CN110982837B - 一种辣椒遗传转化体系的制备方法 - Google Patents

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Abstract

本发明属于植物组织遗传领域，特别涉及一种辣椒遗传转化体系的制备方法。该方法包括：预培养、侵染、共培养、芽分化、芽伸长、生根、验证步骤，通过根癌农杆菌向辣椒中转入pCAMBIA1302双元质粒载体。本发明的制备方法不仅包括得到转基因植株的步骤，还包括对转基因植株的验证步骤，形成了完整的转基因体系，可实现转基因辣椒的快速培育，为辣椒基因功能组学的研究和育种奠定基础，从而培育出丰产、优质的辣椒新品种。

Description

一种辣椒遗传转化体系的制备方法
技术领域
本发明属于植物组织遗传领域，特别涉及一种辣椒遗传转化体系的制备方法。
背景技术
转基因技术是利用重组DNA、细胞组织培养或种质系统转化等技术，将外源基因导入植物细胞或组织，使之定向重组遗传物质，改良植物性状，培育优质高产作物新品种的技术。转基因技术已成为植物分子生物学研究的强有力的实验手段，更是基因克隆、功能基因组研究必不可少的实验工具。这种技术和常规育种方法比较，所具特点有:1)不受亲缘关系的限制，可实现动植物和微生物间遗传物质的交流；2)有效地打破有利基因和不利基因的连锁，充分利用有用基因；3)加快育种进程，缩短育种年限。遗传转化方法为三类：1)农杆菌介导的基因转移；2)以原生质体、细胞或组织为受体的直接转移，如电激、微注射、PEG介导法；3)种质系统的基因转移，如利用子房注射、种胚、体细胞胚及花粉。目前应用最多的是根癌农杆菌介导的转基因方法，迄今所获得的200多种转基因植物中，80％以上是利用该方法获得的。
辣椒为茄科辣椒属蔬菜作物在世界各地广泛种植，是一种非常重要的经济和营养蔬菜作物，在世界各地广泛种植。与其他作物一样，辣椒生产过程中常受到害虫，疾病和非生物胁迫的威胁。辣椒对非生物胁迫耐受性的基因工程对于提高农业生产力至关重要，这取决于高效可靠的遗传转化体系。
辣椒转基因植物长期以来都没有建立起来成熟稳定的辣椒转基因体系。辣椒的再生具有高度基因型依赖性，并且农杆菌介导的转化效率在该系统中受到限制，再生效率不理想，在多数试验中植株的再生周期长或分化频率低，其不定芽的生长能力较差，有的甚至停留在芽诱导阶段而不能进一步生长，这在很大程度上限制了辣椒基因工程的研究进展。自从首次开展辣椒组织培养工作以来，国内外相继出现采用不同的辣椒外植体，如子叶、茎尖、茎段、叶片、下胚轴、子叶柄、花药及其原生质体等进行组织培养的报道。目前，关于辣椒转基因工作研究主要集中遗传转化体系的建立上，但遗传转化过程仍存在一些主要问题限制了辣椒转基因技术在实际育种中的应用，如：培养周期长、植株再生困难和遗传转化率低等。
因此，如何建立针对于辣椒的成熟的遗传转化体系、提高遗传转化率是辣椒转基因工作中急需解决的一个难题。
发明内容
本发明提供一种辣椒遗传转化体系的制备方法。
本发明是通过以下的技术方案实现的。
一种辣椒遗传转化体系的制备方法，包括：
预培养步骤：将辣椒外植体置于预培养基进行预培养，得到预培养外植体；侵染步骤：将所述预培养外植体于农杆菌侵染液中进行侵染，得到侵染后的外植体；共培养步骤：将所述侵染后的外植体移入共培养基进行共培养，得到共培养外植体；芽分化步骤：将所述共培养外植体移入选择性培养基进行选择性培养，再转入芽分化培养基进行芽分化培养，得到不定芽；芽伸长培养步骤：将所述不定芽移入芽伸长培养基进行芽伸长培养，得到伸长芽；生根培养步骤：将所述伸长芽移入生根培养基进行生根培养，得到转基因再生植株；优选地，所述农杆菌为根癌农杆菌，更优选为LBA4404菌株；转入所述农杆菌的质粒载体为双元质粒载体，更优选为pCAMBIA1302质粒载体。
在优选的实施方式中，所述外植体为辣椒子叶。
在优选的实施方式中，所述预培养步骤中，所述预培养的时间为3-4天，优选为4天；光照条件为弱光，更优选为：在1800-2300LUX，优选2000LUX下，用薄纸覆盖培养器；温度为24-28℃，优选为25℃；优选地，所述预培养基包括：在MS基本培养基的基础上，添加：吲哚乙酸至终浓度2-8mg/L，优选5mg/L，蔗糖至终浓度20-40g/L，优选30g/L，琼脂粉至终浓度5-10g/L，优选8g/L。在优选的实施方式中，所述侵染步骤中，所述农杆菌侵染液的制备方法包括：将含有质粒载体的单菌落接种于LB液体培养基，再培养至OD600值为0.4-0.6，优选为0.5，之后进行离心处理保留沉淀物，再向所述沉淀物中加入1/2MS液体培养基并混匀，得到所述农杆菌侵染液。
