CN107709551A

CN107709551A - 无t‑dna整合的农杆菌介导的基因组修饰

Info

Publication number: CN107709551A
Application number: CN201680019773.1A
Authority: CN
Inventors: T·斯托达德; N·J·巴特斯; 罗松
Original assignee: Cellectis SA
Current assignee: Cellectis SA
Priority date: 2015-02-02
Filing date: 2016-02-02
Publication date: 2018-02-16
Also published as: EP3253877A1; AU2016214048A1; WO2016125078A1; US20160222395A1; CA2975709A1; JP2018508203A

Abstract

本文描述用于基因组工程改造的方法，包括采用修饰的转移DNA(T‑DNA)质粒利用核酸酶的瞬时表达的方法。

Description

无T-DNA整合的农杆菌介导的基因组修饰

相关申请的交叉引用

本申请要求2015年2月2日提交的美国临时申请系列号62/110,735的优先权，其通过引用其全文纳入本文。

技术领域

本发明涉及用于基因组工程改造的方法，包括通过利用修饰的转移DNA(T-DNA)质粒的核酸酶的瞬时表达进行基因组工程改造的方法。

技术背景

革兰氏阴性细菌类的农杆菌(Agrobacterium)利用水平基因转移来造成植物中的肿瘤生成，其通过大肿瘤诱导型(Ti)或根系发生(Ri)质粒将转移DNA(T-DNA)引入植物基因组来进行。为了具有毒力，农杆菌必须包含具有T-DNA和将该T-DNA转移至植物细胞并将其整合进入染色体DNA所需的全部基因的Ti或Ri质粒。尽管Ti和Ri质粒均存在多种变化形式，在天然产生的菌株中常见几种特征：毒力基因、复制起点、冠瘿碱(opine)分解代谢基因、右边界(RB)序列、左边界(LB)序列，和转移DNA(T-DNA)区域。毒力基因和边界序列允许农杆菌通过IV型分泌系统(TIVSS)将所述T-DNA转移进入植物细胞。一旦T-DNA被转化进入植物细胞，其能够在农杆菌毒力蛋白的协助下整合进入宿主基因组。该整合的T-DNA可包含致癌基因和冠瘿碱合成基因，其允许增加冠瘿碱的产量，该物质作为农杆菌的碳源和氮源。Ti和Ri质粒在核苷酸水平上显著不同，而所述质粒可在根癌农杆菌(A.tumefaciens)和毛根农杆菌(A.rhizogenes)之间互换，因此使所述细菌具有指示其所包含的Ti或Ri质粒的新病原性特征。农杆菌T-DNA可被修饰并用于二元载体系统，其中，毒力基因和T-DNA在分开的质粒上。该策略已被用于将新基因引入植物基因组(参见例如，Lee和Gelvin，Plant Physiol146：325-332，2008)。认为Ti或Ri质粒上的毒力基因和许多农杆菌染色体基因是整合机制所必需的。然而，整合机制尚未被完全阐明。

发明内容

本文部分基于如下发现：农杆菌介导的转化可用于植物细胞中序列特异性核酸酶的瞬时表达，以产生非转基因的遗传修饰的植物。例如，农杆菌可用于将编码所需核酸酶基因的T-DNA引入植物细胞，以允许核酸酶在无T-DNA整合的情况下表达。所述核酸酶的瞬时表达可导致定点基因组修饰，使得对所选植物物种的准确工程改造成为可能。这可消除对于后续回交以移除通过传统农杆菌转化整合的外来DNA的需求，减少了调控方面的问题，并加快了推向市场的速度。

本文特别提供一种在植物细胞中瞬时表达多肽的方法。所述方法可包括：将包含T-DNA区域的修饰的Ti、Ri或T-DNA质粒引入植物细胞，所述T-DNA区域包括：(a)T-DNA边界序列，和(b)包含5′启动子区域的多肽编码序列、编码多肽的结构编码序列，和编码聚腺苷酸化信号的3′非翻译区域，其中所述5′启动子区域和所述3′非翻译区域操作性地连接至所述结构编码序列，从而所述多肽编码序列在所述植物细胞中瞬时表达且不整合进入所述植物细胞的基因组。例如，所述方法可包括，将抑制整合的T-DNA(iiT-DNA)质粒引入细胞，所述抑制整合的T-DNA(iiT-DNA)质粒对应于Ti、Ri和T-DNA质粒，其已通过移除或失活至少一个T-DNA边界而被修饰的，从而减少所得iiT-DNA的整合。在一些实施方式中，修饰的Ti质粒、Ri质粒或T-DNA质粒的LB被移除或失活，从而破坏了T-DNA向植物基因组中的整合。修饰的Ti、Ri或T-DNA质粒可具有至少一个非功能性的T-DNA边界序列(例如，可仅具有一个功能性T-DNA边界序列，或可没有功能性T-DNA边界序列)。在一些实施方式中，一旦该iiT-DNA进入植物细胞，则使iiT-DNA质粒的RB(不含LB或失活的LB)成为可移除的或失活的，从而进一步破坏T-DNA整合。在所述实施方式中，所述质粒在本文中称为可移除的右边界iiT-DNA(RRBiiT-DNA)质粒。如本文所述，RRBiiT-DNA可通过切点罕见核酸内切酶移除RB序列来获得。一般而言，切点罕见核酸内切酶可由修饰的Ti、Ri或T-DNA质粒中包含的T-DNA序列中包括的结构编码序列之一编码。

本发明还提供一种在无T-DNA整合的情况下，采用如本文所述的修饰的Ti、Ri或T-DNA质粒在植物细胞中进行基因编辑的方法，其中切点罕见核酸内切酶从所述质粒瞬时表达。所述切点罕见核酸内切酶可导向针对植物基因组中的特定基因座，从而其作用可导致位于该特定基因座处的遗传序列的突变、修饰或修复。

在一些实施方式中，方法可包括向所述细胞引入(或使细胞接触)能够进行水平基因转移的生物体，其中所述生物体包含所述修饰的Ti、Ri或T-DNA质粒。在本文提供的方法中，所述能够进行水平基因转移的生物体可以是细菌(例如，农杆菌)。T-DNA边界序列可来自农杆菌。上述iiT-DNA边界序列可以是T-DNA RB序列(例如，来自真蛸碱Ti质粒、胭脂碱Ti质粒或农杆碱Ti质粒的RB序列)。iiT-DNA边界序列可以是Ti或Ri质粒中的多肽编码序列的5′。5′启动子区域可天然存在于植物细胞中，或可能能够天然进入植物细胞。所述5′启动子区域可包括组成型启动子，或所述5′启动子区域可包括诱导型启动子，并且所述方法还可包括诱导所述启动子。多肽编码序列可编码切点罕见核酸内切酶或切点罕见核酸内切酶亚基。切点罕见核酸内切酶可以是转录激活因子样(TAL)效应物核酸内切酶(也称为TALE核酸酶或)、锌指核酸酶、大范围核酸酶，或可编程的RNA导向的核酸内切酶。所述切点罕见核酸内切酶的瞬时表达可导致定点诱变。所述修饰的Ti、Ri或T-DNA质粒可包含报告基因，其采用所述结构编码序列瞬时表达。报告基因的表达可导致视觉信号或抗生素抗性。T-DNA区域还可包括供体序列。供体序列向所述细胞的瞬时递送可导致基因靶向。

所述T-DNA区域还可包含第二多肽编码序列，其具有5′启动子区域、编码第二多肽的结构编码序列，和编码聚腺苷酸化信号的3′非翻译区域，其中所述5′启动子区域和所述3′非翻译区域操作性地连接至所述结构编码序列，从而第二多肽编码序列在所述植物细胞中瞬时表达且不整合进入所述植物细胞的基因组。第二多肽编码序列的5′启动子区域可天然存在于植物细胞或可能能够天然进入植物细胞。所述5′启动子区域可包括组成型启动子，或所述5′启动子区域可包括诱导型启动子，并且所述方法还可包括诱导所述启动子。所述多肽编码序列可编码切点罕见核酸内切酶(例如，TAL效应物核酸内切酶、锌指核酸酶、大范围核酸酶，或可编程的RNA导向的核酸内切酶)或切点罕见核酸内切酶亚基，并且第二多肽编码序列可编码切点罕见核酸内切酶或切点罕见核酸内切酶亚基。所述切点罕见核酸内切酶或切点罕见核酸内切酶亚基的瞬时表达可导致定点诱变。

所述T-DNA还可包含重复且反向的序列。例如，所述T-DNA可在该T-DNA边界序列的约1000核苷酸之内包括重复且反向的序列，例如该T-DNA边界序列的约500～1000核苷酸之内、该T-DNA边界序列的约250～500核苷酸之内，或该T-DNA边界序列的约1～500核苷酸之内。在一些实施方式中，所述重复且反向的序列可位于边界序列处，从而该重复的序列包含边界(例如，边界因突变而变得非功能性)和其它T-DNA。在一些实施方式中，该重复且反向的序列可与所述边界序列毗连，但不包括所述边界序列。在这两种情况中，所述重复且反向的序列可促进线性T-DNA分子的一端处的茎-环结构的形成。

在另一个方面，本文涉及一种生成植物的方法。所述方法可包括：(a)提供根据如下方法获得的植物细胞，所述方法包括，将能够进行水平基因转移的生物体引入易感植物细胞，其中所述生物体包含含有T-DNA区域的修饰的Ti、Ri或T-DNA质粒，所述T-DNA区域包括(i)T-DNA边界序列，和(ii)包含5′启动子区域的多肽编码序列、编码多肽的结构编码序列，和编码聚腺苷酸化信号的3′非翻译区域，其中所述5′启动子区域和所述3′非翻译区域操作性地连接至所述结构编码序列，从而所述多肽编码序列在所述植物细胞中瞬时表达且不整合进入所述植物细胞的基因组，并且其中，所述多肽编码序列编码切点罕见核酸内切酶或切点罕见核酸内切酶亚基，和(b)使所述植物细胞再生成植物。再生的植物可包含由所述切点罕见核酸内切酶的瞬时表达产生的一个或多个突变。

