ES2248795T3 - Procedimientos para la produccion de plantas transgenicas. - Google Patents

Procedimientos para la produccion de plantas transgenicas.

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ES2248795T3 ES95117589T ES95117589T ES2248795T3 ES 2248795 T3 ES2248795 T3 ES 2248795T3 ES 95117589 T ES95117589 T ES 95117589T ES 95117589 T ES95117589 T ES 95117589T ES 2248795 T3 ES2248795 T3 ES 2248795T3
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Abstract

UN VECTOR PARA LA INTRODUCCION DE UN GEN DESEADO EN UNA PLATA, QUE CONTIENE EL GEN DESEADO Y AL MENOS UN GEN DE INDUCCION DE UNA ANORMALIDAD MORFOLOGICA (MAI) COMO GEN MARCADOR, O QUE CONTIENE EL GEN DESEADO, AL MENOS UN GEN DE MAI Y UN ELEMENTO EXTRAIBLE. UN METODO PARA LA PRODUCCION DE UNA PLANTA TRANSGENICA SIN LA INFLUENCIA DE UN GEN MARCADOR. UN METODO PARA LA INTRODUCCION DE MANERA MULTITUDINARIA DE LOS GENES DESEADOS EN UNA PLANTA.

Description

Procedimientos para la producción de plantas transgénicas.
La presente invención se refiere a un nuevo vector para la introducción de una planta que utiliza procedimientos de ingeniería genética para obtener una planta transgénica; a un procedimiento para la producción de una planta transgénica libre de la influencia de un marcador genético que utiliza este vector; y a un procedimiento para la introducción de por lo menos dos genes deseados en una planta utilizando este vector.
La transformación de los microorganismos y de las células cultivadas que utilizan ingeniería genética se aplica actualmente a la producción de sustancias fisiológicamente activas útiles como medicinas y de este modo contribuye en gran medida con la industria. En el campo de la reproducción vegetal, la aplicación industrial de la ingeniería genética se queda rezagada debido a que los ciclos vitales de las plantas son mucho más prolongados que los de los microorganismos. Sin embargo, como esta técnica permite introducir directamente un gen deseado en las plantas que deben reproducirse, ello presenta las siguientes ventajas en comparación con la reproducción clásica que requiere múltiples cruces.
(a)
Es posible introducir únicamente una característica que debe mejorarse.
(b)
Es posible introducir las características de otras especies aparte de las plantas (tales como microorganismos y similares).
(c)
Es posible acortar en gran medida el periodo de reproducción.
Por este motivo, los procedimientos de ingeniería genética para reproducción de plantas han sido investigados a fondo.
La producción de plantas transgénicas requiere las tres etapas siguientes.
(1)
Introducir el gen deseado en la célula vegetal (incluyendo la introducción del mismo en los cromosomas, núcleo y similares).
(2)
Seleccionar el tejido vegetal integrado únicamente por células en las que se ha introducido el gen deseado.
(3)
Regenerar una planta a partir del tejido vegetal seleccionado.
Para seleccionar los tejidos transgénicos en los cuales se ha introducido un gen deseado, ha sido deseable la identificación visual del tejido en el que se expresa el gen sin regenerar la nueva planta. Para conseguir esto, se introduce de forma típica el gen deseado en la célula vegetal junto con un gen marcador cuya expresión puede detectarse fácilmente en la etapa de cultivo de la célula. Es decir, la expresión del gen marcador se utiliza como índice de la introducción del gen deseado. Los ejemplos de genes marcadores convencionales comprenden los genes resistentes a antibióticos, tales como el gen resistente a kanamicina (es decir, NPTII; el gen de neomicina fosfotransferasa), un gen resistente a la higromicina (es decir, HPT; el gen de higromicina fosfotransferasa), los genes de aminoácidos sintetasa, tales como el gen de nopalina sintetasa (NOS), un gen de octopina sintetasa (OCS) y un gen resistente a la sulfonilurea (es decir, ALS; el gen de acetoacetato sintetasa) que comunica resistencia a los productos químicos agrícolas.
Sin embargo, la expresión de un gen marcador puede producir graves problemas cuando dicha planta transgénica se utiliza en alimentación. Esto es, es muy difícil asegurar que un producto génico producido mediante la expresión de un gen marcador sea seguro para el cuerpo humano. Por consiguiente si una planta transgénica que contiene un gen marcador está destinada a ser comercializada como alimento, debe realizarse una investigación detallada para determinar la influencia del gen marcador en el cuerpo humano. Por ejemplo, el gen NPTII se ha utilizado como gen marcador en el ámbito de laboratorio desde el principio de la década de los 80. En 1994, el producto de este gen se aceptó finalmente como un aditivo alimenticio por la U.S. Food and Drug Admnistration (FDA). Desde entonces, se han utilizado en alimentación las plantas transgénicas que contienen el gen NPTII como gen marcador. Sin embargo, algunos consumidores de productos que contienen el gen NPTII están todavía preocupados por este efecto del gen.
Además, los genes marcadores que se utilizan en la práctica son exclusivamente genes, tal como el gen NPTII, que contribuyen a la desintoxicación de una sustancia inhibidora del crecimiento en las células vegetales. Por consiguiente, para seleccionar el tejido vegetal transgénico en el que se ha introducido el gen deseado, se cultiva el tejido en un medio de cultivo que contiene la sustancia inhibidora del crecimiento, y la expresión del gen marcador, es decir se evalúa la resistencia en el tejido a la sustancia inhibidora del crecimiento y se utiliza como índice. Sin embargo, aún cuando el tejido presente dicha resistencia, el cultivo en presencia de una sustancia inhibidora puede producir efectos secundarios indeseables en las células vegetales, tal como una disminución de la proliferación y de la rediferenciación del tejido transgénico.
Además, la expresión de un gen marcador en una célula vegetal después de la selección del tejido transgénico dificulta gravemente la reproducción vegetal como consecuencia de la introducción del gen. Esto es, cuando se introduce otro gen en una planta transgénica que contiene un gen marcador, debe controlarse la introducción del gen utilizando un gen marcador diferente. Sin embargo, la eficacia de un gen marcador varía con la especie vegetal. Por consiguiente, se necesita una prueba preliminar para establecer las condiciones de cada gen marcador (por ejemplo, está descrito que el gen HPT es más eficaz en las plantas de arroz que el gen NPTII (K. Shimamoto et al., Nature (Londres), vol. 338, pág. 274, 1989). Aún más, dado que las variedades del gen marcador están limitadas, la introducción múltiple de un gen no puede repetirse indefinidamente cambiando simplemente el gen marcador. Esto es, el número de introducciones génicas en una determinada planta está autolimitada por la variedad de genes marcadores que puede utilizarse en esta planta. Además, la clase de gen marcador que puede utilizarse realmente está limitada como se mencionó anteriormente. Por consiguiente, es deseable encontrar un procedimiento para eliminar el gen marcador del cromosoma tras la selección del tejido vegetal transgénico para excluir la influencia del gen marcador en la célula, tejido y planta.
Para eliminar la influencia de un gen marcador, se han descrito dos procedimientos. En un procedimiento, se introduce un gen marcador y un transposón en un cromosoma de la planta y posteriormente se elimina de éste después del transposón (patente internacional expuesta al público nº WO 92/01370). En un segundo procedimiento, se utiliza el sistema de recombinación específico del punto del fago P1 en lugar del transposón (patente internacional expuesta al público nº WO 92/01283). Utilizando estos procedimientos, es posible obtener una célula en la que se haya eliminado del cromosoma el gen marcador de la planta en una proporción dada después de la introducción del gen. Desgraciadamente, la probabilidad de que el gen marcador esté eliminado es muy baja.
Además, las células vegetales en las que el gen marcador ha sido eliminad o de los cromosomas que utilizan estos procedimientos están dispersadas entre las células en las que los marcadores están todavía presentes y expresados. Estas dos clases de células no pueden distinguirse a simple vista.
Pueden seleccionarse células vegetales que contienen genes marcadores y un gen deseado basándose en su resistencia química, requisitos nutritivos y similares. Sin embargo, en el momento de la selección, las células que carecen de genes marcadores presentan una inhibición grave del crecimiento y se destruyen en muchos casos. Por consiguiente, estas selecciones no pueden aplicarse para obtener células que carecen de genes marcadores.
Para obtener plantas que carecen de un gen marcador y que contienen el gen deseado utilizando los procedimientos mencionados anteriormente, el tejido de la planta, en la que se mezclan las células que carecen del gen marcador y las células que contienen los genes marcadores, se multiplica, se regenera y a continuación se analiza para la selección, utilizando procedimientos tales como la hibridación de Southern o la reacción en cadena de polimerasa. Este procedimiento se basa en la suposición de que un ejemplar regenerado procede de una sola célula y por consiguiente todas las células de la planta deberían presentar las mismas características. Por este motivo, un ejemplar procedente de una célula que carece del gen marcador está integrado únicamente por dichas células. Desgraciadamente, las células que constituyen dicho ejemplar regenerado no son necesariamente uniformes. Las células que carecen del cromosoma del gen marcador y las células que contienen el gen marcador coexisten y se distribuyen de manera muy irregular aún en la misma planta regenerada individual y en su mismo tejido. Así pues, es sumamente difícil obtener un ejemplar integrado exclusivamente por células que carecen del gen marcador en la etapa en la que el tejido cultivado se rediferencia para regenerar el ejemplar.
Además, los procedimientos de selección analíticos conocidos utilizan un tejido, tal como una hoja, como muestra de prueba (no un ejemplar completo o una sola célula). Por consiguiente, se analiza únicamente la tendencia general con respecto al estado del gen marcador presente en una hoja. Además, en este caso, es corriente que la célula exenta de gen marcador y la célula que contiene el gen marcador estén ambas presentes en el mismo ejemplar o tejido. Así que, incluso si sucede que un ejemplar está formado solo por células que carecen del gen marcador, es difícil seleccionar éste. Aún si no se detecta la presencia del gen marcador en este tejido, los tejidos en otros puntos del mismo ejemplar pueden contener el gen marcador o demuestra simplemente que la cantidad de gen marcador está por debajo del límite detectado. Por consiguiente, es imposible determinar si la muestra de prueba está completamente exenta de las células que contienen el gen marcador.
Utilizando los procedimientos mencionados anteriormente, se obtiene un ejemplar que carece del gen marcador únicamente a partir de una célula germinal, tal como de polen, un cigoto y similares. Cuando se realiza la autopolinización utilizando el cigoto que carece del gen marcador, se obtiene un óvulo fertilizado que carece del gen marcador en una proporción fija según una ley clásica de la herencia y a partir de este óvulo fertilizado, se produce un ejemplar integrado solamente por las células que tienen las mismas características que el óvulo fertilizado. Los procedimientos analíticos convencionales tales como la hibridación de Southern pueden realizarse utilizando este ejemplar. Es decir, incluso si la célula que carece del gen marcador es producida por el procedimiento descrito en el informe mencionado en la presente memoria, el ejemplar integrado solamente por dichas células durante el primer periodo se obtiene por rediferenciación de la planta del tejido cultivado que contiene dicha célula, realizando el cruzamiento de la planta regenerada y obteniendo la descendencia de F_{1} o generaciones posteriores. El ejemplar obtenido de este modo puede seleccionarse como un ejemplar que carece del gen marcador.
Para eliminar el gen marcador de la planta transgénica, el documento JP-A-6-276872 describe una técnica para la introducción génica en la que un gen marcador se inserta en un vector del plásmido independiente diferente del vector que contiene el gen deseado. El plásmido que contiene el gen marcador se extrae de la célula después de terminar la introducción del gen (el término "JP-A" tal como se utiliza en la presente memoria significa una solicitud de patente japonesa publicada). Sin embargo, esta técnica requiere una etapa de cruzamiento para la eliminación del gen marcador. A este respecto, la técnica es la misma que las de los dos informes mencionados anteriormente.
Los procedimientos anteriores son difíciles de aplicar a las plantas leñosas que tienen un periodo de crecimiento prolongado, a los ejemplares estériles o a los ejemplares híbridos en los que F_{1} es valioso por sí mismo. Además, cuando se utilizan los elementos eliminables del ADN, tal como un transposón y similares, la proporción en la que estos elementos se extraen del ADN cromosómico, del ADN del vector vírico y similares donde estos elementos están presentes y funcionan típicamente es sumamente baja. Por consiguiente, es necesario que la eliminación de estos elementos (es decir, la eliminación del gen marcador) pueda detectarse fácilmente de hecho por lo menos en la etapa del tejido cultivado). Cuando éste no puede detectarse antes de la rediferenciación del tejido cultivado y de la formación de una generación posterior mediante el cruzamiento del ejemplar regenerado, el procedimiento no es práctico.
Por consiguiente, un objetivo de la presente invención consiste en proporcionar un vector para la introducción de un gen deseado en una planta, que comprende el gen deseado, por lo menos un gen inductor de anomalía morfológica como un gen marcador y un elemento eliminable del ADN, en el que dicho gen inductor de anomalía morfológica está colocado de modo que se elimina junto con el elemento eliminable del ADN y en el que dicho gen deseado está colocado de modo que no se elimina junto con el elemento eliminable del ADN.
Además la memoria describe un vector que contiene un gen deseado que debe introducirse en una planta y un gen marcador, en la que la planta que contiene el mismo no presenta un efecto desfavorable en el cuerpo humano cuando se ingiere, incluso si el gen marcador está expresado.
Además, se describe un vector para la introducción de un gen deseado en una planta, en la que el vector contiene un gen marcador que permite la selección de un tejido transgénico sin utilización de una sustancia inhibidora del crecimiento de la célula vegetal que disminuye la actividad de la célula vegetal.
Todavía otro aspecto de la memoria consiste en describir un vector para la introducción de un gen deseado en una planta, en el que el vector contiene un gen marcador y funciona para excluir la influencia de un gen marcador eliminando el gen marcador del ADN, en el que el gen marcador está presente y funciona. Utilizando este vector, puede introducirse repetidamente un gen deseado de manera eficaz.
Un aspecto adicional de la memoria consiste en describir un procedimiento para la producción de una planta transgénica que utiliza dicho vector, que puede excluir la influencia del gen marcador, sin experimentar la etapa de producción de F_{1} o de generaciones posteriores por cruzamiento, y un procedimiento para la introducción de numerosos genes en una planta aplicando el procedimiento descrito anteriormente.