在优选的实施方式中，所述含有质粒载体的单菌落的制备方法包括：将保存在-80℃的农杆菌在冰上融化，加入质粒载体，再进行冰浴、冷冻、水浴、冰上静置；之后再加入LB液体培养基，再培养后离心取沉淀物，再将所述沉淀物重悬浮得到重悬浮液；再将所述重悬浮液涂布于含有LB固体培养基培养，至长出单菌落。
在优选的实施方式中，所述共培养步骤中，所述共培养的时间为1-3天，优选为2天，温度为25℃，光照条件为黑暗；优选地，所述共培养基包括：在MS基本培养基的基础上，添加：6-苄氨基嘌呤至终浓度2-8mg/L，优选5mg/L，吲哚乙酸至终浓度2-8mg/L，优选5mg/L，蔗糖至终浓度20-40g/L，优选30g/L，琼脂粉至终浓度5-10g/L，优选8g/L。
在优选的实施方式中，所述芽分化步骤中，所述芽分化培养的时间为2-4周，优选为3周，温度为26-28℃，光照条件为每天16h光照8h黑暗，其间每5-7天，优选为每5天更换一次培养基；优选地，所述芽分化培养基包括：在MS基本培养基的基础上，添加：6-苄氨基嘌呤至终浓度2-8mg/L，优选5mg/L，吲哚乙酸至终浓度2-8mg/L，优选5mg/L，潮霉素至终浓度10-30mg/L，优选30mg/L，头孢氨苄至终浓度0.1-0.3mg/L，优选0.2mg/L，蔗糖至终浓度20-40g/L，优选30g/L，琼脂粉至终浓度5-10g/L，优选8g/L；更优选地，所述芽分化培养基还包括：2-异戊烯腺嘌呤1.0-3.0mg/L，优选为2.0mg/L，吲哚丁酸1-3mg/L，优选为2.0mg/L，酵母提取物，所述酵母提取物与MS基本培养基的质量百分比为0.1-0.4％，优选为0.2％。
在优选的实施方式中，所述伸长培养步骤中，所述芽伸长培养的光照为1800-2300LUX，优选为2000LUX，温度为24-28℃，优选为25℃；优选地，所述芽伸长培养基包括：在MS基本培养基的基础上，添加：吲哚乙酸至终浓度2-8mg/L，优选5mg/L，潮霉素至终浓度20-40mg/L，优选30mg/L，赤霉素至终浓度0.5-1.5mg/L，优选1mg/L，蔗糖至终浓度20-40g/L，优选30g/L，琼脂粉至终浓度5-10g/L，优选8g/L。
在优选的实施方式中，所述生根培养步骤中，所述生根培养基包括：在MS基本培养基的基础上，添加：吲哚乙酸至终浓度2-8mg/L，优选5mg/L，头孢氨苄至终浓度100-600mg/L，优选500mg/L，蔗糖至终浓度20-40g/L，优选30g/L，琼脂粉至终浓度5-10g/L，优选8g/L。
在优选的实施方式中，所述方法还包括：验证步骤，包括：以所述转基因再生植株的基因组DNA为模板，进行PCR扩增反应，再对所述PCR扩增反应进行检测，验证所述转基因再生转基因植株是否为阳性；
优选地，所述验证步骤中，所述PCR扩增反应包括第一PCR扩增反应和第二PCR扩增反应；所述第一PCR扩增反应的目的片段是pCAMBIA1302质粒中GFP基因中808bp的片段；所述第二PCR扩增反应的目的片段是pCAMBIA1302质粒中35S基因中905bp的片段；优选地，所述验证步骤中，所述第一PCR扩增反应中，引物的核苷酸序列为：正向5'-CATGGTAGATCTGACTAGTAAAGG-3'和反向5'-CTTTATTGCCAAATGTTTGAACG-3'；优选地，所述第二PCR扩增反应中，引物的核苷酸序列为：正向5'-AGGCTTTACACTTTATGCTTCCG-3'和反向5'-GTCAAGAGTCCCCCGTGTTCTCTC-3'；优选地，所述验证步骤中，所述第一PCR扩增反应中，反应程序为：94℃初始变性5分钟，然后进行30个循环，94℃变性30秒，49℃退火30秒，72℃延伸50秒，最后在72℃下延伸10分钟，4℃保温；优选地，所述第二PCR扩增反应中，反应程序为：94℃初始变性5分钟，然后进行30个循环，94℃变性30秒，54℃退火30秒，72℃延伸55秒，最后在72℃下延伸10分钟，4℃保温。
