JP3985474B2 - 遺伝子導入効率を向上させたユーカリ属の植物への遺伝子導入方法 - Google Patents
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Description
【０００１】
【発明の属する技術分野】
本発明は、遺伝子工学的手法により植物に目的遺伝子を導入する場合の、遺伝子導入効率を向上させる技術に関する。
【０００２】
【従来の技術】
遺伝子工学技術を利用した植物への遺伝子導入は、目的とする遺伝子を直接、対象となる植物に導入することを可能とするため、（ａ）改変すべき形質のみが導入できる、（ｂ）植物以外の種（微生物等）の形質も植物に導入できる、（ｃ）育種期間の大幅な短縮ができるなど、交配を重ねて行う古典的な育種と比べて多くのメリットを有している。
【０００３】
もっとも植物の種類によっては、遺伝子工学的手法による遺伝子導入効率が低く、上記したメリットを十分に享受できないものも多くある。例えば、樹木はライフサイクルが長いため、交配を重ねて行う従来の育種では、広大な土地と長い年月が必要とされる。また、樹木は、最も重要なバイオマス資源の一つであって、近年は地球環境の維持・改善へも寄与するものと期待され、生産性や耐環境性等、より優れた性質を有する品種の作出が望まれている。従って、遺伝子導入による直接的な品種改良は、樹木においても大きなメリットをもたらすが、産業的に重要な樹種への遺伝子導入効率は、多くの場合非常に低い。
【０００４】
そこで、こうした樹木の遺伝子導入にあたっては、使用する遺伝子導入用組織の種類、遺伝子導入処理の条件及びこの処理の前後における遺伝子導入用組織の培養条件等、種々の観点から検討が行われ、遺伝子導入効率の向上が図られてきた。シュートを遺伝子導入用組織として遺伝子導入処理を行い、これから不定芽を再分化させ、目的遺伝子が導入された個体、即ち形質転換体を得る方法も、多くの樹種を対象として検討されている。
【０００５】
しかし、もともと遺伝子導入効率の低い樹種は、その効率を向上させることも難しい。結局、産業上重用な樹種の中で、遺伝子導入によって実用上評価し得るほどにその性質が改善されたものは、いまだ得られていないのが実情である。
【０００７】
【発明が解決しようとする課題】
本願発明は、遺伝子工学的手法を用いて行う遺伝子導入の効率を向上させることにより、遺伝子導入が困難であるとされるユーカリ属の植物への遺伝子導入を実用上可能とする、ユーカリ属の植物への遺伝子導入方法を提供することを目的とする。
【０００８】
【課題を解決するための手段】
本願発明者らは鋭意研究の結果、頂芽又は頂芽原基を有するユーカリ属の胚軸から、根及び根の原基、並びに子葉を切落とすことにより採取した遺伝子導入用組織を用い、目的遺伝子をこの遺伝子導入用組織の根及び根の原基が切落とされた端面がある方に導入することにより、この端面がある方の部分の細胞に効率良く目的遺伝子が導入され、しかも、こうして目的遺伝子が導入された部分は、目的遺伝子が導入された不定芽を再分化させる能力が高いことを見出し、本願発明を完成した。
【０００９】
即ち、本願発明は、頂芽又は頂芽原基を有するユーカリ属の胚軸から、根及び根の原基、並びに子葉を切落とすことにより採取した遺伝子導入用組織を用い、この遺伝子導入用組織の頂芽又は頂芽原基を保持させたまま、根及び根の原基が切落とされた端面がある方に目的遺伝子を導入し、不定芽を分化させることにより、ユーカリ属の植物への遺伝子導入効率を向上させることを特徴とする。
【００１０】
【発明の実施の形態】
本願発明は、遺伝子導入が困難とされているユーカリ属の植物において、その効果をより発揮する。
【００１１】
本願発明においては、組織の褐変等の原因となるポリフェノール類の含有量が低い幼若組織を用いる観点から、種子を発芽させて得られる胚軸を遺伝子導入用組織として用いる。
【００１２】
但し、上記胚軸は、生長点を有する少なくとも一端と、生長点を有さない基部とを備えたものでなければならない。かかる胚軸は、種子の発芽後に、その胚軸から、頂芽や頂芽原基はそのままに、根及び根の原基を有する部分を切落とすことにより得る。つまり、生長点を有する一端とは、頂芽等がある方の端部を指し、生長点を有さない基部とは、根等が切落とされた端面がある方の部分を指している。
【００１３】
本願発明においては、上記のようにして採取された遺伝子導入用組織の、頂芽又は頂芽原基は保持させたまま、根及び根の原基が切落とされた端面がある方に目的遺伝子を導入して、不定芽を分化させる。目的遺伝子としては、産業的に優れた形質を付与できる遺伝子、産業的に優れた形質を付与するとは限らないが、遺伝子発現機構の研究に必要とされる遺伝子等、種々の遺伝子を選択して使用できる。
【００１４】
本願発明の遺伝子導入方法において、目的遺伝子の遺伝子導入用組織への導入は、この目的遺伝子を適当なベクターに組込むことで、ジェミニウイルス、ブロムモザイクウイルス、アグロバクテリウム・ツメファシエンス（以下、Ａ．ツメファシエンスと略す。）、アグロバクテリウム・リゾジェネス等のウイルスや細菌を介して間接的に、又は、パーティクルガン法等によって直接的に行うことができる（I. Potrykus、Annu. Rev. Plant Physiol. Plant Mol. Biol.、42:205、1991）。
【００１５】
例えば、アグロバクテリウム菌を用いる遺伝子導入法（アグロバクテリウム法）では、目的遺伝子を組込んだ適当なベクターをアグロバクテリウム菌に予め導入しておき、このアグロバクテリウム菌を感染させることで、遺伝子導入用組織に目的遺伝子の導入を行う。アグロバクテリウム菌の感染は、アグロバクテリウム菌を懸濁した液に遺伝子導入用組織を浸漬等することにより行う。
【００１６】
ちなみに、アグロバクテリウム菌の感染は植物組織についた傷口で起こるので、遺伝子導入用組織として根等を切落とした胚軸を使用する本願発明の遺伝子導入方法では、その切断の際に生じた端面（切断面）で感染が起こる。つまり、本願発明の遺伝子導入方法では、遺伝子導入用組織を単にアグロバクテリウム菌液に浸漬するだけで、遺伝子導入用組織の根及び根の原基が切落とされた端面がある方に目的遺伝子が導入されることとなる。
【００１７】
なお、植物組織へのアグロバクテリウム菌の感染は、遺伝子導入用組織を菌液に浸漬等した後、この組織を固体培地上に移して更に数日間、アグロバクテリウム菌と共存培養することにより、確実となる。共存培養用の培地としては、例えばＭＳ（Murashige and Skoog、Physiol. Plant、1962、15:473-497）やＷＰＭ（Loyd and McCown、Prop. Int. Plant Prop. Soc.、1980、30:421-427）などの良く知られている基本培地に、又は、アグロバクテリウム菌を感染させる遺伝子導入用組織に適するようにこれらの組成を改良したものに、炭素源や培地の固形化剤を加え、必要に応じて植物ホルモンであるオーキシン類やサイトカイニン類などを適宜添加して、用いることができる。このとき、炭素源としてはシュークロース１０〜３０ｇ／ｌ、培地の固形化剤としては寒天５〜１０ｇ／ｌ又はジェランガム１〜４ｇ／ｌ、サイトカイニン類としてはゼアチン又はベンジルアデニン等を０．０１〜５．０ｍｇ／ｌ、オーキシン類としてはナフタレン酢酸（ＮＡＡ）、インドール酪酸（ＩＢＡ）又はインドール酢酸等を０．０１〜２．０ｍｇ／ｌの濃度範囲で用いることが多い。また、アセトシリンゴン１０〜２００ｍｇ／ｌを上記共存培養用の培地に添加することで、菌の感染力が上昇する場合もある。
【００１８】