Estos y otros aspectos pueden conseguirse utilizando un vector, que comprende un gen deseado y por lo menos un gen inductor de anomalía morfológica (denominado en lo sucesivo "MAI") como gen marcador.
Se describe asimismo la utilización de dicho vector, en la que se extrae el gen marcador del ADN tras su expresión. La expresión del gen marcador y la desaparición de su función son detectables mediante cambios morfológicos en el tejido en el que se ha introducido el gen marcador.
Por otra parte, estos y otros objetivos de la presente invención se han conseguido utilizando un vector que comprende un gen deseado, por lo menos un gen MAI como gen marcador y un elemento eliminable del ADN. El gen MAI está colocado de modo que se elimina junto con el elemento eliminable del ADN. El gen deseado está colocado de modo que no se elimina junto con el elemento eliminable del ADN.
Un objetivo adicional de la presente invención consiste en proporcionar un procedimiento para la producción de una planta transgénica sin la influencia de un gen marcador, que comprende las etapas siguientes:
(A)
introducir un vector en una célula vegetal, en la que dicho vector comprende un gen deseado, por lo menos un gen MAI como gen marcador y un elemento eliminable del ADN, en la que dicho gen MAI está colocado de modo que se elimina junto con el elemento eliminable del ADN y en la que dicho gen deseado está colocado de modo que no se elimina junto con el elemento eliminable del ADN,
(B)
cultivar la célula vegetal obtenida en (A), detectar un tejido vegetal morfológicamente anormal que aparece durante el cultivo y seleccionar dicho tejido morfológicamente anormal, y
(C)
cultivar dicho tejido morfológicamente anormal seleccionado en (B), detectar un tejido morfológicamente normal que aparece durante el cultivo y seleccionar dicho tejido morfológicamente anormal.
Todavía además, la presente invención proporciona un procedimiento para la introducción de por lo menos dos genes deseados en una planta, que comprende la realización de las siguientes etapas por lo menos dos veces:
(A)
introducir un vector en una célula vegetal, en la que dicho vector comprende un gen deseado, por lo menos un gen MAI como gen marcador y un elemento eliminable del ADN, en la que dicho gen MAI está colocado de modo que se elimina junto con el elemento eliminable del ADN y en la que dicho gen deseado está colocado de modo que no se elimina junto con el elemento eliminable del ADN,
(B)
cultivar la célula vegetal obtenida en (A), detectar un tejido vegetal morfológicamente anormal que aparece durante el cultivo y seleccionar dicho tejido morfológicamente anormal, y
(C)
cultivar dicho tejido morfológicamente anormal seleccionado en (B), detectar un tejido morfológicamente normal que aparece durante el cultivo y seleccionar dicho tejido morfológicamente anormal.
Además, estos y otros objetivos de la presente invención se han conseguido mediante una planta regenerada cultivando el tejido morfológicamente normal descrito anteriormente.
La Fig. 1 es un diagrama del plásmido Ti y una cartografía de la endonucleasa de restricción del fragmento Pst I en una región de T-ADN de una cepa PO22 de A. tumefaciens.
La Fig. 2 es un diagrama de la construcción de pIPT2.
La Fig. 3 es un diagrama de la construcción de pIPT3 a partir de pIPT2.
La Fig. 4 es un diagrama de la construcción de pIPT4 a partir de pIPT3.
La Fig. 5 es la cartografía de la endonucleasa de restricción de una región de T-ADN en la estructura de pIPT4.
La Fig. 6 es el resultado del análisis por PCR de un fenotipo del brote terminal de una planta de tabaco en la que se ha introducido un gen utilizando pIPT4.
La Fig. 7 es un diagrama de la construcción de pNPI102.
La Fig. 8 es un diagrama de la construcción de pNPI103 a partir de pIPT4 y pNPI102
La Fig. 9 es un diagrama de la construcción de pNPI106 a partir de pNPI103.
La Fig. 10 es la cartografía de la endonucleasa de restricción de una región de T-ADN en la estructura de pNPI106.
La Fig. 11 es una fotografía del brote nº 2 tras un mes de cultivo en el Ejemplo 2.
La Fig. 12 es una fotografía del brote nº 8 tras un mes de cultivo en el Ejemplo 2.
La Fig. 13 es el resultado de un análisis por PCR del brote nº 8 en el Ejemplo 2.
La Fig. 14 es el resultado del análisis por PCR de los ejemplares normales obtenidos de los brotes nº 13-1 y nº 14-1 en el Ejemplo 3.
La Fig. 15 es una fotografía de los brotes normales diferenciados de un fenotipo del brote terminal de una planta de tabaco en el Ejemplo 3.
La Fig. 16 es el resultado del análisis por PCR de un ejemplar normal que se obtiene de una hoja formada a partir del brote nº 7 en el Ejemplo 2.
La Fig. 17 es un diagrama de la construcción del pNPI128.
La Fig. 18 es un diagrama de la construcción del pNPI129 a partir de pNPI128.
La Fig. 19 es un diagrama de la construcción del pNPI132 a partir de pNPI101 y pNPI129.
La Fig. 20 es la cartografía de la endonucleasa de restricción de una región de T-ADN en la estructura de pNPI132.
La Fig. 21 es el resultado del análisis por PCR de los ejemplares normales obtenidos a partir de los brotes nº 15 a nº 21 en el Ejemplo 5 utilizando cebadores en los que se detectó la existencia de un gen ipt.
La Fig. 22 es el resultado del análisis por PCR de los ejemplares normales obtenidos a partir de los brotes nº 15 a nº 21 en el Ejemplo 5 utilizando cebadores en los que se detectó la eliminación de una zona soportada por un par Rs que incluye un gen ipt.
La Fig. 23 es el resultado del análisis por PCR de los ejemplares normales obtenidos a partir de los brotes nº 15 a nº 21 en el Ejemplo 5 utilizando cebadores en los que se detectó la existencia de un gen GUS.
La Fig. 24 es el resultado del análisis por PCR de los ejemplares normales obtenidos a partir de la línea que no pudo formar un fenotipo del brote terminal en el Ejemplo 5.
La Fig. 25 es un diagrama de la construcción del pNPI702.
La Fig. 26 es la cartografía de la endonucleasa de restricción de una región de T-ADN en la estructura de pNPI702.
La Fig. 27 es una fotografía de los brotes normales diferenciados de un fenotipo del brote terminal del álamo temblón híbrido en el Ejemplo 7.
La Fig. 28 es la cartografía de la endonucleasa de restricción de una región de T-ADN en la estructura de pNPI140.
La Fig. 29 es el resultado del análisis por PCR de un brote normal diferenciado a partir de un fenotipo del brote terminal después de la introducción de numerosos genes en el Ejemplo 8.
Tal como se utiliza en la presente memoria, el gen MAI es un gen que produce en un tejido de una planta morfológicamente anormal diferenciación tal como enanismo, destrucción del dominio apical, cambio de pigmentos, formación de una agalla en la copa, formación de raíces fasciculadas, ondulación de las hojas o similares. Con respecto al gen MAI preferido, pueden utilizarse los genes aislados de las bacterias del género Agrobacterium o similares que producen tumor o teratoma (p. ej., formación de brotes adventicios y raíces adventicias) en varias plantas. Ejemplos de estos genes MAI variados incluyen los genes de la síntesis de citoquinina (p. ej., el gen ipt (isopenteniltransferasa) (A. C. Smigocki, L. D. Owens, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, vol. 85, pág. 5131, 1988), iaaM (triptófano monooxigenasa) (H. J. Klee et al, GENES & DEVELOPMENT, vol. 1, pág. 86, 1987), el gen 5 (H. Körber et al., EMBO Journal, vol. 10, pág. 3983, 1991), el gen 6b (P. J. J. Hooykaas et al., Plant Mol. Biol., vol. 11, pág. 791, 1988) y los genes rol tales como rolA, rolB, rolC y rolD (F. F. White et al., J. Bacteriol., vol. 164, pág. 33, 1985). Además, ejemplos de los mismos comprenden un gen iaaL (ácido indolacético-lisina sintetasa) tal como Pseudomonas syringae subsp. savastanoi (A. Spena et al., Mol. Gen. Genet., vol. 227, pág. 205, 1991), genes con la secuencia homeo y los genes del fitocromo en varias plantas. Preferentemente, se utilizan los genes de la síntesis de la citoquinina tales como el gen ipt o por lo menos un gen seleccionado de entre los genes rol (más preferentemente, los genes rol que contienen los genes rolA, rolB y rolC). El gen ipt está presente en la T del ADN de Agrobacterium tumefaciens y produce la destrucción del dominio apical. Los genes rol que contienen los genes rolA, rolB y rolC están presentes en la T del ADN de Agrobacterium rhizogenes y por lo menos uno de estos produce la formación de raíces fasciculadas, enanismo, ondulación de las hojas y similares de una planta regenerada a partir de la raíz fasciculada.
Utilizando las técnicas de la presente invención, se puede diseñar una combinación de estos genes marcadores, de modo que una estructura científica, tal como un brote adventicio, una raíz adventicia o similares se rediferencia en una planta específica en la que se introducen estos genes marcadores. En la presente invención, puede utilizarse dicha combinación de genes MAI, según las condiciones de producción de la planta transgénica, tal como el género de planta en la que deben introducirse los genes.
El tejido morfológicamente anormal producido mediante la introducción del gen MAI en la célula está integrado únicamente por las células que contienen este gen. Por consiguiente, utilizando este gen como gen marcador, se construye un vector junto con el gen deseado. Cuando se introduce este vector en la célula vegetal y se cultiva la célula transgénica, el tejido integrado únicamente por estas células en el cual se introduce el gen marcador y el gen deseado puede seleccionarse a simple vista seleccionando los tejidos morfológicamente anormales formados a partir de esta célula.
Los vectores adecuados útiles según la presente invención presentan una secuencia de ADN que introduce un gen extraño en una célula anfitriona y que expresa la célula extraña en una célula de un anfitrión.
Cuando se introduce el gen utilizando el vector de la presente invención, el tejido vegetal integrado únicamente por la célula transformada puede seleccionarse a simple vista cultivando meramente la célula tras la operación para la introducción del gen en un medio de cultivo corriente tal como el medio de cultivo MS (Murashige-Skoog) en condiciones de cultivo ordinarias. Dado que no existe necesidad de utilizar una sustancia especial para seleccionar el tejido transformado, tal como una sustancia inhibidora del crecimiento de la célula vegetal o similares, no sólo es el procedimiento simplificado, sino también la actividad de la célula vegetal no ha disminuido mediante dicha sustancia. Además, la planta posee intrínsecamente el gen MAI o el gen MAI se introduce espontáneamente en la planta por infección con bacterias o similares. Por consiguiente, la planta obtenida utilizando el vector de la presente invención no es diferente de las plantas naturales que presentan esta anomalía morfológica.
Los vectores adecuados según la presente invención incluyen un vector en el que el gen MAI está colocado de modo que se elimina junto con el elemento eliminable del ADN y el gen deseado está colocado de modo que no se retira junto con el elemento eliminable del ADN.
Tal como se utiliza en la presente memoria, el elemento eliminable del ADN es un elemento de una secuencia de ADN que se extrae del ADN en el que el elemento del ADN existe y funciona. En las plantas, un transposón presente en un cromosoma es conocido como este elemento. La estructura, actividad y comportamiento de los transposones ha sido casi completamente identificada. Para que funcione el transposón, se requieren dos componentes en principio, (1) una enzima que se expresa en el gen presente en ésta y que cataliza la escisión y transposición del propio transposón (transposasa) y (2) la secuencia de unión del ADN que están presentes en la zona terminal del transposón y en las que actúa la transposasa. Mediante estos elementos se escinde el transposón en el cromosoma en el que existe y a continuación se transpone normalmente a una nueva posición en el ADN. Sin embargo, en una determinada proporción, el transpo-
són también desaparece sin ser transpuesto. La presente invención utiliza dicho error de transposición del transposón.
El transposón puede ser de uno de los dos tipos, bien un transposón autónomo o un transposón no autónomo. El transposón autónomo mantiene los dos elementos, la transposasa y la secuencia de unión al ADN. En el transposón autónomo, la transposasa se expresa y se une a la secuencia de unión del ADN para la actuación, por lo que el transposón se escinde de manera autónoma del cromosoma. El transposón no autónomo conserva la secuencia terminal de unión al ADN a la cual se une la transposasa para su actuación. En el transposón no autónomo, el gen de la transposasa experimenta una mutación de modo que la transposasa no se expresa; de este modo el transposón no puede escindirse del cromosoma de manera autónoma. Sin embargo, cuando la transposasa es suministrada al transposón no autónomo desde el transposón autónomo o desde un gen de la transposasa independiente, el transposón no autónomo se comporta de manera similar al transposón autónomo.
Ejemplos de transposones autónomos comprenden Ac y Spm aislados del maíz (A. Gierl y H. Saedler, Plant Mol. Biol., vol. 19, pág. 39, 1992). Ac pueden obtenerse por digestión del locus del gen wx-m7 en el cromosoma del maíz con la endonucleasa de restricción Sau3A (U. Behrens et al., Mol. Gen. Genet., vol. 194, pág. 346, 1992). Este transposón autónomo es el más analizado entre los transposones vegetales. De hecho, la secuencia del ADN ya ha sido determinada (M. Müller-Neumann et al., Mol. Gen. Genet., vol. 198, pág. 19, 1984).
Ejemplos de transposones no autónomos incluyen Ds y dSpm obtenidos eliminando las regiones internas de Ac y Spm, respectivamente (H.-P. Döring y P. Starlinger, Ann. Rev. Genet., vol. 20, pág. 175, 1986) y los aislados de muchas plantas, aparte del maíz, tales como boca de dragón, las de floración diurna y similares (por ejemplo, Y. Inagaki et al., Plant Cell, vol. 6, pág. 375, 1994). Cuando estos transposones se introducen en los cromosomas de las plantas exógenas, estos transposones se escinden también en un cromosoma y se transponen en el momento en que presentan la actividad (por ejemplo, B. Baker et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, vol. 83, pág. 4844, 1986).
En la presente invención, pueden utilizarse tanto los transposones autónomos como los no autónomos. Los transposones no autónomos pueden utilizarse en el momento de la inserción en estos de un gen de transposasa funcional.