相比现有技术，本发明具有如下有益效果：
1、本发明的制备方法不仅包括得到转基因植株的步骤，还包括对转基因植株的验证步骤，形成了完整的转基因体系。
2、本发明可实现转基因辣椒的快速培育，为辣椒基因功能组学的研究和育种奠定基础，从而培育出丰产、优质的辣椒新品种。
3、本发明利用质粒通过农杆菌LBA4404转入辣椒，质粒具有更强的可操作性，为基因组学研究和育种提供了很好的基础。
4、本发明采用分别针对于pCAMBIA1302-GFP和pCAMBIA1302-35S的两组引物来验证转基因植物是否为阳性，更加科学严谨，验证结论可信度高。
5、本发明采用的各个培养基配比合理，所得辣椒转基因再生植株移栽成活率、培养过程中再生植株形成率、转基因植株阳性率均有较大提高。尤其是芽分化培养基中加入了2-异戊烯腺嘌呤、吲哚丁酸、酵母提取物，能够进一步促进不定芽分化。
6、本发明的各个步骤和参数之间协同作用，共同进一步提高了转基因的效率。
7、本发明操作简便易行，成本低廉，适合广泛使用。
附图说明
图1为本发明辣椒转基因研究流程图。
图2为实施例1中抗性筛选得到的辣椒转基因植株叶片中GFP标签的PCR电泳图。
图3为实施例1中抗性筛选得到的辣椒转基因植株叶片中CaMV 35S的PCR电泳图。
图4为实施例1中CaMV 35S测序结果与pCAMBIA 1302序列比对图。
图5为实施例1中GFP标签测序结果与pCAMBIA 1302序列比对图。
具体实施方式
本发明提供一种辣椒遗传转化体系的制备方法；优选地，采用的农杆菌为根癌农杆菌，更优选为LBA4404菌株，转入上述农杆菌的质粒载体为双元质粒载体，更优选为pCAMBIA1302。
上述LBA4404菌株为Ach5型背景，核基因中含有筛选标签——利福平抗性基因Rif。为了便于转化操作，此菌株携带一无自身转运功能的章鱼碱型Ti质粒pAL4404，此质粒含有vir基因(vir基因是T-DNA插入植物基因组必需的元件，pAL4404质粒自身的T-DNA转移功能被破坏，但可以帮助转入的双元载体T-DNA顺利转移)。pAL4404型Ti质粒含有筛选标签：Strep，赋予LBA4404菌株链霉素抗性，适用于菸草、番茄、烟草等。植物的转基因操作，经植物双元pCAMBIA2301质粒检测，转化效率可达103cfu/μg，-70℃保存12个月转化效率不发生改变。
如图1所示，该方法包括以下步骤：
步骤一、预培养(预处理)：将辣椒外植体置于预培养基进行预培养，得到预培养外植体。本步骤有利于芽点形成和愈伤组织产生。
上述外植体的制备方法优选为：选择生长良好的幼苗，并在其生长点切割子叶将成(0.5-2.5)×(0.5-2.5)cm的块。选择子叶切块作为外植体，是因为子叶部位产生芽点数目最多。
上述预培养的时间为3-4天，优选为4天；光照条件为弱光，具体为：在1800-2300LUX，优选为2000LUX，24-28℃，优选为25℃条件下，用薄的纸张，优选为报纸覆盖培养器。
上述预培养的时间需要限定为3-4天，不进行预培养或预培养时间超过6天时，侵染效率就会明显下降。这可能是由于预培养可促进基因受体细胞的分裂和提高细胞代谢水平，而易于整合外源，使转化率提高。但是预培养时间过长时，可能增大假转化体比。因此，本发明的叶片的预培养时间确定优选为4天较合适。
上述预培养基包括：在MS基本培养基的基础上，添加：吲哚乙酸(IAA)至终浓度2-8mg/L(可以为2mg/L、3mg/L、4mg/L、6mg/L、7mg/L、8mg/L)，优选5mg/L，蔗糖至终浓度20-40g/L(可以为20g/L、25g/L、35g/L、40g/L)，优选30g/L，琼脂粉至终浓度5-10g/L(可以为5g/L、6g/L、7g/L、9g/L、10g/L)，优选8g/L。
步骤二、侵染：将上述预培养外植体于农杆菌侵染液中进行侵染，得到侵染后的外植体。
本步骤中，先利用冻融法将质粒载体pCAMBIA1302转到根癌农杆菌LBA4404中，再将农杆菌活化后侵染。
上述含有质粒载体的单菌落的制备方法包括：将保存在-80℃的农杆菌在冰上融化，加入质粒载体，再进行冰浴、冷冻、水浴、冰上静置；之后再加入LB液体培养基，再培养后离心取沉淀物，再将上述沉淀物重悬浮得到重悬浮液；再将其涂布于含有LB固体培养基培养至长出单菌落。