一方、パーティクルガンにより目的遺伝子を導入する場合には、上記共存培養用培地を遺伝子導入処理用の培地として用いることができる。この場合には、遺伝子導入用組織を、目的遺伝子を導入しようとする部位、つまりシュート基部を上にしてこの培地上に置床し、定法に従い、パーティクルガンを操作して遺伝子導入を行えばよい。
【００１９】
通常、遺伝子導入用組織に目的遺伝子を導入するにあたっては、目的遺伝子と共に選抜マーカー遺伝子を導入し、この選抜マーカー遺伝子の発現を目的遺伝子導入の指標とする。本願発明の遺伝子導入方法は、選抜マーカー遺伝子としてサイトカイニン関連遺伝子を使用することにより、その遺伝子導入効率を一層向上させることができる。
【００２０】
ここでサイトカイニン関連遺伝子とは、導入された植物細胞においてサイトカイニンによる影響を増大する方向に働き、その細胞の不定芽分化能を増大させる遺伝子である。かかる遺伝子としては、Ａ．ツメファシエンス由来のサイトカイニン合成遺伝子であるｉｐｔ遺伝子（A. C. Smigocki、L. D. Owens、Proc. Natl. Acad. Sci. USA、85:5131、1988）、不活性型サイトカイニンを活性化する遺伝子である大腸菌由来のβ-glucuronidase遺伝子（Morten Joersbo and Finn T. Okkels、Plant Cell Reports、16:219-221、1996）及びシロイヌナズナ由来でサイトカイニン受容体遺伝子と考えられているＣＫＩ１遺伝子（Kakimoto T.、Science、274:982-985、1996）から選択して用いる。中でも、本願の実施例において使用したｉｐｔ遺伝子は、最も良く知られ、その機能の解明も進んだ遺伝子である。
【００２１】
なお、目的遺伝子、サイトカイニン関連遺伝子、及び、必要に応じて導入されるその他の塩基配列や遺伝子は、同一ベクター上に組込んで導入しても、それぞれ異なるベクター上に組込んで導入しても、これらが遺伝子導入用組織の同一細胞中に導入される限り問題はない。ただし、これらの遺伝子等を同一ベクター上に組込む場合には、一方の遺伝子等の存在により、他方の遺伝子等の発現が阻害されることがないように、これらを配置することを要する。
【００２２】
遺伝子導入後の組織からの不定芽分化は、アンモニア態窒素と硝酸態窒素の濃度比を１：３としたＭＳ培地（以下、単に改変ＭＳ培地という。）を１〜４倍に希釈等して、シュークロース１０〜３０ｇ／ｌ、ゲランガム１〜４ｇ／ｌ又は寒天５〜１０ｇ／ｌ、植物ホルモンとしてゼアチン０．２〜５．０ｍｇ／ｌ及びＮＡＡ０．０１〜１．０ｍｇ／ｌを添加したものを不定芽分化培地として用いることができる。但し、選抜マーカー遺伝子としてサイトカイニン関連遺伝子を用いる場合には、植物ホルモンは無添加（ホルモンフリー）又はオーキシンのみの添加でよい。また、前記したアグロバクテリウム法により遺伝子を導入する場合には、アグロバクテリウム菌の除菌のため、この培地にカルベニシリン、ティカルシリン、セフォタキシム等の抗生物質を１０〜１００００ｍｇ／ｌ添加する。温度は１５〜３０℃、光強度０〜２００μｍｏｌ／ｍ２／ｓが好ましい。遺伝子導入時に保持させていた頂芽又は頂芽原基は、以降の過程においては特に必要とされないので、適当な時期にこれを切除しても構わない。
【００２３】
不定芽分化培地にて培養した組織は、普通、培養を始めてから数週間で不定芽を分化する。このとき、不定芽分化に先立ち、わずかにカルスが増殖することもある。ここで分化してくる不定芽は、従来法に基づいて植物のシュートに遺伝子導入を行い、分化させた不定芽と比べ、高い効率で目的遺伝子が導入されている。もっとも、サイトカイニン関連遺伝子を選抜マーカー遺伝子として遺伝子導入を行った場合には、この遺伝子により形態異常が引起され、目的遺伝子が導入された不定芽が多芽体等の異常形態を示す場合がある。しかし、この場合でも、例えば特開平９−１５４５８０に示すように、サイトカイニン関連遺伝子と脱離能を有するＤＮＡ因子とを組合わせて用いれば、最終的には、サイトカイニン関連遺伝子の影響を排除して、正常な形態をした不定芽を得ることができる。
【００２４】
目的遺伝子が導入された個体は、こうして得られた不定芽を切取り、例えばオーキシン類を０〜１．０ｍｇ／ｌ含む発根培地に移植して発根させれば、再生することができる。
【００２５】
本願発明は、頂芽又は頂芽原基を有するユーカリ属の胚軸から、根及び根の原基、並びに子葉を切落とすことにより採取した遺伝子導入用組織を用い、目的遺伝子をこの遺伝子導入用組織の根及び根の原基が切落とされた端面がある方に遺伝子導入処理を行うことで、この端面がある方の部分の細胞に効率良く目的遺伝子が導入され、しかも、こうして目的遺伝子が導入された部分は、頂芽又は頂芽原基を除いた場合と比べ、目的遺伝子が導入された不定芽を再分化させる能力が高いとの知見に基づく。
【００２６】
この理由は必ずしも明らかではない。しかし、一端に存在する頂芽又は頂芽原基が何らかの形で寄与しているものと考えられる。遺伝子導入にあたっては、植物組織や細胞は常にある程度のダメージを受けるが、このダメージからの回復力が生長点の存在によって増強されるため、遺伝子を導入された細胞においても活発な増殖力が維持され、これが、目的遺伝子の導入、及び／又は、目的遺伝子が導入された不定芽の再分化に有利に働いたのであろう。
【００２７】
また、一般に、生長点を有していないシュート基部は、発根に適した部位とされている。このため、選抜マーカー遺伝子としてサイトカイニン関連遺伝子を用い、本願発明の遺伝子導入用組織の根及び根の原基が切落とされた端面がある方に遺伝子導入を行った場合には、遺伝子が導入された細胞と導入されていない細胞とで、不定芽分化に関する能力の差が格段に大きくなり、結果的に、目的遺伝子が導入された細胞が選択的に不定芽を分化させると考えられる。従って、かかる遺伝子を選抜マーカー遺伝子として用いることは、目的遺伝子が導入された不定芽の分化に、一層有利に働く。
【００２８】
【実施例】
以下に、本願発明を実施例に基づいて説明する。
【００２９】
［実施例１］
ユーカリプタス・カマルドレンシス（Eucalyptus camaldulensis、以下、Ｅ．カマルドレンシスと略す。）の種子を、７０％エタノールに１分間浸漬し、さらに、２％次亜塩素酸ソーダ水溶液に約２時間撹拌しつつ浸漬して殺菌した後、無菌水でよく洗浄して発芽用培地に播種し、発芽促進のため４℃の冷蔵庫で２日間以上保存してから、２５℃、光強度約４０μｍｏｌ／ｍ２／ｓの全明条件下で培養し、これを発芽させた。なお、ここで発芽用培地としては、改変ＭＳ培地を２倍希釈したもの（以下、カマルドレンシス基本培地という。）に、シュークロース１０ｇ／ｌ及び寒天８ｇ／ｌを添加して用いた。
【００３０】
発芽用培地に種子を播種してから１〜２週間後、発芽苗の根と子葉を切取り、頂芽のみをその一端に残して胚軸を採取し、その生長点を有さない基部に、ｐＢＩ１２１ベクター（ＣＬＯＮＴＥＣＨ社より市販。図１参照。）の導入を行った。即ち、エレクトロポレーション法（バイオラッド社製 ＧＥＮＥ ＰＵＬＳＥＲ ＩＩを使用。）にて、ｐＢＩ１２１ベクターを、予めＡ．ツメファシエンスＥＨＡ１０５株に導入しておき、これをＹＥＢ液体培地で一夜培養後、同培地でＯＤ６３０＝０．５に希釈して菌液を調製し、上記のようにして採取した胚軸をこの菌液に浸漬した。次いでこの胚軸を、余分な菌液を除去した上で、アセトシリンゴン４０ｍｇ／ｌを添加した不定芽分化用培地にて２日間、２５℃、暗所にてアグロバクテリウム菌と共存培養することにより、ｐＢＩ１２１ベクター導入アグロバクテリウムを感染させた。なお、不定芽分化用培地としては、カマルドレンシス基本培地にゼアチン２．０ｍｇ／ｌ、ＮＡＡ０．３ｍｇ／ｌ、シュークロース１０ｇ／ｌ及び寒天８ｇ／ｌを添加して用いた。
【００３１】