Otro elemento de ADN eliminable, que no está presente en las plantas, pero que puede utilizarse según la presente invención es un elemento procedente de un sistema de recombinación específica de sitio. Un sistema de recombinación específica de sitio consta de dos elementos, (1) un punto de recombinación (correspondiente al elemento eliminable del ADN de la presente invención) que presenta una secuencia de ADN característica, y (2) una enzima que se une a la secuencia de ADN específicamente y cataliza la recombinación entre las secuencias de ADN si existen dos o más secuencias (recombinasa). Cuando las dos secuencias de ADN están orientadas en la misma dirección en un intervalo dado en la misma molécula de ADN, la zona soportada por estas secuencias de ADN se escinde de la molécula de ADN por ejemplo un plásmido, cromosoma o similares. Cuando las dos secuencias de ADN están orientadas en direcciones opuestas en la misma molécula de ADN, la zona soportada por esta secuencia de ADN se invierte.
La presente invención utiliza preferentemente la escisión anterior. Tanto la escisión como la inversión en el punto de recombinación se producen como resultado de la recombinación homóloga mediante el sistema de recombinación específica de sitio, que es diferente del mecanismo que utiliza el transposón. Es conocido que el gen de recombinasa no está necesariamente presente en la misma molécula de ADN, en la que existe el punto de recombinación. El gen de recombinasa solo necesita estar presente en la misma célula y expresarse para escindir o invertir la zona soportada por las dos secuencias de ADN (N. L. Craig, Annu. Rev. Genet., vol. 22, pág. 77, 1988).
Actualmente, los sistemas de recombinación específicas de sitio han sido identificados en microorganismos tales como fagos, bacterias (p. ej., E. coli), levaduras y similares. Ejemplos de éstos incluyen un sistema Cre/lox, un sistema pSR1, un sistema FLP, un sistema cer, y un sistema fim (por ejemplo, N. L. Craig, Annu. Rev. Genet., vol. 22, pág. 77, 1988). Cuando el sistema de recombinación específica de sitio separado de estos microorganismos mediante la utilización de un sistema Cre/lox procedente del fago P1 (documento WO 93/01283) se introduce en organismos (incluyendo plantas) diferentes del organismo del que procede este sistema, se comporta de la misma manera que en el organismo original. El sistema de recombinación específica de sitio de la levadura (Zygosaccharomyces rouxii) sistema (pSR1) (H. Matsuzaki et al., J. Bacteriology, vol. 172, pág. 610, 1990)) puede también utilizarse según la presente invención. El sistema pSR1 mantiene también su función propia en las plantas superiores (H. Onouchi et al., Nucleic Acid Res., vol. 19, pág. 6373, 1991).
En la presente invención, el gen inductor de anomalía morfológica (MAI) se inserta en una posición en la que este gen se escinde junto con el elemento eliminable del ADN. Por ejemplo, cuando se utiliza el transposón como elemento eliminable del ADN, el gen MAI puede insertarse en una posición que no influye en la escisión del transposón y que está corriente arriba de la zona activadora del gen de la transposasa pero corriente abajo de la zona terminal a la que se une la transposasa. Cuando se utiliza el sistema pSR1, el gen MAI puede insertarse en cualquier posición dentro de la zona soportada por las secuencias características del ADN que no inhiben la expresión de la recombinasa.
En la presente invención, el gen MAI está preferentemente presente dentro del elemento eliminable del ADN. Por otra parte, la posición del gen deseado no está particularmente limitada; sin embargo, preferentemente, el gen deseado está presente fuera del elemento eliminable del ADN.
Utilizando el vector de dicha estructura tras la introducción del gen deseado, puede eliminarse el gen MAI con una determinada frecuencia, junto con el elemento eliminable del ADN, a partir del ADN en el que está introducido y funciona. El gen deseado que no se elimina junto con el gen marcador se conserva en el mismo ADN. Puede utilizarse el vector para introducir múltiples veces un gen deseado en una determinada planta. Además, dado que la pérdida de la función de este gen MAI puede detectarse a simple vista como un cambio morfológico del tejido transgénico durante el cultivo, el tejido integrado únicamente por las células con el gen deseado pero sin el gen marcador puede seleccionarse con facilidad y sin necesidad de un procedimiento especial. Por consiguiente, aún cuando dicha célula se forme realmente en una proporción baja, la célula puede seleccionarse suficientemente para hacer que el procedimiento sea útil en la práctica. Además, no sólo la introducción múltiple del gen que utiliza este vector puede repetirse muchas veces, sino que puede repetirse antes de que se regenere una planta madura. De este modo, la introducción múltiple puede realizarse de manera eficaz. Para obtener la planta transgénica individual integrada únicamente por dichas células, la planta puede regenerarse a partir del tejido seleccionado de este modo sin tener que experimentar la etapa de cruzamiento. La planta transgénica individual obtenida de este modo está completamente libre de cualquier efecto desfavorable en el cuerpo humano producido por el gen marcador tal como se mencionó anteriormente. Además, la utilización de este vector no requiere una sustancia inhibidora del crecimiento celular que pueda disminuir la actividad de la célula en la etapa de selección del tejido transgénico.
El vector de la presente invención puede utilizarse en cualquier planta en la que pueda introducirse el gen por procedimientos de ingeniería genética. El gen deseado según la presente invención puede ser cualquier gen para el que se puedan comunicar características excelentes desde el punto de vista agrícola y cualquier gen que permita estudios de mecanismos de expresión génica y similares, aunque no se comuniquen necesariamente características excelentes desde el punto de vista agrícola.
Para producir una proteína tal como la enzima procedente de un gen, se requieren generalmente una secuencia génica estructural que codifique la información del polipéptido y las secuencias reguladoras del gen estructural, tal como una secuencia de activador (secuencia de iniciación de la expresión), una secuencia de terminador (secuencia de terminación de la expresión) y similares. Ejemplos de secuencia de activador adecuada que funciona en la planta comprende el activador 35S de un virus del mosaico de la coliflor (J. T. Odell et al., Nature (Londres), vol. 313, pág. 810, 1985), el activador de una nopalina sintetasa (W. H. R. Langridge et al., Plant Cell Rep., vol. 4, pág. 355, 1985), y el activador de la subunidad pequeña de la difosfato ribulosa carboxilasa/oxigenasa (R. Fluhr et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, vol. 83, pág. 2358, 1986). Los ejemplos de secuencias de terminador adecuadas comprenden la señal de poliadenilación de una nopalina sintetasa (A. Depicker et al., J. Mol. Appl. Gen., vol. 1, pág. 561, 1982) y la señal de poliadenilación de una octopina sintetasa (J. Gielen et al., EMBO J., vol. 3, pág. 835, 1984). Por consiguiente, cuando sea necesario, un gen en el vector de la presente invención comprende un gen estructural y sus secuencias reguladoras de la expresión génica. El gen, o el gen y las secuencias reguladoras, puede obtenerse por síntesis clínica o por clonación del ADNc o del ADN genómico.
El vector de la presente invención puede introducirse indirectamente en la célula vegetal mediante virus o bacterias con los que se infectan las plantas (I. Potrykus, Annu. Rev. Plant Physiol. Plant Mol. Biol., vol. 42, pág. 205, 1991). Ejemplos de virus adecuados incluyen el virus del mosaico de la coliflor, geminivirus, el virus del mosaico del tabaco y el virus del mosaico de las gramíneas. Los ejemplos de bacterias adecuadas comprenden la Agrobacterium tumefaciens (denominada en lo sucesivo A. tumefaciens) y Agrobacterium rhizogenes (denominado en lo sucesivo A. rhizogenes). Las plantas dicotiledoneas son conocidas generalmente porque se infectan con las bacterias del género Agrobacterium. Recientemente, ha sido descrita también la introducción de genes en las plantas monocotiledoneas por la infección de estas plantas con ellas (por ejemplo, en la patente internacional expuesta al público nº WO 94/00977).
El vector de la presente invención puede introducirse directamente en la célula vegetal por medios físicos y químicos tales como una microinyección, una electroporación, un procedimiento con polietilenglicol, un procedimiento de fusión y una penetración balística a alta velocidad (I. Potiykus, Annu. Rev. Plant. Physiol. Plant. Mol. Biol., vol. 42, página 205, 1991). Dado que el procedimiento general de introducción indirecta que utiliza el género Agrobacterium no puede aplicarse a muchas plantas monocotiledoneas y a las plantas dicotiledoneas que son resistentes a la infección con Agrobacterium, los procedimientos de introducción directa mencionados anteriormente son eficaces para estas plantas.
Para su utilización en la presente invención el vector no está particularmente limitado siempre que se satisfagan los requisitos de la presente invención. Por ejemplo, si el vector se introduce indirectamente en la célula vegetal, el vector puede ser un vector Ti o un vector vírico. Ejemplos de vector de Ti para su utilización en la presente invención comprenden Bin19 (M. Bevan et al., Nucleic Acids Res., vol. 12, pág. 8711, 1984), pRAL3940 (A. Hoekema et al., Plant Mol. Biol., vol. 5, pág. 85, 1985), pGA492 y pGA482 (G. An, Plant Physiol., vol. 81, pág. 86, 1986), pC22 (C. Simoens et al., Nucleic Acids Res., vol. 14, pág. 8073, 1986), pAGS111 (P. van den Elzen et al., Plant Mol. Biol., vol. 5, pág. 149, 1985), pEND4K (H. J. Klee et al., Bio/Technology, vol. 3, pág. 637, 1985), pGV831 (R. Delaere et al., Nucleic Acids Res., vol. 13, pág. 4777, 1985), y pMON200 (R. T. Fraley et al., Bio/Technology, vol. 3, pág. 629, 1985). Ejemplos del vector vírico para su utilización en la presente invención comprenden el vector del virus del mosaico de la coliflor (N. Brisson et al., Nature (Londres), vol. 310, pág. 511, 1984), del geminivirus (R. J. Hayes et al., Nature (Londres), vol. 334, pág. 179, 1988), el vector del mosaico de las gramíneas (R. French et al., Science, vol. 231, pág. 1294, 1986), el vector del mosaico del tabaco (N. Takamatsu et al., EMBO J., vol. 6, pág. 307, 1987) y el vector de la agroinfección (N. Grimsley et al., Nature (Londres), vol. 325, pág. 177, 1987). Sin embargo, los vectores para su utilización en la presente invención no se limitan a éstos.
Además, el gen deseado para su utilización en la presente invención no está particularmente limitado. La naturaleza del propio gen deseado no es crítica para la presente invención. Ejemplos del gen deseado para su utilización en la presente invención comprenden los genes para resistencia a la enfermedad (p. ej., el gen para la endotoxina del Bacillus thuringiensis, documento WO 92/20802), para resistencia a herbicidas (p. ej., el gen mutante de la acetolactato sintetasa, documento WO 92/08794), la proteína de almacenamiento en semillas (p. ej., el gen de glutelina, documento WO 93/18643), para la síntesis de ácidos grasos (p. ej., el gen de acil-ACP tioesterasa, documento WO 92/20236), para la hidrólisis de la pared celular (p. ej., el gen de la poligalacturonasa (D. Grierson et al., Nucleic Acids Res., vol. 14, pág. 8595, 1986), para la biosíntesis de la antocianina (p. ej., el gen de la chalcona sintetasa (H. J. Reif et al., Mol. Gen. Genet., vol. 199, pág. 208, 1985), para la biosíntesis de etileno (p. ej., el gen de ACC oxidasa (A. Slater et al., Plant Mol. Biol., vol. 5, pág. 137, 1985), el sistema oxígeno activo-antioxidante (p. ej., el gen de la glutación reductasa (S. Greer y R. N. Perham, Biochemistry, vol. 25, pág. 2736, 1986) y para la biosíntesis de la lignina (p. ej., el gen de la fenilalanina amoniaco-liasa, el gen de alcohol cinamílico deshidrogenasa, el gen de o-metiltransferasa, el gen de cinamato 4-hidroxilasa, el gen de 4-cumarato-CoA ligasa, el gen de cinamoil CoA reductasa (A. M. Boudet et al., New Phytol., vol. 129, pág. 203, 1995). Sin embargo, los genes deseados para su utilización en la presente invención no se limitan a éstos.
Además, la planta anfitriona para su utilización en la presente invención no está particularmente limitada. Ejemplos de plantas herbáceas utilizadas como planta anfitriona incluyen el tabaco (Tabacum), tomate (Lycopersicom), batata (Impoea), patata (Solanum), zanahoria (Dacus), lechuga (Lactuoca), coliflor (Brassica), calabaza (Brassica), colza (Brassica), girasol (Helianthus), remolacha azucarera (Bela), espárrago (Asparagus), plátano (Musa), algodón (Gossypium), arabidopsis (Arabidopsis), alfalfa (Medicago), guisantes (Pisum), soja (Glycine), arroz (Oryza), maíz (Sea) y centeno (Secale). Ejemplo de plantas arbustivas utilizadas como plantas anfitrionas comprenden el álamo (Populus), eucalipto (Eucalyptus), acacia (Acacia), peral (Pyrus), manzano (Malus), vid (Vitis), nogal (Juglans), ciruelo (Prunus), rosal (Rosa) y abeto (Picea). Sin embargo, las plantas anfitrionas para su utilización en la presente invención no se limitan a éstas.
En la presente invención, el gen MAI se expresa para construir el interior de la célula fisiológica anormal. Las anomalías fisiológicas comprenden la producción de la hormona de crecimiento vegetal en una célula vegetal, con el resultado de que la proliferación y la diferenciación de la célula que contiene el gen MAI se confunden al producir varias anomalías morfológicas. Por ejemplo, una acumulación de brotes desordenados con destrucción del dominio apical (fenotipo del brote terminal; ESP), raíces fasciculadas o similares, pueden proceder de una célula por la que se introduce dicho gen MAI. Este fenotipo se forma por proliferación y diferenciación anormales de la célula mencionada anteriormente. Por este motivo, el tejido morfológicamente anormal está integrado únicamente por la célula que contiene este gen. Por consiguiente si se construye el vector utilizando este gen como gen marcador junto con el gen deseado y se introduce en la célula vegetal y se cultiva la célula, el tejido integrado solamente por la célula en la que se han introducido el gen marcador y el gen deseado puede seleccionarse meramente a simple vista seleccionando el tejido morfológicamente anormal formado a partir de la célula vegetal. Por este motivo, es posible seleccionar a simple vista el tejido transgénico sin realizar ningún procedimiento especial tal como la adición de la sustancia inhibidora del crecimiento celular de la planta y similares a un medio de cultivo.
