉外植片で安定的ＧＵＳ発現を示した（図４）。
第４の実験において、合計９００個の苗外植片を作製した。このうちの２８８個にＡＧＬ１（ｐＢＰＳＥＷ００８）を接種し、６１２個にＳＨＡ０１７（ｐＳＢ１、ｐＢＰＳＥＷ００８）を接種した（表３）。この試験において、ＡＧＬが接種された外植片から１個のＧＵＳ＋苗条（０．３５％）が確認され、ＳＨＡ０１７が接種された外植片から２５個の独立したＧＵＳ＋苗条（４．１％）が確認された。これらのうちで、ＳＨＡ０１７処理を受けた苗条の１０個は、成熟Ｔ０植物体まで発育した。１０個のＴ０植物体のサザン分析から、各植物体は、植物ゲノム中へのＴ−ＤＮＡ組込みパターンに基づき独立した形質転換事象であることが確認された。また、一系列２１−２のＴ１後代へのＴ−ＤＮＡの遺伝は、ｇｕｓ遺伝子およびｂａｒ遺伝子のプローブへの植物ゲノムＤＮＡのサザンハイブリダイゼーションにより確認された（図１５）。
Figure 2008511294
実施例４ｂ：シロイヌナズナ（Arabidopsis thaliana）の形質転換
シロイヌナズナ（Arabidopsis thaliana）植物（生態型Ｃｏｌ−０）を開花するまで土壌で成長させ、一次抽薹を除去して二次抽薹の花を増加させた。アグロバクテリウム株ＭＰ９０（GV3101 (pMP90); Koncz and Schell 1986）、ＳＨＡ００１、および野生型Ｋ５９９を、対象の構築物ｐＢＰＳＥＷ００８（配列番号１５）およびｐＢＰＳＭＭ１９２ｂ（配列番号１６）で形質転換し、１．２のＯＤ６５０に達するまで、液体ＬＢ培地（１０ｇ／Ｌ トリプトン、５ｇ／Ｌ 酵母抽出物、１０ｇ／Ｌ ＮａＣｌ（EM Science））中、２５０ｍＬで培養物を増殖させた。細菌細胞を遠心（１５分間、４，０００×ｇ）により回収し、０．８〜０．９のＯＤ６５０になるように浸潤溶液（５％ スクロース、０．０５％ ＳＩＬＷＥＴ Ｌ−７７［Lehle Seeds, Cat.No. VIS-02］、０．２１７％ ＭＳ塩［Sigma M5524]］）中に再懸濁した。
次に、アグロバクテリウム溶液中に１０〜２０秒間浸漬することにより、上述のベクターを保有するトランスジェニックアグロバクテリウム株で花浸漬法（Clough and Bent 1998）により開花シロイヌナズナ（A. thaliana）植物を形質転換した。その後、種子を採取できるようになるまで、成長チャンバー内に植物を保持した。成長培地（４．４ｇ／Ｌ ＭＳ塩［Sigma-Aldrich］、１ｇ／Ｌ ＭＥＳ［Duchefa］、２０ｇ／Ｌ スクロース、６ｇ／Ｌ Ｐｈｙｔａｇａｒ、ただし、ｂａｒ耐性マーカーを保有する植物用の５ｍｇ／Ｌ グルホシネート、、ＡｔＡＨＡＳ遺伝子の発現カセットを含む植物体用の１００ｎＭ Ｐｕｒｓｕｉｔ、ｎｐｔＩＩ耐性マーカーを保有する植物用の５０ｍｇ／Ｌ カナマイシン、またはロドトルラ・グラシリス（Rhodotorula gracilis）由来のｄａｏ１遺伝子の発現カセットを含む植物用の０．３〜３０ｍＭ Ｄ−アミノ酸（以下に記載されるとおり）が追加されている）上に表面滅菌種子を蒔くことにより、トランスジェニック種子を選択した。生存植物を土壌に移し、温室内で成長させた。ＧＵＳアッセイ溶液（Jefferson 1987）（０．４Ｍ ＮａＨ２ＰＯ４−Ｈ２Ｏ ｐＨ ７．０、０．５Ｍ ＥＤＴＡ、０．０１％ ＴｒｉｔｏｎＸ−１００、２５０ｍｇ／Ｌ Ｘ−グルクロニダーゼ（Fermentas））を用いて３７℃で生存植物の試料を一晩染色し、ＧＵＳ発現に関して観測を行った（図１０）。
適切な選択剤を含む培地上で発芽したＴ２集団中のＴ−ＤＮＡ偏在を統計解析することにより、単一のＴ−ＤＮＡ挿入断片遺伝子座を含有する系列を選択する。挿入されたＴ−ＤＮＡの単一の遺伝子座を含む植物を成長させ、自家受精させる。次に、Ｔ３後代中のＴ−ＤＮＡ偏在を解析することによりホモ接合Ｔ３種子ストックを特定し、導入された遺伝子を発現しているかをノーザンブロット分析により確認する。
実施例４ｃ： ブラシカ・ナプス（Brassica napus）のアグロバクテリウム媒介形質転換
対象のプラスミド（たとえばｐＢＰＳＭＭ１９２ｂ）で形質転換された非病害性アグロバクテリウム株Ｋ５９９（ｐＲｉ２６５９Δ）を５０ｍＬ ＹＥＢ培地（実施例４ａ参照）中、２８℃で一晩増殖させる。０．５のＯＤ６５０に達するまで、アグロバクテリウム溶液を液体共培養培地（２倍濃度 ＭＳＢ５塩（Duchefa）、３０ｇ／Ｌ スクロース（Duchefa）、３．７５ｍｇ／Ｌ ＢＡＰ（６−ベンジルアミノプリン、Duchefa）、０．５ｇ／Ｌ ＭＥＳ（Duchefa）、０．５ｍｇ／Ｌ ＧＡ３（ジベレリン酸、Duchefa）；ｐＨ ５．２）と混合する。成長培地Ｂ（ＭＳＢ５塩（Duchefa）、３％ スクロース（Duchefa）、０．８％ ｏｘｏｉｄａｇａｒ（Oxoid GmbH））の上で成長させたブラシカ・ナプス（Brassica napus）栽培品種Ｗｅｓｔａｒの４日齢の苗の葉柄を切り取った。葉柄をアグロバクテリウム溶液中に２〜３秒間浸漬し、その後、共培養のための固体培地（１．６％ Ｏｘｏｉｄａｇａｒが追加された共培養培地）中に入れた。共培養を３日間継続させる（２４℃および約５０μＭｏｌ／ｍ２ｓの光強度）。その後、適切な選択剤（ｎｐｔＩＩマーカーを含む植物体用の１８ｍｇ／Ｌ カナマイシン（Duchefa）（ｎｐｔＩＩ耐性マーカーを保有する植物用のカナマイシン）、またはロドトルラ・グラシリス（Rhodotorula gracilis）由来のｄａｏ１遺伝子の発現カセットを含む植物用の０．３〜３０ｍＭ Ｄ−アミノ酸（以下に記載されるとおり））および３００ｍｇ／Ｌ Ｔｉｍｅｎｔｉｎ（Duchefa）が追加された共培養培地に葉柄を移した。