ここで用いたｐＢＩ１２１ベクターは、目的遺伝子のモデルとしてＧＵＳ遺伝子、選抜マーカー遺伝子としてカナマイシン耐性遺伝子（ＮＰＴＩＩ遺伝子）が組込まれたものである。従って、ｐＢＩ１２１ベクターを導入することにより、その細胞にはＧＵＳ遺伝子とカナマイシン耐性遺伝子が導入され、ＧＵＳ活性とカナマイシン耐性を示すこととなる。
【００３２】
共存培養後の胚軸は、ティカルシリンを５００ｍｇ／ｌ、及び、ｐＢＩ１２１ベクター導入細胞を選抜するためのカナマイシンを５０ｍｇ／ｌ添加した不定芽分化培地に移植して、２５℃、光強度約４０μｍｏｌ／ｍ２／ｓの全明条件下で、２週間ごとに同組成の培地に植え継ぎながら培養し、アグロバクテリウムの感染から３ヶ月後、分化・伸長してきた不定芽を発根用培地で発根させた。発根用培地としては、ユーカリ基本培地に、ＩＢＡ０．０５ｍｇ／ｌ、ティカルシリン５００ｍｇ／ｌ、カナマイシン１５０ｍｇ／ｌ、シュークロース１０ｇ／ｌ及びジェランガム２．５ｇ／ｌを添加して用いた。
【００３３】
以上の実験を５０個の胚軸について３回繰返して行った結果、いずれの場合も、アグロバクテリウムの感染後６週間で不定芽分化が観察され始め、最終的に、胚軸１５０個中６個に由来する芽（これを、６系統の芽という）からの発根が４ヶ月後に観察された。これらの芽についてJeffersonらの方法に準拠し、ＧＵＳ活性試験を行ったところ、５系統の芽でその発現が確認された。即ち、この場合の遺伝子導入効率は、カナマイシン耐性を基準とすると６／１５０×１００＝４．０％、ＧＵＳ活性を基準とすると５／１５０×１００＝３．３％であった。
結果を表１に示す。
【００３４】
［比較例１］
遺伝子導入用の胚軸として、Ｅ．カマルドレンシス種子の発芽苗から、根と子葉と頂芽を切取ったものを使用した他は、実施例１と同様にしてＧＵＳ遺伝子とカナマイシン耐性遺伝子の導入、そして植物体の再生を行った。
【００３５】
胚軸３２０個について実験を行った結果、最終的に、８系統の芽で発根が観察され、そのうち６系統の芽でＧＵＳ活性が観察された。即ち、この場合の遺伝子導入効率は、カナマイシン耐性を基準とすると８／３２０×１００＝２．５％、ＧＵＳ活性を基準とすると６／３２０×１００＝１．９％であった。
結果を表１に示す。
【００３６】
【表１】
【００３７】
［実施例２］
選抜マーカー遺伝子として、実施例１で用いたｐＢＩ１２１ベクターのカナマイシン耐性遺伝子の代りに、Ａ．ツメファシエンスＰＯ２２株由来のｉｐｔ遺伝子を有するｐＩＰＴ１０ベクター（作成法については特開平１１−１９７７２２に記載。図２参照。）を、実施例１と同様にして、根と子葉を切取り、頂芽のみをその一端に残したＥ．カマルドレンシスの胚軸基部に導入し、不定芽を分化させた。但し、このとき、上記胚軸はアグロバクテリウムの感染に先立って不定芽分化用培地にて前培養を１日間行った。また、アグロバクテリウム感染後の不定芽分化用培地には植物ホルモン及びカナマイシンを添加しなかった。胚軸の頂芽は、アグロバクテリウムの感染から１０週間後に切除した。
【００３８】
胚軸４０個について実験を行ったところ、この場合は、不定芽の分化に先立って若干のカルス増殖が観察された。そこで、アグロバクテリウムの感染から３ヶ月後、カルスから分化した不定芽と共に、カルス自体についても、ＧＵＳ活性試験を行った。その結果、ＧＵＳ活性が確認されたのは、２０個の胚軸に由来するカルス（これを、２０系統のカルスという。）であり、この２０系統のカルスのうち６系統が不定芽を分化させ、そのうち、４系統の不定芽がＧＵＳ活性を示した。即ち、ＧＵＳ活性基準で、カルスへの遺伝子導入効率は２０／４０×１００＝５０．０％、不定芽への遺伝子導入効率は４／４０×１００＝１０．０％であった。
結果を表２に示す。
【００３９】
［比較例２］
遺伝子導入用の胚軸として、Ｅ．カマルドレンシス種子の発芽苗から、根と子葉と頂芽を切取ったものを使用した他は、実施例２と同様にして、ｐＩＰＴ１０ベクターを用いてＧＵＳ遺伝子とｉｐｔ遺伝子を導入し、不定芽を分化させた。
【００４０】
胚軸９８個について実験を行ったところ、この場合にも、不定芽の分化に先立って若干のカルス増殖が観察された。アグロバクテリウムの感染から３ヶ月後のＧＵＳ活性試験の結果、ＧＵＳ活性が確認されたのは、４０系統のカルスであり、この４０系統のカルスのうち５系統が不定芽を分化させた。しかし、これらいずれの不定芽においても、ＧＵＳ活性は確認できなかった。即ち、ＧＵＳ活性基準で、カルスへの遺伝子導入効率は４０／９８×１００＝４０．８％であったが、不定芽への遺伝子導入効率は０／９８×１００＝０．０％であった。
結果を表２に示す。
【００４１】
［実施例３］
ユーカリプタス・グロビュラス（Eucalyptus globulus、以下、Ｅ．グロビュラスと略す。）の種子を、７０％エタノールに１分間浸漬し、さらに、２％次亜塩素酸ソーダ水溶液に約４時間撹拌しつつ浸漬して殺菌した後、無菌水でよく洗浄して発芽用培地に播種し、発芽促進のため４℃の冷蔵庫で２日間以上保存してから、２５℃、光強度約４０μｍｏｌ／ｍ２／ｓの全明条件下で培養し、これを発芽させた。なお、ここで発芽用培地としては、ＭＳ培地にゼアチン０．５ｍｇ／ｌ、シュークロース２０ｇ／ｌ及び寒天９ｇ／ｌを添加して用いた。
【００４２】
発芽用培地に種子を播種してから１〜２週間後、発芽苗の根と子葉を切取り、頂芽のみをその一端に残して胚軸を採取し、その生長点を有さない基部に、ＧＵＳ遺伝子を、選抜マーカー遺伝子であるカナマイシン耐性遺伝子と共に導入した。即ち、この胚軸を、実施例１と同様にして調製した、ｐＢＩ１２１ベクター（ＣＬＯＮＴＥＣＨ社より市販。図１参照。）導入アグロバクテリウム菌液に浸漬してから、余分な菌液を除去した上で、アセトシリンゴン４０ｍｇ／ｌを添加した不定芽分化用培地にて３日間、２５℃、暗所にてアグロバクテリウム菌と共存培養することにより、ｐＢＩ１２１ベクター導入アグロバクテリウムを感染させた。なお、不定芽分化用培地としては、改変ＭＳ培地の窒素源の濃度のみを１／２としたものに、ゼアチン１．０ｍｇ／ｌ、ＮＡＡ０．０５ｍｇ／ｌ、シュークロース２０ｇ／ｌ及び寒天９ｇ／ｌを添加して用いた。
【００４３】
共存培養後の胚軸は、ティカルシリンを５００ｍｇ／ｌ、及び、ｐＢＩ１２１ベクター導入細胞を選抜するためのカナマイシンを１００ｍｇ／ｌ添加した不定芽分化用培地に移植して、２５℃、光強度約４０μｍｏｌ／ｍ２／ｓの全明条件下で、２週間ごとに同組成の培地に植え継ぎながら培養し、不定芽を分化させた。なお、このとき、胚軸の頂芽は、アグロバクテリウムの感染から１ヶ月後に切除した。
【００４４】
胚軸１８２個について実験を行ったところ、この場合も、不定芽の分化に先立って若干のカルス増殖が観察された。そこで、アグロバクテリウムの感染から３ヶ月後、カルスから分化した不定芽と共に、カルス自体についても、ＧＵＳ活性試験を行った。その結果、ＧＵＳ活性が確認されたのは、４０系統のカルスであり、この４０系統のカルスのうち１２系統が不定芽を分化させ、そのうち、６系統の不定芽がＧＵＳ活性を示した。即ち、ＧＵＳ活性基準で、カルスへの遺伝子導入効率は４０／１８２×１００＝２２．０％、不定芽への遺伝子導入効率は６／１８２×１００＝３．３％であった。
結果を表２に示す。
【００４５】
［比較例３］
遺伝子導入用の胚軸として、Ｅ．グロビュラス種子の発芽苗から、根と子葉と頂芽を切取ったものを使用した他は、実施例３と同様にしてＧＵＳ遺伝子とカナマイシン耐性遺伝子の導入、そして植物体の再生を行った。
【００４６】