Mientras que los genes marcadores convencionales, tal como el gen NPTII, no se introducen en las plantas sin ingeniería genética, el gen MAI de la presente invención es un gen que las plantas retienen intrínsecamente o que es introducido de forma natural por las plantas mediante infección por bacterias o similares. Por esta razón, se considera que la seguridad de este producto génico para el cuerpo humano es bastante alta.
Además, en la presente invención, el gen MAI se injerta en una posición tal que se elimina junto con el elemento eliminable del ADN. Una vez el vector que tiene dicha estructura se introduce en la planta, el gen MAI utilizado como gen marcador se elimina del ADN junto con el elemento eliminable del ADN a una frecuencia fija que produce la pérdida de su función. Mientras tanto, el gen deseado que no se elimina junto con el elemento eliminable del ADN permanece en el mismo ADN y mantiene su función. De este modo, la expresión del mismo gen marcador puede utilizarse como índice para la introducción de un gen deseado una y otra vez. Por consiguiente, este vector produce la introducción múltiple del gen en una determinada planta cambiando meramente la estructura relacionada con el gen deseado que debe introducirse sin imponer ningún cambio en las estructuras del gen marcador ni en los demás. Por esta razón, el vector puede utilizarse repetidamente durante una cantidad ilimitada de veces.
Dado que la pérdida de la función del gen marcador, es decir, la pérdida de la función del gen MAI, puede detectarse a simple vista, el tejido integrado por células que carecen del gen marcador y que contienen el gen deseado puede obtenerse de forma segura y fácil. Esto es, el cultivo, la selección visual y la separación pueden repetirse sin necesidad de ningún procedimiento especial para obtener dicho tejido. Además, la planta integrada únicamente por las células mencionadas anteriormente puede obtenerse solamente regenerando la planta del tejido obtenido, sin tener que experimentar la etapa de cruce. Aún más, aunque un transposón es difícil de eliminar completamente del ADN porque este elemento presenta una gran capacidad para transponerse, la invención puede ponerse en práctica suficientemente porque la selección es muy eficaz.
En los Ejemplos siguientes, se realizaron los experimentos conforme a las instrucciones de Molecular Cloning, 2ª edición (Sambrook et al., eds., Cold Spring Harbor Laboratory Press, Nueva York, 1989) o a través de un fabricante a no ser que se den otras instrucciones.
Ejemplo 1 I. Construcción de un vector
Un gen ipt presente en la T del ADN de la cepa P022 patógena de A. tumefaciens (H. Wabiko, Chemical Regulation of Plants, vol. 24, pág. 35, 1989 (véase Fig. 1)) se cortó con PstI de endonucleasa de restricción y se obtuvo el plásmido pIPT1 ligando el gen ipt a la secuencia PstI de la endonucleasa de restricción del plásmido pUC7 (Molecular Cloning, 2ª edición, vol. 1, 4.10). A partir de este plásmido, un gen ipt que contiene un activador natural y una señal de poliadenilación natural se cortó con las BamHI y PstI de endonucleasas de restricción y se obtuvo el plásmido pIPT2 ligando el gen ipt a las secuencias BamHI-PstI de la endonucleasa de restricción del plásmido pUC119 (adquirido en Takara Shuzo Co., Ltd.). A partir de este plásmido, el gen estructural y la señal de poliadenilación natural del gen ipt se cortaron con RsaI de la endonucleasa de restricción, y se obtuvo el plásmido pIPT3 ligando el gen ipt a la secuencia SmaI de la endonucleasa de restricción del plásmido pUC119. Además, el gen ipt insertado en pIPT3 se cortó con las BamHI y SacI de endonucleasas de restricción, y se obtuvo el plásmido pIPT4 ligando el fragmento a las secuencias BamHI-SacI del plásmido del vector pBI121 (adquirido en Clontech Co.) que sirve para la introducción de genes en una planta. Cuando se infecta una planta con A. tumefaciens que tiene el plásmido pIPT4, una región de T-ADN que existe entre un punto LB y un punto RB, una zona de aproximadamente 5 kb que tiene el gen NPTII y el gen ipt, viene para integrarse en el cromosoma de la planta.
Se introdujo este plásmido pIPT4 en la cepa JM109 de E. coli (Escherichia coli) y se depositó de acuerdo con el Tratado de Budapest como E. coli JM109 (pIPT4) con el nº de registro FERM BP-5063.
En las Figs. 2 a 4 se presenta esquemáticamente la estrategia para la construcción del plásmido pIPT4. En la Fig. 5 se presenta la cartografía de la endonucleasa de restricción de la región de T-ADN de ésta. En las Figs. 2 a 4 y 5, "P" y "T" rodeadas por un círculo indican un activador natural y una señal de poliadenilación natural del propio gen ipt respectivamente. 35S-P indica un activador 35S de un virus del mosaico de la coliflor y Nos-P indica un activador de un gen de nopalina sintetasa. T (Fig. 4) o Nos-T (Fig. 5) indica una señal de poliadenilación del gen de nopalina sintetasa.
En este Ejemplo, como se muestra en la Fig. 5, para el gen MAI como gen marcador, se utilizó el gen ipt que contribuye a la formación de un ESP provocando la destrucción del dominio apical y el gen NPTII se utilizó como modelo del gen deseado. El gen ipt es un elemento de los oncogenes que conserva el A. tumefaciens patógeno. Una célula vegetal en la que se introduce este gen ipt produce diferenciación que conduce a la formación de un ESP durante la sobreproducción de citoquinina, que es una hormona vegetal.
En este Ejemplo, se utilizó el activador 35S de un virus del mosaico de la coliflor para la secuencia del activador del gen ipt y se utilizó la señal de poliadenilación natural del propio gen ipt para una secuencia de terminación.
II. Introducción de pIPT4 en Agrobacterium
Se inoculó una cepa LBA4404 de A. tumefaciens (adquirida en Clontech Co.) en 10 ml de medio de cultivo líquido YEB (que contenía 5 g/litro de extracto de carne de vacuno, 1 g/litro de extracto de levadura, 1 g/litro de peptona, 5 g/litro de sacarosa y MgSO 2 mM, pH de 7,2 a 22ºC (el pH a 22ºC se aplica a lo siguiente a menos que se den otras instrucciones) y se cultivó a 28ºC hasta que la DO_{630} estuvo comprendida dentro del intervalo entre 0,4 y 0,6. A continuación, se centrifugó el cultivo a 6.900 \times g durante 10 minutos a 4ºC para recoger las células. Se pusieron en suspensión las células en 20 ml de Tris-HCl 10 mM (pH 8,0) y se volvió a centrifugar la suspensión a 6.900 \times g durante 10 minutos a 4ºC. Posteriormente las células recogidas se volvieron a poner en suspensión en 200 \mul de medio de cultivo líquido YEB y se utilizó esta suspensión como solución celular para introducir un plásmido.
En un tubo de 15 mililitros (fabricado por Falcon), se mezclaron 200 \mul de la solución celular para introducir el plásmido con 6 \mug del plásmido pIPT4 obtenido en la etapa I descrita anteriormente y se enfrió la mezcla sumergiéndola durante 5 minutos en etanol que se había enfriado en nitrógeno líquido durante 30 a 40 minutos. La solución enfriada de este modo, junto con el tubo, se dejó reposar en un baño de agua a 29ºC durante 25 minutos. A continuación, se añadieron a ésta 750 \mul de medio de cultivo líquido YEB y la solución mezclada se cultivó a 29ºC durante 1 hora mientras se agitaba. Esta solución celular se extendió en el medio de cultivo YEB con agar agar (que contenía 1,2% p/v y los mismos ingredientes que los del medio de cultivo mencionado anteriormente) al cual se añadieron 50 mg/litro de kanamicina y se cultivaron a 28ºC durante 2 días. Las colonias celulares obtenidas de este modo se inocularon en medio de cultivo líquido YEB y se continuaron cultivando. Después, se extrajo el plásmido de las células por un procedimiento alcalino y se escindió con las PstI, BamHI y EcoRI de endonucleasas de restricción. Los fragmentos del plásmido obtenidos de este modo se analizaron por electroforesis en gel de agarosa y se confirmó que el plásmido pIPT4 estaba introducido en la cepa LBA4404 de A. tumefaciens.
III. Introducción de pIPT4 de Agrobacterium en una planta de tabaco
Las hojas maduras de una planta de tabaco (Nicotiana tabacum cv. xanthi, en lo sucesivo una planta de tabaco da a entender esta variedad a menos que se indique de otro modo) cultivadas en un invernadero se sumergieron en una solución acuosa de hipoclorito de sodio al 1% v/v para su esterilización y se lavaron tres veces con agua esterilizada. A continuación se retiró el nervio central de la hoja para formar discos de la hoja de aproximadamente 8 mm cuadrados. Los discos de la hoja obtenidos de este modo se sumergieron a continuación durante aproximadamente 1 minuto en una suspensión celular de la cepa LBA4404 de A. tumefaciens, se introdujo pIPT4 en la etapa II descrita anteriormente y se infectó con ésta (cuya suspensión se diluyó con agua esterilizada a DO_{630}=0,25 después de cultivo durante la noche en un medio de cultivo líquido YEB). El disco de la hoja infectado se colocó en un papel de filtro esterilizado para eliminar cualquier suspensión celular adicional. A continuación, se depositó en el medio de cultivo MS con agar-agar exento de hormonas (T. Murashige y F. Skoog, Physiol. Plant., vol. 15, pág. 473, 1962 (con la condición de que se añada agar-agar al 0,8% p/v a éste)) que contenía 50 mg/litro de acetosiringona con el envés de la hoja hacia arriba y se cultivó durante 3 días a 25ºC a plena luz (el cultivo de un explante y de un tejido vegetal y una planta se realizaron a esta temperatura y condiciones de iluminación a menos que se indique de otro modo). El disco de la hoja cultivado de este modo se trasplantó a continuación a un medio de cultivo MS con agar-agar exento de hormonas que contenía solamente 500 mg/litro de carbenicilina y se continuó el cultivo. Como resultado, se rediferenciaron 22 brotes adventicios. Se separaron estos brotes adventicios y se siguieron cultivando en un medio de cultivo con la composición mencionada anteriormente para obtener 6 líneas ESP. Estas líneas ESP se subcultivaron en el mismo medio de cultivo cada mes, y se subcultivaron en medio de cultivo MS con agar-agar exento de hormonas que no contenía carbenicilina varias veces 3 meses después de la infección. Una vez que no se observó la proliferación de Agrobacterium, se realizó una prueba de resistencia a la kanamicina y el análisis por PCR.
IV. Análisis de una planta de tabaco en la que se ha introducido el gen A. Prueba de resistencia a la kanamicina
Se cultivaron las 6 líneas ESP obtenidas en la etapa III descrita anteriormente como tal sin subcultivo. Las hojas desarrolladas de estas líneas ESP se cortaron para formar discos de hojas de aproximadamente 3 mm cuadrados. Los discos de la hoja obtenidos de este modo se depositaron en un medio de cultivo MS con agar-agar (a éste se añadió 1 mg/litro de bencil adenina y 0,2 mg/litro de ácido \alpha-naftalenacético) que contenía 200 mg/litro de kanamicina. Tras el cultivo en este medio de cultivo que contiene kanamicina durante 1 mes, se observó también la formación de líneas ESP en los discos de la hoja obtenidos a partir de estas líneas ESP.
B. Análisis por PCR
Se extrajeron los ADN cromosómicos de las 6 líneas ESP obtenidas en la etapa III descrita anteriormente y se analizaron los genes introducidos en éstos por el método PCR.
Se extrajo el ADN cromosómico utilizando el siguiente procedimiento CTAB modificado.
En primer lugar, se machacó aproximadamente 1 g de las hojas desarrolladas a partir de ESP en nitrógeno líquido utilizando un mortero y una mano de mortero enfriados y se puso en suspensión en 5 ml de un tampón (que contenía CTAB (bromuro de hexadeciltrimetilamonio) al 2% p/v, NaCl 1,4 M, \beta-mercaptoetanol al 0,2% v/v, EDTA 20 mM y Tris-HCl 100 mM (pH 8,0)) que se había calentado a 60ºC. Se calentó esta suspensión a 60ºC durante 30 a 60 minutos mientras se agitaba suavemente y se enfrió a temperatura ambiente. A esta suspensión se añadió una mezcla de cloroformo y alcohol isoamílico (24:1) en volúmenes iguales y éstos se mezclaron suavemente. A continuación, se centrifugó la mezcla a 1.600 \times g durante 5 minutos para recuperar el sobrenadante. Posteriormente, se añadió al sobrenadante 2/3 del volumen de alcohol isopropílico y éstos se mezclaron suavemente de nuevo. Se dejó reposar la mezcla en hielo durante 10 minutos para precipitar el ADN cromosómico. Se recogió este ADN cromosómico por centrifugación a 1.600 \times g durante 10 minutos. Se lavó el ADN cromosómico recogido de este modo con etanol al 70% v/v, a continuación se secó al vacío y se disolvió en 300 \mul de TE (compuesto por Tris-HCl 10 mM y EDTA 1 mM).
Mientras tanto, para detectar el gen ipt por el método PCR, se sintetizó un par de cebadores (oligonucleótidos) que debe utilizarse mediante un sintetizador de ADN (fabricado por Applied Biosystems Co.). Cuando se unieron al gen ipt la distancia entre los dos cebadores llegó a ser aproximadamente de 800 bp. Para ampliar el gen ipt, se disolvió 1 \mug del ADN cromosómico extraído en 50 \mul de una solución mixta que contenía 0,2 \mum de estos cebadores, Tris-HCl 10 mM (pH de 8,8 a 25ºC) KCl 50 mM, MgCl_{2} 1,5 mM, Triton X-100 1% p/v, dNTP 0,1 mM y 1,25 unidades de Taq polimerasa (adquirida en CETUS CO.). Después de calentar la mezcla a 94ºC durante 1,5 minutos, se repitió un ciclo de calentamiento en tres partes, es decir a 94ºC durante 1 minuto, a 55ºC durante 2 minutos y a 72ºC durante 3 minutos durante un total de 30 veces para completar la reacción. Se analizó la mezcla de reacción obtenida por electroforesis en gel de agarosa para detectar la presencia del gen ipt en el ADN cromosómico mediante la ampliación del gen de aproximadamente 800 bp.