在另一个方面，本文涉及一种生成植物的方法。所述方法可包括：(a)提供根据如下方法获得的植物细胞，所述方法包括，向易感植物细胞引入能够进行水平基因转移的生物体，其中所述生物体包含含有T-DNA区域的修饰的Ti、Ri或T-DNA质粒，所述T-DNA区域包括(i)T-DNA边界序列、(ii)包含5′启动子区域的多肽编码序列、编码多肽的结构编码序列，和编码聚腺苷酸化信号的3′非翻译区域，其中所述5′启动子区域和所述3′非翻译区域操作性地连接至所述结构编码序列，和(iii)包含5′启动子区域的第二多肽编码序列、编码第二多肽的结构编码序列，和编码聚腺苷酸化信号的3′非翻译区域，其中所述5′启动子区域和所述3′非翻译区域操作性地连接至所述结构编码序列，从而所述多肽编码序列在所述植物细胞中瞬时表达且不整合进入所述植物细胞的基因组，并且其中，所述多肽编码序列编码切点罕见核酸内切酶或切点罕见核酸内切酶亚基，并且第二多肽编码序列可编码切点罕见核酸内切酶或切点罕见核酸内切酶亚基，和(b)使所述植物细胞再生成植物。再生的植物可包含由所述切点罕见核酸内切酶或切点罕见核酸内切酶亚基的瞬时表达产生的一个或多个突变。

在另一方面，本文提供在植物细胞中瞬时表达多肽的方法，其中所述方法包括将能够进行水平基因转移的生物体引入植物细胞，其中所述生物体包含具有T-DNA区域的修饰的Ti、Ri或T-DNA质粒，所述T-DNA区域包括：(a)T-DNA边界序列，(b)切点罕见核酸内切酶的靶位点，和(c)包括5′启动子区域的多肽编码序列、编码多肽的结构编码序列，和编码聚腺苷酸化信号的3′非翻译区域，其中所述5′启动子区域和所述3′非翻译区域操作性地连接至所述结构编码序列，从而所述多肽编码序列在所述植物细胞中瞬时表达且不整合进入所述植物细胞的基因组。能够进行水平基因转移的生物体可以是细菌(例如，农杆菌)。T-DNA边界序列可来自农杆菌。T-DNA边界序列可以是T-DNA右边界序列。T-DNA边界序列可来自真蛸碱Ti质粒、胭脂碱Ti质粒，或农杆碱Ti质粒。T-DNA边界序列可以是Ti或Ri质粒中的多肽编码序列的5′。5′启动子区域可天然存在于植物细胞中，或可能能够天然进入植物细胞。所述5′启动子区域可包括组成型启动子，或所述5′启动子区域可包括诱导型启动子，并且所述方法还可包括诱导所述启动子。所述多肽编码序列可编码切点罕见核酸内切酶或切点罕见核酸内切酶亚基(例如，TAL效应物核酸内切酶、锌指核酸酶、大范围核酸酶，或可编程的RNA导向的核酸内切酶)。所述切点罕见核酸内切酶的瞬时表达可导致定点诱变。

在另一方面，本文提供在植物细胞中瞬时表达多肽的方法，其中所述方法包括：使植物细胞接触能够进行水平基因转移的生物体，其中所述生物体包含具有T-DNA区域的修饰的Ti、Ri或T-DNA质粒，所述T-DNA区域包括(a)T-DNA边界序列，和(b)包括5′启动子区域的多肽编码序列、编码所述多肽的结构序列，和包含聚腺苷酸化信号的3′非翻译区域，其中所述5′启动子区域和所述3′非翻译区域操作性地连接至所述结构编码序列。该T-DNA还可包括(c)切点罕见核酸内切酶的靶位点。所述多肽编码序列可编码切点罕见核酸内切酶或切点罕见核酸内切酶亚基，其在其靶位点(例如，在所述T-DNA中包含的靶位点)处特定地识别并切割DNA。例如，所述切点罕见核酸内切酶的表达可导致所述切点罕见核酸内切酶靶位点的双链断裂，移除T-DNA边界。不受具体理论限制，T-DNA边界的移除也可引起共价接合至该靶位点的蛋白质的移除，这可能会驱使T-DNA随机插入植物染色体DNA。

所述修饰的Ti、Ri或T-DNA质粒还可包括与结构编码序列瞬时表达的报告基因。报告基因的表达可导致视觉信号或抗生素抗性。在一些实施方式中，由所述T-DNA中包括的多肽编码序列编码的相同切点罕见核酸内切酶能够同时切割位于该T-DNA质粒中的切点罕见核酸内切酶靶序列和所述植物基因组中的基因组靶DNA。

所述T-DNA区域还可包含第二多肽编码序列，其具有5′启动子区域、编码第二多肽的结构编码序列，和编码聚腺苷酸化信号的3′非翻译区域，其中所述5′启动子区域和所述3′非翻译区域操作性地连接至所述结构编码序列，从而第二多肽编码序列在所述植物细胞中瞬时表达且不整合进入所述植物细胞的基因组。第二多肽编码序列的5′启动子区域可天然存在于植物细胞或可能能够天然进入植物细胞。所述5′启动子区域可包括组成型启动子，或所述5′启动子区域可包括诱导型启动子，并且所述方法还可包括诱导所述启动子。所述多肽编码序列可编码切点罕见核酸内切酶或切点罕见核酸内切酶亚基，并且第二多肽编码序列可编码切点罕见核酸内切酶或切点罕见核酸内切酶亚基。所述切点罕见核酸内切酶可以是TAL效应物核酸内切酶、锌指核酸酶、大范围核酸酶，或可编程的RNA导向的核酸内切酶。所述切点罕见核酸内切酶或切点罕见核酸内切酶亚基的瞬时表达可导致定点诱变。

所述方法还可包括将能够进行水平基因转移的第二生物体引入所述植物细胞，其中第二生物体包含具有T-DNA区域的修饰的Ti、Ri或T-DNA质粒，所述T-DNA区域包括T-DNA边界序列、包含5′启动子区域的第二多肽编码序列、编码多肽的结构编码序列，和编码聚腺苷酸化信号的3′非翻译区域，其中所述5′启动子区域和所述3′非翻译区域操作性地连接至所述结构编码序列，从而第二多肽编码序列在所述植物细胞中瞬时表达且不整合进入所述植物细胞的基因组。第二生物体在第一生物体的五天内被引入所述植物细胞。所述多肽编码序列的5′启动子区域和第二多肽编码序列的5′启动子区域可天然存在于植物细胞中，或可能能够天然进入植物细胞。所述5′启动子区域可包括组成型启动子，或所述5′启动子区域可包括诱导型启动子，并且所述方法还可包括诱导所述启动子。所述多肽编码序列可编码切点罕见核酸内切酶或切点罕见核酸内切酶亚基，并且第二多肽编码序列可编码切点罕见核酸内切酶或切点罕见核酸内切酶亚基。所述切点罕见核酸内切酶可以是TAL效应物核酸内切酶、锌指核酸酶、大范围核酸酶，或可编程的RNA导向的核酸内切酶。所述切点罕见核酸内切酶或切点罕见核酸内切酶亚基的瞬时表达可导致定点诱变。所述切点罕见核酸内切酶或切点罕见核酸内切酶亚基的表达可导致所述切点罕见核酸内切酶靶位点的双链断裂，移除第一T-DNA边界和共价接合的蛋白质。T-DNA区域还可包括供体序列。供体序列向所述细胞的瞬时递送可导致基因靶向。

所述方法还可包括：将能够进行水平基因转移的第二生物体引入所述植物细胞，其中第二生物体包含具有T-DNA区域的修饰的Ti、Ri或T-DNA质粒，所述T-DNA区域包括T-DNA边界序列、包含5′启动子区域的第二多肽编码序列、编码多肽的结构编码序列，和编码聚腺苷酸化信号的3′非翻译区域，其中所述5′启动子区域和所述3′非翻译区域操作性地连接至所述结构编码序列；和包含5′启动子区域的第三多肽编码序列、编码多肽的结构编码序列，和编码聚腺苷酸化信号的3′非翻译区域，其中所述5′启动子区域和所述3′非翻译区域操作性地连接至所述结构编码序列，从而第二和第三多肽编码序列在所述植物细胞中瞬时表达且不整合进入所述植物细胞的基因组。第二生物体在第一生物体的五天内被引入所述植物细胞。第二多肽编码序列可编码切点罕见核酸内切酶或切点罕见核酸内切酶亚基，并且第三多肽编码序列编码切点罕见核酸内切酶或切点罕见核酸内切酶亚基。所述切点罕见核酸内切酶可以是TAL效应物核酸内切酶、锌指核酸酶、大范围核酸酶，或可编程的RNA导向的核酸内切酶。所述切点罕见核酸内切酶或切点罕见核酸内切酶亚基的瞬时表达可导致定点诱变。T-DNA区域还可包括供体序列。供体序列的瞬时递送可导致基因靶向。所述切点罕见核酸内切酶或切点罕见核酸内切酶亚基的表达可导致所述切点罕见核酸内切酶靶位点的双链断裂，移除第一T-DNA边界和共价接合的蛋白质。

在另一方面，本文提供用于产生植物的方法，其中所述方法包括：(a)提供根据如下方法获得的植物细胞，所述方法包括，将能够进行水平基因转移的生物体引入植物细胞，其中所述生物体包含具有T-DNA区域的修饰的Ti、Ri或T-DNA质粒，所述T-DNA区域包括，(i)T-DNA边界序列、(ii)切点罕见核酸内切酶的靶位点，和(iii)包含5′启动子区域的多肽编码序列、编码多肽的结构编码序列，和编码聚腺苷酸化信号的3′非翻译区域，其中所述5′启动子区域和所述3′非翻译区域操作性地连接至所述结构编码序列，从而所述多肽编码序列在所述植物细胞中瞬时表达且不整合进入所述植物细胞的基因组，并且其中，所述多肽编码序列编码切点罕见核酸内切酶或切点罕见核酸内切酶亚基，和(b)使所述植物细胞再生成植物。再生的植物可包含由所述切点罕见核酸内切酶的瞬时表达产生的一个或多个突变。

在另一方面中，本文提供用于产生植物的方法，其中所述方法包括：(a)提供根据如下方法获得的植物细胞，所述方法包括，将能够进行水平基因转移的生物体引入植物细胞，其中所述生物体包含具有T-DNA区域的修饰的Ti、Ri或T-DNA质粒，所述T-DNA区域包括(i)T-DNA边界序列、(ii)切点罕见核酸内切酶的靶位点、(iii)包含5′启动子区域的多肽编码序列、编码多肽的结构编码序列，和编码聚腺苷酸化信号的3′非翻译区域，其中所述5′启动子区域和所述3′非翻译区域操作性地连接至所述结构编码序列，和(iv)包含5′启动子区域的第二多肽编码序列、编码第二多肽的结构编码序列，和编码聚腺苷酸化信号的3′非翻译区域，其中所述5′启动子区域和所述3′非翻译区域操作性地连接至所述结构编码序列，从而所述多肽编码序列在所述植物细胞中瞬时表达且不整合进入所述植物细胞的基因组，并且其中，所述多肽编码序列编码切点罕见核酸内切酶或切点罕见核酸内切酶亚基，和第二多肽编码序列编码切点罕见核酸内切酶或切点罕见核酸内切酶亚基，和(b)使所述植物细胞再生成植物。再生的植物可包含由所述切点罕见核酸内切酶或切点罕见核酸内切酶亚基的瞬时表达产生的一个或多个突变。