胚軸２２０個について実験を行ったところ、この場合も、不定芽の分化に先立って若干のカルス増殖が観察された。アグロバクテリウムの感染から３ヶ月後のＧＵＳ活性試験の結果、ＧＵＳ遺伝子の発現が確認されたのは、９系統のカルスであり、この９系統のカルスのうち２系統が不定芽を分化させ、そのうち、１系統の不定芽がＧＵＳ活性を示した。即ち、ＧＵＳ活性基準で、カルスへの遺伝子導入効率は９／２２０×１００＝４．１％、不定芽への遺伝子導入効率は１／２２０×１００＝０．５％であった。
結果を表２に示す。
【００４７】
［実施例４］
実施例３と同様にして、ｐＩＰＴ１０ベクター（作成法については特開平１１−１９７７２２に記載。図２参照。）を根と子葉を切取り、頂芽のみをその一端に残したＥ．グロビュラスの胚軸基部に導入し、不定芽を分化させた。但し、このとき、不定芽分化用培地には植物ホルモン及びカナマイシンを添加しなかった。
【００４８】
胚軸１２０個について実験を行った結果、アグロバクテリウムの感染から４ヶ月後までに２２個の胚軸から不定芽が分化し、そのうち８系統の不定芽でＧＵＳ活性が観察された。即ち、この場合の不定芽への遺伝子導入効率は、ＧＵＳ活性基準で８／１２０×１００＝６．７％であった。
結果を表２に示す。
【００４９】
［比較例４］
遺伝子導入用の胚軸として、Ｅ．グロビュラス種子の発芽苗から、根と子葉と頂芽を切取ったものを使用した他は、実施例４と同様にして、ｐＩＰＴ１０ベクターを用いてＧＵＳ遺伝子とｉｐｔ遺伝子を導入し、不定芽を分化させた。
【００５０】
胚軸１８０個について実験を行った結果、アグロバクテリウムの感染から４ヶ月後までに１８個の胚軸から不定芽が分化し、そのうち６系統の不定芽でＧＵＳ活性が観察された。即ち、この場合の不定芽への遺伝子導入効率は、ＧＵＳ活性基準で６／１８０×１００＝３．３％であった。
結果を表２に示す。
【００５１】
［実施例５］
交雑ヤマナラシ（Populus sieboldii×Populus grandidentata）Ｙ−６３株（秋田十條化成（株）内実験林より採取。）の無菌フラスコ苗の茎を、節を含むように切取って発芽用培地に置床し、２５℃、光強度約４０μｍｏｌ／ｍ２／ｓの全明条件下で培養して、この節についた定芽を１ｃｍ程度まで伸長させた。なお、ここで発芽用培地としては、改変ＭＳ培地にゼアチン０．５ｍｇ／ｌ、シュークロース２０ｇ／ｌ及び寒天９ｇ／ｌを添加して用いた。
【００５２】
次いで、この定芽を茎との付け根付近から切取って、先端部に頂芽を有する短いシュートを得、このシュートの基部にＧＵＳ遺伝子を、選抜マーカー遺伝子であるｉｐｔ遺伝子と共に導入した。即ち、定芽を茎から切取ったときに生じたシュート基部の切断面を、実施例１と同様にして調製したｐＩＰＴ１０ベクター（作成法については特開平１１−１９７７２２に記載。図２参照。）導入アグロバクテリウム菌液の二倍希釈液に浸し、余分な菌液を除去してから、アセトシリンゴン４０ｍｇ／ｌを添加した不定芽分化用培地にこのシュートを置床して、２日間、２５℃、暗所にてアグロバクテリウム菌と共存培養することにより、ｐＩＰＴ１０ベクター導入アグロバクテリウムを感染させた。なお、不定芽分化用培地としては、改変ＭＳ培地にシュークロース２０ｇ／ｌ及び寒天９ｇ／ｌを添加して用いた。
【００５３】
共存培養後のシュートは、カルベニシリンを５００ｍｇ／ｌ添加した不定芽分化用培地に移植して、２５℃、光強度約４０μｍｏｌ／ｍ２／ｓの全明条件下で、１０日ごとに同組成の培地に植え継ぎながら培養し、不定芽を分化させた。なお、このとき、シュート先端の頂芽は、アグロバクテリウムの感染から１ヶ月後に切除した。
【００５４】
シュート３０個について実験を行った結果、アグロバクテリウムの感染から４０日後までに２５個のシュートから不定芽が分化し、そのうち８系統の不定芽でＧＵＳ活性が観察された。即ち、この場合の不定芽への遺伝子導入効率は、ＧＵＳ活性基準で８／３０×１００＝２６．７％であった。
結果を表２に示す。
【００５５】
［比較例５］
遺伝子導入用のシュートとして、先端部の頂芽を切除した、長さ５ｍｍ程度のシュートを用いた他は、実施例５と同様にしてＧＵＳ遺伝子とｉｐｔ遺伝子を導入し、不定芽を分化させた。
【００５６】
シュート４３個について実験を行った結果、アグロバクテリウムの感染から４０日後までに２５個のシュートから不定芽が分化し、そのうち４系統の不定芽でＧＵＳ活性が観察された。即ち、この場合の不定芽への遺伝子導入効率は、ＧＵＳ活性基準で４／４３×１００＝９．３％であった。
結果を表２に示す。
【００５７】
【表２】
【００５８】
表１より明らかなように、実施例１〜５はいずれも、それぞれ対応する比較例１〜５と比べ、カナマイシン耐性基準、ＧＵＳ遺伝子発現基準で高い遺伝子導入効率を示した。
【００５９】
また、実施例２、３でＧＵＳ遺伝子が導入されたカルスは、比較例２、３と比べ、ＧＵＳ遺伝子が導入された不定芽を分化させる確率が高かった。ちなみに、実施例２では、ＧＵＳ遺伝子が導入されたカルス２０系統のうち４系統からＧＵＳ遺伝子が導入された不定芽が分化しているので、この確率は４／２０×１００＝２０．０％、比較例２では、ＧＵＳ遺伝子が導入されたカルスが４０系統得られたが、これらはいずれもＧＵＳ遺伝子が導入された不定芽を分化させなかったので、この確率は０／４０×１００＝０％、実施例３では、ＧＵＳ遺伝子が導入されたカルス４０系統のうち６系統からＧＵＳ遺伝子が導入された不定芽が分化しているので、この確率は６／４０×１００＝１５．０％、比較例３では、ＧＵＳ遺伝子が導入されたカルス９系統のうち１系統からＧＵＳ遺伝子が導入された不定芽が分化しているので、この確率は１／９×１００＝１１．１％である。
【００６０】
これは、実施例２、３においてＧＵＳ遺伝子が導入されたカルスは、比較例２、３においてＧＵＳ遺伝子が導入されたカルスと比べ、全体として、活発に不定芽を分化させたためであると考えられる。ＧＵＳ遺伝子が導入されたカルスからの不定芽分化率は、この推論を裏付けるものである。即ち、このとき不定芽分化率は、実施例２では６／２０×１００＝３０％、比較例２では５／４０×１００＝１２．５％、実施例３では１２／４０×１００＝３０％、比較例３では２／９×１００＝２２．２％であった。このような不定芽分化率の向上は、実施例２、３において遺伝子導入用組織として用いた胚軸の、一端に残した頂芽の影響によると考えられる。
【００６１】
【発明の効果】
本願発明によれば、ユーカリ属の植物への遺伝子導入方法において、目的遺伝子の導入効率を向上させることができる。しかも、本願発明においては、目的遺伝子導入組織から、効率良く、目的遺伝子が導入された不定芽が分化する。従って、本願発明によれば、不定芽への目的遺伝子導入効率が特に向上する。
【００６３】
即ち、本願発明は、産業上重要なユーカリ属の植物への遺伝子導入を効率良く行うことを可能とし、実用上評価し得る形質転換体の作出への途を開くものである。
【図面の簡単な説明】
【図１】ｐＢＩ１２１ベクターのうち、植物遺伝子に組込まれることとなるＴ−ＤＮＡ領域の構造を示す、概念図である。図中、ＮＰＴＩＩはカナマイシン耐性遺伝子、３５Ｓ−ＧＵＳ−Ｔは、３５Ｓプロモーターを５’側に、ターミネーターを３’側に連結したＧＵＳ遺伝子を示す。
【図２】ｐＩＰＴ１０ベクターのうち、植物遺伝子に組込まれることとなるＴ−ＤＮＡ領域の構造を示す、概念図である。図中、ｉｐｔＰ−ｉｐｔ−Ｔは、ｉｐｔ遺伝子自身のプロモーターを５’側に、ターミネーターを３’側に連結したｉｐｔ遺伝子を示す。他は図１と同じである。
【発明の属する技術分野】
本発明は、遺伝子工学的手法により植物に目的遺伝子を導入する場合の、遺伝子導入効率を向上させる技術に関する。
【０００２】
【従来の技術】
遺伝子工学技術を利用した植物への遺伝子導入は、目的とする遺伝子を直接、対象となる植物に導入することを可能とするため、（ａ）改変すべき形質のみが導入できる、（ｂ）植物以外の種（微生物等）の形質も植物に導入できる、（ｃ）育種期間の大幅な短縮ができるなど、交配を重ねて行う古典的な育種と比べて多くのメリットを有している。
