CN109042297B - 一种玉米自交系sl1303幼胚转化方法 - Google Patents

Abstract

本发明属于作物遗传育种领域，具体涉及一种玉米自交系SL1303幼胚转化方法，包括如下步骤：1）愈伤组织诱导：在无菌操作台中剥取幼胚，用镊子将玉米种子固定住，将玉米的胚挑出，沿胚轴纵切成两半，然后置于诱导培养基上进行诱导培养；2）继代培养：将诱导产生的愈伤切去内生芽，接种至继代培养基中25℃暗培养7天，继代两次，统计产生胚性愈伤组织；3）分化培养：将长出胚性愈伤组织转入再生培养基中，25℃光照培养至长芽；4）生根培养：待长出完整的再生苗后转入生根培养基中，进行生根壮苗，根长至4cm左右，进行炼苗移栽。本发明建立了一个高效的玉米自交系SL1303幼胚转化方法，为今后利用该体系进行玉米自交系SL1303的转基因提供了坚实的基础。

Description

一种玉米自交系SL1303幼胚转化方法

技术领域

本发明属于作物遗传育种领域，具体涉及一种玉米自交系SL1303幼胚转化方法。目前，农杆菌介导法是作物转基因研究最常用的方法，其成功获得转基因植株的关键是高效稳定遗传转化及再生体系的建立。幼胚是玉米组织培养中开展最早、应用最成功的外植体，幼胚作为受体材料进行遗传转化具有较好的体细胞繁殖和再生效果，建立以幼胚为受体材料的转化体系具有重要意义。

背景技术

1引言

玉米(Zea mays L.)是世界上种植面积最广、产量最高的谷类粮食作物，具有粮食、饲料、工业原料等多种用途，玉米的稳产高产是世界粮食安全的保障。我国是世界上第二大玉米生产国和消费国，但玉米单位面积产量却偏低，生产成本较高，严重制约了我国玉米的国际竞争力。面对如此大的挑战，任何可以提高粮食产量的方法都值得去尝试。针对粮食作物品种改良，人们主要采取传统育种，通过去雄杂交促进亲本间基因组的重组变异，利用田间试验，以优良性状为指标筛选获得所需育种目标的玉米优良品种。随着现代生物学的发展，转基因技术培育作物新品种已经成为一种重要的育种手段，使用转基因技术培育优质、高产、抗逆的玉米新品种，对于提高我国玉米的生产力水平具有重要意义。

植物转基因是利用重组DNA技术将克隆到的优良目的基因导入植物细胞或组织，并在其中进行表达，从而获得具新性状的植物。相比于传统杂交育种，转基因技术可打破生殖隔离，进一步扩大植物遗传变异的范围。同时传统育种的周期长、受气候环境影响大，而转基因方法有效缩短改良时间，整个过程可在培养箱和温室进行，并且可以针对某一种性状或者综合性状进行分子标记辅助选择，从而提高育种效率。转基因技术主要包括：基因克隆、目的基因功能鉴定、目的基因插入植物基因组、生理鉴定获得改良品种。植物基因组插入外源基因的方法有基因枪法和农杆菌介导法和花粉管通道法等。

2玉米转基因的方法

基因枪法(gene gun,particle gun)，是将表面附着核酸分子的金属微粒通过高速运动引入受体细胞的技术，基因枪法具有受体依赖性小、操作简单、技术成熟等优点，是转基因玉米获得的主要途径之一。但是基因枪法具有目的基因多拷贝、外源基因断裂以及嵌合体产生、设备昂贵等缺点，而农杆菌转化则一定程度上避免这些缺陷。

农杆菌是普遍存在土壤中的革兰氏阴性细菌，双子叶植物受伤后，释放信号分子诱导农杆菌附着在植物细胞表面，将T-DNA插入到植物基因组中。科学家将T区的左臂和右臂之间的片段，替换成目的基因，最终实现目的基因的转化。19世纪80年代中期，人们已经研究农杆菌转化的机制，并利用农杆菌对烟草、矮牵牛花等双子叶植物叶片进行侵染，得到阳性植株(Fraleyetal et al.,1986)。因为农杆菌侵染的天然宿主是双子叶植物，所以直到20世纪90年代中期，单子叶植物转化方法才开始兴起。后来随着农杆菌转化机理认识的加强，主要的水稻、玉米、小麦等单子叶植物也利用农杆菌实现有效地转化。