選択培地上、２４℃で、形質転換葉柄を４週間インキュベートする。苗条が出現するまで、このステップを反復する。適切な選択剤（ｎｐｔＩＩマーカーを含む植物体用の１８ｍｇ／Ｌ カナマイシン（ｎｐｔＩＩ耐性マーカーを保有する植物用のカナマイシン）（Duchefa）または以下に記載されるような０．３〜３０ｍＭ Ｄ−アミノ酸）が追加されたＡ６培地（ＭＳ塩（Sigma Aldrich）、２０ｇ／Ｌ スクロース、１００ｍｇ／Ｌ ｍｙｏ−イノシトール（Duchefa）、４０ｍｇ／Ｌ 硫酸アデニン（Sigma Aldrich）、５００ｍｇ／Ｌ ＭＥＳ、０．００２５ｍｇ／Ｌ ＢＡＰ（Sigma）、５ｇ／Ｌ ｏｘｏｉｄａｇａｒ（Oxoid GmbH）、１５０ｍｇ／Ｌ ｔｉｍｅｔｉｎ（Duchefa）、０．１ｍｇ／Ｌ ＩＢＡ（インドール酪酸、Duchefa）；ｐＨ ５，８）に苗条を移し、伸長するまで置く。伸長した苗条を発根用のＡ７培地（ＢＡＰを含まないＡ６培地）で培養する。発根した植物体を土壌に移し、温室内で成長させる。
実施例４ｄ： トマトのアグロバクテリウム媒介形質転換
ｉｎ ｖｉｔｒｏ種子発芽
０．１％ Ｔｗｅｅｎ ２０を含有する１０％ ＣｌｏｒｏｘＴＭ（５．２５％ 次亜塩素酸ナトリウム）中で、攪拌を行いながらトマト種子を１５分間滅菌する。滅菌された種子を滅菌蒸留水で濯ぐ。滅菌後、２５×１００ｍｍのペトリ皿中の発芽培地［０．２５× ＭＳ、７．５ｇ／Ｌ スクロース、０．７％ 精製寒天（Sigma）、ｐＨ ５．８］に種子を移す。種子を含有するペトリ皿を暗所に２〜３日間配置して均一に発芽させ、そして培養室に移して培養室内の明所下に置く（２５℃、１６／８時間の光周期、７０μＥ／ｍ２ｓの光強度）。約８日齢の苗の子葉をアグロバクテリウム媒介形質転換に使用する。
アグロバクテリウムの調製
バイナリーベクターｐＢＰＳＥＷ００８［p-NOS::c-bar::t-NOS p-PcUBI::c-gusINT::t-NOS］（配列番号１５）またはｐＢＰＳＭＭ１９２ｂ［p-AtAhas::c-csr1-2::t-AtAHASpA t-NOS::c-gusINT::p-SUPER］（配列番号１６）を保有する非病害性アグロバクテリウム株Ｋ５９９（ＳＨＡ００１）を固体ＹＥＰ［１０ｇ／Ｌ バクトペプトン（Difco; Becton, Dickinson, and Co., Cockeysville, MD, USA）、５ｇ／Ｌ 酵母抽出物（Difco）、５ｇ／Ｌ ＮａＣｌ、５０ｍｇ／Ｌ カナマイシン、１．２％ 顆粒化寒天（Difco）固体のみ；ｐＨ ７．０］上に塗り、そして２５℃で２日間インキュベートした。単一コロニーを滅菌楊枝で採取し、抗生物質を含む５０ｍＬの液体ＹＥＰ中に配置し、そして２５℃で１６時間振盪した（１７５ｒｐｍ）。０．８〜１．０のＯＤ６５０に達した後、１５％のグリセロールストック液を作製し、−８０℃で貯蔵した。外植片接種の１日前、アグロバクテリウム＋５０ｍｇ／Ｌ カナマイシンの処理用ストック液（アグロバクテリウムの増殖およびストック液濃度に応じて５μＬ〜５０μＬの間の任意の量）をエルレンマイヤーフラスコ中のＹＥＰ液体培地に添加した。ＯＤ６５０が０．８に達するまで、フラスコを２５℃で一晩振盪した。トマト外植片を作製する前、２０℃および５，５００×ｇで１０分間遠心することにより、アグロバクテリウムをペレット化し、所望の濃度（たとえば、ＯＤ６５０ ０．５）になるように液体共培養培地［１／１０× Ｂ５主要塩、１／１０× Ｂ５副次塩、１／１０× ＭＳＩＩＩ鉄、１×Ｂ５ビタミン、３％ スクロース、２０ｍＭ ＭＥＳ、２００μＭ アセトシリンゴン、０．７２μＭ ＧＡ３、７．５μＭ ＢＡＰ；ｐＨ５．４］中に再懸濁し、そして室温で３０分間インキュベートした。
外植片の作製
約８日齢の苗から子葉を切り離し、滅菌ペトリ皿上に配置する。子葉の両端を除去し、横方向に半分に切断し、向軸面を下に向けて滅菌濾紙上に移し、そして２２℃の暗所で前培養培地［ＭＳ塩およびビタミン、１６ｇ／Ｌ グルコース、０．１ｍｇ／Ｌ ＮＡＡ、１ｍｇ／Ｌ ＢＡＰ、０．７％精製寒天、ｐＨ５．８］上に２日間配置した。
共培養
外植片と共に濾紙を共培養培地［ＭＳ塩およびビタミン、１６ｇ／Ｌ グルコース、０．１ｍｇ／Ｌ ＮＡＡ、１ｍｇ／Ｌ ＢＡＰ、０．７％ 精製寒天、１５０μＭ アセトシリンゴン、ｐＨ ５．８］上に配置し、そしてアグロバクテリウム懸濁液（０．３〜０．５のＯＤ６５０）を接種して２２℃の暗所に２〜３日間置いた。