【０００３】
もっとも植物の種類によっては、遺伝子工学的手法による遺伝子導入効率が低く、上記したメリットを十分に享受できないものも多くある。例えば、樹木はライフサイクルが長いため、交配を重ねて行う従来の育種では、広大な土地と長い年月が必要とされる。また、樹木は、最も重要なバイオマス資源の一つであって、近年は地球環境の維持・改善へも寄与するものと期待され、生産性や耐環境性等、より優れた性質を有する品種の作出が望まれている。従って、遺伝子導入による直接的な品種改良は、樹木においても大きなメリットをもたらすが、産業的に重要な樹種への遺伝子導入効率は、多くの場合非常に低い。
【０００４】
そこで、こうした樹木の遺伝子導入にあたっては、使用する遺伝子導入用組織の種類、遺伝子導入処理の条件及びこの処理の前後における遺伝子導入用組織の培養条件等、種々の観点から検討が行われ、遺伝子導入効率の向上が図られてきた。シュートを遺伝子導入用組織として遺伝子導入処理を行い、これから不定芽を再分化させ、目的遺伝子が導入された個体、即ち形質転換体を得る方法も、多くの樹種を対象として検討されている。
【０００５】
しかし、もともと遺伝子導入効率の低い樹種は、その効率を向上させることも難しい。結局、産業上重用な樹種の中で、遺伝子導入によって実用上評価し得るほどにその性質が改善されたものは、いまだ得られていないのが実情である。
【０００７】
【発明が解決しようとする課題】
本願発明は、遺伝子工学的手法を用いて行う遺伝子導入の効率を向上させることにより、遺伝子導入が困難であるとされるユーカリ属の植物への遺伝子導入を実用上可能とする、ユーカリ属の植物への遺伝子導入方法を提供することを目的とする。
【０００８】
【課題を解決するための手段】
本願発明者らは鋭意研究の結果、頂芽又は頂芽原基を有するユーカリ属の胚軸から、根及び根の原基、並びに子葉を切落とすことにより採取した遺伝子導入用組織を用い、目的遺伝子をこの遺伝子導入用組織の根及び根の原基が切落とされた端面がある方に導入することにより、この端面がある方の部分の細胞に効率良く目的遺伝子が導入され、しかも、こうして目的遺伝子が導入された部分は、目的遺伝子が導入された不定芽を再分化させる能力が高いことを見出し、本願発明を完成した。
【０００９】
即ち、本願発明は、頂芽又は頂芽原基を有するユーカリ属の胚軸から、根及び根の原基、並びに子葉を切落とすことにより採取した遺伝子導入用組織を用い、この遺伝子導入用組織の頂芽又は頂芽原基を保持させたまま、根及び根の原基が切落とされた端面がある方に目的遺伝子を導入し、不定芽を分化させることにより、ユーカリ属の植物への遺伝子導入効率を向上させることを特徴とする。
【００１０】
【発明の実施の形態】
本願発明は、遺伝子導入が困難とされているユーカリ属の植物において、その効果をより発揮する。
【００１１】
本願発明においては、組織の褐変等の原因となるポリフェノール類の含有量が低い幼若組織を用いる観点から、種子を発芽させて得られる胚軸を遺伝子導入用組織として用いる。
【００１２】
但し、上記胚軸は、生長点を有する少なくとも一端と、生長点を有さない基部とを備えたものでなければならない。かかる胚軸は、種子の発芽後に、その胚軸から、頂芽や頂芽原基はそのままに、根及び根の原基を有する部分を切落とすことにより得る。つまり、生長点を有する一端とは、頂芽等がある方の端部を指し、生長点を有さない基部とは、根等が切落とされた端面がある方の部分を指している。
【００１３】
本願発明においては、上記のようにして採取された遺伝子導入用組織の、頂芽又は頂芽原基は保持させたまま、根及び根の原基が切落とされた端面がある方に目的遺伝子を導入して、不定芽を分化させる。目的遺伝子としては、産業的に優れた形質を付与できる遺伝子、産業的に優れた形質を付与するとは限らないが、遺伝子発現機構の研究に必要とされる遺伝子等、種々の遺伝子を選択して使用できる。
【００１４】
本願発明の遺伝子導入方法において、目的遺伝子の遺伝子導入用組織への導入は、この目的遺伝子を適当なベクターに組込むことで、ジェミニウイルス、ブロムモザイクウイルス、アグロバクテリウム・ツメファシエンス（以下、Ａ．ツメファシエンスと略す。）、アグロバクテリウム・リゾジェネス等のウイルスや細菌を介して間接的に、又は、パーティクルガン法等によって直接的に行うことができる（I. Potrykus、Annu. Rev. Plant Physiol. Plant Mol. Biol.、42:205、1991）。
【００１５】
例えば、アグロバクテリウム菌を用いる遺伝子導入法（アグロバクテリウム法）では、目的遺伝子を組込んだ適当なベクターをアグロバクテリウム菌に予め導入しておき、このアグロバクテリウム菌を感染させることで、遺伝子導入用組織に目的遺伝子の導入を行う。アグロバクテリウム菌の感染は、アグロバクテリウム菌を懸濁した液に遺伝子導入用組織を浸漬等することにより行う。
【００１６】
ちなみに、アグロバクテリウム菌の感染は植物組織についた傷口で起こるので、遺伝子導入用組織として根等を切落とした胚軸を使用する本願発明の遺伝子導入方法では、その切断の際に生じた端面（切断面）で感染が起こる。つまり、本願発明の遺伝子導入方法では、遺伝子導入用組織を単にアグロバクテリウム菌液に浸漬するだけで、遺伝子導入用組織の根及び根の原基が切落とされた端面がある方に目的遺伝子が導入されることとなる。
【００１７】
なお、植物組織へのアグロバクテリウム菌の感染は、遺伝子導入用組織を菌液に浸漬等した後、この組織を固体培地上に移して更に数日間、アグロバクテリウム菌と共存培養することにより、確実となる。共存培養用の培地としては、例えばＭＳ（Murashige and Skoog、Physiol. Plant、1962、15:473-497）やＷＰＭ（Loyd and McCown、Prop. Int. Plant Prop. Soc.、1980、30:421-427）などの良く知られている基本培地に、又は、アグロバクテリウム菌を感染させる遺伝子導入用組織に適するようにこれらの組成を改良したものに、炭素源や培地の固形化剤を加え、必要に応じて植物ホルモンであるオーキシン類やサイトカイニン類などを適宜添加して、用いることができる。このとき、炭素源としてはシュークロース１０〜３０ｇ／ｌ、培地の固形化剤としては寒天５〜１０ｇ／ｌ又はジェランガム１〜４ｇ／ｌ、サイトカイニン類としてはゼアチン又はベンジルアデニン等を０．０１〜５．０ｍｇ／ｌ、オーキシン類としてはナフタレン酢酸（ＮＡＡ）、インドール酪酸（ＩＢＡ）又はインドール酢酸等を０．０１〜２．０ｍｇ／ｌの濃度範囲で用いることが多い。また、アセトシリンゴン１０〜２００ｍｇ／ｌを上記共存培養用の培地に添加することで、菌の感染力が上昇する場合もある。
【００１８】
一方、パーティクルガンにより目的遺伝子を導入する場合には、上記共存培養用培地を遺伝子導入処理用の培地として用いることができる。この場合には、遺伝子導入用組織を、目的遺伝子を導入しようとする部位、つまりシュート基部を上にしてこの培地上に置床し、定法に従い、パーティクルガンを操作して遺伝子導入を行えばよい。
【００１９】
通常、遺伝子導入用組織に目的遺伝子を導入するにあたっては、目的遺伝子と共に選抜マーカー遺伝子を導入し、この選抜マーカー遺伝子の発現を目的遺伝子導入の指標とする。本願発明の遺伝子導入方法は、選抜マーカー遺伝子としてサイトカイニン関連遺伝子を使用することにより、その遺伝子導入効率を一層向上させることができる。
【００２０】