上述农杆菌侵染液的制备方法包括：将含有质粒载体的单菌落接种于LB液体培养基，再培养至OD600值为0.4-0.6，优选为0.5，如果该OD600值低于0.4则导致侵染效率低，高于0.6则会使外植体褐化死亡；之后进行离心处理保留沉淀物，再向上述沉淀物中加入1/2MS液体培养基并混匀，得到上述农杆菌侵染液。
优选地，上述LB液体培养基包括：NaCL 10g/L，胰蛋白胨10g/L，酵母提取物5g/L；上述LB固体培养基包括：NaCL 10g/L，胰蛋白胨10g/L，酵母提取物5g/L，琼脂粉15g/L。
步骤三、共培养：将上述侵染后的外植体移入共培养基进行共培养，得到共培养外植体。
上述共培养的时间为1-3天，优选为2天，温度为24-28℃，优选为25℃，光照条件为黑暗。
上述共培养基包括：在MS基本培养基的基础上，添加：:6-苄氨基嘌呤(6-BA)至终浓度2-8mg/L(可以为2mg/L、3mg/L、4mg/L、6mg/L、7mg/L、8mg/L)，优选5mg/L，IAA至终浓度2-8mg/L(可以为2mg/L、3mg/L、4mg/L、6mg/L、7mg/L、8mg/L)，优选5mg/L，蔗糖至终浓度20-40g/L(可以为20g/L、25g/L、35g/L、40g/L)，优选30g/L，琼脂粉至终浓度5-10g/L(可以为5g/L、6g/L、7g/L、9g/L、10g/L)，优选8g/L。
步骤四、再生培养(芽分化培养)：将上述共培养外植体移入芽分化培养基进行芽分化培养，得到不定芽。
上述再生培养的时间为2-4周，优选为3周，温度为26-28℃，光照条件为每天16h光照8h黑暗，其间每5-7天，优选5天一次更换培养基。
上述芽分化培养基(再生养基)包括：
在MS基本培养基的基础上，添加：6-BA至终浓度2-8mg/L(可以为2mg/L、3mg/L、4mg/L、6mg/L、7mg/L、8mg/L)，优选5mg/L，IAA至终浓度2-8mg/L(可以为2mg/L、3mg/L、4mg/L、6mg/L、7mg/L、8mg/L)，优选5mg/L，潮霉素(Hygr)至终浓度10-30mg/L(可以为10mg/L、15mg/L、20mg/L、25mg/L)，优选30mg/L，头孢氨苄(Tim)至终浓度0.1-0.3mg/L(可以为0.1mg/L、0.15mg/L、0.25mg/L、0.3mg/L)，优选0.2mg/L，蔗糖至终浓度20-40g/L(可以为20g/L、25g/L、35g/L、40g/L)，优选30g/L，琼脂粉至终浓度5-10g/L(可以为5g/L、6g/L、7g/L、9g/L、10g/L)，优选8g/L。
优选地，上述芽分化培养基还需要添加：
细胞分裂素——2-异戊烯腺嘌呤(2-IP)至终浓度1.0-3.0mg/L(可以为1mg/L、1.5mg/L、2.5mg/L、0.3mg/L)，优选为2.0mg/L；生长素——吲哚丁酸(IBA)：至终浓度1.0-3.0mg/L(可以为1mg/L、1.5mg/L、2.5mg/L、0.3mg/L)，优选为2.0mg/L；酵母提取物(YE)：至终浓度为与MS基本培养基的质量百分比为0.1-0.4％(可以为0.1％、0.15％、0.25％、0.3％、0.35％)，优选为0.2％。这些试剂的添加能够进一步促进不定芽分化，从而提高不定芽分化率、再生植株形成率和转基因植株阳性率。
步骤五、伸长培养：将上述不定芽移入芽伸长培养基进行芽伸长培养，得到伸长芽，其长度达到2-3cm。如果不定芽的长度低于2cm转到生根培养基中则易死亡，如果高于3cm则不易生根。上述伸长芽培养中，光照为1800-2300LUX，优选为2000LUX，温度为24-28℃，优选为25℃。
上述芽伸长培养基包括：
在MS基本培养基的基础上，添加：IAA至终浓度2-8mg/L(可以为2mg/L、3mg/L、4mg/L、6mg/L、7mg/L、8mg/L)，优选5mg/L，Hygr至终浓度20-40mg/L(可以为20mg/L、25mg/L、35mg/L、40mg/L)，优选30mg/L，GA3至终浓度0.5-1.5mg/L(可以为0.5mg/L、0.8mg/L、1.2mg/L、1.5mg/L)，优选1mg/L，蔗糖至终浓度20-40g/L(可以为20g/L、25g/L、35g/L、40g/L)，优选30g/L，琼脂粉至终浓度5-10g/L(可以为5g/L、6g/L、7g/L、9g/L、10g/L)，优选8g/L。