選択および植物再生
３日目の終わり、背軸面を下に向けて外植片を回復培地（１× ＭＳ塩およびビタミン、１６ｇ／Ｌ グルコース、２ｍｇ／Ｌ ゼアチン、０．７％ 精製寒天、２００ｍｇ／Ｌ ｔｉｍｅｎｔｉｎ）上に配置し、２５℃の培養室内（７０μＥ／ｍ２ｓ）に一週間入れた。回復後、外植片を選択／再生培地（１× ＭＳ塩およびビタミン、３０ｇ／Ｌ スクロース、２ｍｇ／Ｌ ゼアチン、０．７％ 精製寒天、２００ｍｇ／Ｌ ｔｉｍｅｎｔｉｎ、５０〜１００ｎＭ Ｐｕｒｓｕｉｔ、ｐＨ ５．８）に移して２．５週間置く。カルスの苗条芽を子葉から切り出し、伸長培地（１× ＭＳ塩およびビタミン、２０ｇ／Ｌ スクロース、０．５ｍｇ／Ｌ ゼアチンまたは０．２５ｍｇ／Ｌ ＩＢＡ、０．７％ 精製寒天、２００ｍｇ／Ｌ ｔｉｍｅｎｔｉｎ、および５０〜１００ｎＭ Ｐｕｒｓｕｉｔ）に移して２〜３週間置く。伸長苗条をカルスから切り出し、幼植物体が土壌に移植可能な状態になるまで、発根培地（１× ＭＳ塩およびビタミン、２０ｇ／Ｌ スクロース、０．２５ｍｇ／Ｌ ＩＢＡ、０．７％ 精製寒天、１００ｍｇ／Ｌ ｔｉｍｅｎｔｉｎ、５０ｎＭ Ｐｕｒｓｕｉｔ、ｐＨ ５．８）上に２〜３週間配置する。
ＧＵＳ組織化学的アッセイ
ＧＵＳ組織化学的染色液［８０ｍＭ Ｎａ２ＨＰＯ４（ｐＨ ８．０）、８ｍＭ Ｎａ２ＥＤＴＡ、０．８％（ｖ／ｖ） Ｔｒｉｔｏｎ−Ｘ、１．６％（ｖ／ｖ） ジメチルスルホキシド、２０％（ｖ／ｖ） メタノール、０．３８ｍＭ Ｋ４Ｆｅ（ＣＮ）６，１ｍＭ Ｘ−ｇｌｕｃｕｒｏ ＣＨＡ塩（Inalco, Milan, Italy）］中に３７℃で１日配置することにより、ＧＵＳ活性に関して葉外植片を評価し、その後、葉組織を７０％（ｖ／ｖ）エタノール中で洗浄し、そして９５％エタノール中で透明化した（Jefferson et al. 1987, Kosugi et al. 1990）。
ｐＢＰＳＭＭ１９２ｂ（配列番号１６）を含有する非病害性アグロバクテリウム株Ｋ５９９（ＳＨＡ００１）を用いて、トランスジェニックトマト幼植物体を得た（図５参照）。
実施例４ｅ： トウモロコシ（Zea mays）のアグロバクテリウム媒介形質転換
特定のトウモロコシ近交系またはトウモロコシ雑種系の種子を発芽させ、発根させ、そして温室内で成長させる。授粉の８〜１４（平均１０）日後（ＤＡＰ）、トウモロコシ植物体の穂を採取し、それから未成熟胚を単離する。採取の時期は、成長状態およびトウモロコシ品種に依存して異なる。形質転換のための未成熟胚の最適長さは、胚盤の長さを含めて約１〜１．５ｍｍである。胚は、不透明ではなく半透明でなければならない。切り出された胚をＭＳ系液体培地（１．５ｍｇ／Ｌの２，４−Ｄを含む）中に収集する。アグロバクテリウムの接種と同時またはアグロバクテリウム感染への使用直前のいずれかで、アセトシリンゴン（５０〜１００μＭ）を培地に添加する。
アグロバクテリウムの調製： 対象のプラスミド（ｐＳＢ１／ｐＢＰＳＭＭ２３２；このプラスミドは、ｐＢＰＳＭＭ２３２（配列番号１７［p-ZmUbi1 ::c-ZmAHASL/Xi12::t-ZmAHAS t-NOS::c-gusINT::p-ZmUbi1］）とｐＳＢ１（Komari 1996）との融合から生じるキメラプラスミドである）で形質転換されたアグロバクテリウム株ＳＨＡ０１７（Ｋ５９９［ｐＲｉ２６５９Δ］）をＹＥＰ培地上で増殖させる。アグロバクテリウム懸濁液を上記の培地中でボルテックスする（１００μＭアセトシリンゴンを含む培地、好ましくは感染前１〜２時間）。
接種／共培養： 前浸漬された未成熟胚の入ったマイクロチューブ（プレート）に細菌懸濁液を添加し、室温（２０〜２５℃）で５〜３０分間放置する。過剰の細菌懸濁液を除去し、残留培地中の未成熟胚および細菌をペトリ皿に移す。平らな面を下に向けて（胚盤を上に向けて）未成熟胚を共培養培地上に配置する。プレートを密閉し、２２℃の暗所で２〜３日間インキュベートする。（共培養培地：ＭＳ基本培地、１．５ｍｇ／Ｌ ２，４−Ｄ、１５μＭ ＡｇＮＯ３、１００μＭ アセトシリンゴン）。他の選択肢として、平らな面を下に向けて（胚盤を上に向けて）、切り出された未成熟胚を共培養培地上に直接配置する。希釈されたアグロバクテリウム細胞懸濁液を各未成熟胚に添加する。プレートを密閉し、２２℃の暗所で２〜３日間インキュベートする。
回復： 共培養の後、胚を回復培地（１．５ｍｇ／Ｌ ２，４−Ｄ、１５０ｍｇ／Ｌ Ｔｉｍｅｎｔｉｎを含むＭＳ基本培地）に移し、胚盤側を上に向けてプレートを２７℃の暗所で約５〜７日間インキュベートする。