ここでサイトカイニン関連遺伝子とは、導入された植物細胞においてサイトカイニンによる影響を増大する方向に働き、その細胞の不定芽分化能を増大させる遺伝子である。かかる遺伝子としては、Ａ．ツメファシエンス由来のサイトカイニン合成遺伝子であるｉｐｔ遺伝子（A. C. Smigocki、L. D. Owens、Proc. Natl. Acad. Sci. USA、85:5131、1988）、不活性型サイトカイニンを活性化する遺伝子である大腸菌由来のβ-glucuronidase遺伝子（Morten Joersbo and Finn T. Okkels、Plant Cell Reports、16:219-221、1996）及びシロイヌナズナ由来でサイトカイニン受容体遺伝子と考えられているＣＫＩ１遺伝子（Kakimoto T.、Science、274:982-985、1996）から選択して用いる。中でも、本願の実施例において使用したｉｐｔ遺伝子は、最も良く知られ、その機能の解明も進んだ遺伝子である。
【００２１】
なお、目的遺伝子、サイトカイニン関連遺伝子、及び、必要に応じて導入されるその他の塩基配列や遺伝子は、同一ベクター上に組込んで導入しても、それぞれ異なるベクター上に組込んで導入しても、これらが遺伝子導入用組織の同一細胞中に導入される限り問題はない。ただし、これらの遺伝子等を同一ベクター上に組込む場合には、一方の遺伝子等の存在により、他方の遺伝子等の発現が阻害されることがないように、これらを配置することを要する。
【００２２】
遺伝子導入後の組織からの不定芽分化は、アンモニア態窒素と硝酸態窒素の濃度比を１：３としたＭＳ培地（以下、単に改変ＭＳ培地という。）を１〜４倍に希釈等して、シュークロース１０〜３０ｇ／ｌ、ゲランガム１〜４ｇ／ｌ又は寒天５〜１０ｇ／ｌ、植物ホルモンとしてゼアチン０．２〜５．０ｍｇ／ｌ及びＮＡＡ０．０１〜１．０ｍｇ／ｌを添加したものを不定芽分化培地として用いることができる。但し、選抜マーカー遺伝子としてサイトカイニン関連遺伝子を用いる場合には、植物ホルモンは無添加（ホルモンフリー）又はオーキシンのみの添加でよい。また、前記したアグロバクテリウム法により遺伝子を導入する場合には、アグロバクテリウム菌の除菌のため、この培地にカルベニシリン、ティカルシリン、セフォタキシム等の抗生物質を１０〜１００００ｍｇ／ｌ添加する。温度は１５〜３０℃、光強度０〜２００μｍｏｌ／ｍ２／ｓが好ましい。遺伝子導入時に保持させていた頂芽又は頂芽原基は、以降の過程においては特に必要とされないので、適当な時期にこれを切除しても構わない。
【００２３】
不定芽分化培地にて培養した組織は、普通、培養を始めてから数週間で不定芽を分化する。このとき、不定芽分化に先立ち、わずかにカルスが増殖することもある。ここで分化してくる不定芽は、従来法に基づいて植物のシュートに遺伝子導入を行い、分化させた不定芽と比べ、高い効率で目的遺伝子が導入されている。もっとも、サイトカイニン関連遺伝子を選抜マーカー遺伝子として遺伝子導入を行った場合には、この遺伝子により形態異常が引起され、目的遺伝子が導入された不定芽が多芽体等の異常形態を示す場合がある。しかし、この場合でも、例えば特開平９−１５４５８０に示すように、サイトカイニン関連遺伝子と脱離能を有するＤＮＡ因子とを組合わせて用いれば、最終的には、サイトカイニン関連遺伝子の影響を排除して、正常な形態をした不定芽を得ることができる。
【００２４】
目的遺伝子が導入された個体は、こうして得られた不定芽を切取り、例えばオーキシン類を０〜１．０ｍｇ／ｌ含む発根培地に移植して発根させれば、再生することができる。
【００２５】
本願発明は、頂芽又は頂芽原基を有するユーカリ属の胚軸から、根及び根の原基、並びに子葉を切落とすことにより採取した遺伝子導入用組織を用い、目的遺伝子をこの遺伝子導入用組織の根及び根の原基が切落とされた端面がある方に遺伝子導入処理を行うことで、この端面がある方の部分の細胞に効率良く目的遺伝子が導入され、しかも、こうして目的遺伝子が導入された部分は、頂芽又は頂芽原基を除いた場合と比べ、目的遺伝子が導入された不定芽を再分化させる能力が高いとの知見に基づく。
【００２６】
この理由は必ずしも明らかではない。しかし、一端に存在する頂芽又は頂芽原基が何らかの形で寄与しているものと考えられる。遺伝子導入にあたっては、植物組織や細胞は常にある程度のダメージを受けるが、このダメージからの回復力が生長点の存在によって増強されるため、遺伝子を導入された細胞においても活発な増殖力が維持され、これが、目的遺伝子の導入、及び／又は、目的遺伝子が導入された不定芽の再分化に有利に働いたのであろう。
【００２７】
また、一般に、生長点を有していないシュート基部は、発根に適した部位とされている。このため、選抜マーカー遺伝子としてサイトカイニン関連遺伝子を用い、本願発明の遺伝子導入用組織の根及び根の原基が切落とされた端面がある方に遺伝子導入を行った場合には、遺伝子が導入された細胞と導入されていない細胞とで、不定芽分化に関する能力の差が格段に大きくなり、結果的に、目的遺伝子が導入された細胞が選択的に不定芽を分化させると考えられる。従って、かかる遺伝子を選抜マーカー遺伝子として用いることは、目的遺伝子が導入された不定芽の分化に、一層有利に働く。
【００２８】
【実施例】
以下に、本願発明を実施例に基づいて説明する。
【００２９】
［実施例１］
ユーカリプタス・カマルドレンシス（Eucalyptus camaldulensis、以下、Ｅ．カマルドレンシスと略す。）の種子を、７０％エタノールに１分間浸漬し、さらに、２％次亜塩素酸ソーダ水溶液に約２時間撹拌しつつ浸漬して殺菌した後、無菌水でよく洗浄して発芽用培地に播種し、発芽促進のため４℃の冷蔵庫で２日間以上保存してから、２５℃、光強度約４０μｍｏｌ／ｍ２／ｓの全明条件下で培養し、これを発芽させた。なお、ここで発芽用培地としては、改変ＭＳ培地を２倍希釈したもの（以下、カマルドレンシス基本培地という。）に、シュークロース１０ｇ／ｌ及び寒天８ｇ／ｌを添加して用いた。
【００３０】
発芽用培地に種子を播種してから１〜２週間後、発芽苗の根と子葉を切取り、頂芽のみをその一端に残して胚軸を採取し、その生長点を有さない基部に、ｐＢＩ１２１ベクター（ＣＬＯＮＴＥＣＨ社より市販。図１参照。）の導入を行った。即ち、エレクトロポレーション法（バイオラッド社製 ＧＥＮＥ ＰＵＬＳＥＲ ＩＩを使用。）にて、ｐＢＩ１２１ベクターを、予めＡ．ツメファシエンスＥＨＡ１０５株に導入しておき、これをＹＥＢ液体培地で一夜培養後、同培地でＯＤ６３０＝０．５に希釈して菌液を調製し、上記のようにして採取した胚軸をこの菌液に浸漬した。次いでこの胚軸を、余分な菌液を除去した上で、アセトシリンゴン４０ｍｇ／ｌを添加した不定芽分化用培地にて２日間、２５℃、暗所にてアグロバクテリウム菌と共存培養することにより、ｐＢＩ１２１ベクター導入アグロバクテリウムを感染させた。なお、不定芽分化用培地としては、カマルドレンシス基本培地にゼアチン２．０ｍｇ／ｌ、ＮＡＡ０．３ｍｇ／ｌ、シュークロース１０ｇ／ｌ及び寒天８ｇ／ｌを添加して用いた。
【００３１】
ここで用いたｐＢＩ１２１ベクターは、目的遺伝子のモデルとしてＧＵＳ遺伝子、選抜マーカー遺伝子としてカナマイシン耐性遺伝子（ＮＰＴＩＩ遺伝子）が組込まれたものである。従って、ｐＢＩ１２１ベクターを導入することにより、その細胞にはＧＵＳ遺伝子とカナマイシン耐性遺伝子が導入され、ＧＵＳ活性とカナマイシン耐性を示すこととなる。
【００３２】
共存培養後の胚軸は、ティカルシリンを５００ｍｇ／ｌ、及び、ｐＢＩ１２１ベクター導入細胞を選抜するためのカナマイシンを５０ｍｇ／ｌ添加した不定芽分化培地に移植して、２５℃、光強度約４０μｍｏｌ／ｍ２／ｓの全明条件下で、２週間ごとに同組成の培地に植え継ぎながら培養し、アグロバクテリウムの感染から３ヶ月後、分化・伸長してきた不定芽を発根用培地で発根させた。発根用培地としては、ユーカリ基本培地に、ＩＢＡ０．０５ｍｇ／ｌ、ティカルシリン５００ｍｇ／ｌ、カナマイシン１５０ｍｇ／ｌ、シュークロース１０ｇ／ｌ及びジェランガム２．５ｇ／ｌを添加して用いた。