步骤六、生根培养：将上述伸长芽移入生根培养基进行生根培养，得到转基因再生植株。
上述生根培养中，光照为1800-2300LUX，优选为2000LUX，温度为24-28℃，优选为25℃。
上述生根培养基包括：
在MS基本培养基的基础上，添加：IAA至终浓度2-8mg/L(可以为2mg/L、3mg/L、4mg/L、6mg/L、7mg/L、8mg/L)，优选5mg/L，Tim至终浓度100-600mg/L(可以为100mg/L、200mg/L、300mg/L、400mg/L、600mg/L)，优选500mg/L，蔗糖至终浓度20-40g/L(可以为20g/L、25g/L、35g/L、40g/L)，优选30g/L，琼脂粉至终浓度5-10g/(可以为5g/L、6g/L、7g/L、9g/L、10g/L)，优选8g/L。
上述MS(MURASHIGE&SKOOG MEDIUM(incLuding vitamins))基本培养基(不含蔗糖和琼脂)的成分为：
大量元素，包括：
硝酸钾(KNO3)：1900mg/L，硝酸铵(NH4NO3)：1650mg/L，硫酸镁(MgSO4·7H2O)：370mg/L，磷酸二氢钾(KH2PO4)：170mg/L，氯化钙(CaCL2·2H2O)：440mg/L；
微量元素，包括：
硫酸锰(MnSO4·H2O)：16.9mg/L，硫酸锌(ZnSO4·7H2O)：8.6mg/L，硼酸(H3BO3)：6.2mg/L，碘化钾(KI)：0.83mg/L，钼酸钠(Na2MoO4·2H2O)：0.25mg/L，硫酸铜(CuSO4·5H2O)：0.025mg/L，氯化钴(CoCL2·6H2O)：0.025mg/L；
铁盐，包括：
二水合乙二胺四乙酸二钠(Na2-EDTA)：37.3mg/L，硫酸亚铁(FeSO4·4H2O)：27.8mg/L；
有机物，包括：
甘氨酸：2.0mg/L，盐酸吡哆醇：0.5mg/L，盐酸硫胺素：0.1mg/L，烟酸：0.5mg/L，肌酸：100mg/L。
上述MS基本培养基(不含蔗糖和琼脂)也可以采用市场现有的MS培养基粉末直接配制。
本发明的制备方法还包括：验证步骤；当转入上述农杆菌的质粒载体为pCAMBIA1302时，该验证步骤包括：
分步骤一、以质粒pCAMBIA1302的DNA为阳性对照，以未转基因的对照植物基因组DNA为阴性对照，实验组以上述转基因再生植株的基因组DNA为模板，进行PCR扩增反应。采用双重PCR验证，是为了防止转入不完整，即：存在两个目的基因但只转入一个的情况。
上述PCR扩增反应包括第一PCR扩增反应和第二PCR扩增反应；
上述第一PCR扩增反应的目的片段是pCAMBIA1302质粒中GFP基因中808bp的片段。引物的核苷酸序列为：正向5'-CATGGTAGATCTGACTAGTAAAGG-3'和反向5'-CTTTATTGCCAAATGTTTGAACG-3'。反应程序为：94℃初始变性5分钟，然后进行30个循环，94℃变性30秒，49℃退火30秒，72℃延伸50秒，最后在72℃下延伸10分钟，4℃保温。
上述第二PCR扩增反应的目的片段是pCAMBIA1302质粒中35S基因中905bp的片段。引物的核苷酸序列为：正向5'-AGGCTTTACACTTTATGCTTCCG-3'和反向5'-GTCAAGAGTCCCCCGTGTTCTCTC-3'。反应程序为：94℃初始变性5分钟，然后进行30个循环，94℃变性30秒，54℃退火30秒，72℃延伸55秒，最后在72℃下延伸10分钟，4℃保温。
分步骤二、对上述PCR扩增反应进行检测，包括琼脂糖凝胶电泳检测和DNA测序，如果实验组的电泳结果和测序结果与上述阳性对照相同，即上述再生转基因植株为阳性。
综上，本发明不仅包括从外植体得到转基因植株的步骤，还包括对转基因植株进行检测的步骤，如此就形成了完整的、稳定的辣椒转基因体系，为辣椒基因功能组学的研究和育种奠定基础。