基因枪和农杆菌转化法是目前转基因玉米获得的主要方法，除此之外，花粉管通道法、PEG法、电激法、显微注射法、离子束介导法、超声波介导法、激光微束穿孔法等也受到科学家的关注，例如，1986年研究人员首次成功用电激法转化了玉米原生质体(Fromm etal.,1986)，继而利用超声波法转化玉米愈伤组织获得转基因植株(张宏等，1997)。丁群星等采用子房注射法把Bt基因导入到玉米中，成功获得了转基因植株(丁群星等，1993)。

3农杆菌转化法的原理

农杆菌是生存在土壤中革兰氏阴性细菌，包括根癌农杆菌(Agrobacteriumtumefaciens)和发根农杆菌(Agrobacterium rhizogenes)。发根农杆菌中含有Ri质粒，可以导致受伤部位产生毛发状根。目前农杆菌介导主要利用根癌农杆菌，根癌农杆菌含有能诱发冠瘿瘤的Ti质粒，质粒主要是由可转移T区、毒性基因和冠瘿碱代谢基因编码区。T区主要特征是左右两边分别是长度为25bp的重复序列，左右边界内是合成生长激素、细胞分裂素和冠瘿碱相关的基因。毒性基因是多段毒性基因组成的：VirA、VirB、VirC、VirD等。天然条件下，双子叶植物细胞受到伤害后会产生酚类物质，一方面诱导农杆菌附着植物细胞表面；另一方面与植物细胞壁表面的单糖一起诱导Vir区基因表达，通过与virA蛋白相互作用(Toyoda-Yamamoto et al.，2000)，激活virA蛋白，具有跨膜组氨酸蛋白激酶功能的virA自磷酸化后将virG蛋白激活，磷酸化的virG作为转录调控因子激活vir区的virB、virC、virD、virE等基因的表达。virD1是拓扑异构蛋白，可以使DNA结构变得松弛。virD1蛋白识别并且结合在T-DNA的左右边界处，具有特异剪切DNA内切酶作用的virD2，将T-DNA右边界处切开为单链。在DNA解旋酸的帮助下，virD2蛋白与T一链的5’端共价结合，避免T-DNA被核酸外切酶降解。DNA复制酶将单链模板从右向左复制合成新的T-DNA，新链代替旧链，旧链被释放出来(Dombek et al.，1997)。为防止T-DNA被细胞内的核酸酶降解，virE2蛋白与游离的核酸蛋白复合物结合形成T-复合体。植物细胞壁上由virB蛋白组成的通道帮助T-复合体穿过农杆菌的细胞壁和细胞膜。virD2和virE2的核定位信号被识别后，T-复合体进入细胞核并整合进植物基因组内。4玉米农杆菌转化法的发展历史

Smith和Townsent发现农杆菌是植物致瘤的起因，能够侵染双子叶植物(Smith etal.,1907年)。第一株以农杆菌介导的转基因烟草问世(Zambryski et al.,1983)。尽管人们认为农杆菌不能转化单子叶植物，但是科学家们还是希望能通过农杆菌转化单子叶获得转基因植物。一些实验室着力于农杆菌侵染单子叶植物的研究，并参照双子叶侵染的过程研究冠瘿瘤形成以及参与反应的酶。随着研究的深入，科学家发现某些酚类物质如乙酰丁香酮(Stachel et al.,1985)可以激活毒性基因表达，促进农杆菌的转化，这也正是农杆菌介导单子叶植物转化困难的关键(Usami et al.,1987)。农杆菌介导的原理被研究清楚后，越来越多的单子叶植物通过农杆菌转化获得转基因苗。第一株通过农杆菌介导法获得的转基因玉米诞生于1996年，Ishida等在前人探索与研究的基础上，利用农杆菌LBA4404转化玉米自交系A188幼胚，获得了转基因玉米，且转化率达5％-30％，并且证明了外源基因的成功整合、表达以及稳定遗传(Ishida et al.,1996)。该研究在一定程度上充分证实了玉米通过农杆菌介导进行遗传转化的可行性，并为今后的研究提供了可靠的科学依据。