形質転換カルスの選択： 未成熟胚を選択培地（選択剤、たとえば、０．３〜３０ｍＭの濃度のＤ−アラニンをさらに含む回復培地）に移し（胚盤を上に向けて）、２７℃の暗所で１０〜１４日間インキュベートする（第１の選択）。さまざまなカルスを生成する未成熟胚をすべて、第２〜第３の選択培地に移して継代培養する。この段階で、形成された根があればすべて除去する。第１の選択のときと同一の条件下でインキュベーションを２週間行う（第２の選択）。再生可能なカルスを胚盤から切り出し（再生可能なカルスは、白味を帯びた色を有し、緻密であり、粘液性はなく、いくつかの胚様構造体を有しうる）、新たな第２〜第３の選択培地に移す。プレートに覆いをかけ、２７℃の暗所で２週間インキュベートする（第３の選択は、ほとんどの遺伝子型に必要でないこともあり、再生可能なカルスを、再生培地に移すことが可能である）。
形質転換植物体の再生： 増殖したカルス（白味を帯び、胚構造体を形成している）を第２／第３の選択のときと同じように切り出し、再生培地（選択培地と同様であるが２，４−Ｄを含まない）に移す。プレートに覆いをかけ、２週間にわたりまたは苗条様構造体が見えるようになるまで、２５℃または２７℃の明所（約２，０００ルクス）に置く。必要であれば新たな再生培地に移す。再生苗条または再生苗条様構造体を有するカルス断片を発根培地の入ったＰｈｙｔａｔｒａｙに移し、上記の工程と同一の条件下で２週間にわたりまたは発根した幼植物体が出現するまで、インキュベートする。発根培地（１／２濃度 ＭＳ培地、２，４−Ｄなし、選択剤なし）上に２〜４週間置いた後、依然として緑色領域を有する（ただし、再生苗を有していない）カルスを新たな発根用Ｐｈｙｔａｔｒａｙｓに移す。発根した苗を温室内のＭｅｔｒｏｍｉｘ土壌に移し、苗立ちするまで少なくとも１週間にわたりそれぞれプラスチックドームで覆う。植物体が三葉期〜四葉期に達したとき、Ｏｓｍｏｃｏｔｅで施肥し、次に、選択剤（たとえば、Ｄ−アラニンまたはＤ−セリン）をスプレーし、そしてさらに２週間にわたり温室内で成長させる。非トランスジェニック植物は、この時点で除草性症状を示すかまたは死滅するはずである。ＭｅｔｒｏＭｉｘおよび茶匙１杯のＯｓｍｏｃｏｔｅの入った１０インチポットに生存植物を移植する。
実施例５： ｐＲｉ２５６９Δプラスミドの精製、配列決定、および注釈付け
５リットルのＬＢブロス中、２８℃で、アグロバクテリウム株ＳＨＡ０１７（非病害性アグロバクテリウムＫ５９９［ｐＲｉ２６５９Δ］）を一晩増殖させた。標準的アルカリ溶解プロトコルおよびそれに続くフェノール−クロロホルム抽出（Sambrook et al. 1989）に基づいて、全ＤＮＡを抽出した。ＣＨＥＦ−ＤＲＩＩＩシステム（Bio-Rad Cat.#: 170-3695）を用いてパルスフィールドゲル電気泳動（ＰＦＧＥ）により、ｐＲｉ２６５９ΔプラスミドＤＮＡを全ＤＮＡから単離した。全ＤＮＡを０．５×ＴＢＥ緩衝液（４５ｍＭ Ｔｒｉｓ−ホウ酸、１ｍＭ ＥＤＴＡ）中の１％パルスフィールド用アガロース（Bio-Rad Cat #: 162-0137）ゲルにロードし、続いて、６Ｖ／ｃｍ、１秒間の初期スイッチ時間および２５秒間の最終スイッチ時間、１４℃、２４時間の条件でＰＦＧＥにかけた。電気泳動後、分子マーカーレーンを含むゲルストリップおよびゲルの両側のサンプルレーン縁部を含むゲルストリップを切り出し、エチジウムブロミド（Ｓｉｇｍａ）で染色し、そして画像化した。１つの分解可視バンドがゲルストリップ中に存在し、ＤＮＡの残りの部分はウェル中に残存した。単一のバンドを切り出し、Fu and Dooner (2000)に基づいて電気泳動溶出により回収した。
回収されたＤＮＡをｐＲｉ特異的プライマーによるＰＣＲ増幅用の鋳型として使用し、ｐＲｉ ＤＮＡの回収を確認した。プライマーは、ｐＲｉ１７２４（ＧｅｎＢａｎｋ登録番号ＡＰ００２０８６）の保存されたｖｉｒ遺伝子領域内に設計した。
ｖｉｒＧフォワードプライマー： ５’−ＴＡＣＴＴＣＣＴＣＣ ＴＣＡＣＧＣＡＣＴＣ−３’ （配列番号２７）
ｖｉｒＢリバースプライマー： ５’−ＧＣＣＡＧＣＡＡＴＧ ＡＴＣＡＡＧＡＡＴＴ ＴＧＴＴＴ−３’ （配列番号２８）。
ショットガンクローニングのような当業者に公知の方法により、ｐＲｉの断片を作製することが可能である。ＢａｍＨＩ、ＳｐｈＩ、ＥｃｏＲＩ、ＨｉｎｄＩＩＩ（New England Biolabs, Beverly, MAからすべて入手可能）のような種々の市販の制限酵素を用いてＲｉプラスミド調製物を個別的に消化させて、同様に消化されたｐＢｌｕｅＳｃｒｉｐｔ（Stratagene, La Jolla, CA）のようなｐＵＣ型ベクター中にサブクローニングすることが可能である。次に、個々のクローンの配列決定を行って、個々の配列をコンティグの形態にアセンブルし、以下に記載されるように全配列地図を作製することが可能である。
Margulies et al. (2005)およびSanger (1977)に基づいて、精製ｐＲｉ２６５９Δの配列決定を行った。ｃｒｏｓｓ＿ｍａｔｃｈ（Green（著作権） 1994-1999）を用いてベクター配列をマスキングし、Margulies et al. (2005)およびＣＡＰ３（Huang and Madan 1999）に基づいて浄化原配列データをアセンブルする。以下のプライマーを用いるＰＣＲ増幅およびそれに続く配列決定により、残存する配列ギャップを埋めた：