Los resultados se presentan en la Fig. 6. Como es evidente a partir de la Fig. 6, la ampliación del gen de aproximadamente 800 bp se observó en las 6 ESP. En la Fig. 6, los valores mostrados en el lado izquierdo indican la longitud de las bases, que era de los ingredientes de la banda detectados (en lo sucesivo denominados "banda") en la electroforesis del marcador de tamaño del ADN.
Ejemplo comparativo 1
Se realizó el análisis con respecto a los 16 brotes que no tenían capacidad para formar una ESP y se obtuvieron de los brotes adventicios rediferenciados en la hoja infectada con A. tumefaciens en la etapa III del Ejemplo 1. Es decir, se cultivaron a la vez los 22 brotes adventicios y se seleccionaron las 6 líneas ESP en la etapa III del Ejemplo 1, las que presentan brotes morfológicamente normales (en lo sucesivo denominadas "no-ESP") se liberaron también del A. tumefaciens y se sometieron a la prueba de resistencia a la kanamicina de la misma forma que en las etapas III y IV del Ejemplo 1. Además, las 9 líneas no-ESP se sometieron a análisis por PCR. Sin embargo, con respecto a estas líneas no-ESP, los discos de la hoja depositados en el medio de cultivo que contiene kanamicina se volvieron todos marrones y se blanquearon después de aproximadamente 3 meses. Además, en el análisis por PCR, la ampliación de un fragmento de ADN de aproximadamente 800 bp que demuestra la presencia del gen ipt no se detectó en ninguna de las nueve líneas analizadas.
En la Fig. 6 se presentan los resultados de los análisis por PCR.
Ejemplo 2 I. Construcción de un vector
Se digirió el plásmido pHSG398 (adquirido en Takara Shuzo Co., Ltd.) con BamHI de endonucleasa de restricción. Los terminales adherentes producidos por digestión se convirtieron en terminales truncados con T4ADN polimerasa I (subunidad grande) y se obtuvo el plásmido pNPI100 ligando estos terminales. Es decir, el pNPI100 era el pHSG398 que pierde la secuencia BamHI de la endonucleasa de restricción. Mientras tanto, se digirió el plásmido pCKR97 (T. Izawa et al., Mol. Gen. Genet., vol. 227, pág. 391, 1991) con PstI de endonucleasa de restricción. Se cortó el transposón Ac de maíz y se insertó en una secuencia PstI de la endonucleasa de restricción del pNPI100 para obtener el plásmido pNPI102.
Posteriormente, a partir del plásmido pIPT4 construido en el Ejemplo 1, se cortaron un activador 35S del virus del mosaico de la coliflor y un gen ipt unido a éste con HindIII y SacI de endonucleasas de restricción. Los terminales adhesivos del fragmento obtenido de este modo se convirtieron en terminales truncados con T4 ADN polimerasa I y el fragmento se insertó en la secuencia HincII de la endonucleasa de restricción del plásmido pUC119 para obtener el plásmido pNPI101. A partir de este plásmido pNPI101, se cortó de nuevo el activador 35S del virus del mosaico de la coliflor con las PstI y EcoRI de endonucleasas de restricción y los terminales adhesivos del fragmento se convirtieron en terminales truncados con T4 ADN polimerasa I. Además, se obtuvo el plásmido pNPI103 ligando el fragmento en la secuencia BamHI truncada de la endonucleasa del pNPI102. Es decir, en el plásmido pNPI103, el activador 35S y el gen ipt ligado a éste existían en la secuencia BamHI de la endonucleasa de restricción dentro del transposón Ac.
Se obtuvo el vector deseado cortando el transposón Ac que contiene el activador 35S del virus del mosaico de la coliflor y el gen ipt del plásmido pNPI103 con la PstI de la endonucleasa de restricción e insertando este transposón Ac en la secuencia SseI de la endonucleasa de restricción del plásmido del vector pBI121. Éste se denominó plásmido pNPI106.
Se introdujo este plásmido pNPI106 en la cepa JM109 de E. coli (Escherichia coli) y se depositó de acuerdo con el Tratado de Budapest como E. coli JM109 (pNPI106) con el nº de registro FERM BP-5064.
En las Figs. 7 a 9 se presenta esquemáticamente la estrategia para la elaboración del plásmido pNPI106. En la Fig. 10 se presenta una cartografía de la endonucleasa de restricción de la región de T-ADN de éste. En las Figs. 7 a 9 y 10, se muestra la zona terminal del transposón Ac mediante triángulos negros opuestos, respectivamente. En la Fig. 10 Ac-P es un activador natural presente en Ac. Los demás símbolos son los mismos a los mostrados en las Figs. 2 a 5.
Como es evidente en la Fig. 10, este plásmido presenta el gen ipt como gen marcador, y el gen NPTII y el gen GUS (\beta-galactosidasa) como modelo de gen deseado en la región de T-ADN, es decir en la zona que debe integrarse en el cromosoma de la planta. Además, el gen ipt está presente insertado dentro del transposón Ac. Como la célula que tiene el gen GUS metaboliza un sustrato especial para producir un pigmento azul, la expresión del gen puede identificarse detectando este pigmento. De este modo, el gen GUS se utiliza con frecuencia en el análisis de la expresión del gen en la planta.
II. Introducción de pNPI106 en una planta de tabaco y análisis de una planta de tabaco en la que se ha introducido el gen A. Introducción de pNPI106 en una planta de tabaco y prueba para la expresión del gen introducido
De la misma manera que en las etapas II y III del Ejemplo 1, se introdujo pNPI106 en una cepa LBA4404 de A. tumefaciens y se infectaron los discos de la hoja del tabaco con este A. tumefaciens. Se cultivó la hoja del tabaco infectada de este modo en medio de cultivo MS con agar-agar exento de hormonas que contenía 50 mg/litro de acetosiringona y a continuación en medio de cultivo MS con agar-agar exento de hormonas al que se añadieron 50 mg/litro de carbenicilina. Después de dos meses de dicho cultivo, se separaron las 63 líneas ESP.
Se trasplantaron estas líneas ESP en el medio de cultivo con la misma composición (medio de cultivo MS con agar-agar exento de hormonas que contiene 500 mg/litro de carbenicilina). Un mes después, se seleccionaron a simple vista de entre los brotes de las ESP que habrían crecido ligeramente, 9 brotes (los que se generan a partir de los ESP se denominan simplemente "brotes" en lo sucesivo) que habían crecido aproximadamente el doble o más en comparación con los demás brotes, en los que no se observó crecimiento de los brotes laterales y en los que parecía haber disminuido la influencia del gen ipt. Las hojas de estos brotes se sometieron a la misma prueba de resistencia a la kanamicina realizada en la etapa IV-A del Ejemplo 1 y a la prueba de la expresión del gen GUS (prueba de actividad de GUS) basadas en el procedimiento de Jefferson et al. Los brotes obtenidos después de cortar las hojas se trasplantaron en el medio de cultivo MS con agar-agar exento de hormonas y se cultivaron. Un mes después, se observaron las formas para detectar la capacidad de formación de las ESP de los brotes, presentando de este modo, la expresión del gen ipt.
Los resultados se presentan en la Tabla 1.
TABLA 1 Resultados de una prueba de expresión de un gen introducido en una planta de tabaco por el vector pNPI106
Brote nº Resistencia a la Actividad de Morfología tras 1
kanamicina GUS mes de cultivo
Ejemplo 2 1 + + ESP
2 + + ESP
3 + - ESP
4 + + ESP
5 + - ESP
6 + - ESP
7 + + ESP
8 + + normal
9 + + ESP
Ejemplo 10 - - normal
comparativo 2 11 - - normal
12 - - normal
Notas:
\hskip1cm 1. En la resistencia a la kanamicina, + es "resistente" y - es "no resistente".
\hskip1cm 2. En la actividad de GUS, + es "activo" y - es "inactivo".
\hskip1cm 3. \begin{minipage}[t]{140mm}"normal" significa un ejemplar que produce el crecimiento dominante de un brote apical y la formación de raíces.\end{minipage}
Como es evidente en la Tabla 1, aunque la hoja del brote nº 8 presenta resistencia a la kanamicina y actividad de GUS, un ESP no se forma aunque el brote se cultive durante 1 mes. Esto supuestamente es debido a que el gen ipt que produce la formación el ESP está presente en la forma insertada dentro del transposón Ac en el plásmido pNPI106. Es decir, el gen ipt, que está introducido en el cromosoma del tabaco mediante la infección con el A. tumefaciens que contiene este plásmido en el tejido y se expresa en la etapa inicial de cultivo del tejido inmediatamente después de la infección, se elimina junto con Ac mediante la acción de Ac durante el cultivo posterior. Mientras tanto, en el mismo vector, el gen NPTII y el gen GUS se injertan en una posición en la que no funcionan íntegramente con Ac, de modo que estos genes permanecen todavía en el cromosoma de la planta y se expresan.
En la Tabla 1, aunque en los brotes nº 3, nº 5 y nº 6, se observa resistencia a la kanamicina y capacidad de formación de ESP, únicamente la actividad de GUS es negativa. Esto significa que en estos brotes solamente el gen GUS de los genes introducidos utilizando el pNPI106 no se expresa. Esto se considera que es debido a la integración errónea que ocurre cuando estos genes se integran en el cromosoma de la planta. Es decir, cuando se introduce el gen a través de A. tumefaciens que contiene el plásmido que presenta la estructura de pNPI106 o similar, la región de T-ADN, es decir, la zona general interna entre la secuencia RB y la secuencia LB debe estar normalmente integrada en el cromosoma de la planta. Sin embargo, esta zona a veces no está completamente integrada, sino que se desgarra y se inserta la pieza defectuosa que carece de alguna parte de los terminales LB. En la región de T-ADN del pNPI106, el gen GUS está presente en la posición más próxima a la secuencia LB. Por consiguiente, se considera que debido a la integración errónea en la introducción del gen, el gen GUS está integrado en el cromosoma en un estado en que el gen GUS se desgarra en piezas y se pierde su propia función, o el gen GUS no está completamente insertado en éste, de modo que el gen GUS no se expresa en estos brotes y no se observa la actividad del mismo.
En las Figs. 11 y 12 se presenta la fotografía de los brotes nº 2 y nº 8 tras un mes de cultivo.
Con respecto al crecimiento de la hoja en el brote nº 8 y sometida a la prueba de resistencia a la kanamicina aquí, se continuó el cultivo tras la prueba. Se obtuvieron cinco brotes adventicios de esta hoja y éstas fueron todas no-ESP.
B. Análisis por PCR
En los brotes nº 1 a nº 9 en la Tabla 1, después de observar la capacidad de formación de ESP, se realizó el análisis por PCR de la misma manera que en la etapa IV-B del Ejemplo 1 para examinar más la presencia del gen ipt en el cromosoma, con la condición de que se utilice el par de cebadores que se diseñaron para estar unidos al gen NPTII y al gen GUS respectivamente además de los cebadores utilizados en la etapa IV-B del Ejemplo 1. En caso de que se utilicen estos cebadores, cuando el Ac y el gen ipt insertados en éste (complejo génico Ac-ipt) se escinden de la región de T-ADN del pNPI106, un fragmento de ADN de aproximadamente 3 kb se amplía en la PCR. Por consiguiente, puede detectarse la escisión del complejo génico Ac-ipt del ADN utilizando como índice esta ampliación.
En la Fig. 13 se presentan los resultados de los análisis por PCR en el brote nº 8, en la cual los valores indicados en el lado izquierdo son los mismos que los mostrados en la Fig. 6.
Como es evidente a partir de los resultados, en el ADN cromosómico extraído del brote nº 8, se observa la ampliación del fragmento de ADN de aproximadamente 3 kb que demuestra la escisión del complejo génico Ac-ipt, mientras que no se observa la ampliación de un fragmento de ADN de aproximadamente 800 bp que demuestra la presencia del gen ipt. Esto significa que el gen ipt se escinde del ADN cromosómico de este brote junto con el Ac y desaparece.
Por otra parte, con respecto a los brotes nº 1 a nº 7 y nº 9, no se detectó la ampliación del fragmento de ADN de aproximadamente 3 kb en ninguna de las muestras de ADN cromosómico de éste, mientras que se detectó la ampliación de un fragmento de ADN de aproximadamente 800 bp en todas las muestras de ADN cromosómico de éste. Por consiguiente, se considera que en estos brotes, el gen ipt está presente todavía en el ADN cromosómico junto con el Ac.
Ejemplo comparativo 2
En el cultivo de la hoja infectada con A. tumefaciens en la etapa II-A del Ejemplo 2, se separaron las 3 no-ESP rediferenciadas junto con las ESP y se sometieron a la prueba de resistencia a la kanamicina, a la prueba de actividad de GUS, a observación visual tras 1 mes de cultivo y a análisis por PCR de la misma manera que en II del Ejemplo 2.
En la Tabla 1 se presentan los resultados. Los brotes obtenidos de estas no-ESP no poseen resistencia a la kanamicina, ni actividad de GUS ni capacidad para formar ESP. Además, la ampliación de los fragmentos de ADN de aproximadamente 800 bp y de aproximadamente 3 kb no se detectó en el análisis por PCR.
Ejemplo 3
Además, se continuó el cultivo de las 63 líneas ESP separadas en el Ejemplo 2 en el medio de cultivo MS con agar-agar exento de hormonas. Aproximadamente dos meses después de la separación, a partir de las 2 líneas ESP se obtuvieron un total de siete brotes nº 13-1 a nº 13-3 y nº 14-1 a nº 14-4 que eran brotes normales capaces de ser identificados a simple vista, es decir, que presentaban el dominio apical. Estos brotes se separaron para su trasplante en el medio de cultivo que presenta la composición mencionada anteriormente, a continuación se alargaron y enraizaron normalmente. De estos, los ejemplares obtenidos a partir de los brotes nº 13-1 y nº 14-1 se sometieron al análisis por PCR de la misma manera que en la etapa II-B del Ejemplo 2. Como resultado, no se observó la ampliación de un fragmento de ADN de aproximadamente 800 bp en el brote nº 13-1 ni en 14-1. Mientras tanto, se observó la ampliación de un fragmento de ADN de aproximadamente 3 kb en ambos brotes. De este modo se determinó que el gen ipt se había escindido del ADN cromosómico de estos ejemplares junto con el Ac y había desaparecido. Los resultados se presentan en la Fig. 14, en la cual los valores indicados en el lado izquierdo son los mismos que los presentados en la Fig. 6. Además, se detectó la expresión del gen GUS en todos los ejemplares obtenidos de estos siete brotes.