本发明的特征还在于包含T-DNA区域的修饰的Ti、Ri或T-DNA质粒，所述T-DNA区域包括(a)一个T-DNA边界序列，和(b)编码切点罕见核酸内切酶或一种或多种切点罕见核酸内切酶亚基的多核苷酸序列，其操作性地连接至在植物细胞中诱导的启动子。T-DNA可包含重复且反向的序列(例如，与所述边界序列毗连的重复且反向的序列)。所述切点罕见核酸内切酶或切点罕见核酸内切酶亚基可来自TAL效应物核酸内切酶、锌指核酸酶、大范围核酸酶，或可编程的RNA导向的核酸内切酶。所述修饰的Ti、Ri或T-DNA质粒还可包含切点罕见核酸内切酶的靶位点，其中所述靶位点在所述T-DNA边界序列的下游。

此外，本文提供包括本文提供的修饰的Ti、Ri或T-DNA质粒的制品。

本发明还提供包括本文提供的修饰的Ti、Ri或T-DNA质粒的组合物。

此外，本文提供用本文提供的修饰的Ti、Ri或T-DNA质粒转化的分离的宿主细胞。

除非另外定义，本文使用的所有技术和科学术语的意义与本发明所属领域普通技术人员通常所理解的相同。虽然与本文所述类似或等同的方法和材料可用来实施本发明，但在下文描述合适的方法和材料。本文中述及的所有出版物、专利申请、专利和其他参考文献都通过引用全文纳入本文。在抵触的情况下，以本说明书(包括定义在内)为准。此外，材料、方法和实施例都仅是说明性的，并不意在构成限制。

在附图和以下描述中详细说明了本发明的一种或多种实施方式。本发明的其他特征、目的和优势通过描述、附图以及权利要求书将是显而易见的。

附图说明

图1是pCAMBIA-1300载体的示意图。

图2是合成的盒的示意图。

图3是包含两个ALS2_T1 TALE核酸酶亚基的iiT-DNA质粒的示意图。

图4是iiT-DNA质粒的图示，在T-DNA边界具有重复且反向的序列。还显示具有预期的发夹结构的单链和双链线性TDNA分子。

图5是显示ALS2_T1 TALE核酸酶亚基在通过农杆菌渗入法被递送至本氏烟(Nicotiana benthamiana)叶子之后的诱变频率的凝胶图像。采用iiT-DNA或常规T-DNA将TALE核酸酶亚基递送至植物细胞。

图6是RRBiiT-DNA质粒的示意图，其包含两个ALS2_T1 TALE核酸酶亚基，和RB序列附近的ALS2 TALEN靶位点。

发明详述

遗传修饰的作物提供了开发新植物品种的途径，其能够在环境和农业约束下茁壮成长，从而使在投入上回报的能量最优化。转基因植物通常通过插入外来遗传物质来生成，但所述方法可能需要在公共应用得到批准之前进行长期费力的监管步骤。本文所述的材料和方法可用于产生非转基因的遗传修饰的植物，因此避免了用于公共应用的审批所需的至少一些监管步骤。一般而言，本文所述的方法涉及通过农杆菌进行的所需核酸(例如，编码核酸酶或其亚基的核酸)的瞬时表达，所述农杆菌提供在无外来核酸的整合的情况下允许基因组工程改造的递送系统。

若需要被转移进入植物细胞，T-DNA一般首先从环状Ti或Ri质粒加工。VirD1/D2复合物结合至并在Ti或Ri DNA的T-DNA的LB和RB序列处生成缺口。这些边界序列通常长约25bp，并且在正向取向上重复，侧接Ti或Ri质粒的T-DNA区域(参见例如，Wang等，Cell 38：455-462，1984)。在自然中存在的生物变种中，界定T-DNA区域的右边界和左边界共有低同源性程度，其中差异最大的边界共有约50％的序列相同性，不过有些共有约80％或更高(例如，约90％或约95％)序列相同性。一般而言，T-DNA边界包括10-13个核苷酸，有些包含保守CAGGATATAT(SEQ ID NO：13)共有序列，如表1中所示(还参见，Slightom等，EMBO J 4(12)：3069-3077，1985)。

如下所述测定特定核酸或氨基酸序列与特定序列识别号所指示的序列之间的序列相同性百分比。首先，使用来自含有BLASTN版本2.0.14和BLASTP版本2.0.14的BLASTZ独立版本的BLAST 2序列(Bl2seq)程序比较核酸或氨基酸序列与特定序列识别号所指示的序列。该BLASTZ独立版本可在fr.com/blast或ncbi.nlm.nih.gov在线获取。解释如何使用Bl2seq程序的说明书可参见BLASTZ附带的自述文件。Bl2seq使用BLASTN或BLASTP算法在两条序列之间进行比较。BLASTN用于比较核酸序列，而BLASTP用于比较氨基酸序列。为比较两条核酸序列，如下所述设置选项：-i设为含有待比较的第一核酸序列的文件(如C：\seq1.txt)；-j设为含有待比较的第二核酸序列的文件(如C：\seq2.txt)；-p设为blastn；-o设为任何需要的文件名(如C：\output.txt)；-q设为-1；-r设为2；且所有其他选项都设为其默认设置。例如，以下命令可用于生成含有两条序列之间比较的输出文件：C：\Bl2seq-ic：\seq1.txt-j c：\seq2.txt-p blastn-o c：\output.txt-q-1-r 2。为比较两条氨基酸序列，如下所述设置Bl2seq的选项：-i设为含有待比较的第一氨基酸序列的文件(如C：\seq1.txt)；-j设为含有待比较的第二氨基酸序列的文件(如C：\seq2.txt)；-p设为blastp；-o设为任何需要的文件名(如C：\output.txt)；且所有其他选项都设为其默认设置。例如，以下命令可用于生成含有两条氨基酸序列之间比较的输出文件：C：\Bl2seq-ic：\seq1.txt-j c：\seq2.txt-p blastp-o c：\output.txt。如果两条比较的序列具有同源性，则指定的输出文件会以经比对序列的形式显示那些同源区域。如果比较的两条序列不具有同源性，则指定的输出文件不会显示经比对的序列。

一旦进行比对，即通过对两条序列中存在相同核苷酸或氨基酸的位置的数目进行计数来确定匹配的数目。将匹配的数目除以鉴定的序列(如SEQ ID NO：1)中所列序列长度或连接的长度(如来自鉴定的序列中所列序列的100个连续核苷酸或氨基酸残基)，随后将结果值乘以100，从而确定序列相同性百分比。例如，与SEQ ID NO：1中所列序列比对时具有23个匹配的核酸序列与SEQ ID NO：1中所列序列具有92％相同性(即23÷25x 100＝92)。应注意序列相同性百分比值四舍五入至小数点后第一位。例如，75.11、75.12、75.13和75.14向下四舍五入至75.1，而75.15、75.16、75.17、75.18和75.19向上四舍五入至75.2。还应注意，长度值始终是整数。

如本文所述，Ti或Ri质粒可以是包含T-区域和将T-DNA从该细菌输出至植物细胞所必需的毒力基因的单一质粒。在一些实施方式中，Ti或Ri质粒可以是T-DNA二元-载体系统，其包括两个质粒：(i)辅助质粒，其包含T-DNA加工和转移至植物细胞所必需的毒力基因，和(ii)二元载体，其包含该T-区域。T-DNA二元载体在本文中称为T-DNA质粒。在一些实施方式中，Ti、Ri或T-DNA质粒可以是所述必需的毒力基因和T-区域之一或两者在农杆菌染色体DNA中的整合形式。

如本文所述，Ti、Ri或T-DNA质粒可通过移除或突变T-DNA边界(例如，左T-DNA边界)从而仅一个T-DNA边界具有功能性被转换成瞬时表达质粒。所述T-DNA边界的移除或突变消除了两个VirD1/VirD2核酸内切酶靶位点之一，因此抑制常规T链形成，其可导致完整质粒骨架向植物细胞的递送。

本文所用的术语“抑制整合的T-DNA(iiT-DNA)质粒”指已通过T-DNA边界的移除或突变被修饰从而抑制了T-DNA整合的Ti、Ri或T-DNA质粒。术语iiT-DNA指Ti、Ri或T-DNA质粒(其已通过T-DNA边界的移除或突变被修饰)中的T-DNA序列。在一些实施方式中，例如，可移除iiT-DNA的LB。

本文所用的术语“可移除的右边界iiT-DNA(RRBiiT-DNA)质粒”指Ti、Ri或T-DNA质粒，其已通过第一T-DNA边界(例如，LB)的移除或突变被修饰，并且已通过添加切点罕见核酸内切酶靶序列以移除第二边界(例如，RB)而被进一步修饰。在本文所述的材料和方法的一些实施方式中，待递送至植物细胞的T-DNA区域可包含单一功能性T-DNA边界序列，以及编码一种或多种感兴趣的多肽的一个或多个(例如，一个、两个、三个、四个、五个或多于五个)序列。因此，该T-DNA区域可包含可被VirD1/D2复合物产生缺口的一个且不多于一个T-DNA边界序列。应注意，T-DNA区域可包含非功能性的一个或多个其它T-DNA边界序列，从而它们无法被VirD1/D2复合物产生缺口。所述非功能性的T-DNA边界序列可通过例如天然产生的T-DNA边界序列的突变(例如，通过对表1中所示的保守区域中的序列进行取代或破坏)来产生。还注意到，非功能性T-DNA边界序列仍可被VirD1/D2复合物结合。不受具体机制限制，包含可被VirD1/D2复合物结合的多重T-DNA边界序列的T-DNA区域可被更有效地转移进入核。

功能性T-DNA边界序列可位于一个或多个多肽编码序列的5′，或一个或多个多肽编码序列的3′。在一些实施方式中，T-DNA边界和多肽编码序列可彼此紧贴。或者，T-DNA边界和多肽编码序列可被约3个-约2000个核苷酸(例如，约10-约1000个核苷酸、约10-约200个核苷酸，或约20-约100个核苷酸)的间隔物序列隔开。在一些实施方式中，当包括多重T-DNA边界序列(例如，多重RB序列)时，它们可成簇，从而它们全部在一个或多个多肽编码序列的5′或3′。然而，应注意，在一些实施方式中，T-DNA区域可在一个或多个多肽编码序列的一侧(例如，5′)包括功能性T-DNA边界序列，且在一个或多个多肽编码序列的另一侧(例如，3′)包括非功能性T-DNA边界序列。