研究者通过转化过程中单独添加乙酰丁香酮大大提高了转化效率，但是成功获得转基因苗还需要再生能力强的细胞。1987年Mackinnon发现植物细胞在体外培养时，诱导的愈伤分为3类，其中胚性愈伤组织的再生能力最强,而且胚性愈伤组织易于长期保存(Mackinnon et al.,1987年)。Hiei和Ishida不仅指出具有较强分化能力和再生能力的细胞是农杆菌转化的关键，同时提出培养基的成分、载体、农杆菌特性、筛选标记以及植株的基因型都对农杆菌转化产生影响(Hiei et al.,1994；Ishida et al.,1996)。玉米等单子叶植物非农杆菌天然宿主,遗传转化率低，即使获得少量转基因植株也因遗传稳定性差、基因表达水平低及嵌合体等问题而限制了对后代的选择和利用。因此研究影响农杆菌转化效率的因素，优化转化体系是用农杆菌转化玉米工作的重点。

5玉米转基因受体体系研究进展

完善的体细胞离体繁殖和再生系统是实现遗传转化的先决条件之一，良好的受体系统是决定玉米转基因操作成败的关键部分(苏顺宗等2013)。所以早期的玉米转基因研究主要集中在受体材料的筛选鉴定方面(Shillito et al 1989)。已报道的玉米遗传转化受体材料包括悬浮细胞系及其分离出的原生质体、幼胚及其诱导的胚性愈伤组织、玉米芽尖培养和幼胚培养等。

5.1原生质体

原生质体(protoplast)是最早用于玉米遗传转化的受体材料，在80年代初就广泛用理化方法(电激法和PEG介导的细胞融合)介导外源DNA直接穿过细胞膜进入到玉米原生质体细胞内并整合到基因组中(Golovkin et al 1993)。Fromm等(1986)利用电激法将除草剂抗性基因PAT(phosphinothricin acetyltransferase)转入玉米原生质体获得抗性愈伤组织，首次在玉米中实现转化。然而原生质体培养周期长、操作复杂、技术难度大，并且玉米原生质体制备受到基因型的限制，无法适用于大部分的栽培品种，不利于在玉米遗传转化中广泛应用(Omar et al 2016)。

5.2幼胚

幼胚(Immature embryos，IEs)是玉米组织培养中开展最早、应用最成功的外植体。在1975年Green和Phillips就利用玉米幼胚进行组织培养，并成功获得了再生植株，开启了玉米幼胚培养的时代。之后Lu等(1982)、Vasil等(1984)、Armstrong等(1985)、Duncan等(1985)、李世润等(1990)、陈英等(1999)、袁鹰等(2001)相继报道成功应用幼胚诱导得到愈伤组织和并分化得到的再生植株。幼胚作为受体材料进行遗传转化具有较好的体细胞繁殖和再生效果，适宜基因枪介导或者农杆菌介导的遗传转化。Klein等(1988)用基因枪轰击玉米幼胚、并成功观察到盾片边缘的GUS基因瞬时表达，率先实现了玉米幼胚的遗传转化。证明了玉米幼胚作为受体材料进行转基因操作的可能性。随后农杆菌介导的玉米幼胚作为转化受体的转基因体系也成功建立并广泛应用(Ishida et al 1996；Frame et al 2002；Zhao et al 2002)。相对于原生质体和细胞悬浮系，幼胚来源和转化操作更简单，但是由于幼胚材料的状态、活力差异严重影响转化效率和转化后再生体系的效率。而且使用幼胚材料作为受体进行遗传转化受到季节限制，不利于一个系统化、规模化的转基因体系的建立。5.3胚性愈伤组织

胚性愈伤组织(Embryonic callus，ECs)是由外植体诱导产生的、具有高度的全能性、具有很强的分裂能力的植物细胞团块，可以通过器官发生途径(Organogenesis)和胚胎发生途径(Embryogenesis)两种方式获得再生植株。Chu等(1975)用N6盐和高浓度的脯氨酸培养玉米自交系A188的幼胚诱导得到愈伤组织，并将结构松碎、快速生长的愈伤组织称为胚性愈伤组织。到现在为止，在适宜条件下已经可以利用多种玉米组织(幼胚、幼胚、花药、幼嫩雌穗、幼嫩雄穗、幼苗的芽尖分生组织、幼苗叶基部、幼苗切段等)诱导出愈伤组织(Danet al 2015；Hu et al 2015；Ge et al 2016)。胚性愈伤组织作为受体材料，广泛应用于基因枪法介导的遗传转化，现有的玉米转基因材料多是通过基因枪轰击愈伤组织得到的。愈伤组织作为受体材料的优点在于来源稳定，多种外植体都可以诱导得到愈伤组织，尤其幼胚诱导得到的愈伤组织可以长期继代，全年提供转基因受体材料。但由于愈伤组织结构特点和转化条件不完善等原因，现在还没有利用愈伤组织进行农杆菌介导的遗传转化的报道。在这个方面的突破必将大大地完善玉米转基因体系。