La Fig. 15 presenta el estado de un brote normal diferenciado de un ESP.
Ejemplo 4
La hoja obtenida de un brote que se presenta como brote nº 7 en la Tabla 1 entre los 9 brotes seleccionados en el Ejemplo 2 se cultivó en medio de cultivo MS con agar-agar exento de hormonas durante aproximadamente 1 mes. Se seleccionó a simple vista un brote normal y se separó de los 6 brotes adventicios que se rediferenciaron de la hoja cultivada. Este brote normal se trasplantó en un medio de cultivo de la composición mencionada anteriormente, a continuación se obtuvo un ejemplar normal alargado y enraizado. Además, se sometió este ejemplar al análisis por PCR de la misma manera que en la etapa II-B del Ejemplo 2 y en los sedimentos de desaparición del fragmento de ADN de aproximadamente 800 bp y en la ampliación del fragmento de ADN de aproximadamente 3 kb, se determinó que el gen ipt se había escindido del ADN cromosómico junto con el Ac y había desaparecido. Los resultados se presentan en la Fig. 16, en la que los valores indicados en el lado izquierdo son los mismos que los mostrados en la Fig. 6. Además, en los mismos ejemplares, también se detectó la expresión del gen GUS.
Ejemplo 5 I. Separación de un sistema de recombinación específico del punto (sistema pSR1) de levadura
Se inoculó levadura (Zygosaccharomyces rouxii (adquirida en el Instituto para la Fermentación) en 5 ml de medio de cultivo líquido YPAD (que contenía 10 g/litro de extracto de levadura, 20 g/litro de polipeptona, 0,4 g/litro de adenina y 20 g/litro de glucosa) y se cultivó a 30ºC durante 24 horas. La solución del cultivo se centrifugó a 6.900 \times g durante 3 minutos a 20ºC para recoger las células (en lo sucesivo, las células se recogieron en las mismas condiciones). Las células obtenidas se pusieron en suspensión en 2 ml de una solución compuesta por Tris-HCl 0,2 M (pH 8,0) y mercaptoetanol al 5% v/v. Se dejó reposar la suspensión celular a 25ºC durante 30 minutos mientras se agitaba suavemente a veces y se recogieron las células. Además las células recogidas se pusieron en suspensión en 1 ml de una solución (pH 6,8) que contenía 2,5 mg/ml de Zaimolyeis-20T (adquirida en SEIKAGAKU CORPORATION), sorbitol al 10% p/v y KPO_{4} al 5% p/v. Se dejó reposar la suspensión a 30ºC durante 90 minutos y se volvió a centrifugar para recoger las células otra vez. Las células recogidas se volvieron a poner en suspensión en 1 ml de una solución que contenía NaCl 0,2 M, EDTA 0,1 M, SDS al 5% p/v, Tris-HCl 50 mM (pH 8,5) y se añadió a esto proteinasa K hasta llegar a 20 mg/ml. Se dejó reposar la solución mezclada a 60ºC durante 1 hora, a continuación se volvió a la temperatura ambiente y se extrajo con una mezcla de fenol y cloroformo y a continuación con cloroformo para purificar. El sobrenadante obtenido de este modo se añadió en un volumen igual de isopropanol para precipitar el ADN cromosómico y el plásmido pSR1. Se centrifugó la mezcla a 6.900 \times g durante 10 minutos a 4ºC para recoger el ADN y el ADN recogido se lavó con etanol al 70% v/v, a continuación se secó al vacío y se disolvió en 100 \mul de TE.
Utilizando el ADN extraído de este modo (la mezcla del ADN cromosómico y el plásmido pSR1) como plantilla, se amplió por el método PCR solamente un sistema de recombinación específica de sitio que estaba presente en el plásmido pSR1 (en lo sucesivo denominado "sistema pSR1"). El sistema pSR1 está constituido por un gen R que es un gen de recombinasa y una secuencia de recombinación Rs y sus secuencias de ADN han sido ya determinadas (H. Araki et al., J. Mol. Biol., vol. 182, pág. 191, 1985). En la presente invención, a fin de ampliar el gen R, un cebador en el cual una secuencia XbaI de la endonucleasa de restricción se añadió a una posición 5' de 22 bases, es decir, las bases 5.596 a 5.617 en la secuencia del plásmido pSR1 (5'-CCTCTAGAATGCAATTGACCAAGGATACTG-3') y un cebador en el cual la secuencia SacI de la endonucleasa de restricción se añadió a la posición 5' de 22 bases, es decir, las bases 4.126 a 4.147 en las secuencias del plásmido pSR1 (5'-CCGAGCTCTTAATCTTGTCAGGAGGTGTCA-3') se sintetizaron para su utilización. Por otra parte, a fin de ampliar Rs, se sintetizaron para su utilización dos parejas de cebadores que comprenden cada una 30 bases (un total de cuatro tipos). Es decir, se compuso una par de cebadores en el que se sustituyeron tres de las bases 287 a 316 de la secuencia del plásmido pSR1 y se introdujo una secuencia SseI de endonucleasa de restricción (5'-AGGATTGAGCTACTGGACGGGAATCCTGCA-3') y un cebador en el que se sustituyeron cuatro bases de 690 a 719 de la secuencia del plásmido pSR1 y se introdujeron la secuencia HindIII de la endonucleasa de restricción y la secuencia XhoI de la endonucleasa de restricción (5'-CAACTCGAGCAATCAAAGCTTCTCGTAGTC-3'). La Rs que se debe ampliar con este conjunto de cebador se denominó "Rs1". Se compuso otro par de cebadores en el que se sustituyeron las tres bases de 287 a 316 de la secuencia del plásmido pSR1 y se introdujeron una secuencia XhoI de la endonucleasa de restricción y una secuencia EcoRI de la endonucleasa de restricción (5'-AGGATTGAGCTACTCGAGGGGAATTCTGGA-3') y un cebador en el cual se sustituyeron las cinco bases de 688 a 717 de la secuencia del plásmido pSR1 y se introdujo la secuencia SseI de la endonucleasa de restricción (5'-ACTGGACCAATCCCTGCAGGTCGTAGTCAA-3'). La Rs que debe ampliarse con este conjunto cebador se denominó "Rs2".
Para ampliar el gen R y los Rs, se añadió 1 \mul de la solución de ADN extraída a cada 50 \mul de la solución mezclada utilizada en la etapa IV-B del Ejemplo 1 que contenía 0,2 \muM de cada conjunto de cebador respectivamente. Se repitió un ciclo de calentamiento de tres partes, es decir, a 95ºC durante 30 segundos, a 55ºC durante 30 segundos y a 72ºC durante 1,5 minutos en la mezcla durante un total de 30 veces. La mezcla de reacción obtenida de este modo se analizó por electrólisis en gel de agarosa para confirmar la ampliación del gen R y de los Rs.
II. Construcción de un vector
Se digirió el Rs1 ampliado por el método PCR con PstI y XhoI de endonucleasas de restricción y se obtuvo el plásmido pNPI126 insertando este Rs1 en las secuencias PstI-XhoI de la endonucleasa de restricción del pSL1180 (adquirida en Pharmacia Biotech Co.).
Posteriormente, a fin de eliminar la secuencia EcoRI de la endonucleasa de restricción y la secuencia HindIII de la endonucleasa de restricción de pHSG398, la digestión de estas endonucleasas de restricción, convirtiendo los terminales digeridos en terminales truncados con T4 polimerasa I (subunidad grande) y la ligadura de los terminales truncados se repitieron en este orden. De este modo, se obtuvo el plásmido pNPI121 con estas secuencias de endonucleasa de restricción eliminadas. Se produjo el plásmido pNPI127 digiriendo el Rs2 ampliado por el método PCR con XhoI y PstI de endonucleasas de restricción e insertando este Rs2 en las secuencias SalI-PstI de la endonucleasa de restricción del plásmido pNPI121.
El plásmido pNPI128 se obtuvo cortando Rs1 del pNPI126 con SmaI y SpeI de endonucleasas de restricción e insertando este fragmento en las secuencias SmaI-XbaI de endonucleasa de restricción de pNPI127.
El gen R ampliado por el método PCR se digirió con XbaI y SacI de endonucleasas de restricción y se insertó en las secuencias XbaI-SacI de la endonucleasa de restricción de pHSG398. El plásmido obtenido de este modo se denominó pNPI124.
A continuación, se digirió el pBI221 (adquirido en Clontech Co.) con PstI de endonucleasa de restricción. Los terminales digeridos se convirtieron en terminales truncados y a continuación se ligaron de la manera descrita anteriormente. De este modo, se obtuvo el plásmido pNPI111 con las secuencias SseI y PstI de endonucleasa de restricción eliminadas. A continuación, el gen R cortado del pNPI124 con XbaI y SacI de endonucleasas de restricción se insertó en las secuencias XbaI-SacI de endonucleasa de restricción del pNPI111 sustituyendo al gen GUS para producir el plásmido pNPI125. Además, un activador 35S del virus del mosaico de la coliflor, el gen R ligado al activador y una señal de poliadenilación de la nopalina sintetasa se cortaron con las HindIII y EcoRI y se insertaron en las secuencias HindIII-EcoRI de endonucleasa de restricción del pNPI128 para obtener el plásmido pNPI129.
Se digirió pNPI101 con la SmaI de endonucleasa de restricción y se insertó un enlazador HindIII fosforilado en 5' (adquirido en Takara Shuzo Co., Ltd.) en el punto de digestión para obtener el plásmido pNPI122. Es decir, este pNPI122 es aquel en el que la secuencia SmaI de endonucleasa de restricción del pNPI101 se sustituyó por la secuencia HindIII de la endonucleasa de restricción. Además el pNPI122 se digirió con PstI de endonucleasa de restricción y los terminales digeridos se convirtieron en terminales truncados y se ligaron para producir el plásmido pNPI123 con las secuencias SseI y PstI de la endonucleasa de restricción eliminadas. De este plásmido pNPI123, se cortó un activador 35S del virus del mosaico de la coliflor y el gen ipt unido al activador con HindIII de endonucleasa de restricción y se insertó en la secuencia HindIII de endonucleasa de restricción del pNPI129 para obtener el plásmido pNPI130.
Se obtuvo el vector deseado cortando el fragmento que contiene el gen ipt y el gen R, los activadores 35S del virus del mosaico de la coliflor unidos a ellos respectivamente y los Rs presentes en ambos terminales de estos genes con PstI de endonucleasa de restricción e insertando este fragmento en la secuencia SseI de la endonucleasa de restricción del pBI121. El plásmido obtenido de este modo se denominó pNPI132.
Se introdujo también este plásmido pNPI132 en la cepa JM109 de E. coli y se depositó de acuerdo con el Tratado de Budapest como E. coli JM109 (pNPI132) con el nº de registro FERM BP-5065.
La estrategia para construir el plásmido pNPI132 se muestra esquemáticamente en las Figs. 17 a 19. La cartografía de la endonucleasa de restricción de la región de T-ADN de la misma se presenta en la Fig. 20. En las Figs. 17 a 19 y 20, un triángulo sombreado indica la secuencia de recombinación Rs procedente del plásmido pSR1 de la levadura y la dirección de su secuencia. Los demás símbolos son iguales a los mostrados en las Figs. 2 a 5.
Como es evidente a partir de la Fig. 20, el plásmido pNPI132, igual que el plásmido pNPI106, tiene el gen ipt como gen marcador y el gen NPTII y el gen GUS como modelos deseados en la región de T-ADN. Sin embargo, en este caso, la zona entre los dos Rs de la secuencia de recombinación del sistema pSR1 se comporta como el elemento eliminable del ADN. Por lo tanto, el gen ipt se inserta de modo que esté soportado por las dos mismas secuencias de recombinación dirigidas.
III. Introducción de pNPI132 en una planta de tabaco y análisis de la planta de tabaco en la que se ha introducido el gen
De la misma manera que en las etapas II y III del Ejemplo 1, se introdujo el plásmido pNPI132 en la cepa LBA4404 de A. tumefaciens y se infectaron los discos de una hoja de una planta de tabaco (Nicotiana tabacum cv. SR1) con esta A. tumefaciens. A continuación se cultivaron las hojas infectadas en medio de cultivo MS con agar-agar exento de hormonas que contenía 50 mg/litro de acetosiringona y a continuación en medio de cultivo MS con agar-agar exento de hormonas que contenía 500 mg/litro de carbenicilina.
Un mes después, las hojas cultivadas se transplantaron en el medio de cultivo de la misma composición, y el cultivo se continuó durante 1 mes. A continuación, se separaron 48 líneas ESP.
Estas líneas ESP se trasplantaron de nuevo en el medio de cultivo de la misma composición y se continuó el cultivo. Aproximadamente un mes después (es decir, aproximadamente 3 meses después de la infección con A. tumefaciens), brotes que eran detectables a simple vista por tener una morfología normal se generaron a partir de siete de las 48 líneas ESP. Se separaron estos brotes y se trasplantaron en el medio de cultivo de la misma composición y a continuación se pudieron obtener diez ejemplares normales.
Estos ejemplares se sometieron al análisis por PCR de la misma manera que en la etapa II-B del Ejemplo 2, con la condición de que se utilizó un par de cebadores para la detección del gen GUS además de los cebadores utilizados en la etapa II-B del Ejemplo 2. Al realizar la PCR utilizando estos cebadores, se amplió un fragmento de ADN de aproximadamente 800 bp cuando estaba presente el gen ipt; se amplió un fragmento de ADN de aproximadamente 3 kb cuando el gen ipt se escindió de la región de T-ADN del plásmido pNPI132 mediante la escisión de la parte soportada por los Rs (estos resultados son los mismos que en los análisis de la etapa II-B del Ejemplo 2); y se amplió el fragmento de ADN de aproximadamente 1,7 kb cuando el gen GUS estaba presente. En la Fig. 21 a 23 y en la Tabla 2 se presentan los resultados. En las Figs. 21 a 23, los valores indicados en el lado derecho son iguales a los presentados en la Fig. 6.