ＰＣＲ Ｇ１０９フォワードプライマー： ５’−ＴＴＧＧＴＧＣＧＡＣ ＡＡＣＴＣＣＴＣＧＧ ＣＧ−３’ （配列番号２９）
ＰＣＲ Ｇ１１２リバースプライマー： ５’−ＧＧＴＧＡＧＣＴＣＧ ＡＴＣＡＧＣＴＴＣＧ ＧＣ−３’ （配列番号３０）。
Sanger (1977)に基づいてＰＣＲ産物の配列決定反応を行った。最終ポリッシングのために、各断片がそれに連結される断片まで続く５０塩基のオーバーラップを有するように、ドラフト配列を１００個の断片に分割し；各断片にきわめてよく一致する配列を有する原配列をプールし、ＣＡＰ３を用いて高ストリンジェンシーで再アセンブルする。各断片からアセンブルされたこれらのコンセンサス配列をＣＡＰ３により再アセンブルし、ｐＲｉ２６５９Δ（配列番号２４）、ｐＲｉ２６５９Δｔｅｔ（配列番号２５）、およびｐＲｉ２６５９（配列番号２６）の配列地図をＶｅｃｔｏｒ ＮＴＩ（Invitrogen, Carlsbad CA）により作製した。ＢＬＡＳＴｘ（ｅ−１０にて）（Altschul et al. 1997）およびＧｅｎＢａｎｋ Ｇｅｎｐｅｐｔタンパク質データリリースバージョン１４８を用いて、新しいｐＲｉ２６５９配列に注釈を付けた。
実施例６： ｐＲｉ２６５９Δによりコードされるタンパク質
以下の表（表４）は、プラスミドｐＲｉ２６５９Δ（配列番号２４）のオープンリーディングフレームによりコードされている可能性のあるタンパク質を列挙したものである。タンパク質の配列番号（ＳＩＮｏ）およびコードされたアミノ酸の詳細事項が列挙されている。
Figure 2008511294
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参照文献
以下に列挙する参照文献および本明細書中に引用したすべての参照文献は、それらが補充し、説明し、背景を提示し、または教示する、本明細書中で利用する方法論、技術、および／もしくは構成の程度で、参照により本明細書中に組み入れられるものとする。
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ＲＡＰＤ（ランダム増幅多型ＤＮＡ）により決定したときのアグロバクテリア株の関係を示す樹状図である。 １６Ｓ ｒＲＮＡ比較により決定したときのアグロバクテリウム株の関係を示す樹状図である。 ｖｉｒＤ２アミノ酸配列比較により決定したときのアグロバクテリウム株の関係を示す樹状図である。 アグロバクテリウムプラスミドｐＲｉ２６５９のＴ−ＤＮＡ領域の物理的制限地図である。 ＡＧＬ１（ｐＢＰＳＭＭ１９２ｂ）（Ｉ）またはＳＨＡ０１６（ｐＢＰＳＭＭ１９２ｂ）（ＩＩ）のいずれかと２日間共培養した後の葉腋成長点外植片のダイズにおける一過的ＧＵＳ発現（５日間）を示す。 アグロバクテリウムＳＨＡ００１（ｐＢＰＳＥＷ００８）を感染させた葉腋成長点外植片を用いたときの感染後３５日目のダイズにおける安定なＧＵＳ発現を示す。 ｐＢＰＳＭＭ１９２ｂを含有する組換えＳＨＡ００１を用いたときのトランスジェニックトマト幼植物（Ａ）およびトランスジェニック葉におけるＧＵＳ発現（Ｂ）を示す。 非病害性テトラサイクリンマーカー付きＫ５９９（ｐＲｉ２６５９Δｔｅｔ）のサザンハイブリダイゼーションを示す。 ダイズ子葉を用いた毛状根アッセイを示す。 植物細胞における一過的ＧＵＳ発現を示す。 ＡＨＡＳで選択された安定なＴ１トランスジェニックシロイヌナズナを示す。 安定なＴ１トランスジェニックシロイヌナズナのＧＵＳ染色を示す。 右隣接領域および左隣接領域を含むプラスミドｐＲｉ２６５９ Ｔ−ＤＮＡ領域の地図である。 菌株Ｋ５９９を非病害化するために使用した欠失カセットを構築するために使用したステップを詳述したフローチャートである。 ベクターｐＢＰＳＭＭ１９２ｂおよびｐＢＰＳＭＭ２３２のプラスミド地図である。 ベクターｐＢＰＳＥＷ００８のプラスミド地図である。 土壌細菌の種々の１６Ｓ−２３Ｓ ｒＲＮＡ遺伝子間配列領域のアライメントを示す。 土壌細菌の種々の１６Ｓ−２３Ｓ ｒＲＮＡ遺伝子間配列領域のアライメントを示す。 土壌細菌の種々の１６Ｓ−２３Ｓ ｒＲＮＡ遺伝子間配列領域のアライメントを示す。 土壌細菌の種々の１６Ｓ−２３Ｓ ｒＲＮＡ遺伝子間配列領域のアライメントを示す。 土壌細菌の種々の１６Ｓ−２３Ｓ ｒＲＮＡ遺伝子間配列領域のアライメントを示す。 非病害性アグロバクテリウム株Ｋ５９９（ｐＲｉ２６５９Δ）で形質転換されたダイズＴ１およびＴ０植物体のサザンハイブリダイゼーションを示す。 アグロバクテリウム種の種々のｖｉｒＤ２アミノ酸配列のアライメントを示す。

Claims (35)

  1. 以下のステップ：
    ａ） アグロバクテリウム株Ｋ５９９（ＮＣＰＰＢ ２６５９）または該菌株の誘導体のトランスジェニック非病原性変異株の細菌を準備するステップ、ここで、該変異株は植物細胞に感染可能であるが、毛状根表現型誘発性を欠損し、かつ該変異株はさらにトランスジェニックＴ−ＤＮＡを含むものである、および