发明内容

本发明目的是提供一种玉米自交系SL1303幼胚离体培养和再生体系优化的转化方法。

本发明公开了一种玉米自交系SL1303幼胚离体培养和再生体系优化的转化方法，以玉米自交系SL1303幼胚为材料，通过对诱导培养基和生根培养基的改良，进一步提高愈伤的诱导率和再生植株的存活率，获得适合幼胚离体培养的玉米品种以及诱导培养基和生根培养基。

以玉米自交系SL1303幼胚为材料，通过设计2mg/L、4mg/L和6mg/L三种不同浓度的诱导培养基培养愈伤，每种浓度放30粒玉米幼胚，每个浓度设置3个重复，10d后统计愈伤长芽率，对愈伤进行继代培养，继代过程中观察愈伤状态变化，并统计胚性愈伤的诱导率，从3种浓度中选出最能抑制内生芽的产生和最容易产生胚性愈伤的2,4-D浓度；将再生植株分别放入加了0.4mg/L的IBA和未加IBA的生根培养基中，观察植株状态变化。

作为优选的方案，本发明中玉米自交系SL1303；诱导培养基最能抑制内生芽的产生和最容易产生胚性愈伤的是加入4mg/L 2,4-D的诱导培养基；生根培养基加了0.4mg/L的IBA的再生植株的生根率更快和存活率更高。

一种玉米自交系SL1303幼胚转化方法，包括如下步骤：

(1)愈伤组织诱导：在无菌操作台中剥取幼胚，用镊子将玉米种子固定住，右手使用解剖刀，将玉米的胚挑出，沿胚轴纵切成两半，然后将胚的外侧面向上置于诱导培养基上；先34℃高温诱导暗培养3天；再放在培养箱25℃，暗培养7天；

(2)继代培养：将诱导产生的愈伤组织切去内生芽，接种至继代培养基中25℃暗培养7天，继代两次，统计产生胚性愈伤组织(颗粒状，淡黄色)；

(3)分化培养：将长出的胚性愈伤组织转入分化培养基中，25℃，光照培养至长芽；

(4)生根培养：待长出完整的再生苗后转入生根培养基中，28℃，每天16小时光照，进行生根壮苗，根长至4-5cm，进行炼苗移栽。

其中，所述的愈伤组织诱导培养基为：以MS培养基为基本培养基，添加终浓度为30g/L的碳源、3g/L的凝胶剂、2-6mg/L的2,4-D、500mg/L的CA；500mg/L的脯氨酸；

所述的继代培养基为：以MS培养基为基本培养基，添加终浓度为30g/L的碳源、3g/L的凝胶剂、2～6mg/L的2,4-D、500mg/L的CA、1g/L的脯氨酸、0.85mg/L的AgNO₃；

所述的分化培养基为：以N6培养基为基本培养基，添加终浓度为60g/L的碳源、3g/L的凝胶剂、0.7g/L的脯氨酸、0.85mg/L的AgNO3、1mg/L的KT、10mg/L的NAA、1mg/L的ZT；

所述的生根培养基为：以1/2MS培养基为基本培养基，添加终浓度为30g/L的碳源、3g/L的凝胶剂、500mg/L的CA、0.5g/L的脯氨酸、0～0.4mg/L的IBA；

优选地，所述的愈伤组织诱导培养基为：以MS培养基为基本培养基，添加终浓度为30g/L的碳源、3g/L的凝胶剂、4mg/L的2,4-D、500mg/L的CA、500mg/L的脯氨酸；

优选地，所述的继代培养基为：以MS培养基为基本培养基，添加终浓度为30g/L的碳源、3g/L的凝胶剂、4mg/L的2,4-D、500mg/L的CA、1g/L的脯氨酸、0.85mg/L的AgNO₃；