在一些实施方式中，本文提供的修饰的Ti、Ri或T-DNA质粒中包含的T-DNA边界序列可以是RB序列。例如，T-DNA边界序列可以是来自根癌农杆菌(A.tumefaciens)或来自毛根农杆菌(A.rhizogenes)的RB序列。在一些实施方式中，T-DNA边界序列可以是来自根癌农杆菌(A.tumefaciens)真蛸碱Ti质粒的RB序列，来自根癌农杆菌(A.tumefaciens)胭脂碱Ti质粒的RB序列，或来自毛根农杆菌(A.rhizogenes)农杆碱Ti质粒的RB序列。代表性的T-DNA边界序列的列表示于表1。在一些实施方式中，功能性T-DNA边界序列可以是如表1所示的序列的变体，从而T-DNA边界序列相对于表1中所示的对应序列具有五个或更少(例如，五个、四个、三个、两个或一个)添加、减少或取代。再次注意到，位于某些位置的核苷酸在表1中所示的T-DNA序列集中是保守的，因此，位于那些位置的核苷酸通常被保留在本文所述的构建体的功能性T-DNA边界序列中。然而，在一些实施方式中，功能性T-DNA边界序列可在一个或两个保守位置具有突变，从而保留位于保守位置的至少80％(例如，至少80％或至少90％)的核苷酸。此外，非功能性T-DNA边界序列可在保守区域中包括突变，该突变导致丧失被VirD1/D2复合物产生缺口的能力。所述边界序列可在，例如，三个或更多个(例如，三个、四个、五个、六个、七个，或多于七个)保守位置包括突变。

表1

T-DNA边界序列

*指示在SEQ ID NOS：1-12中保守的核苷酸

多肽编码序列可包括编码感兴趣的多肽的结构编码序列，以及5′启动子区域和编码聚腺苷酸化信号的3′非翻译区域，其各自可被操作性地连接至结构编码序列。启动子是能够控制(起始)细胞中转录的DNA序列。在一些实施方式中，5′启动子区域可包括植物内源性的启动子序列，或能够天然进入植物细胞的启动子序列(例如，能够天然进入植物细胞的来自5′UTR的序列)。例如，启动子可以是“植物表达型启动子”，其能够控制植物细胞中的转录。这包括植物来源的启动子[例如，T-DNA基因启动子、发育特异性启动子、组织特异性启动子(例如，叶肉特异性启动子)、种子特异性启动子、组成型活性启动子(例如，Ubi1、Uep1或Act1)，或器官特异性启动子(例如，茎-、叶-、根-、管-、匍匐枝-、毛状体-、胚珠-、花药-、花粉-、花粉管-、萼片-，或雌蕊特异性启动子)]，以及能够引导植物细胞中的转录的非植物来源的启动子(例如，病毒或细菌来源的启动子，例如CaMV35S启动子)。“操作性地连接”至结构编码序列的启动子能有效控制该结构编码序列的表达。因此，如果RNA聚合酶能够将编码序列转录成RNA，那么结构编码序列在细胞中是“操作性地连接”并“受控于”该启动子的。

在一些实施方式中，结构编码序列可编码切点罕见核酸内切酶，或切点罕见核酸内切酶的部分(例如，亚基)。术语“切点罕见核酸内切酶”指天然或工程改造的蛋白质，其具有导向至包含识别序列(靶序列)的核酸序列的核酸内切酶活性，所述识别序列通常长约12-40bp(例如，长14-40bp；参见例如，Baker，Nature Methods 9：23-26，2012)。切点罕见核酸内切酶通常在其识别位点内部产生切割，形成与3′OH或5’OH突出端的2-4nt交错切口。此外，活性切点罕见核酸内切酶可以是多聚形式的或与辅助分子相联。因此，切点罕见核酸内切酶可由在靶核酸序列处提供核酸内切酶活性所需的单体亚基、辅助分子，或其组合组成。

切点罕见核酸内切酶包括，例如，大范围核酸酶，例如野生型或变体归巢核酸内切酶[例如，属于十二肽家族(LAGLIDADG(SEQ ID NO：10)的那些；参见，WO 2004/067736]。切点罕见核酸内切酶还包括包含DNA结合结构域和具有切割活性的催化结构域的融合蛋白。例如，转录激活因子样效应物(TALE)核酸内切酶和锌指-核酸酶(ZFN)是具有核酸内切酶FokI的催化结构域的DNA结合结构域的融合物。自定义的TAL效应物核酸内切酶可以商品名TALEN^TM(法国巴黎的赛勒柯蒂斯公司(Cellectis))购得。因此，本文提供的方法可包括应用TAL效应物核酸内切酶、ZFN和大范围核酸酶。

可如他处所述进行用于选择内源性目标序列和生成靶向这类序列的切点罕见核酸内切酶(例如，TALE核酸内切酶)的方法。参见例如，PCT公开号WO 2011/072246(其通过引用全文纳入本文)。TAL效应子发现于黄单胞菌属(Xanthomonas)中的植物病原性细菌中。这些蛋白质通过结合宿主DNA并激活效应器特异性宿主基因在疾病或触发防卫方面起重要作用(参见例如，Gu等，Nature 435：1122-1125，2005；Yang等，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 103：10503-10508，2006；Kay等，Science 318：648-651，2007；Sugio等，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 104：10720-10725，2007；和等，Science 318：645-648，2007)。特异性取决于效应物-可变不完善数目(effector-variable number ofimperfect)，通常是34个氨基酸重复(Schornack等，J.Plant Physiol.163：256-272，2006；和WO 2011/072246)。多态性主要发生在重复位置12和13，本文将其称为重复可变双残基(RVD)。TAL效应物的RVD以直接、线性形式对应于其靶位点的核苷酸，一种RVD对应于一种核苷酸，有一些简并性且没有明显的环境依赖性。该蛋白质-DNA识别机制能针对新的靶标特异性TAL效应物进行靶位点预测，以及靶位点选择和对与所选位点具有结合特异性的新TAL效应物进行工程改造。

TAL效应物DNA结合结构域可与核酸内切酶序列融合，生成靶向特定、经选择的DNA序列的嵌合核酸内切酶并导致在被靶向的序列处或附近的后续DNA切割。可使用一些内切核酸酶(如FokI)以二聚物形式起作用的现象来提高TALE-核酸内切酶的靶标特异性。例如，在一些情况中，可采用靶向至不同的DNA序列的一对TALE核酸内切酶单体。当两个TAL效应物核酸内切酶识别位点紧邻时，无活性的单体可聚集在一起以生成切割DNA的功能性酶。通过需要DNA结合来激活核酸酶，可产生高度位点特异性的限制性酶。

在一些实施方式中，本文提供的方法可包括可编程的RNA导向的核酸内切酶或其部分(例如，亚基)的瞬时表达。RNA导向的核酸内切酶是新基因组工程改造工具，其基于来自II型原核CRISPR适应性免疫系统的RNA导向的CRISPR(成簇的规律间隔的短回文重复序列)相关联的核酸酶(Cas9)被开发(参见例如，Belahj等，Plant Methods 9：39，2013)。本系统可切割侧接有短序列基序(称为前间区序列邻近基序(PAM))的DNA序列。切割通过工程改造与和Cas9核酸内切酶相关联的靶序列互补的特定CRISPR RNA(crRNA)来进行。在该复合物中，反式活化crRNA(tracrRNA)：crRNA复合物作为将Cas9核酸内切酶导向至关联靶序列的向导RNA发挥作用。合成单一向导RNA(sgRNA)已被开发，其本身能够靶向Cas9核酸内切酶。如本文所述，该工具可从Ti、Ri或T-DNA质粒表达至遗传学工程改造植物细胞。因此，在一些实施方式中，Cas9核酸内切酶的编码序列和sgRNA或tracrRNA：crRNA可从本文提供的Ti、Ri或T-DNA质粒瞬时表达。在一些实施方式中，Cas9核酸内切酶编码序列和sgRNA序列或tracrRNA和crRNA序列可被克隆进入iiT-DNA质粒，在RB序列之后。在一些实施方式中，Cas9核酸内切酶序列和sgRNA序列或tracrRNA和crRNA序列可被克隆进入RRB-iiT-DNA质粒，在RB序列和切点罕见核酸内切酶靶序列之后。即，因为RB序列是以5′→3′方向取向，所以该编码序列可被定位于RB：5′-编码序列-RB-3′或5′-编码序列-切点罕见核酸内切酶靶-RB-3′上游。本文所用的“切点罕见核酸内切酶靶序列”是被切点罕见核酸内切酶特异性识别并切割的核苷酸序列。

Cas9的表达可被RNA聚合酶II启动子控制，所述启动子包括但不限于，组成型启动子(例如，花椰菜花叶病毒(CaMV)35S启动子、胭脂碱合酶启动子或真蛸碱合酶启动子)，或组织特异性或诱导型启动子(例如，油菜籽蛋白启动子、菜豆素启动子、PTA29启动子、PTA26启动子、PTA13启动子、XVE雌二醇-诱导型启动子，或乙醇-诱导型启动子)。sgRNA或tracrRNA和crRNA序列的表达可被，例如，RNA聚合酶III启动子控制，所述启动子包括但不限于，U6、U3和7SL。

在一些实施方式中，可将iiT-DNA或RRBiiT-DNA序列转移至植物、植物部分，或植物细胞。所述植物可以是(或所述植物部分或植物细胞可来自)但不限于，黑麦、高粱、小麦、卡诺拉、棉花、印度芥末、向日葵、苜蓿、三叶草、豌豆、花生、白豆、红三叶草、大豆、宽叶菜豆、芋头、黄瓜、茄子、莴苣、番茄、胡萝卜、木薯、马铃薯、甘薯、山药、狗牙根、多年生黑麦草、柳枝稷、高羊茅、草坪草、美国榆树、软木橡树、桉树、松树、杨树、橡胶树、香蕉、柑橘、咖啡、番木瓜、菠萝、鹰嘴豆、甘蔗、美洲板栗、白菜、苹果、蓝莓、葡萄、草莓、核桃、康乃馨、菊花、兰花、矮牵牛、玫瑰、人参、大麻、罂粟、拟南芥、燕麦、烟草，和大麦。

用于转移iiT-DNA或RRBiiT-DNA序列至植物、植物部分或植物细胞的合适方法包括，例如，农杆菌介导的转化方法，包括(但不限于)花浸渍法转化和转化叶外植体、子叶外植体、盾片、胚、愈伤组织和根外植体外植体的方法。