    ｂ） 植物細胞を前記細菌と共培養するステップ、および
    ｃ） 安定的にゲノムに組み込まれた前記トランスジェニックＴ−ＤＮＡを含んでなる植物細胞を単離または選択するステップ
    を含む、トランスジェニック植物細胞の作製方法。
  2. 以下のステップ：
    ａ） アグロバクテリウム株Ｋ５９９（ＮＣＰＰＢ ２６５９）または該菌株の誘導体のトランスジェニック非病原性変異株の細菌を準備するステップ、ここで、該変異株は植物細胞に感染可能であるが、毛状根表現型誘発性を欠損し、かつ該変異株はさらにトランスジェニックＴ−ＤＮＡを含むものである、および
    ｂ） 植物体、植物細胞または植物組織を前記細菌と共培養するステップ、および
    ｃ） 安定的にゲノムに組み込まれた前記トランスジェニックＴ−ＤＮＡを含んでなる植物を単離または選択し、かつ任意により再生するステップ
    を含む、トランスジェニック植物の作製方法。
  3. 前記非病原性変異株が、植物細胞に感染可能であり、植物細胞へのＴ−ＤＮＡの移入を媒介することが可能であり、かつ植物ゲノムへのＴ−ＤＮＡの挿入を媒介することが可能であるが、毛状根表現型誘発性は欠損している、請求項１または２に記載の方法。
  4. 前記アグロバクテリウム株Ｋ５９９（ＮＣＰＰＢ２６５９）の誘導体が、土壌の植物病原性細菌であって、配列番号５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、および１４により示される配列モチーフからなる群より選択される少なくとも１つの配列モチーフを含む１６Ｓ−２３Ｓ ｒＲＮＡ遺伝子間配列により特徴付けられる、請求項１〜３のいずれか１項に記載の方法。
  5. 前記非病原性変異株が、ＲｉプラスミドｐＲｉ２６５９または該プラスミドの誘導体の非病原性プラスミド変異体を含んでなる、請求項１〜４のいずれか１項に記載の方法。
  6. 前記非病原性プラスミド変異体が、以下のもの：
    ａ） 配列番号２４により示される配列または配列番号２４により示される配列のうち少なくとも１００個の連続したヌクレオチドからなる配列を含む配列
    ｂ） 配列番号２４により示される配列または配列番号２４により示される配列のうち少なくとも１０００個の連続したヌクレオチドからなる配列に対して少なくとも９０％の配列同一性を有する配列
    ｃ） ５×ＳＳＰＥ、１％ＳＤＳ、５×デンハルト試薬および１００μｇ／ｍＬの変性サケ精子ＤＮＡからなる溶液中、６８℃での結合またはハイブリダイゼーションと、それに続く、０．１×ＳＳＰＥおよび０．１％ＳＤＳを含む溶液中、６８℃での洗浄と等価の条件下で、配列番号２４により示される配列もしくはその相補配列のうち少なくとも１００個の連続したヌクレオチドからなるプローブにハイブリダイズする配列
    により示される配列の群より選択される少なくとも１つの配列を含む、請求項５に記載の方法。
  7. 前記植物細胞、植物組織、または植物体が、単子葉植物、双子葉植物、および裸子植物からなる群より選択される植物に由来する、請求項１〜６のいずれか１項に記載の方法。
  8. 前記植物が、ウマゴヤシ属（Medicago）、トマト属（Lycopersicon）、アブラナ属（Brassica）、キュウリ属（Cucumis）、ナス属（Solanum）、クルミ属（Juglans）、ワタ属（Gossypium）、リンゴ属（Malus）、ブドウ属（Vitis）、キンギョソウ属（Antirrhinum）、ハコヤナギ属（Populus）、イチゴ属（Fragaria）、シロイヌナズナ属（Arabidopsis）、トウヒ属（Picea）、トウガラシ属（Capsicum）、アカザ属（Chenopodium）、キク属（Dendranthema）、アサガオ属（Pharbitis）、マツ属（Pinus）、エンドウ属（Pisum）、イネ属（Oryza）、トウモロコシ属（Zea）、コムギ属（Triticum）、ライコムギ（Triticale）、ライムギ属（Secale）、ドクムギ属（Lolium）、オオムギ属（Hordeum）、ダイズ属（Glycine）、トガサワラ属（Pseudotsuga）、リュウキュウベンケイ属（Kalanchoe）、フダンソウ属（Beta）、ヒマワリ属（Helianthus）およびタバコ属（Nicotiana）からなる群より選択される属に由来する、請求項７に記載の方法。
  9. 前記トランスジェニックＴ−ＤＮＡが、植物で発現可能な選択マーカー遺伝子を少なくとも１つ含む、請求項１〜８のいずれか１項に記載の方法。
  10. 以下のもの：
    ａ） 配列番号２４により示される配列または配列番号２４により示される配列のうち少なくとも１００個の連続したヌクレオチドからなる配列を含む配列
    ｂ） 配列番号２４により示される配列または配列番号２４により示される配列のうち少なくとも１０００個の連続したヌクレオチドからなる配列に対して少なくとも９０％の配列同一性を有する配列