优选地，所述的分化培养基为：以N6培养基为基本培养基，添加终浓度为60g/L的碳源、3g/L的凝胶剂、0.7g/L的脯氨酸、0.85mg/L的AgNO₃、1mg/L的KT、10mg/L的NAA、1mg/L的ZT；

优选地，所述的生根培养基为：以1/2MS培养基为基本培养基，添加终浓度为30g/L的碳源、3g/L的凝胶剂、500mg/L的CA、0.5g/L的脯氨酸、0.4mg/L的IBA。

所述碳源为蔗糖；所述凝胶剂为植物凝胶。

本发明以玉米自交系SL1303幼胚为受体材料，具体从胚性愈伤的诱导率、再生植株的存活率两个方面对转化体系进行优化，建立了一个高效的玉米自交系幼胚转化方法，为今后利用该体系进行玉米的转基因提供了坚实的基础。

附图说明

图1不同浓度的2,4-D诱导培养10d后的愈伤图，A：2mg/L 2,4-D；B：4mg/L 2,4-D；C：6mg/L 2,4-D；

图2玉米继代1-3次过程中愈伤的变化；

图3继代4次后愈伤的变化，A：Ⅰ型愈伤；B：Ⅱ型愈伤；C：Ⅲ型愈伤；

图4生根培养基，A：未加IBA；B：加0.4mg/L的IBA；

图5农杆菌介导玉米幼胚转化过程，A：诱导培养；B：继代培养；C：分化培养；D：生根培养。

具体实施方式

为了更好地理解本发明，下面结合具体参数、生物材料、附图进行具体说明，不应理解为对本发明保护范围的进一步限定。

实施例1：实验材料

1植物材料

玉米自交系SL1303当年收获的幼胚，材料来自扬州大学农学院玉米育种组，本实验室种植并保存(Gao et al,2016)。

2实验试剂

MS和N6培养基粉末、2,4-D(2,4-二氯苯氧乙酸)和IBA(吲哚丁酸)购自上海生工生物工程技术服务公司。

3培养基

基本培养基为MS和N6培养基，两者均包含微量元素、大量元素、铁盐、钙盐及有机物等5种成分，但各成分的含量有所不同。基本培养基添加的2,4-D(2,4-二氯苯氧乙酸)诱导胚性愈伤组织；CA(酪蛋白氨基酸)作为有机营养物质，促进愈伤生长以及分化；KT(6-糠基氨基嘌呤)和NAA(萘乙酸)的使用，促进胚性愈伤组织分化和生根；ZT(玉米素)促进愈伤发芽；IBA(吲哚丁酸)是生长素的一种，可以促进生根，尤其是不定根的生长，见表1。

表1 玉米幼胚组织培养的培养基成分

实施例2：不同2,4-D浓度对玉米愈伤的影响

设计2、4、6mg/L 3个2,4-D浓度培养愈伤，每种浓度放30粒SL1303的玉米幼胚，每个浓度设置3个重复，诱导愈伤产生10d后统计愈伤长芽率，对愈伤进行继代培养，继代过程中观察愈伤状态变化，从3种浓度中选出最能抑制内生芽的产生和最容易产生胚性愈伤的2,4-D浓度。

由表2可知在一定浓度范围内，2,4-D浓度的增大对内生芽的抑制具有促进作用。当培养基2,4-D的浓度为6.0mg/L时，对内生芽的抑制效果最好，长芽率仅为28.89％。不同浓度的2,4-D诱导培养10天后愈伤长芽情况如图1。

表2 不同浓度的2,4-D诱导10天后愈伤长芽情况

根据Armstrong等将愈伤组织质量分为3种类型，Ⅰ型为乳白色或白色，结构紧密、坚硬，表面皱起，生长慢，易发生器官分化，胚性差不易长期继代；Ⅱ型淡黄色或黄色，结构松散、易碎，有明显的颗粒状，易发生胚状体，且能长期继代培养，是理想类型；Ⅲ型结构疏松，绵软如絮，水渍状，白色透明或半透明，易褐化死亡，不具有分化能力(Armstrong etal.,1985)。