【００３３】
以上の実験を５０個の胚軸について３回繰返して行った結果、いずれの場合も、アグロバクテリウムの感染後６週間で不定芽分化が観察され始め、最終的に、胚軸１５０個中６個に由来する芽（これを、６系統の芽という）からの発根が４ヶ月後に観察された。これらの芽についてJeffersonらの方法に準拠し、ＧＵＳ活性試験を行ったところ、５系統の芽でその発現が確認された。即ち、この場合の遺伝子導入効率は、カナマイシン耐性を基準とすると６／１５０×１００＝４．０％、ＧＵＳ活性を基準とすると５／１５０×１００＝３．３％であった。
結果を表１に示す。
【００３４】
［比較例１］
遺伝子導入用の胚軸として、Ｅ．カマルドレンシス種子の発芽苗から、根と子葉と頂芽を切取ったものを使用した他は、実施例１と同様にしてＧＵＳ遺伝子とカナマイシン耐性遺伝子の導入、そして植物体の再生を行った。
【００３５】
胚軸３２０個について実験を行った結果、最終的に、８系統の芽で発根が観察され、そのうち６系統の芽でＧＵＳ活性が観察された。即ち、この場合の遺伝子導入効率は、カナマイシン耐性を基準とすると８／３２０×１００＝２．５％、ＧＵＳ活性を基準とすると６／３２０×１００＝１．９％であった。
結果を表１に示す。
【００３６】
【表１】
［実施例２］
選抜マーカー遺伝子として、実施例１で用いたｐＢＩ１２１ベクターのカナマイシン耐性遺伝子の代りに、Ａ．ツメファシエンスＰＯ２２株由来のｉｐｔ遺伝子を有するｐＩＰＴ１０ベクター（作成法については特開平１１−１９７７２２に記載。図２参照。）を、実施例１と同様にして、根と子葉を切取り、頂芽のみをその一端に残したＥ．カマルドレンシスの胚軸基部に導入し、不定芽を分化させた。但し、このとき、上記胚軸はアグロバクテリウムの感染に先立って不定芽分化用培地にて前培養を１日間行った。また、アグロバクテリウム感染後の不定芽分化用培地には植物ホルモン及びカナマイシンを添加しなかった。胚軸の頂芽は、アグロバクテリウムの感染から１０週間後に切除した。
【００３８】
胚軸４０個について実験を行ったところ、この場合は、不定芽の分化に先立って若干のカルス増殖が観察された。そこで、アグロバクテリウムの感染から３ヶ月後、カルスから分化した不定芽と共に、カルス自体についても、ＧＵＳ活性試験を行った。その結果、ＧＵＳ活性が確認されたのは、２０個の胚軸に由来するカルス（これを、２０系統のカルスという。）であり、この２０系統のカルスのうち６系統が不定芽を分化させ、そのうち、４系統の不定芽がＧＵＳ活性を示した。即ち、ＧＵＳ活性基準で、カルスへの遺伝子導入効率は２０／４０×１００＝５０．０％、不定芽への遺伝子導入効率は４／４０×１００＝１０．０％であった。
結果を表２に示す。
【００３９】
［比較例２］
遺伝子導入用の胚軸として、Ｅ．カマルドレンシス種子の発芽苗から、根と子葉と頂芽を切取ったものを使用した他は、実施例２と同様にして、ｐＩＰＴ１０ベクターを用いてＧＵＳ遺伝子とｉｐｔ遺伝子を導入し、不定芽を分化させた。
【００４０】
胚軸９８個について実験を行ったところ、この場合にも、不定芽の分化に先立って若干のカルス増殖が観察された。アグロバクテリウムの感染から３ヶ月後のＧＵＳ活性試験の結果、ＧＵＳ活性が確認されたのは、４０系統のカルスであり、この４０系統のカルスのうち５系統が不定芽を分化させた。しかし、これらいずれの不定芽においても、ＧＵＳ活性は確認できなかった。即ち、ＧＵＳ活性基準で、カルスへの遺伝子導入効率は４０／９８×１００＝４０．８％であったが、不定芽への遺伝子導入効率は０／９８×１００＝０．０％であった。
結果を表２に示す。
【００４１】
［実施例３］
ユーカリプタス・グロビュラス（Eucalyptus globulus、以下、Ｅ．グロビュラスと略す。）の種子を、７０％エタノールに１分間浸漬し、さらに、２％次亜塩素酸ソーダ水溶液に約４時間撹拌しつつ浸漬して殺菌した後、無菌水でよく洗浄して発芽用培地に播種し、発芽促進のため４℃の冷蔵庫で２日間以上保存してから、２５℃、光強度約４０μｍｏｌ／ｍ２／ｓの全明条件下で培養し、これを発芽させた。なお、ここで発芽用培地としては、ＭＳ培地にゼアチン０．５ｍｇ／ｌ、シュークロース２０ｇ／ｌ及び寒天９ｇ／ｌを添加して用いた。
【００４２】
発芽用培地に種子を播種してから１〜２週間後、発芽苗の根と子葉を切取り、頂芽のみをその一端に残して胚軸を採取し、その生長点を有さない基部に、ＧＵＳ遺伝子を、選抜マーカー遺伝子であるカナマイシン耐性遺伝子と共に導入した。即ち、この胚軸を、実施例１と同様にして調製した、ｐＢＩ１２１ベクター（ＣＬＯＮＴＥＣＨ社より市販。図１参照。）導入アグロバクテリウム菌液に浸漬してから、余分な菌液を除去した上で、アセトシリンゴン４０ｍｇ／ｌを添加した不定芽分化用培地にて３日間、２５℃、暗所にてアグロバクテリウム菌と共存培養することにより、ｐＢＩ１２１ベクター導入アグロバクテリウムを感染させた。なお、不定芽分化用培地としては、改変ＭＳ培地の窒素源の濃度のみを１／２としたものに、ゼアチン１．０ｍｇ／ｌ、ＮＡＡ０．０５ｍｇ／ｌ、シュークロース２０ｇ／ｌ及び寒天９ｇ／ｌを添加して用いた。
【００４３】
共存培養後の胚軸は、ティカルシリンを５００ｍｇ／ｌ、及び、ｐＢＩ１２１ベクター導入細胞を選抜するためのカナマイシンを１００ｍｇ／ｌ添加した不定芽分化用培地に移植して、２５℃、光強度約４０μｍｏｌ／ｍ２／ｓの全明条件下で、２週間ごとに同組成の培地に植え継ぎながら培養し、不定芽を分化させた。なお、このとき、胚軸の頂芽は、アグロバクテリウムの感染から１ヶ月後に切除した。
【００４４】
胚軸１８２個について実験を行ったところ、この場合も、不定芽の分化に先立って若干のカルス増殖が観察された。そこで、アグロバクテリウムの感染から３ヶ月後、カルスから分化した不定芽と共に、カルス自体についても、ＧＵＳ活性試験を行った。その結果、ＧＵＳ活性が確認されたのは、４０系統のカルスであり、この４０系統のカルスのうち１２系統が不定芽を分化させ、そのうち、６系統の不定芽がＧＵＳ活性を示した。即ち、ＧＵＳ活性基準で、カルスへの遺伝子導入効率は４０／１８２×１００＝２２．０％、不定芽への遺伝子導入効率は６／１８２×１００＝３．３％であった。
結果を表２に示す。
【００４５】
［比較例３］
遺伝子導入用の胚軸として、Ｅ．グロビュラス種子の発芽苗から、根と子葉と頂芽を切取ったものを使用した他は、実施例３と同様にしてＧＵＳ遺伝子とカナマイシン耐性遺伝子の導入、そして植物体の再生を行った。
【００４６】
胚軸２２０個について実験を行ったところ、この場合も、不定芽の分化に先立って若干のカルス増殖が観察された。アグロバクテリウムの感染から３ヶ月後のＧＵＳ活性試験の結果、ＧＵＳ遺伝子の発現が確認されたのは、９系統のカルスであり、この９系統のカルスのうち２系統が不定芽を分化させ、そのうち、１系統の不定芽がＧＵＳ活性を示した。即ち、ＧＵＳ活性基準で、カルスへの遺伝子導入効率は９／２２０×１００＝４．１％、不定芽への遺伝子導入効率は１／２２０×１００＝０．５％であった。
結果を表２に示す。
【００４７】
［実施例４］
実施例３と同様にして、ｐＩＰＴ１０ベクター（作成法については特開平１１−１９７７２２に記載。図２参照。）を根と子葉を切取り、頂芽のみをその一端に残したＥ．グロビュラスの胚軸基部に導入し、不定芽を分化させた。但し、このとき、不定芽分化用培地には植物ホルモン及びカナマイシンを添加しなかった。
【００４８】