在一些实施方式中，已与农杆菌接触的细胞可再生成为完整植物。然后，可针对切点罕见核酸内切酶的靶序列处的突变筛选所述完整植物。再生可采用他处所述的已建立的方法来进行(参见例如，Shrawat等，Plant Biotech J 4：575-603，2006；Somers等，PlantPhysiol 131(3)：892-899，2003；Hiei等，Plant Mol Biol 35：205-218，1997；Vasil等，Methods Molec Biol 111：349-358，1999；和Jones等，Plant Methods 1：5，2005)。

然而，应注意，本文所述的修饰的Ti、Ri和T-DNA质粒中的结构编码序列不限于核酸酶编码序列。事实上，可采用认为在易感植物细胞(接受如本文所述的修饰的Ti、Ri或T-DNA质粒的植物细胞)中瞬时表达的任何转基因。

在一些实施方式中，本文提供的方法可包括将具有T-DNA区域的修饰的Ti、Ri或T-DNA质粒引入植物细胞，所述T-DNA区域包含T-DNA边界序列、编码第一感兴趣的多肽的第一序列，和编码第二感兴趣的多肽的第二序列。所述第一和第二多肽编码序列各自可包括编码感兴趣的多肽的结构编码序列，以及5′启动子区域和编码聚腺苷酸化信号的3′非翻译区域。T-DNA边界序列可被定位于多肽编码序列的5′或3′。第一和第二多肽编码序列中的启动子可相同或可彼此不同。类似地，第一和第二多肽编码序列中的3′非翻译区域可相同或可彼此不同。第一多肽编码序列中的所述启动子区域和所述3′非翻译区域可被操作性地连接至编码第一感兴趣的多肽的结构编码序列，并且，第二多肽编码序列中的所述启动子区域和所述3′非翻译区域可被操作性地连接至编码第二感兴趣的多肽的结构编码序列。

在一些实施方式中，当所述修饰的Ti、Ri或T-DNA质粒中的T-DNA区域包含第一和第二多肽编码序列时，各多肽编码序列可编码切点罕见核酸内切酶或切点罕见核酸内切酶的部分(例如，亚基)。例如，第一和第二多肽编码序列各自可包含编码TAL效应物核酸内切酶、锌指核酸酶、大范围核酸酶，或可编程的RNA导向的核酸内切酶或其部分的结构编码序列。在一些情况中，由第一和第二多肽编码序列编码的切点罕见核酸内切酶(或其部分)可彼此不同，并且，在植物细胞中表达之后，可一起发挥作用以在靶序列处切割内源性的植物DNA。

在一些实施方式中，本文提供的方法可包括，将能够进行水平基因转移且包含具有本文所述的T-DNA区域的修饰的Ti、Ri或T-DNA质粒的生物体引入易感植物细胞。如果植物细胞可通过本文所述的T-DNA序列转化，则认为该植物细胞是易感的。注意到，一些植物细胞可能不被成功地转化，这归因于如下因素，例如模式触发的免疫力、效应物触发的免疫力，或非宿主抗性。所述生物体可以是，例如，细菌(例如，农杆菌、剑菌，或根瘤菌(Rhizobium))。

如本文所述，采用带有编码感兴趣的核酸酶的抑制整合的Ti、Ri或T-DNA质粒的农杆菌进行的植物组织的渗透可用于以反转录方式引入有转录活性的T-DNA，其可被转录和翻译，从而允许核酸酶靶向感兴趣的位点。为了被认为是成功事件，感兴趣的位点必须经非同源末端接合(NHEJ)或同源重组(HR)修饰，无T-DNA整合。可对再生组织的基因组DNA测序以验证定点突变和T-DNA整合的缺乏。T-DNA整合的缺乏也可采用如Southern印迹(采用质粒骨架作为探针)等技术来评估。

在一些实施方式中，修饰的Ti、Ri或T-DNA质粒可包括用于基因靶向的试剂。本文所用的术语“基因靶向”指采用同源重组进行的基因组DNA(例如，真核基因组DNA)的修饰。所述修饰的Ti、Ri或T-DNA质粒可包括供体分子序列，或供体分子序列和编码靶向至染色体序列的切点罕见核酸内切酶的序列。供体分子可包含与染色体DNA中的切点罕见核酸内切酶靶位点处或附近的序列至少约90％同源(例如，约90～95％，约95～99％，或100％同源)的序列。供体还可包括不与染色体DNA同源但由与染色体DNA中的切点罕见核酸内切酶靶位点处或附近的序列至少约90％同源的序列侧接的序列。在成功基因靶向之后，非同源序列可被纳入宿主基因组。

在另一个实施方式中，通过切点罕见核酸内切酶，或切点罕见核酸内切酶和供体分子引入的遗传修饰，可使植物、植物部分或植物细胞具有可选择或可筛选表型。所述可选择表型可以是但不限于，除草剂耐性或抗生素抗性。所述可筛选表型可以是，例如，荧光蛋白质的表达，β葡萄糖醛酸酶的表达，或具体遗传修饰。在一些实施方式中，所述可选择表型可协助修饰的细胞再生成为完整植物。

在一些实施方式中，修饰的Ti、Ri或T-DNA质粒可包括可与结构编码序列瞬时表达的报告序列，因此有利于确定转化是否成功，并且提供用于确认T-DNA序列未被整合进入基因组DNA的筛选工具。有用的报告物包括但不限于，视觉报告物[例如，YFP和绿色荧光蛋白质(GFP)]，和抗生素抗性基因(例如，bar、pmi、nptlI、als、epsps和hph)。

在一些实施方式中，修饰的Ti、Ri或T-DNA质粒可包括在T-DNA边界序列处或与之毗连的重复且反向的序列。所述重复且反向的靶序列可促进单链和双链DNA中的茎-环结构的形成。例如，在从T-DNA质粒释放之后，所述重复且反向的序列可促进茎-环的形成。该茎-环可不利于T-DNA整合，这归因于自由DNA端的空间位阻。一旦单链DNA被宿主聚合酶转化成双链T-DNA分子，该重复且反向的序列可促进双链茎-环的形成。与单链DNA中的茎-环相似，双链茎-环可通过自由DNA端的空间位阻减少DNA整合，由此使T-DNA端不利于整合。

在一些实施方式中，修饰的Ti、Ri或T-DNA质粒可在T-DNA边界序列下游包括切点罕见核酸内切酶靶位点。该靶位点可允许T链边界序列被VirD1/VirD2复合物产生缺口，然后是VirD2与该边界序列的共价连接，其将初期T链引导至植物细胞的核。一旦该T链入核，植物机制可制造T链双链，从而其能够被转录。编码的切点罕见核酸内切酶的瞬时表达可允许植物的基因组DNA的定点诱变，以及T-DNA边界序列下游的切点罕见核酸内切酶靶位点处的双链断裂的生成。所述切割可造成边界序列和共价接合的VirD2从T链解离，进一步减小整合的可能性(Mysore等，Mol Plant-Microbe Interactions，11(7)：668-683，1998)。

因此，本文还提供通过将能够进行水平基因转移且包含具有T-DNA区域的修饰的Ti、Ri或T-DNA质粒的生物体引入植物细胞，在植物细胞中瞬时表达多肽的方法，所述T-DNA区域包括T-DNA边界序列、切点罕见核酸内切酶的靶位点，和多肽编码序列，其中所述切点罕见核酸内切酶靶位点位于T-DNA边界下游。如本文所述，多肽编码序列可包括5′启动子区域、编码多肽的结构编码序列，和编码聚腺苷酸化信号的3′非翻译区域，其中所述5′启动子区域和所述3′非翻译区域操作性地连接至所述结构编码序列。

在一些实施方式中，本文提供的方法可包括采用修饰的Ti、Ri或T-DNA质粒以产生遗传修饰的植物细胞。所述方法可包括将具有T-DNA区域的修饰的Ti、Ri或T-DNA质粒引入易感植物细胞，所述T-DNA区域包括(i)已被突变的(例如，通过突变或缺失)T-DNA边界序列，从而该T-DNA区域不整合进入植物细胞基因组，和(ii)编码切点罕见核酸内切酶或切点罕见核酸内切酶亚基的多核苷酸序列，其中所述多核苷酸序列操作性地连接至在植物细胞能被诱导的启动子，从而所述切点罕见核酸内切酶或切点罕见核酸内切酶亚基在所述植物细胞中瞬时表达。所述方法还可包括选择植物细胞，其中所述切点罕见核酸内切酶或切点罕见核酸内切酶亚基的瞬时表达导致由特定切割活性造成的基因组修饰。在一些实施方式中，所述方法还可包括从被鉴定为具有所述基因组修饰的植物细胞再生完整植物。

因此，本文提供基因编辑的一般方法，其中植物细胞基因组可采用T-DNA被修饰，但该T-DNA不整合进入植物细胞基因组。所述方法一般包括如下步骤：(a)将编码切点罕见核酸内切酶或核酸内切酶亚基且仅具有一个或无边界功能性序列的T-DNA引入植物细胞，(b)在所述植物细胞中瞬时表达所述切点罕见核酸内切酶或核酸内切酶亚基，(c)选择其中在由切点罕见核酸内切酶靶向的基因座处观察到遗传修饰的植物细胞，和，任选地，(d)从所选的植物细胞再生完整植物。

如本文中所述，新植物性状可采用能够进行水平基因转移的生物体(例如农杆菌)产生，不发生转基因尤其是T-DNA转基因的插入。采用本文所述的方法再生的植物可具有能被稳定遗传的切点罕见核酸内切酶诱导的突变，并且可与其它种质杂交以获得适应的有价值的新作物品种。当基因编辑不整合外源性DNA序列时(例如，当靶向的基因座仅被突变或修复时)，所得植物可被视为非GMO，因为它们在其基因组中不包括外来DNA。

在一些实施方式中，本文提供的方法还可包括将能够进行水平基因转移且包含具有T-DNA区域的修饰的Ti、Ri或T-DNA质粒的第二生物体引入植物细胞，所述T-DNA区域包括第二T-DNA边界序列，其可与第一T-DNA边界序列相同或不同，和第二多肽编码序列，或第二T-DNA边界序列、第二多肽编码序列，和第三多肽编码序列。在所述实施方式中，一个或多个第二和/或第三多肽编码序列可包括5′启动子区域、编码多肽的结构编码序列，和编码聚腺苷酸化信号的3′非翻译区域，其中所述5′启动子区域和所述3′非翻译区域操作性地连接至所述结构编码序列。第二(或第二和第三)多肽编码序列可与所述第一生物体的修饰的Ti、Ri或T-DNA质粒中所含的多肽编码序列相同或不同。当采用所述方法时，第一和第二生物体可被同时(例如，通过混合或共同培养第一和第二生物体，然后将它们引入所述细胞)或依次引入植物细胞。例如，第一生物体可被引入植物细胞，然后是一至五天(例如，一、二、三、四或五)天的孵育，然后可引入第二生物体。