Ⅱ型胚性愈伤组织诱导率＝(Ⅱ型胚性愈伤组织数目/愈伤组织总数)×100％

将继代4次之后出现的胚性愈伤组织转移到再生培养基上，光照培养1周左右分化出绿色幼苗，观察不同2,4-D浓度诱导产生的愈伤组织分化成幼苗的能力。

继代1-3次过程中愈伤变化不明显(图2)，继代4次后愈伤变化状态开始发生变化，逐渐产生Ⅰ型、Ⅱ型和Ⅲ型愈伤(图3)，加入4mg/L的2,4-D的培养基比加入2mg/L、6mg/L的2,4-D的培养基，经继代4次后Ⅱ型愈伤率更多，Ⅱ型愈伤率为18.89％(表3)。

表3 不同浓度的2,4-D继代4次后愈伤诱导情况

实施例3：生根培养基

设计生根培养基，从SL1303愈伤块上切下单株无菌小苗，移栽到不同的生根培养基中，分别为一个不加IBA和一个加0.4mg/L的IBA的生根培养基。研究显示(图4)，小苗转入加0.4mg/L的IBA的生根培养基后，3-4天即可生出0.5-1.0cm的粗壮幼根且生长迅速，10d左右时间就可以进行炼苗移栽，比不加IBA培养基更适合用作生根培养基。

实施例4：玉米幼胚的转化方法

1选种和灭菌

挑选玉米自交系SL1303授粉后15天的种子，放入250ml的三角瓶中，先用70％酒精对种子表面消毒5min，再用0.1％升汞浸泡6min(不能高于8min)或者2％次氯酸钠浸泡30min，完毕后用无菌水洗涤5次(残留的升汞和次氯酸钠会影响愈伤组织的状态)。

2诱导培养

在无菌操作台中剥取幼胚，用镊子将玉米种子固定住，右手使用解剖刀，将玉米的胚挑出，沿胚轴纵切成2半，然后盾片向上置于诱导培养基上。先34℃高温诱导暗培养3天；再放在培养箱25℃，暗培养7天。

3继代培养

将诱导产生的愈伤切去内生芽，接种至继代培养基中25℃暗培养7天，继代两次，统计产生胚性愈伤组织(颗粒状，淡黄色)。

4分化培养

将长出胚性愈伤组织转入分化培养基中，25℃，光照培养至长芽。

5生根培养

待长出完整的再生苗后转入生根培养基中，28℃，每天16小时光照，进行生根壮苗，根长至4cm左右，进行炼苗移栽(图5)。

本发明所述的实例是对本发明的说明而不能限制本发明，在与本发明相当的含义和范围内的任何改变和调整，都应认为是在本发明的范围内。

Claims (1)

1.一种玉米自交系SL1303幼胚转化方法，其特征在于：包括如下步骤：

（1）愈伤组织诱导：在无菌操作台中剥取幼胚，用镊子将玉米种子固定住，将玉米的胚挑出，沿胚轴纵切成两半，然后将胚的外侧面向上置于愈伤组织诱导培养基上；先在34℃高温下暗培养3天；再放在培养箱25℃，暗培养7天；

（2）继代培养：将诱导产生的愈伤组织切去内生芽，接种至继代培养基中25℃暗培养7天，继代两次，统计产生的胚性愈伤组织；

（3）分化培养：将长出的胚性愈伤组织转入分化培养基中，25℃，光照培养至长芽；

（4）生根培养：待长出完整的再生苗后转入生根培养基中，28℃，每天16小时光照，进行生根壮苗，根长至4-5cm，进行炼苗移栽；

所述的愈伤组织诱导培养基为：MS+30g/L碳源+3g/L凝胶剂+4mg/L 2,4-D+500mg/L酪蛋白氨基酸+500mg/L脯氨酸；

所述的继代培养基为：MS+30g/L碳源+3g/L凝胶剂+4mg/L 2,4-D+500mg/L 酪蛋白氨基酸+500mg/L脯氨酸+0.85mg/L AgNO₃；

所述的分化培养基为：N6+60g/L 碳源+3g/L 凝胶剂+0.7g/L脯氨酸+500mg/L 酪蛋白氨基酸+1mg/L KT+10mg/L NAA+1mg/L ZT；

所述的生根培养基为：1/2MS+30g/L 碳源+3g/L 凝胶剂+500mg/L酪蛋白氨基酸+0.5g/L脯氨酸+0.4mg/L IBA；

所述碳源为蔗糖；

所述凝胶剂为植物凝胶。

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