TABLA 2 Resultado del análisis de un gen transgénico en una planta de tabaco en la que el gen se introduce con el vector pNPI132
re ipt
Línea ESP nº Ejemplar de 800 bp 3 kb re GUS
planta nº 1,7 kb
15 1 - + +
2 - + +
16 1 - + +
17 1 - + +
18 1 - + +
19 1 - + +
2 - + +
20 1 - + +
2 - + +
21 1 - + +
Notas: + indica que el fragmento del ADN correspondiente está ampliado y - indica que no está ampliado.
Como es patente en la Tabla 2, la presencia del gen ipt que era el gen marcador no se detectó en ninguno de los cromosomas de los ejemplares que habían sido seleccionados simplemente por observación visual de su morfología, y en su lugar, se detectó la ampliación del fragmento de ADN que indica la escisión del gen ipt. Mientras tanto, se detectó la presencia del gen GUS utilizado como gen deseado en todos los ejemplares.
Por otra parte, se examinó la resistencia a la kanamicina utilizando los brotes terminales de los ejemplares, que se obtuvieron de los no-ESP que se diferencian casi simultáneamente con las 48 líneas ESP y que presentaban alargamiento y enraizamiento normales, con utilización de un medio MS con agar-agar exento de hormonas que contenía 200 mg/l de kanamicina. Como resultado, se descubrió que dos de cada 16 ejemplares presentaban resistencia a la kanamicina.
Posteriormente, se continuaron examinando estos ejemplares resistentes a la kanamicina sometiéndolos a análisis por PCR junto con tres ejemplares seleccionados de entre 14 ejemplares sensibles a la kanamicina de la misma manera que la empleada para los ejemplares obtenidos a partir de las ESP. La Fig. 24 presenta los resultados, en los que los valores indicados en el lado izquierdo son los mismos que los mostrados en la Fig. 6.
Como muestra claramente la Fig. 24, cada uno de los dos ejemplares resistentes a la kanamicina presentaba la ampliación de un fragmento de ADN que indicaba la escisión de una zona que contenía el gen ipt y estaba soportada por los Rs, y la presencia del gen GUS. Por esta razón se demostró que los genes originados en pNPI132 habían estado integrados en estos cromosomas. En cambio, no se observó dicha ampliación en los tres ejemplares sensibles a kanamicina. Además, ninguno de estos ejemplares (es decir, ni los ejemplares resistentes a la kanamicina ni los ejemplares sensibles a la kanamicina) presentaban la ampliación de un fragmento de ADN, lo que indica la presencia del gen ipt.
Se supone que estos ejemplares resistentes a la kanamicina obtenidos de una cepa que carece de capacidad para formar los ESP, lo mismo que los ejemplares sensibles a kanamicina, se originaron en las células en el interior de los cromosomas de los cuales pNPI132 no se había introducido en la infección con A. tumefaciens. Basándose en esta suposición, es imposible que los genes que se originan en este vector estén contenidos en los cromosomas. Además, no es razonable que los ejemplares, que carecen del gen ipt pero que contenían el gen NPTII (indicado por el hecho de que estos ejemplares eran resistentes a la kanamicina) y el gen GUS cada uno en forma completa en los cromosomas, apareciera con tal frecuencia considerando todos estos genes originados en el mismo vector.
Es decir, es razonable concluir que, en estos ejemplares resistentes a la kanamicina, se ha introducido una vez pNPI132 en los cromosomas. Es decir, se estima que la región de T-ADN de pNPI132 se introdujo una vez en el cromosoma debido a la infección con A. tumefaciens, pero la función excesivamente eficaz del sistema pSR1 utilizada para este vector produjo la escisión del gen ipt antes de la formación de los ESP después de la infección con A. tumefaciens. Como resultado, el gen NPTII y el gen GUS permanecieron exclusivamente en el cromosoma. El hecho de que los ejemplares resistentes a la kanamicina presentaban en el análisis por PCR, la escisión de la zona que contenía el gen ipt y soportada por los Rs también apoya esta estimación.
Ejemplo 6 I. Construcción de un vector
Los genes rol (S. Kiyokawa, Plant Physiol., vol. 104, pág. 801, 1994) que contienen rolA, rolB y rolC y que tienen un tamaño total de 7,6 kb, los cuales se han insertado en la secuencia EcoRI de la endonucleasa de restricción de pBluescriptII SK+ (preparado por Toyobo Co., Ltd.), se cortaron con una EcoRI de endonucleasa de restricción. Se insertó este fragmento en la secuencia EcoRI de la endonucleasa de restricción del pNPI129 para producir el plásmido pNPI700.
A partir de este plásmido pNPI700, los genes rol, el activador 35S y el virus del mosaico de la coliflor, el gen R unido al promotor y el Rs presente en ambos terminales de estos genes se cortaron con la SseI de endonucleasa de restricción y se insertaron en la secuencia SseI de endonucleasa de restricción del pBI121 para obtener el plásmido pNPI702 deseado.
Se introdujo también este plásmido pNPI702 en la cepa JM109 de E. coli y se depositó de acuerdo con el Tratado de Budapest como E. coli JM109 (pNPI702) con el nº de registro FERM BP-5066.
La estrategia para construir el plásmido pNPI702 se muestra esquemáticamente en la Fig. 25. La cartografía de la endonucleasa de restricción de la región de T-ADN de la misma se presenta en la Fig. 26. Los símbolos de las Figs. 25 y 26 son los mismos a los de las Figs. 2 a 5.
Como es patente en la Fig. 26, el plásmido pNPI702 es similar al pNPI132, pero sólo el gen marcador se cambió desde el gen ipt a los genes rol. Los genes rol utilizados para este vector están presentes en la naturaleza en la T del ADN de A. rhizogenes. Es conocido que cuando los genes rol son introducidos en las células vegetales, se generan raíces fasciculadas en el tejido vegetal y que la planta generada a partir de esta raíz fasciculada presenta anomalía morfológica tal como enanismo o similar.
II. Introducción de pNPI702 en una planta de tabaco y análisis de la planta de tabaco en la que se ha introducido el gen
De la misma manera que en las etapas II y III del Ejemplo 1, se introdujo el plásmido pNPI702 en una cepa LBA4404 de A. tumefaciens y se infectaron los discos de la hoja de una planta de tabaco con esta A. tumefaciens.
El disco de la hoja de tabaco infectada de este modo se cultivó en medio de cultivo MS con agar-agar exento de hormonas que contenía 50 mg/litro de acetosiringona en un lugar oscuro durante 3 días y a continuación en medio de cultivo MS con agar-agar exento de hormonas al cual se añadieron 400 mg/litro de ticarcilina. Aproximadamente 15 días después del comienzo del cultivo, se observó diferenciación de las raíces fasciculadas. Se separaron las raíces fasciculadas una tras otra, se depositaron en un medio de cultivo de producción de brotes (medio de cultivo MS con agar-agar que contenía 0,1 mg/litro de ácido \alpha-naftalenacético, 2,0 mg/litro de benciladenina y 400 mg/litro de ticarcilina). A continuación entre los brotes rediferenciados, se seleccionaron a simple vista 18 brotes considerados de morfología normal y se sometieron a un análisis por PCR de la misma manera que en la etapa II-B del Ejemplo 2, utilizando cebadores para detección al escindir la zona que contiene los genes rol y que está soportada por los Rs durante la ampliación de un fragmento de ADN de aproximadamente 3 kb (como los mismos cebadores utilizados en los Ejemplos 2 a 5 y en el Ejemplo comparativo 2) y los cebadores para la detección de la presencia de los genes rol durante la ampliación de un fragmento de ADN de aproximadamente 1,1 kb. Como resultado, se confirmó que la zona que contenía los genes rol y que estaba soportada por los Rs se escindió de los cromosomas de los 9 brotes.
Ejemplo 7
Utilizando el vector pNPI106 construido en el Ejemplo 2 anterior, se sometió un álamo híbrido (Populus Sieboldii \times Populus grandidentata; una planta leñosa) a la introducción génica.
El tallo de la cepa Y63 del álamo híbrido (recogido en el bosque experimental de Akita Jujo Chemicals Co., Ltd.) cultivado en un matraz esterilizado se cortó en una sección sin nudos de 5 mm de longitud. A continuación se cortó verticalmente más en dos piezas para utilizarlas como muestra y se infectó la muestra con la cepa LBA4404 de A. tumefaciens introducida en pNPI106 de la misma manera que en la etapa del Ejemplo 1. Tras la infección, la sección del tronco se colocó en un medio de cultivo MS con agar-agar modificado y exento de hormonas (que contenía sacarosa al 2% p/v y agar-agar al 0,8% p/v) al que se añadió 40 mg/litro de acetosiringona y se cultivó en éste durante 3 días. Posteriormente se trasplantó en el mismo medio pero conteniendo 500 mg de carbenicilina en lugar de acetosiringona y se continuó cultivando en éste. El medio de cultivo MS modificado empleado en este ejemplo es el preparado cambiando las concentraciones de nitrógeno del amoníaco y de nitrógeno del nitrato del medio de cultivo MS habitual a 10 mM y 30 mM, respectivamente.
Después de aproximadamente dos meses, se separaron los brotes adventicios que se desarrollan en esta sección y se siguieron cultivando durante 2 meses. De este modo se obtuvieron 6 líneas ESP. Estas líneas se siguieron subcultivando y aproximadamente 4 meses después (es decir, aproximadamente 8 meses después de la infección con A. tumefaciens), se observaron por primera vez los brotes morfológicamente normales que se desarrollan en las ESP. A continuación se trasplantaron estos brotes en un medio MS con goma gellan diluido 2/3 (que contenía sacarosa al 2% p/v y goma gellan al 0,3% p/v) al que se añadió 0,05 mg/litro de IBA (ácido indolbutírico) y se cultivaron en éste. De este modo, se obtuvieron siete ejemplares normales que desarrollaban raíces en total a partir de las 2 líneas ESP diez meses después de la infección con A. tumefaciens.
Estos ejemplares se sometieron a continuación al análisis por PCR de la misma manera que en la etapa III del Ejemplo 5. Como resultado, no se detectó el gen ipt en ninguno de ellos. Por otra parte, se detectó la presencia del gen GUS en dos ejemplares entre ellos. Por lo tanto se confirmó que el vector de la presente invención también actuaría eficazmente en la planta leñosa.
De paso, en los 5 ejemplares normales restantes sólo se detectó una parte del gen GUS. Parece que, en dicho ejemplar, cuando se escindió del cromosoma el transposón Ac introducido por el vector pNPI106 junto con el gen ipt, el gen GUS situado en su proximidad estaba implicado en la escisión y por este motivo desapareció.
La Fig. 27 presenta el estado de un brote normal diferenciado de un ESP.
Ejemplo 8
El ejemplar normal (obtenido a través de ESP) con los genes introducidos en su interior por pNPI132 en el Ejemplo 5 se siguió sometiendo a la introducción génica con utilización del vector de la presente invención.
El gen GUS de pNPI132 fue sustituido por un gen HPT (gen resistente a higromicina) utilizando el vector obtenido de este modo (pNPI140, Fig. 28), los ejemplares normales mencionados anteriormente se sometieron a la introducción génica de la misma manera que en las etapas II y III del Ejemplo I. De este modo se obtuvieron 10 líneas ESP 40 días después de la infección con A. tumefaciens que tiene este vector introducido en su interior. Estas líneas ESP se separaron, se trasplantaron a un medio de cultivo de la misma composición (medio de cultivo MS con agar-agar exento de hormonas que contiene 500 mg/litro de carbenicilina) y se siguieron cultivando en éste. Como resultado, se observó diferenciación de brotes, con morfología normal a simple vista, en una de estas líneas 20 días después (es decir, aproximadamente 2 meses después de la infección con A. tumefaciens).
Uno de estos brotes normales diferenciados de este modo se sometió a análisis por PCR de la misma manera que en las etapas IV-B del Ejemplo 1. La Fig. 29 presenta el resultado. Debe señalarse que, además de los cebadores utilizados en la etapa IV-B del Ejemplo 1, se emplearon en este ejemplo un par de cebadores diseñados para unir el gen NPTII y el gen HPT respectivamente, para detectar la escisión de la zona que contiene el gen ipt y que está soportada por las Rs, del ADN cromosómico, y otro par de cebadores para detectar la presencia del gen HPT (detectada durante la ampliación de los fragmento de ADN de aproximadamente 4 kb y aproximadamente 1 kb, respectivamente). En la Fig. 29, los valores indicados en el lado izquierdo son los mismos que los mostrados en la Fig. 6.
Como muestra claramente la Fig. 29, en el análisis por PCR, el ADN cromosómico extraído del brote presentaba la ampliación del fragmento de ADN de aproximadamente 4 kb, lo que indicaba que el gen ipt se había escindido durante la escisión de la zona soportada por los Rs y la ampliación del fragmento de ADN de aproximadamente 1 kb, lo que indicaba la presencia del gen HPT. Por otra parte, la ampliación del fragmento de ADN de aproximadamente 800 bp, que indicaba la presencia del gen ipt, no se detectó en el mismo ADN. Estos resultados sugieren que el gen ipt, que había sido introducido una vez en el ADN cromosómico de este brote, se escindió del mismo durante la escisión de la zona soportada por los Rs y por esta razón desapareció, mientras que el gen HPT permanecía todavía en el ADN. Es decir, un ejemplar introducido por los genes deseados (es decir, el gen NPTII y el gen GUS) por pNPI132 se siguió introduciendo con un nuevo gen deseado (es decir, el gen HPT), utilizando un vector, en el que la construcción relacionada con el gen deseado se alteró exclusivamente (es decir, el mismo gen ipt utilizado como gen marcador) con repetición del cultivo, la selección visual y la separación a menudo. Además, los resultados demostraron que es completamente posible que puedan introducirse un tercer, cuarto o más genes deseados utilizando el mismo gen marcador.
Como es patente en los Ejemplos descritos anteriormente, las líneas de ESP obtenidas siempre presentaban el gen ipt dentro de sus cromosomas como se muestra en la Fig. 6. Además, las ESP, que presentaban anomalía morfológica destacada que podía identificarse a simple vista, presentaban resistencia a la kanamicina, sin excepción, por la expresión del gen NPTII que era el gen deseado como modelo e introducido junto con el gen ipt. Esto demuestra que dicho gen MAI está totalmente disponible como gen marcador para introducir un gen en una planta y que el vector de la presente invención que contiene este gen MAI como gen marcador está también disponible como vector para introducir un gen en una planta.