除了本文所述的方法以外，本文还提供本文所述的修饰的Ti和Ri质粒和T-DNA质粒。例如，本文提供修饰的Ti和Ri质粒和T-DNA质粒，其包括T-DNA区域，所述T-DNA区域包含T-DNA边界序列和编码感兴趣的多肽的多核苷酸序列，其中，所述多肽编码序列操作性地连接至在植物细胞中诱导的启动子。在一些实施方式中，感兴趣的多肽可以是切点罕见核酸内切酶(例如，TAL效应物核酸内切酶、ZFN、大范围核酸酶，或可编程的RNA导向的核酸内切酶)，或切点罕见核酸内切酶亚基。此外，在一些实施方式中，本文所述的Ti和Ri质粒和T-DNA质粒还可包含切点罕见核酸内切酶的靶位点。例如，该靶位点可位于T-DNA边界序列下游。

本文还提供用本文所述的修饰的Ti、Ri或T-DNA质粒转化的分离的宿主细胞。宿主细胞可以是，例如，农杆菌细胞。

此外，本文提供组合物和制品，其包括本文所述的一种或多种Ti质粒、Ri质粒和/或T-DNA质粒，任选地，与用于本文所述的方法的包装材料和一种或多种其它组分(例如，缓冲剂或其它试剂)的组合。在一些实施方式中，组合物或制品可包括用本文所述的修饰的Ti、Ri或T-DNA质粒转化的宿主细胞。所述一种或多种质粒和/或所述宿主细胞可采用本领域已知用于组合物和制品的包装材料包装。此外，所述组合物和制品可具有标记(例如，固定于包装材料的标签或标记、印在包装材料上的标记，或插入该包装的标记)。例如，所述标记可指示包装中包含的组合物、质粒和/或宿主细胞可用于产生遗传修饰的植物、植物部分或植物细胞。

以下实施例进一步描述了本发明，这些实施例并不限制权利要求书所述的本发明范围。

实施例

实施例1-工程改造序列特异的核酸酶以诱变ALS2基因。

为了完全失活或敲出本氏烟(Nicotiana benthamiana)中的ALS2基因，采用特定地鉴别TALE核酸酶识别位点的软件，例如TALE-NT 2.0(Doyle等，Nucleic acids Res 40：W117-122，2012)，将序列特异性核酸酶设计在刚好蛋白质编码序列的下游。ALS2基因的TALE核酸酶识别位点列于表2；该TALE核酸酶称为ALS2_T1。TALE核酸酶获自赛勒柯蒂斯生物研究公司(Cellectis Bioresearch)(法国巴黎)。

表2

ALS2_T1 TALE核酸酶靶序列

实施例2-酵母中的ALS2-T1 TALE核酸酶活性

为评估靶向ALS2基因的TALE-核酸酶的活性，通过与他处所述方法(Christian等，Genetics 186：757-761，2010)类似的方法在酵母中进行活性试验。对于这些试验，构建目标质粒，其中将TALE-核酸酶识别位点克隆至非功能性β-半乳糖苷酶报告基因中。靶位点侧接β-半乳糖苷酶编码序列的直接重复，从而如果报告基因被TALE-核酸酶切割，则在直接重复之间会发生重组并恢复β-半乳糖苷酶基因的功能。因此，β-半乳糖苷酶活性被用于测量TALE-核酸酶切割活性。在酵母试验中，ALS2_T1 TALE核酸酶对显示切割活性。将切割活性对基准核酸酶I-SceI进行标准化。结果总结于表3。

表3

酵母中ALS2 TALE核酸酶活性

*标准化至I-SceI(最大值＝1.0)

实施例3-抑制整合的T-DNA质粒的构建

为实现转移DNA(T-DNA)的所需核酸酶无整合(sans integration)的瞬时表达，合成缺乏LB的新载体。该修饰抑制VirD1/VirD2边界特异性核酸内切酶对LB产生缺口，导致不具有高效整合所需的正确加工的T-DNA盒。为了构建抑制整合的T-DNA(iiT-DNA)质粒，pCAMBIA-1300(澳大利亚堪培拉的堪比亚公司(Cambia))质粒(图1)采用限制性酶修饰以移除左边界并插入合成的盒(GenScript USA Inc.)，其包含：(i)右边界，(ii)Nos启动子，(iii)接头序列，其包含用于定向TALE核酸酶亚基A克隆的包括22个限制性位点，(iv)Nos终止子，(v)用于TALE核酸酶亚基B(TALE核酸酶亚基B盒包含Nos启动子和Nos终止子)克隆目的的限制性位点，(vi)Nos启动子，(vii)具有核定位信号的黄色荧光蛋白质，和(viii)Nos终止子(图2)。该盒经合成用于采用 HD克隆试剂盒(克隆泰克实验室公司(Clontech Laboratories，Inc.))连接成修饰的pCAMBIA-1300。在大肠杆菌中验证之后，该质粒经历限制性酶消化，随后是TALE核酸酶亚基的连接，以产生所需产物(图3)，此时其转化进入根癌农杆菌(Agrobacterium tumefaciens)。

实施例4-通过iiT-DNA质粒的YFP瞬时表达

为显示iiT-DNA质粒在无整合情况下瞬时表达所需蛋白质的能力，将YFP转化进入本氏烟(N.benthamiana)并监控超过20天的时程。iiTi处理中的荧光加速减少指示瞬时表达。该验证通过将根癌农杆菌(A.tumefaciens)(包含两个前述构建体)无针注射器渗透进入本氏烟(N.benthamiana)完整叶子来完成。在二十天的时程中跟踪转化的叶子的荧光表达水平。这些图像采用Cell Profiler(Broad Institute)软件定量，其允许比较iiT-DNA和对照质粒之间的相对荧光单位(RFU)。整合的减少由纳入了iiT-DNA质粒的细胞在整个时程中的YFP荧光的更陡峭下降以及约9dpt处的YFP荧光的稳定表达的缺乏来证实。

实施例5-ALS2 TALE核酸酶通过iiT-DNA质粒的瞬时表达

为显示核酸酶导致定点诱变无整合的瞬时表达，采用无针注射器用根癌农杆菌(A.tumefaciens)浸润本氏烟(N.benthamiana)完整叶子。测试根癌农杆菌(A.tumefaciens)的两个菌株：一个包含编码ALS2 TALE核酸酶的iiT-DNA质粒，另一个包含编码相同TALE核酸酶的常规T-DNA质粒。通过直接比较不同的根癌农杆菌(A.tumefaciens)菌株之间的NHEJ频率，能够间接检测相对T-DNA转移效率。本氏烟(N.benthamiana)叶子渗透后两天，分离基因组DNA并通过PCR扩增ALS基因。所得PCR产物经历T7核酸内切酶I消化。NHEJ频率基于条带强度进行定量，采用计算NHEJ频率＝100x(1-(1-切割的分数)^1/2)。惊人的是，对于包含iiT-DNA的样品和包含常规T-DNA的样品观察到相似突变频率(图4)。这些数据指示采用iiT-DNA质粒时，转移未被破坏。

实施例6-通过利用右边界附近的茎-环结构的抑制整合的Ti质粒的ALS2 TALEN的瞬时表达

为显示利用右边界附近(例如，右边界约1000核苷酸内；图5)的茎-环结构，核酸酶的瞬时表达导致定点诱变无整合，本氏烟(N.benthamiana)完整叶子通过无针注射器用根癌农杆菌(A.tumefaciens)浸润(如上所述)，并且比较茎-环iiT-DNA和对照质粒之间的NHEJ和整合频率。这些数据在从完整叶子7dpt的浸润的区域获取叶盘之后获得，以通过454深度测序检测NHEJ频率，并通过qRT-PCR检测T-DNA整合。

实施例7-与常规T-DNA质粒相比的采用iiT-DNA质粒的减少的整合的验证

为显示相较于常规T-DNA质粒，移除LB会减少稳定整合的频率，烟草(Nicotianatabacum)子叶采用花浸渍法方法(Clough和Bent，Plant J，16：735-743，1998)用农杆菌转化。测试根癌农杆菌(A.tumefaciens)的两个菌株：一个包含编码卡那霉素选择性标志物的iiT-DNA质粒，另一个包含编码相同卡那霉素选择性标志物的常规T-DNA质粒。然而，与iiT-DNA质粒不同，常规T-DNA质粒在卡那霉素终止密码子下游包含独特的KpnI限制性位点，由此允许鉴定整合进入植物基因组后的常规T-DNA序列。两个不同的农杆菌菌株生长至OD₆₀₀＝0.6，此时以1∶1比例混合重悬的培养物。然后，该混合物用于采用标准转化方案(Horsch等，Science，227：1229-1231，1985)转化烟草(Nicotiana tabacum)子叶。转化的子叶在卡那霉素选择条件下在选择性再生培养基上生长6-8周，直至芽再生，此时切下芽组织并进行DNA提取。然后，提取的DNA用于经设计以扩增NptII抗性基因的PCR。所得扩增子经历KpnI限制性酶消化，允许高通量筛选个体转化事件，以确定哪种T-DNA被整合进入宿主基因组。采用该方法，相较于常规T-DNA，采用iiT-DNA观察到约10倍更低的整合事件，指示移除LB序列有效抑制T-DNA整合。结果总结于表4。

表4

iiT-DNA载体的整合频率

实施例8-通过采用可移除的右边界的iiT-DNA质粒的ALS2 TALEN瞬时表达

为显示利用可移除的RB(图6)，核酸酶的瞬时表达导致定点诱变无整合，本氏烟(N.benthamiana)完整叶子采用根癌农杆菌(A.tumefaciens)通过无针注射器浸润(如上所述)，并且比较可移除的右边界(RRB)-iiT-DNA和对照质粒之间的NHEJ和整合频率。这些数据在从完整叶子7dpt的浸润的区域获取叶盘之后获得，以通过454深度测序检测NHEJ频率，并通过qRT-PCR检测T-DNA整合。

实施例9-iiT-DNA的减少的整合

为显示相较于常规T-DNA质粒，LB的移除减少稳定整合的频率，拟南芥(Arabidopsis)采用农杆菌花浸渍法方法转化。为确定整合频率，两个不同的农杆菌菌株生长至OD₆₀₀＝0.6，此时重悬的培养物以1∶1比例混合。该混合物用于通过花浸渍法转化拟南芥。植物另生长3-5周直至长角果干燥，此时种子经收获并在含卡那霉素的琼脂中生长以仅选择已被转化的种子。然后，抗性种子经生长和基因分型以确定哪种质粒，iiT-DNA或常规T-DNA，造成抗性。iiT-DNA质粒应显示低于常规-T-DNA质粒的整合频率。