下面结合具体实施例，进一步阐述本发明。应理解，这些实施例仅用于本发明而不用于限制本发明的范围。对外应理解，在阅读了本发明的内容之后，本领域技术人员对本发明作各种改动或修改，这些等价形式同样落于本申请所附权利要求书所限定的范围。
实施例1
本实施例的植物材料选用线椒国福403种子；转化载体为根癌农杆菌菌株LBA4404，质粒为pCAMBIA1302，均购自北京华岳洋生物科技有限公司。本实施例所有的培养基均经过121℃灭菌15min。
本实施例的制备方法包括：
(1)辣椒外植体的制备：选择生长良好的幼苗，并在其生长点切割子叶形成2X2cm的块作为外植体。
(2)预培养：将外植体在预培养基中在弱光2000LUX，25℃的条件下，用报纸覆盖培养基，预培养4天，得到预培养外植体。
上述预培养基的组成为：MS粉4.4052g+IAA 5mg+蔗糖30g+琼脂粉8g，蒸馏水定容至1L。该培养基中的MS粉为荷兰DUCHEFA Biochemie的公司产品。
(3)农杆菌转化：将保存在-80℃的根癌农杆菌(在离心管中)在冰上融化，在超净工作台中加入2-4μL(不超过感受态体积的1/10)的pCAMBIA1302质粒DNA至100μL感受态细胞；将离心管轻轻摇动，先在冰上沐浴5分钟，再冷冻在液氮中5分钟，然后再37℃水浴5分钟，最后冰上静置5分钟；在无菌条件下，向其中加入700μL无抗生素的LB液体培养基，并在28℃下培养2-3小时；然后以5000rpm/min离心1分钟收集沉淀物，并留下约100μL上清液；轻轻吹上重悬浮液(操作为：用留下的约100μL上清液，将沉淀物重悬于其中)，涂布在含有相应抗生素的LB平板(LB固体培养基)上，28℃倒置培养2-3天至长出单菌落。
上述LB液体培养基的组成为：NaCL 10g+胰蛋白胨10g+酵母提取物5g，蒸馏水定容至1L；
上述LB固体培养基的组成为：NaCL 10g+胰蛋白胨10g+酵母提取物5g，琼脂粉15g，蒸馏水定容至1L。
(4)农杆菌侵染液制备：挑取一个含有pCAMBIA1302载体的单菌落接种到20mL的LB液体培养基上，在28℃220rpm摇床培养至菌液的OD600值为0.5，再用移液枪吸3-5mL的菌液至离心管中，以12000rpm/min离心1分钟，弃上清，加入等体积的液体1/2MS培养基并混匀，获得农杆菌侵染液。
(5)农杆菌侵染：将上述预培养的外植体置于农杆菌侵染液；轻轻摇动培养皿以均匀混合并浸泡5-8分钟；然后用镊子将外植体平放在无菌滤纸上，直至吸干侵染液。
(6)共培养：将上述侵染后的外植体的子叶伤口部位向下插入共培养的培养基，于在黑暗中于25℃培养两天，得到共培养的外植体。
上述共培养的培养基的组成为：MS 4.4052g+6-BA 5mg+IAA 5mg+蔗糖30g+琼脂粉8g，蒸馏水定容至1L。
(7)芽分化培养：将上述共培养的外植体移入芽分化培养基，26-28℃条件下每天16h光照8h黑暗条件下培养约3周，其间每5天更换一次培养基，获得愈伤组织或不定芽，最后选择长势良好的不定芽用于下一步。
上述芽分化培养基的组成为：MS 4.4052g+6-BA 5mg+IAA 5mg+Hygr 30mg+Tim0.2mg+蔗糖30g+琼脂粉8g，蒸馏水定容至1L。
本步骤中，不定芽分化率(即：本步骤中长出的用于下一步的不定芽的外植体数/共培养的外植体数)为60％。
(8)芽伸长培养：将上述不定芽转入芽伸长培养基中2000LUX，25℃进行培养，至不定芽的长度至2-3cm。
上述芽伸长培养基的组成为：MS 4.4052g+IAA 5mg+Hygr 30mg+GA3 1mg+蔗糖30g+琼脂粉8g，蒸馏水定容至1L。
(9)生根培养：将上述不定芽移到生根选择培养基中2000LUX，25℃培养，直至长成完整的再生植株。
上述生根培养基的组成为：MS 4.4052g+IAA 5mg+Tim 500mg+蔗糖30g+琼脂粉8g，蒸馏水定容至1L。
本实施例的验证步骤包括：
(1)取再生植株的叶片，利用十六烷基三甲基溴化铵(CTAB)法提取样品总DNA，利用核酸蛋白测定仪测定样品DNA的浓度与纯度，DNA质量浓度可以达到100ng/μL以上，OD260/OD230值在大于2.0，OD260/OD280值在1.8～2.0之间，均达到后续试验对DNA进行分析的要求。