Al introducir un gen en una planta utilizando el vector pNPI106 en la que el gen ipt estaba integrado dentro del transposón Ac, se obtuvo a partir del tejido un brote o similar que perdió su capacidad para formar ESP como resultado de la desaparición del gen ipt del cromosoma, mientras que conserva las características proporcionadas por el gen deseado (gen NPTII y/o gen GUS) una vez formada la ESP en la etapa inicial de cultivo precisamente después de la operación de introducción del gen, como se muestra en la Tabla 1 y en las Figs. 13, 14 y 16. Por otra parte, la morfología de este tejido obtenido (es decir, brote o similar que pierde su capacidad para formar ESP) podría identificarse a simple vista como se muestra en las Figs. 15 y 27. Además, cuando se seleccionó, se separó y se cultivó éste, se obtuvo un ejemplar alargado y enraizado con una morfología normal. Aún más, los tejidos que se rediferenciaron del tejido obtenido del brote que pierde la capacidad para formar ESP también presentaban morfologías normales sin tener capacidad para formar ESP. Esto demuestra que dicho brote o similar se componía de células uniformes.
Se observaron también los mismos resultados cuando un derivado del sistema de recombinación específica de sitio se utilizó como elemento eliminable del ADN y cuando se utilizaron los genes rol como el gen MAI. Esto es, cuando se introdujo un gen en una planta que utiliza un vector, en la que la construcción relacionada con el transposón o el transposón y el gen ipt de los vectores utilizados en los Ejemplos 1 a 4 y 7 se sustituyó por la relacionada con el sistema de recombinación mencionado anteriormente y/o los genes rol como se describió en los Ejemplos 5 y 6, se obtuvo a partir del tejido que presentaba la morfología anormal inmediatamente después de la introducción del gen (Figs. 21 a 23, Tabla 2) el tejido y la planta morfológicamente normales en los que desapareció el gen MAI de este cromosoma, mientras se mantenía el gen deseado. Además, es posible introducir numerosos genes deseados en el mismo ejemplar repitiendo las etapas de la introducción del gen, cultivo y selección visual utilizando el vector en el que se altera exclusivamente la construcción correspondiente al gen deseado mientras que el gen que produce anomalía morfológica se emplea como gen marcador (Ejemplo 8, Fig. 29).
Por consiguiente, cuando se utiliza dicho vector, en el que se utiliza el gen MAI como gen marcador y se inserta en una posición tal que funciona íntegramente con el elemento eliminable del ADN, se obtiene un tejido integrado sólo por células en las que el gen solo deseado permanece en el cromosoma o similar y mantiene su función solamente realizando las etapas siguientes: (1) cultivando las células inmediatamente después de la operación de introducción del gen y seleccionando a simple vista un tejido morfológicamente anormal que aparece durante el cultivo, (2) cultivando más este tejido morfológicamente anormal y seleccionando a simple vista un tejido morfológicamente normal que aparece durante el cultivo. Además, una planta integrada solamente por dichas células puede obtenerse también a partir de este tejido morfológicamente normal.
Además, cuando se utilizaba un derivado del sistema de recombinación específica de sitio como elemento eliminable del ADN, dado que la escisión de éste sucedía rápida y completamente con mucha frecuencia, el tejido morfológicamente normal que aparecía en el tejido morfológicamente anormal podía también detectarse rápidamente y se obtenían muchos ejemplares normales de éste con buena eficacia.
La Tabla 3 presenta la eficacia a la que se obtuvo el ejemplar normal a partir del tejido morfológicamente anormal cuando se utilizaba el transposón o un derivado del sistema de recombinación específica de sitio como elemento eliminable del ADN en el vector de la presente invención.
TABLA 3 Diferencia de eficacia en la obtención de ejemplares normales dependiendo de un tipo de elemento eliminable del ADN
Vector Elemento eliminable Número de Número de líneas en las que se
del ADN líneas ESP regeneran los ejemplares
normales
Ejemplo 3 pNPI106 Ac (transposón) 63 2
(7 ejemplares)
Ejemplo 5 pNPI132 zona mantenida por los Rs del 48 7
sistema pSR1 (sistema de (10 ejemplares)
recombinación específica de
sitio)
Notas:
\hskip1cm 1. La ESP se separó después de dos meses de cultivo.
\hskip1cm 2. \begin{minipage}[t]{143mm}El brote normal se pudo detectar tras cuatro meses de cultivo en el Ejemplo 3 y tras tres meses de cultivo en el Ejemplo 5.\end{minipage}
\hskip1cm 3. \begin{minipage}[t]{143mm}Cada uno de los ejemplares normales mencionados anteriormente contenía un gen GUS como modelo de gen deseado.\end{minipage}
En los Ejemplos 1 a 5, bajo condiciones sin hormonas, el tejido que contiene las células transgénicas proliferó, diferenció los brotes adventicios y regeneró la planta. Esto supuestamente es atribuible a la acción del gen ipt que se introdujo en el cromosoma en la célula transgénica como gen marcador. Es decir, mediante la expresión de este gen, la hormona vegetal se sobreprodujo dentro de la célula. Por consiguiente la hormona vegetal producida en la célula que contiene el gen ipt influyó no solamente en la propia célula para diferenciar el tejido tal como el ESP o similares sino también en el tejido adyacente a la célula en alguna medida, por lo que se creó el mismo estado que el proporcionado por la adición artificial de la hormona vegetal al medio de cultivo.
En el vector de la presente invención, se utiliza el gen MAI como gen marcador. Por consiguiente, cuando se realiza la introducción del gen en la planta utilizando este vector, puede seleccionarse el tejido en el que se introduce el gen deseado cultivando la célula sometida a tratamiento para la introducción del gen, en un medio de cultivo habitual en condiciones de cultivo habituales sin añadir ninguna sustancia química para la selección e identificando a simple vista el tejido morfológicamente anormal resultante. Por consiguiente, se simplifica el procedimiento y la actividad de la célula vegetal no disminuye durante la selección.
Además, dicho gen MAI es intrínseco en la planta o se introduce en la planta por infección con bacterias o de naturaleza similar. Por esta razón, incluso si el gen MAI se expresa en la célula vegetal en la que se ha introducido el gen, su seguridad es considerablemente elevada cuando es ingerido en el cuerpo humano.
Aún más, cuando se utiliza el gen ipt como gen MAI, el tejido que contiene la célula transgénica prolifera y diferencia el brote adventicio mediante la acción de este gen, permitiendo eliminar la necesidad de adición de hormonas vegetales al medio de cultivo lo que generalmente se estima indispensable para la proliferación y diferenciación en el cultivo de la célula vegetal.
Además, en este vector, el gen MAI utilizado como gen marcador se inserta en la posición de modo que funcione íntegramente con el elemento del ADN eliminable, por lo que el gen marcador es eliminado del ADN donde este gen existe y funciona durante la escisión del elemento del ADN en una proporción dada después de introducir el gen en la célula vegetal y éste pierde su propia función. De este modo, únicamente el gen deseado presente en una posición del vector tal que no funciona íntegramente con el elemento eliminable del ADN permanece en el mismo ADN y mantiene la capacidad de expresar su función. Por consiguiente, en esta estructura, el vector produce la introducción múltiple con relación al gen en una determinada planta cambiando meramente la parte del gen deseado que debe introducirse sin cambiar las estructuras del gen marcador ni las demás. Por esta razón, la introducción múltiple puede realizarse un número ilimitado de veces.
Además, en este caso, la pérdida de la función del gen MAI como gen marcador puede detectarse a simple vista mediante el cambio morfológico del tejido transgénico como en la introducción de este gen. Por consiguiente, el tejido elaborado solamente de las células en las que el gen deseado permanece solo en el cromosoma o similares y mantiene su función, puede seleccionarse con seguridad y fácilmente. Como resultado, la múltiple introducción del gen puede realizarse con gran eficacia y la planta transgénica elaborada solamente con dichas células, es decir, el ejemplar libre de la influencia del gen marcador y completamente libre de cualquier riesgo vital planteado por el producto del gen marcador, puede obtenerse sin tener que experimentar la etapa de cruzamiento.
Aunque la invención ha sido descrita con detalle y haciendo referencia a los ejemplos específicos de la misma, será evidente para un experto en la materia que pueden realizarse varios cambios y modificaciones sin apartarse del espíritu y alcance de la misma.

Claims (27)

1. Vector para la introducción de un gen deseado en una planta, el cual comprende el gen deseado, por lo menos un gen inductor de anomalía morfológica como gen marcador y un elemento eliminable del ADN, en el que dicho gen inductor de anomalía morfológica está colocado de modo que se elimina junto con el elemento eliminable del ADN y en el que dicho gen deseado está colocado de modo que no se elimina junto con el elemento eliminable del ADN.
2. Vector según la reivindicación 1, en el que dicho gen inductor de anomalía morfológica está presente en dicho elemento eliminable del ADN.
3. Vector según la reivindicación 1 ó 2, en el que dicho elemento eliminable del ADN es un transposón.
4. Vector según la reivindicación 1 ó 2, en el que dicho elemento eliminable del ADN procede de un sistema de un sistema de recombinación específica de sitio.
5. Vector según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 4, en el que dicho gen inductor de anomalía morfológica se obtiene a partir de un microorganismo del género Agrobacterium.
6. Vector según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 5, en el que dicho gen inductor de anomalía morfológica es un gen para la síntesis de citoquinina.
7. Vector según la reivindicación 6, en el que dicho gen para la síntesis de citoquinina es un gen ipt (isopenteniltransferasa) que está presente en la T del ADN de Agrobacterium tumefaciens.
8. Vector según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 5, en el que dicho gen inductor de anomalía morfológica es por lo menos un gen seleccionado de entre los genes rol.
9. Vector según la reivindicación 8, en el que dichos genes rol son los genes rol que contienen rolA, rolB y rolC, que están presentes en la T del ADN de Agrobacterium rhizogenes.
10. Procedimiento para la producción de una planta transgénica libre de la influencia de un gen marcador, que comprende las etapas siguientes:
(a)
introducir un vector en una célula vegetal, en el que dicho vector comprende un gen deseado, por lo menos un gen inductor de anomalía morfológica como gen marcador y un elemento eliminable del ADN, en el que dicho gen inductor de anomalía morfológica está colocado de modo que se elimina junto con el elemento eliminable del ADN y en el que dicho gen deseado está dispuesto de modo que no se elimina junto con el elemento eliminable del ADN;
(b)
cultivar la célula vegetal obtenida en (a), detectar un tejido vegetal morfológicamente anormal que aparece durante el cultivo y seleccionar dicho tejido morfológicamente anormal; y
(c)
cultivar dicho tejido morfológicamente anormal seleccionado en (b), detectar un tejido morfológicamente normal que aparece durante el cultivo y seleccionar dicho tejido morfológicamente normal.
11. Procedimiento según la reivindicación 10, en el que dicho gen inductor de anomalía morfológica está presente en el elemento eliminable del ADN.
12. Procedimiento según la reivindicación 10 u 11, en el que dicho elemento eliminable del ADN es un transposón.
13. Procedimiento según la reivindicación 10 u 11, en el que dicho elemento eliminable del ADN procede de un sistema de recombinación específica de sitio.
14. Procedimiento según cualquiera de las reivindicaciones 10 a 13, en el que dicho gen inductor de anomalía morfológica se obtiene a partir de un microorganismo del género Agrobacterium.
15. Procedimiento según cualquiera de las reivindicaciones 10 a 14, en el que dicho gen inductor de anomalía morfológica es un gen para la síntesis de citoquinina.
16. Procedimiento según la reivindicación 15, en el que dicho gen para la síntesis de citoquinina es un gen ipt (isopenteniltransferasa) que está presente en el T-ADN de Agrobacterium tumefaciens.
17. Procedimiento según cualquiera de las reivindicaciones 10 a 14, en el que dicho gen inductor de anomalía morfológica es por lo menos un gen seleccionado de entre los genes rol.
18. Procedimiento según la reivindicación 17, en el que dichos genes rol son los genes rol que contienen rolA, rolB y rolC, que están presentes en la T del ADN de Agrobacterium rhizogenes.
19. Procedimiento para la introducción de por lo menos dos genes deseados en una planta, que comprende realizar las etapas siguientes por lo menos dos veces:
(a)
introducir un vector en una célula vegetal, en el que dicho vector comprende un gen deseado, por lo menos un gen inductor de anomalía morfológica como gen marcador y un elemento eliminable del ADN, en el que dicho gen inductor de anomalía morfológica está colocado de modo que se elimina junto con el elemento eliminable del ADN y en el que dicho gen deseado está colocado de modo que no se elimina junto con el elemento eliminable del ADN;
(b)
cultivar la célula vegetal obtenida en (a), detectar un tejido vegetal morfológicamente anormal que aparece durante el cultivo y seleccionar dicho tejido morfológicamente anormal; y
(c)
cultivar dicho tejido morfológicamente anormal seleccionado en (b), detectar un tejido morfológicamente normal que aparece durante el cultivo y seleccionar dicho tejido morfológicamente anormal.
20. Procedimiento según la reivindicación 19, en el que dicho gen inductor de anomalía morfológica está presente en el elemento eliminable del ADN.
21. Procedimiento según la reivindicación 19 ó 20, en el que dicho elemento eliminable del ADN es un transposón.
22. Procedimiento según la reivindicación 19 ó 20, en el que dicho elemento eliminable del ADN procede de un sistema de un sistema de recombinación específica de sitio.
23. Procedimiento según cualquiera de las reivindicaciones 19 a 22, en el que el gen inductor de anomalía morfológica se obtiene a partir de un microorganismo del género Agrobacterium.
24. Procedimiento según cualquiera de las reivindicaciones 19 a 23, en el que dicho gen inductor de anomalía morfológica es un gen para la síntesis de citoquinina.
25. Procedimiento según la reivindicación 24, en el que dicho gen para la síntesis de citoquinina es un gen ipt (isopenteniltransferasa) que está presente en la T del ADN de Agrobacterium tumefaciens.
26. Procedimiento según cualquiera de las reivindicaciones 19 a 23, en el que dicho gen inductor de anomalía morfológica es por lo menos un gen seleccionado de entre los genes rol.
27. Procedimiento según la reivindicación 26, en el que dichos genes rol son los genes rol que contienen rolA, rolB y rolC, que están presentes en la T del ADN de Agrobacterium rhizogenes.
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