实施例10-利用右边界毗连的茎-环结构的抑制整合的iiT-DNA质粒的减少的整合

为显示相较于常规T-DNA质粒，RB序列附近(例如，RB约1000核苷酸内)的茎-环结构减少稳定整合的频率，拟南芥(Arabidopsis)采用农杆菌花浸渍法转化。为确定整合频率，两个不同的农杆菌菌株生长至OD₆₀₀＝0.6，此时重悬的培养物以1∶1比例混合。该混合物用于通过花浸渍法转化拟南芥。植物另生长3-5周直至长角果干燥，此时种子经收获并在含卡那霉素的琼脂中生长以仅选择已被转化的种子。然后，抗性种子经生长和基因分型以确定哪种质粒，茎-环iiT-DNA或常规T-DNA，造成抗性。茎-环iiT-DNA质粒应显示低于常规-T-DNA质粒的整合频率。

实施例11-利用可移除的右边界的iiT-DNA的减少的整合

为显示相较于常规T-DNA质粒，RB的移除，通过序列特异性核酸酶的iiT-DNA的切割，减少稳定整合的频率，拟南芥(Arabidopsis)采用农杆菌花浸渍法转化。可移除的RBiiT-DNA称为RRBiiT-DNA。为确定整合频率，测试两个不同的农杆菌菌株：一个包含RRBiiT-DNA，其编码TALE核酸酶和卡那霉素选择性标志物，另一个包含常规T-DNA质粒，其编码相同卡那霉素选择性标志物，但具有独特KpnI限制性消化序列。农杆菌菌株生长至OD₆₀₀＝0.6，此时以1∶1比例混合重悬的培养物。该混合物用于通过花浸渍法转化拟南芥。植物另生长3-5周直至长角果干燥，此时种子经收获并在含卡那霉素的琼脂中生长以仅选择已被转化的种子。然后，抗性种子经生长和基因分型以确定哪种5质粒，RRB iiTi或常规T-DNA质粒，造成抗性。九个独立事件中，九株植物包含常规T-DNA且无植物包含RRBiiT-DNA。因此，RRBiiT-DNA质粒显示低于常规T-DNA质粒的整合频率。

表5

RRBiiT-DNA的整合频率

其他实施方式

应理解虽然本发明已结合其详述进行描述，但以上描述意在说明而不是限制本发明的范围，该范围由所附权利要求的范围限定。其他方面、优势和修改在以下权利要求的范围内。

序列表

<110> 塞尔克蒂斯股份有限公司(CELLECTIS)

<120> 无T-DNA整合的农杆菌介导的基因组修饰

<130> 36861-0006WO1

<150> 62/110,735

<151> 2015-02-02

<160> 10

<170> FastSEQ for Windows Version 4.0

<210> 1

<211> 25

<212> DNA

<213> 根癌农杆菌(Agrobacterium tumefaciens)

<400> 1

tggcaggata tataccgttg taatt 25

<210> 2

<211> 25

<212> DNA

<213> 根癌农杆菌(Agrobacterium tumefaciens)

<400> 2

cggcaggata tattcaattg taaat 25

<210> 3

<211> 25

<212> DNA

<213> 根癌农杆菌(Agrobacterium tumefaciens)

<400> 3

cggcaggata tattcaattg taaac 25

<210> 4

<211> 25

<212> DNA

<213> 根癌农杆菌(Agrobacterium tumefaciens)

<400> 4

tgacaggata tattggcggg taaac 25

<210> 5

<211> 25

<212> DNA

<213> 根癌农杆菌(Agrobacterium tumefaciens)

<400> 5

tggcaggata tattgtggtg taaac 25

<210> 6

<211> 25

<212> DNA

<213> 根癌农杆菌(Agrobacterium tumefaciens)

<400> 6

tggcaggata tatcgaggtg taaaa 25

<210> 7

<211> 25

<212> DNA

<213> 根癌农杆菌(Agrobacterium tumefaciens)

<400> 7

tggcaggata tatgcggttg taatt 25

<210> 8

<211> 25

<212> DNA

<213> 根癌农杆菌(Agrobacterium tumefaciens)

<400> 8

tgacaggata tatccccttg tctag 25

<210> 9

<211> 10

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 共有

<400> 9

caggatatat 10

<210> 10

<211> 9

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 共有

<400> 10

Leu Ala Gly Leu Ile Asp Ala Asp Gly

1 5

Claims

1.在植物细胞中瞬时表达多肽的方法，所述方法包括将修饰的Ti、Ri或T-DNA质粒引入所述植物细胞，其中，所述修饰的Ti、Ri或T-DNA质粒包含T-DNA区域，该T-DNA区域包含：

(a)T-DNA边界序列；和

(b)包含5′启动子区域的多肽编码序列、编码所述多肽的结构编码序列，和包含聚腺苷酸化信号的3′非翻译区域，其中，所述5′启动子区域和所述3′非翻译区域操作性地连接至所述结构编码序列，

从而所述多肽编码序列在所述植物细胞中瞬时表达且不整合进入所述植物细胞的基因组。

2.如权利要求1所述的方法，其中，所述修饰的Ti、Ri或T-DNA质粒包含至少一个非功能性的T-DNA边界序列。

3.如权利要求1所述的方法，其中，所述修饰的Ti、Ri或T-DNA质粒仅包含一个功能性T-DNA边界序列。

4.如权利要求1所述的方法，其中，所述修饰的Ti、Ri或T-DNA质粒不包含任何功能性T-DNA边界序列。

5.如权利要求1-4中任一项所述的方法，其中，所述修饰的Ti、Ri或T-DNA质粒不包含右边界序列。

6.如权利要求1所述的方法，其中，所述引入步骤包含使易感植物细胞与能够进行水平基因转移的生物体接触。

7.如权利要求6所述的方法，其中，所述能够进行水平基因转移的生物体是细菌。

8.如权利要求2所述的方法，其中，所述细菌是农杆菌(Agrobacterium)。

9.如权利要求1所述的方法，其中，所述T-DNA边界序列来自农杆菌。

10.如权利要求1所述的方法，其中，所述T-DNA边界序列是T-DNA右边界序列。

11.如权利要求1所述的方法，其中，所述T-DNA边界序列来自真蛸碱Ti质粒、胭脂碱Ti质粒，或农杆碱Ti质粒。

12.如权利要求1所述的方法，其中，所述T-DNA包含重复且反向的序列。

13.如权利要求12所述的方法，其中，所述重复且反向的序列与所述边界序列毗连。

14.如权利要求1所述的方法，其中，所述T-DNA边界序列是所述修饰的Ti、Ri或T-DNA质粒中的多肽编码序列的5′。

15.如权利要求1所述的方法，其中，所述5′启动子区域天然存在于植物细胞中或能够天然进入植物细胞。

16.如权利要求1所述的方法，其中，所述5′启动子区域包含组成型启动子。

17.如权利要求1所述的方法，其中，所述5′启动子区域包含诱导型启动子，并且其中，所述方法还包括诱导所述启动子。

18.如权利要求1所述的方法，其中，所述多肽编码序列编码切点罕见核酸内切酶或切点罕见核酸内切酶亚基。

19.如权利要求18所述的方法，其中，所述切点罕见核酸内切酶是转录激活因子样(TAL)效应物核酸内切酶、锌指核酸酶、大范围核酸酶，或可编程的RNA导向的核酸内切酶。

20.如权利要求18所述的方法，其中所述切点罕见核酸内切酶的瞬时表达导致定点诱变。

21.如权利要求1所述的方法，其中，所述修饰的Ti、Ri或T-DNA质粒包含与所述结构编码序列瞬时表达的报告基因。

22.如权利要求21所述的方法，其中所述报告基因的表达导致视觉信号或抗生素抗性。

23.如权利要求1所述的方法，其中，所述T-DNA区域还包含供体序列。

24.如权利要求23所述的方法，其中所述供体序列的瞬时递送导致基因靶向。

25.如权利要求1所述的方法，其中，所述T-DNA区域还包含含有5′启动子区域的第二多肽编码序列，编码第二多肽的结构编码序列，和编码聚腺苷酸化信号的3′非翻译区域，其中，所述5′启动子区域和所述3′非翻译区域操作性地连接至所述结构编码序列，从而第二多肽编码序列在所述植物细胞中瞬时表达且不整合进入所述植物细胞的基因组。

26.如权利要求25所述的方法，其中，第二多肽编码序列的5′启动子区域天然存在于植物细胞中或能够天然进入植物细胞。

27.如权利要求25所述的方法，其中，第二多肽编码序列的5′启动子区域包含组成型启动子。

28.如权利要求25所述的方法，其中，第二多肽编码序列的5′启动子区域包含诱导型启动子，并且其中，所述方法还包括诱导所述启动子。

29.如权利要求25所述的方法，其中，所述多肽编码序列编码切点罕见核酸内切酶或切点罕见核酸内切酶亚基，并且第二多肽编码序列编码切点罕见核酸内切酶或切点罕见核酸内切酶亚基。

30.如权利要求29所述的方法，其中，所述切点罕见核酸内切酶是TAL效应物核酸内切酶、锌指核酸酶、大范围核酸酶，或可编程的RNA导向的核酸内切酶。

31.如权利要求29所述的方法，其中所述切点罕见核酸内切酶或切点罕见核酸内切酶亚基的瞬时表达导致定点诱变。

32.一种产生植物的方法，包括，提供根据如权利要求1所述的方法获得的植物细胞，其中，所述多肽编码序列编码切点罕见核酸内切酶或切点罕见核酸内切酶亚基，和，使所述植物细胞再生成植物。

33.如权利要求32所述的方法，其中，所述再生的植物包含由所述切点罕见核酸内切酶的瞬时表达产生的一个或多个突变。

34.一种产生植物的方法，包括，提供根据如权利要求25所述的方法获得的植物细胞，其中，所述多肽编码序列编码切点罕见核酸内切酶或切点罕见核酸内切酶亚基，并且第二多肽编码序列编码切点罕见核酸内切酶或切点罕见核酸内切酶亚基，和，使所述植物细胞再生成植物。

35.如权利要求34所述的方法，其中，所述再生的植物包含由所述切点罕见核酸内切酶或切点罕见核酸内切酶亚基的瞬时表达产生的一个或多个突变。

36.在植物细胞中瞬时表达多肽的方法，所述方法包括，将能够进行水平基因转移的生物体引入植物细胞，其中，所述生物体包含含有T-DNA区域的修饰的Ti、Ri或T-DNA质粒，所述T-DNA区域包含：