胚軸１２０個について実験を行った結果、アグロバクテリウムの感染から４ヶ月後までに２２個の胚軸から不定芽が分化し、そのうち８系統の不定芽でＧＵＳ活性が観察された。即ち、この場合の不定芽への遺伝子導入効率は、ＧＵＳ活性基準で８／１２０×１００＝６．７％であった。
結果を表２に示す。
【００４９】
［比較例４］
遺伝子導入用の胚軸として、Ｅ．グロビュラス種子の発芽苗から、根と子葉と頂芽を切取ったものを使用した他は、実施例４と同様にして、ｐＩＰＴ１０ベクターを用いてＧＵＳ遺伝子とｉｐｔ遺伝子を導入し、不定芽を分化させた。
【００５０】
胚軸１８０個について実験を行った結果、アグロバクテリウムの感染から４ヶ月後までに１８個の胚軸から不定芽が分化し、そのうち６系統の不定芽でＧＵＳ活性が観察された。即ち、この場合の不定芽への遺伝子導入効率は、ＧＵＳ活性基準で６／１８０×１００＝３．３％であった。
結果を表２に示す。
【００５１】
［実施例５］
交雑ヤマナラシ（Populus sieboldii×Populus grandidentata）Ｙ−６３株（秋田十條化成（株）内実験林より採取。）の無菌フラスコ苗の茎を、節を含むように切取って発芽用培地に置床し、２５℃、光強度約４０μｍｏｌ／ｍ２／ｓの全明条件下で培養して、この節についた定芽を１ｃｍ程度まで伸長させた。なお、ここで発芽用培地としては、改変ＭＳ培地にゼアチン０．５ｍｇ／ｌ、シュークロース２０ｇ／ｌ及び寒天９ｇ／ｌを添加して用いた。
【００５２】
次いで、この定芽を茎との付け根付近から切取って、先端部に頂芽を有する短いシュートを得、このシュートの基部にＧＵＳ遺伝子を、選抜マーカー遺伝子であるｉｐｔ遺伝子と共に導入した。即ち、定芽を茎から切取ったときに生じたシュート基部の切断面を、実施例１と同様にして調製したｐＩＰＴ１０ベクター（作成法については特開平１１−１９７７２２に記載。図２参照。）導入アグロバクテリウム菌液の二倍希釈液に浸し、余分な菌液を除去してから、アセトシリンゴン４０ｍｇ／ｌを添加した不定芽分化用培地にこのシュートを置床して、２日間、２５℃、暗所にてアグロバクテリウム菌と共存培養することにより、ｐＩＰＴ１０ベクター導入アグロバクテリウムを感染させた。なお、不定芽分化用培地としては、改変ＭＳ培地にシュークロース２０ｇ／ｌ及び寒天９ｇ／ｌを添加して用いた。
【００５３】
共存培養後のシュートは、カルベニシリンを５００ｍｇ／ｌ添加した不定芽分化用培地に移植して、２５℃、光強度約４０μｍｏｌ／ｍ２／ｓの全明条件下で、１０日ごとに同組成の培地に植え継ぎながら培養し、不定芽を分化させた。なお、このとき、シュート先端の頂芽は、アグロバクテリウムの感染から１ヶ月後に切除した。
【００５４】
シュート３０個について実験を行った結果、アグロバクテリウムの感染から４０日後までに２５個のシュートから不定芽が分化し、そのうち８系統の不定芽でＧＵＳ活性が観察された。即ち、この場合の不定芽への遺伝子導入効率は、ＧＵＳ活性基準で８／３０×１００＝２６．７％であった。
結果を表２に示す。
【００５５】
［比較例５］
遺伝子導入用のシュートとして、先端部の頂芽を切除した、長さ５ｍｍ程度のシュートを用いた他は、実施例５と同様にしてＧＵＳ遺伝子とｉｐｔ遺伝子を導入し、不定芽を分化させた。
【００５６】
シュート４３個について実験を行った結果、アグロバクテリウムの感染から４０日後までに２５個のシュートから不定芽が分化し、そのうち４系統の不定芽でＧＵＳ活性が観察された。即ち、この場合の不定芽への遺伝子導入効率は、ＧＵＳ活性基準で４／４３×１００＝９．３％であった。
結果を表２に示す。
【００５７】
【表２】
表１より明らかなように、実施例１〜５はいずれも、それぞれ対応する比較例１〜５と比べ、カナマイシン耐性基準、ＧＵＳ遺伝子発現基準で高い遺伝子導入効率を示した。
【００５９】
また、実施例２、３でＧＵＳ遺伝子が導入されたカルスは、比較例２、３と比べ、ＧＵＳ遺伝子が導入された不定芽を分化させる確率が高かった。ちなみに、実施例２では、ＧＵＳ遺伝子が導入されたカルス２０系統のうち４系統からＧＵＳ遺伝子が導入された不定芽が分化しているので、この確率は４／２０×１００＝２０．０％、比較例２では、ＧＵＳ遺伝子が導入されたカルスが４０系統得られたが、これらはいずれもＧＵＳ遺伝子が導入された不定芽を分化させなかったので、この確率は０／４０×１００＝０％、実施例３では、ＧＵＳ遺伝子が導入されたカルス４０系統のうち６系統からＧＵＳ遺伝子が導入された不定芽が分化しているので、この確率は６／４０×１００＝１５．０％、比較例３では、ＧＵＳ遺伝子が導入されたカルス９系統のうち１系統からＧＵＳ遺伝子が導入された不定芽が分化しているので、この確率は１／９×１００＝１１．１％である。
【００６０】
これは、実施例２、３においてＧＵＳ遺伝子が導入されたカルスは、比較例２、３においてＧＵＳ遺伝子が導入されたカルスと比べ、全体として、活発に不定芽を分化させたためであると考えられる。ＧＵＳ遺伝子が導入されたカルスからの不定芽分化率は、この推論を裏付けるものである。即ち、このとき不定芽分化率は、実施例２では６／２０×１００＝３０％、比較例２では５／４０×１００＝１２．５％、実施例３では１２／４０×１００＝３０％、比較例３では２／９×１００＝２２．２％であった。このような不定芽分化率の向上は、実施例２、３において遺伝子導入用組織として用いた胚軸の、一端に残した頂芽の影響によると考えられる。
【００６１】
【発明の効果】
本願発明によれば、ユーカリ属の植物への遺伝子導入方法において、目的遺伝子の導入効率を向上させることができる。しかも、本願発明においては、目的遺伝子導入組織から、効率良く、目的遺伝子が導入された不定芽が分化する。従って、本願発明によれば、不定芽への目的遺伝子導入効率が特に向上する。
【００６３】
即ち、本願発明は、産業上重要なユーカリ属の植物への遺伝子導入を効率良く行うことを可能とし、実用上評価し得る形質転換体の作出への途を開くものである。
【図面の簡単な説明】
【図１】ｐＢＩ１２１ベクターのうち、植物遺伝子に組込まれることとなるＴ−ＤＮＡ領域の構造を示す、概念図である。図中、ＮＰＴＩＩはカナマイシン耐性遺伝子、３５Ｓ−ＧＵＳ−Ｔは、３５Ｓプロモーターを５’側に、ターミネーターを３’側に連結したＧＵＳ遺伝子を示す。
【図２】ｐＩＰＴ１０ベクターのうち、植物遺伝子に組込まれることとなるＴ−ＤＮＡ領域の構造を示す、概念図である。図中、ｉｐｔＰ−ｉｐｔ−Ｔは、ｉｐｔ遺伝子自身のプロモーターを５’側に、ターミネーターを３’側に連結したｉｐｔ遺伝子を示す。他は図１と同じである。
Claims (4)
- 頂芽又は頂芽原基を有するユーカリ属の胚軸から、根及び根の原基、並びに子葉を切落とすことにより採取した遺伝子導入用組織を用い、この遺伝子導入用組織の頂芽又は頂芽原基を保持させたまま、根及び根の原基が切落とされた端面がある方に目的遺伝子を導入し、不定芽を分化させることを特徴とする、ユーカリ属の植物への遺伝子導入方法。
- 目的遺伝子の導入にあたっては、アグロバクテリウム法を用いることを特徴とする、請求項１に記載のユーカリ属の植物への遺伝子導入方法。
- 目的遺伝子と共に、選抜マーカー遺伝子としてｉｐｔ（ isopentenyltransferase ）遺伝子、β -glucuronidase 遺伝子及びＣＫＩ１遺伝子から選択されるサイトカイニン関連遺伝子を導入することを特徴とする、請求項１又は２に記載のユーカリ属の植物への遺伝子導入方法。
- サイトカイニン関連遺伝子としてｉｐｔ（isopentenyltransferase）遺伝子を用いることを特徴とする、請求項３に記載のユーカリ属の植物への遺伝子導入方法。
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