(2)以步骤(10)得到的再生植株叶片的总DNA为实验组，pCAMBIA1302质粒DNA做阳性对照，未转化植株的总DNA做阴性对照，进行PCR扩增。选取阳性的辣椒转基因再生植株进行PCR检测并进行测序，再取阳性的辣椒转基因再生植株，即完成辣椒转基因体系建立。
(2.1)第一组引物的PCR扩增：PCR确认转基因植物引物pCAMBIA1302-GFP组(正向5'-CATGGTAGATCTGACTAGTAAAGG-3'和反向5'-CTTTATTGCCAAATGTTTGAACG-3')用于扩增对应于pCAMBIA1302质粒中GFP基因的转基因植物中特定的808bp DNA序列：
对于pCAMBIA1302质粒GFP基因的检测，PCR条件设定为：94℃初始变性5分钟，然后进行30个循环，94℃变性30秒，49℃退火30秒，72℃延伸50秒，最后在72℃下延伸10分钟，4℃保温。
(2.2)第二组引物的PCR扩增：PCR确认转基因植物引物pCAMBIA1302-35S组(正向5'-AGGCTTTACACTTTATGCTTCCG-3'和反向5'-GTCAAGAGTCCCCCGTGTTCTCTC-3'用于扩增对应于pCAMBIA1302质粒35S基因的转基因植物中特定的905bp的DNA序列。
对于pCAMBIA1302质粒的检测，PCR条件设定为：94℃初始变性5分钟，然后进行30个循环，94℃变性30秒，54℃退火30秒，72℃延伸55秒，最后在72℃下延伸10分钟，4℃保温。
(2.3)质粒DNA用作阳性对照，来自未转化对照植物的DNA用作阴性对照。在1.5％(w/v)琼脂糖(Seakem LE，KoLen，Germany)凝胶上电泳后，使用凝胶记录系统(QuantityOne)观察放大的PCR产物并拍照，通过GeLLred核酸染料染色。
上述各个PCR扩增均采用20μL反应体系，由下列成分组成:
Figure BDA0002320496380000121
(3)检测结果：提取经过抗性筛选得到的辣椒转基因植株叶片的DNA，以未转化的植株为阴性对照(ck-)，pCAMBIA1302质粒为阳性对照(ck+)。图2为转入植物的pCAMBIA1302质粒上GFP标签的PCR检测结果，其中M表示DNA Marker DL2000,ck-表示阴性对照，ck+表示阳性对照，泳道1-10表示转基因植株A1，A2，A3，A4，A5，A6，A7，A8，A9，A10。图3为转入植物的pCAMBIA1302质粒上35S启动子的PCR检测结果，其中M表示DNA Marker DL2000,ck-表示阴性对照，ck+表示阳性对照，泳道1-10表示转基因植株A1，A2，A3，A4，A5，A6，A7，A8，A9，A10。辣椒的转基因株系1-10均能扩增出与阳性对照大小一致的目的条带，而阴性对照中则没有任何条带。将扩增出目的条带的PCR产物测序，并与pCAMBIA 1302质粒序列进行比对一致(如图4和图5)，认为成功将pCAMBIA 1302质粒转入辣椒，辣椒遗传转化体系成功建立。
本实施例所得辣椒转基因再生植株移栽成活率98％，培养过程中再生植株形成率26％，转基因植株阳性率70％。
上述再生植株移栽成活率的计算方式为：(再生植株移栽成活数/步骤(9)得到的再生植株的移栽数)×100％；
上述再生植株形成率的计算方式为：(步骤(9)得到的再生植株数/步骤(1)得到的外植体数)×100％；
上述转基因植株阳性率的计算方式为：(PCR检测阳性植株数/用于PCR检测的步骤(9)得到的再生植株数)×100％。
实施例2
本实施例的植物材料、转化载体、质粒为均与实施例1相同，各个试剂的来源均与实施例1相同。本实施例所有的培养基均经过121℃灭菌15min。
本实施例的制备方法包括：
(1)辣椒外植体的制备：操作与实施例1相同。
(2)预培养：将外植体在预培养基中在弱光2200LUX，28℃的条件下，用报纸覆盖培养基，预培养2天，得到预培养外植体。
上述预培养基的组成为：MS粉4.4052g+IAA 4mg+蔗糖30g+琼脂粉8g，蒸馏水定容至1L。
(3)-(5)：操作与实施例1相同。
(6)共培养：将上述侵染后的外植体的子叶伤口部位向下插入共培养的培养基，于在黑暗中于25℃培养两天，得到共培养的外植体。