(a)T-DNA边界序列；

(b)切点罕见核酸内切酶的靶位点；和

(c)包含5′启动子区域的多肽编码序列、编码所述多肽的结构编码序列，和包含聚腺苷酸化信号的3′非翻译区域，其中，所述5′启动子区域和所述3′非翻译区域操作性地连接至所述结构编码序列，

37.如权利要求36所述的方法，其中，所述能够进行水平基因转移的生物体是细菌。

38.如权利要求37所述的方法，其中，所述细菌是农杆菌(Agrobacterium)。

39.如权利要求36所述的方法，其中，所述T-DNA边界序列来自农杆菌。

40.如权利要求36所述的方法，其中，所述T-DNA边界序列是T-DNA右边界序列。

41.如权利要求36所述的方法，其中，所述T-DNA边界序列来自真蛸碱Ti质粒、胭脂碱Ti质粒，或农杆碱Ti质粒。

42.如权利要求36所述的方法，其中，所述T-DNA边界序列是所述修饰的Ti、Ri或T-DNA质粒中的多肽编码序列的5′。

43.如权利要求36所述的方法，其中，所述5′启动子区域天然存在于植物细胞或能够天然进入植物细胞。

44.如权利要求36所述的方法，其中，所述5′启动子区域包含组成型启动子。

45.如权利要求36所述的方法，其中，所述5′启动子区域包含诱导型启动子，并且其中，所述方法还包括诱导所述启动子。

46.如权利要求36所述的方法，其中，所述多肽编码序列编码切点罕见核酸内切酶或切点罕见核酸内切酶亚基。

47.如权利要求46所述的方法，其中，所述切点罕见核酸内切酶是TAL效应物核酸内切酶、锌指核酸酶、大范围核酸酶，或可编程的RNA导向的核酸内切酶。

48.如权利要求46所述的方法，其中所述切点罕见核酸内切酶的瞬时表达导致定点诱变。

49.如权利要求36所述的方法，其中，所述T-DNA区域还包含供体序列。

50.如权利要求49所述的方法，其中所述供体序列的瞬时递送导致基因靶向。

51.如权利要求46所述的方法，其中所述切点罕见核酸内切酶的表达导致所述切点罕见核酸内切酶靶位点的双链断裂，从而移除T-DNA边界和共价接合的蛋白质。

52.如权利要求36所述的方法，其中，所述修饰的Ti、Ri或T-DNA质粒包含与所述结构编码序列瞬时表达的报告基因。

53.如权利要求52所述的方法，其中所述报告基因的表达导致视觉信号或抗生素抗性。

54.如权利要求36所述的方法，其中，所述T-DNA区域还包含含有5′启动子区域的第二多肽编码序列，编码第二多肽的结构编码序列，和编码聚腺苷酸化信号的3′非翻译区域，其中，所述5′启动子区域和所述3′非翻译区域操作性地连接至所述结构编码序列，从而第二多肽编码序列在所述植物细胞中瞬时表达且不整合进入所述植物细胞的基因组。

55.如权利要求54所述的方法，其中，第二多肽编码序列的5′启动子区域天然存在于植物细胞中或能够天然进入植物细胞。

56.如权利要求54所述的方法，其中，第二多肽编码序列的5′启动子区域包含组成型启动子。

57.如权利要求54所述的方法，其中，第二多肽编码序列的5′启动子区域包含诱导型启动子，并且其中，所述方法还包括诱导所述启动子。

58.如权利要求54所述的方法，其中，所述多肽编码序列编码切点罕见核酸内切酶或切点罕见核酸内切酶亚基，并且第二多肽编码序列编码切点罕见核酸内切酶或切点罕见核酸内切酶亚基。

59.如权利要求58所述的方法，其中，所述切点罕见核酸内切酶是TAL效应物核酸内切酶、锌指核酸酶、大范围核酸酶，或可编程的RNA导向的核酸内切酶。

60.如权利要求58所述的方法，其中所述切点罕见核酸内切酶或切点罕见核酸内切酶亚基的瞬时表达导致定点诱变。

61.如权利要求36所述的方法，还包括，将能够进行水平基因转移的第二生物体引入植物细胞，其中，所述第二生物体包含含有T-DNA区域的第二修饰的Ti、Ri或T-DNA质粒，所述T-DNA区域包含：

(a)T-DNA边界序列；

(b)包含5′启动子区域的第二多肽编码序列、编码多肽的结构编码序列，和包含聚腺苷酸化信号的3′非翻译区域，其中，所述5′启动子区域和所述3′非翻译区域操作性地连接至所述结构编码序列，

从而第二多肽编码序列在所述植物细胞中瞬时表达且不整合进入所述植物细胞的基因组。

62.如权利要求61所述的方法，其中，在第一生物体五天内将所述第二生物体引入所述植物细胞。

63.如权利要求61所述的方法，其中，所述多肽编码序列的5′启动子区域和第二多肽编码序列的5′启动子区域天然存在于植物细胞中或能够天然进入植物细胞。

64.如权利要求61所述的方法，其中，所述5′启动子区域包含组成型启动子。

65.如权利要求61所述的方法，其中，所述5′启动子区域包含诱导型启动子，并且其中，所述方法还包括诱导所述启动子。

66.如权利要求61所述的方法，其中，所述多肽编码序列编码切点罕见核酸内切酶或切点罕见核酸内切酶亚基，并且第二多肽编码序列编码切点罕见核酸内切酶或切点罕见核酸内切酶亚基。

67.如权利要求66所述的方法，其中，所述切点罕见核酸内切酶是TAL效应物核酸内切酶、锌指核酸酶、大范围核酸酶，或可编程的RNA导向的核酸内切酶。

68.如权利要求66所述的方法，其中，所述切点罕见核酸内切酶或切点罕见核酸内切酶亚基的瞬时表达导致定点诱变。

69.如权利要求66所述的方法，其中所述切点罕见核酸内切酶或切点罕见核酸内切酶亚基的表达导致所述切点罕见核酸内切酶靶位点的双链断裂，从而移除第一T-DNA边界和共价接合的蛋白质。

70.如权利要求36所述的方法，还包括，将能够进行水平基因转移的第二生物体引入所述植物细胞，其中，所述第二生物体包含含有T-DNA区域的修饰的Ti、Ri或T-DNA质粒，所述T-DNA区域包含：

(a)T-DNA边界序列；

(b)包含5′启动子区域的第二多肽编码序列、编码第二多肽的结构编码序列，和包含聚腺苷酸化信号的3′非翻译区域，其中，所述5′启动子区域和所述3′非翻译区域操作性地连接至所述结构编码序列；和

(c)包含5′启动子区域的第三多肽编码序列、编码所述第三多肽的结构编码序列，和编码聚腺苷酸化信号的3′非翻译区域，其中，所述5′启动子区域和所述3′非翻译区域操作性地连接至所述结构编码序列，

从而第二和第三多肽编码序列在所述植物细胞中瞬时表达且不整合进入所述植物细胞的基因组。

71.如权利要求70所述的方法，其中，在第一生物体五天内将所述第二生物体引入所述植物细胞。

72.如权利要求70所述的方法，其中，所述第二多肽编码序列编码切点罕见核酸内切酶或切点罕见核酸内切酶亚基，并且所述第三多肽编码序列编码切点罕见核酸内切酶或切点罕见核酸内切酶亚基。

73.如权利要求72所述的方法，其中，所述切点罕见核酸内切酶是TAL效应物核酸内切酶、锌指核酸酶、大范围核酸酶，或可编程的RNA导向的核酸内切酶。

74.如权利要求72所述的方法，其中，所述切点罕见核酸内切酶或切点罕见核酸内切酶亚基的瞬时表达导致定点诱变。

75.如权利要求70所述的方法，其中，所述T-DNA区域还包含供体序列。

76.如权利要求75所述的方法，其中所述供体序列的瞬时递送导致基因靶向。

77.如权利要求72所述的方法，其中所述切点罕见核酸内切酶或切点罕见核酸内切酶亚基的表达导致所述切点罕见核酸内切酶靶位点的双链断裂，从而移除第一T-DNA边界和共价接合的蛋白质。

78.一种产生植物的方法，包括，提供根据如权利要求36所述的方法获得的植物细胞，其中，所述多肽编码序列编码切点罕见核酸内切酶或切点罕见核酸内切酶亚基，和，使所述植物细胞再生成植物。

79.如权利要求78所述的方法，其中，所述再生的植物包含由所述切点罕见核酸内切酶的瞬时表达产生的一个或多个突变。

80.一种产生植物的方法，包括，提供根据如权利要求54所述的方法获得的植物细胞，其中，所述多肽编码序列编码切点罕见核酸内切酶或切点罕见核酸内切酶亚基，并且第二多肽编码序列编码切点罕见核酸内切酶或切点罕见核酸内切酶亚基，和，使所述植物细胞再生成植物。

81.如权利要求80所述的方法，其中，所述再生的植物包含由所述切点罕见核酸内切酶或切点罕见核酸内切酶亚基的瞬时表达产生的一个或多个突变。

82.包含T-DNA区域的修饰的Ti、Ri或T-DNA质粒，所述T-DNA区域包含：

i)仅一个T-DNA边界序列；和

ii)编码切点罕见核酸内切酶或一种或多种切点罕见核酸内切酶亚基的多核苷酸序列，其操作性地连接至在植物细胞中诱导的启动子。

83.如权利要求82所述的修饰的Ti、Ri或T-DNA质粒，其中，所述T-DNA包含重复且反向的序列。

84.如权利要求83所述的修饰的Ti、Ri或T-DNA质粒，其中，所述重复且反向的序列与所述边界序列毗连。

85.如权利要求82所述的修饰的Ti、Ri或T-DNA质粒，其中，所述切点罕见核酸内切酶或切点罕见核酸内切酶亚基来自TAL效应物核酸内切酶、锌指核酸酶、大范围核酸酶，或可编程的RNA导向的核酸内切酶。

86.如权利要求82所述的修饰的Ti、Ri或T-DNA质粒，其中，所述质粒还包含切点罕见核酸内切酶的靶位点，并且其中，所述靶位点位于边界序列下游。

87.一种制品，其包含如权利要求82所述的修饰的Ti、Ri或T-DNA质粒。

88.一种组合物，其包含如权利要求82所述的修饰的Ti、Ri或T-DNA质粒。

89.用如权利要求82所述的修饰的Ti、Ri或T-DNA质粒转化的分离的宿主细胞。