    ｃ） ５×ＳＳＰＥ、１％ＳＤＳ、５×デンハルト試薬および１００μｇ／ｍＬの変性サケ精子ＤＮＡからなる溶液中、６８℃での結合またはハイブリダイゼーションと、それに続く、０．１×ＳＳＰＥおよび０．１％ＳＤＳを含む溶液中、６８℃での洗浄と等価の条件下で、配列番号２４により示される配列もしくはその相補配列のうち少なくとも１００個の連続したヌクレオチドからなるプローブにハイブリダイズする配列
    により示される配列の群より選択される、単離されたヌクレオチド配列。
  11. 植物細胞感染および形質転換に必要な機能をもたらすが、毛状根表現型を引き起こす配列は欠損している、ｐＲｉ２６５９または該Ｒｉプラスミドの誘導体の非病原性プラスミド変異体。
  12. 請求項１０に記載のヌクレオチド配列により示される、請求項１１に記載の非病原性プラスミド変異体。
  13. 前記誘導体が、配列番号１１２により示される配列に対して少なくとも８５％のアミノ酸配列同一性を有するｖｉｒＤ２タンパク質をコードする、請求項１１または１２に記載の非病原性プラスミド変異体。
  14. 植物細胞感染および形質転換に必要な生来型の病原性ｐＲｉ２６５９またはその誘導体の配列を含むが、毛状根表現型を媒介するＴ−ＤＮＡの配列は欠損している、請求項１１または１３に記載の非病原性プラスミド変異体。
  15. 境界領域を含むＴ−ＤＮＡ全体が生来型のプラスミドから欠失している、請求項１１〜１４のいずれか１項に記載の非病原性プラスミド変異体。
  16. 前記欠失したＴ−ＤＮＡが、配列番号４の塩基５３８付近から塩基１５５１９付近までの配列または配列番号２６の塩基３６４４付近から塩基１８５７７付近までの配列により示される配列に対応する、請求項１１〜１５のいずれか１項に記載の非病原性プラスミド変異体。
  17. ５×ＳＳＰＥ、１％ＳＤＳ、５×デンハルト試薬および１００μｇ／ｍＬの変性サケ精子ＤＮＡからなる溶液中、６８℃での結合またはハイブリダイゼーションと、それに続く、０．１×ＳＳＰＥおよび０．１％ＳＤＳを含む溶液中、６８℃での洗浄と等価の高ストリンジェンシーの条件下で、病原性アグロバクテリウム株Ｋ５９９（ＮＣＰＰＢ ２６５９）の生来型の病原性ＲｉプラスミドｐＲｉ２６５９の全体とハイブリダイズするが、該高ストリンジェンシーの条件下で、配列番号４により示される配列の塩基５３８付近から塩基１５５１９付近までの配列または配列番号２６により示される配列の塩基３６４４付近から塩基１８５７７付近までの配列とはハイブリダイズしない、請求項１１〜１６のいずれか１項に記載の非病原性プラスミド変異体。
  18. 前記ｐＲｉ２６５９の誘導体が、植物細胞への土壌細菌からのＴ−ＤＮＡの移入を媒介することができ、
    ａ） 生来型ｐＲｉ２６５９プラスミド（アグロバクテリウム株Ｋ５９９（ＮＣＰＰＢ ２６５９に含まれるものと同様）をコードするＤＮＡに対して少なくとも９０％の配列同一性を有すること、または
    ｂ） ５×ＳＳＰＥ、１％ＳＤＳ、５×デンハルト試薬および１００μｇ／ｍＬの変性サケ精子ＤＮＡからなる溶液中、６８℃での結合またはハイブリダイゼーションと、それに続く、０．１×ＳＳＰＥおよび０．１％ＳＤＳを含む溶液中、６８℃での洗浄と等価の高ストリンジェンシーの条件下で、生来型ｐＲｉ２６５９プラスミドとハイブリダイズすること
    によりさらに特徴付けられるプラスミドである、請求項１１〜１７のいずれか１項に記載の非病原性プラスミド変異体。
  19. アグロバクテリウム・リゾゲネス（Agrobacterium rhizogenes）ｐＲｉ２６５９プラスミド由来の少なくとも１つのＴ−ＤＮＡ境界領域がつなげられ、毛状根表現型を引き起こす配列を含まない、トランスジェニックＴ−ＤＮＡ。
  20. 前記境界配列が配列番号１８または１９により示されるものである、請求項１９に記載のトランスジェニックＴ−ＤＮＡ。
  21. 前記トランスジェニックＴ−ＤＮＡが、前記植物に、農学上有益な形質または少なくとも１つのマーカー遺伝子を付与するための少なくとも１つの発現カセットを含み、該マーカー遺伝子は、形質転換された植物体、植物細胞もしくは組織の選択および／または特定を可能にするものである、請求項１９または２０に記載のトランスジェニックＴ−ＤＮＡ。
  22. 請求項１９〜２１のいずれか１項に記載のトランスジェニックＴ−ＤＮＡを含んでなるトランスジェニックベクター。
  23. 請求項１０に記載のヌクレオチド配列、請求項１１〜１８のいずれか１項に記載の非病原性プラスミド変異体、請求項１９〜２１のいずれか１項に記載のトランスジェニックＴ−ＤＮＡ、もしくは請求項２２に記載のトランスジェニックベクターを含んでなる細胞または非ヒト生物。
  24. 細菌、酵母、植物、哺乳動物、および昆虫からなる群より選択される、請求項２３に記載の細胞または非ヒト生物。
  25. リゾビウム科（genes Rhizobiaceae）の土壌細菌である、請求項２３または２４に記載の細胞または非ヒト生物。
  26. 植物細胞に感染可能であるが、毛状根表現型誘発性を欠損している、アグロバクテリウム株Ｋ５９９（ＮＣＰＰＢ ２６５９）またはその誘導体の非病原性変異株。
  27. 植物細胞に感染可能であるが、毛状根表現型誘発性を欠損しており、さらにトランスジェニックＴ−ＤＮＡを含んでなる、アグロバクテリウム株Ｋ５９９（ＮＣＰＰＢ ２６５９）またはその誘導体のトランスジェニック非病原性変異株。
  28. 植物細胞に感染可能であり、植物細胞へのＴ−ＤＮＡの移入を媒介することが可能であり、かつ植物ゲノムへのＴ−ＤＮＡの挿入を媒介することが可能であるが、毛状根表現型誘発性を欠損している、請求項２６または２７に記載の非病原性変異株。
  29. 前記アグロバクテリウム株Ｋ５９９（ＮＣＰＰＢ ２６５９）の誘導体が、土壌の植物病原性細菌であって、配列番号５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、および１４により示される配列モチーフからなる群より選択される少なくとも１つの配列モチーフを含む１６Ｓ−２３Ｓ ｒＲＮＡ遺伝子間配列により特徴付けられる、請求項２６〜２８のいずれか１項に記載の非病原性変異株。
  30. ＲｉプラスミドｐＲｉ２６５９またはその誘導体の非病原性プラスミド変異体を含んでなる、請求項２６〜２９のいずれか１項に記載の非病原性変異株。
  31. 前記非病原性プラスミド変異体が請求項１１〜１８のいずれか１項に記載のものである、請求項３０に記載の非病原性変異株。
  32. 突然変異型もしくはキメラ型ｖｉｒＡまたはｖｉｒＧ遺伝子の存在あるいは強毒性プラスミドの存在からなる群より選択される１以上の特徴をさらに含む、請求項２５〜３１のいずれか１項に記載の非病原性変異株。
  33. 以下のもの：
    ａ） 配列番号１１２により示される配列またはそのうちの少なくとも２００個の連続したアミノ酸からなる配列、
    ｂ） 配列番号１１２により示される配列に対して少なくとも８５％の配列同一性を有する配列
    からなる群より選択されるアミノ酸配列を含むポリペプチド。
  34. 以下のもの：
    ａ） 配列番号２５、２６、２７、２８、２９、３０、３１、３２、３３、３４、３５、３６、３７、３８、３９、４０、４１、４２、４３、４４、４５、４６、４７、４８、４９、５０、５１、５２、５３、５４、５５、５６、５７、５８、５９、６０、６１、６２、６３、６４、６５、６６、６７、６８、６９、７０、７１、７２、７３、７４、７５、７６、７７、７８、７９、８０、８１、８２、８３、８４、８５、８６、８７、８８、８９、９０、９１、９２、９３、９４、９５、９６、９７、９８、９９、１００、１０１、１０２、１０３、１０４、１１４、１１５、１１６、１１７、１１８、１１９、１２０、１２１、１２２、１２３、１２４、１２６、１２８、１２９、１３０、１３１、１３２、１３３、１３４、１３６、１３７、１３９、１４０、１４２、１４３、１４４、１４５、１４６、１４７、１４８、１４９、１５０、１５１、１５２、１５４、１５５、１５６、１５８、１５９、１６１、１６２、１６３、１６４、１６５、１６６、１６７、１６８、１６９、１７０、１７１、１７２、１７３、１７４、１７５、１７６、１７７、１７８、１７９、１８０、１８１、１８２、１８３、１８４、１８５、１８６、もしくは１８７のいずれか１つにより示される配列またはそのうちの少なくとも２００個の連続したアミノ酸からなる配列、
    ｂ） 配列番号２５、２６、２７、２８、２９、３０、３１、３２、３３、３４、３５、３６、３７、３８、３９、４０、４１、４２、４３、４４、４５、４６、４７、４８、４９、５０、５１、５２、５３、５４、５５、５６、５７、５８、５９、６０、６１、６２、６３、６４、６５、６６、６７、６８、６９、７０、７１、７２、７３、７４、７５、７６、７７、７８、７９、８０、８１、８２、８３、８４、８５、８６、８７、８８、８９、９０、９１、９２、９３、９４、９５、９６、９７、９８、９９、１００、１０１、１０２、１０３、１０４、１１４、１１５、１１６、１１７、１１８、１１９、１２０、１２１、１２２、１２３、１２４、１２６、１２８、１２９、１３０、１３１、１３２、１３３、１３４、１３６、１３７、１３９、１４０、１４２、１４３、１４４、１４５、１４６、１４７、１４８、１４９、１５０、１５１、１５２、１５４、１５５、１５６、１５８、１５９、１６１、１６２、１６３、１６４、１６５、１６６、１６７、１６８、１６９、１７０、１７１、１７２、１７３、１７４、１７５、１７６、１７７、１７８、１７９、１８０、１８１、１８２、１８３、１８４、１８５、１８６、または１８７のいずれか１つにより示される配列に対して少なくとも８５％の配列同一性を有する配列
    からなる群より選択されるアミノ酸配列を含むポリペプチド。
  35. 請求項３３または３４に記載のポリペプチドをコードする配列を含むヌクレオチド配列。
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