上述共培养的培养基的组成为：MS 4.4052g+6-BA 5.5mg+IAA 5mg+蔗糖30g+琼脂粉8g，蒸馏水定容至1L。
(7)芽分化培养：将上述共培养的外植体移入芽分化培养基，26-28℃条件下每天16h光照8h黑暗条件下培养约3周，其间每7天更换一次培养基，获得愈伤组织或不定芽，最后选择长势良好的不定芽用于下一步。
上述芽分化培养基的组成为：MS 4.4052g+6-BA 5.5mg+IAA 5.5mg+Hygr 30mg+Tim 0.2mg+蔗糖30g+琼脂粉8g，蒸馏水定容至1L。
(8)芽伸长培养：将上述不定芽转入芽伸长培养基中2200LUX，28℃进行培养，至不定芽的长度至2-3cm。
上述芽伸长培养基的组成为：MS 4.4052g+IAA 6mg+Hygr 30mg+GA3 1mg+蔗糖30g+琼脂粉8g，蒸馏水定容至1L。
(9)生根培养：将上述不定芽移到生根选择培养基中2200LUX，28℃培养，直至长成完整的再生植株。
上述生根培养基的组成为：MS 4.4052g+IAA 6mg+Tim 500mg+蔗糖30g+琼脂粉8g，蒸馏水定容至1L。
本实施例的验证步骤的操作与实施例1相同，辣椒转基因再生植株移栽成活率99％，培养过程中再生植株形成率20％，转基因植株阳性率80％。
实施例3
本实施例的植物材料、转化载体、质粒为均与实施例1相同，各个试剂的来源均与实施例1相同。本实施例所有的培养基均经过121℃灭菌15min。
本实施例的制备方法包括：
(1)辣椒外植体的制备：操作与实施例1相同。
(2)预培养：将外植体在预培养基中在弱光2100LUX，26℃的条件下，用报纸覆盖培养基，预培养3天，得到预培养外植体。
上述预培养基的组成为：MS粉4.4052g+IAA 6mg+蔗糖30g+琼脂粉8g，蒸馏水定容至1L。
(3)-(5)：操作与实施例1相同。
(6)共培养：将上述侵染后的外植体的子叶伤口部位向下插入共培养的培养基，于在黑暗中于27℃培养两天，得到共培养的外植体。
上述共培养的培养基的组成为：MS 4.4052g+6-BA 4mg+IAA 6mg+蔗糖30g+琼脂粉8g，蒸馏水定容至1L。
(7)芽分化培养：将上述共培养的外植体移入芽分化培养基，26-28℃条件下每天16h光照8h黑暗条件下培养约3周，其间每6天更换一次培养基，获得愈伤组织或不定芽，最后选择长势良好的不定芽用于下一步。
上述芽分化培养基的组成为：MS 4.4052g+6-BA 6mg+IAA 4mg+Hygr 30mg+Tim0.2mg+蔗糖30g+琼脂粉8g，蒸馏水定容至1L。
(8)芽伸长培养：将上述不定芽转入芽伸长培养基中2100LUX，26℃进行培养，至不定芽的长度至2-3cm。
上述芽伸长培养基的组成为：MS 4.4052g+IAA 4mg+Hygr 30mg+GA3
1.5mg+蔗糖30g+琼脂粉8g，蒸馏水定容至1L。
(9)生根培养：将上述不定芽移到生根选择培养基中2100LUX，26℃培养，直至长成完整的再生植株。
上述生根培养基的组成为：MS 4.4052g+IAA 6mg+Tim 500mg+蔗糖30g+琼脂粉8g，蒸馏水定容至1L。
本实施例的验证步骤的操作与实施例1相同，辣椒转基因再生植株移栽成活率97％，培养过程中再生植株形成率30％，转基因植株阳性率85％。
实施例4
本实施例的植物材料、转化载体、质粒为均与实施例1相同，各个试剂的来源均与实施例1相同。本实施例所有的培养基均经过121℃灭菌15min。
本实施例的制备方法包括：
(1)辣椒外植体的制备：操作与实施例1相同。
(2)预培养：将外植体在预培养基中在弱光1900LUX，25℃的条件下，用报纸覆盖培养基，预培养2天，得到预培养外植体。
上述预培养基的组成为：MS粉4.4052g+IAA 5.5mg+蔗糖30g+琼脂粉8g，蒸馏水定容至1L。
(3)-(5)：操作与实施例1相同。
(6)共培养：将上述侵染后的外植体的子叶伤口部位向下插入共培养的培养基，于在黑暗中于25℃培养3天，得到共培养的外植体。
上述共培养的培养基的组成为：MS 4.4052g+6-BA 4mg+IAA 6mg+蔗糖30g+琼脂粉8g，蒸馏水定容至1L。
(7)芽分化培养：将上述共培养的外植体移入芽分化培养基，26-28℃条件下每天16h光照8h黑暗条件下培养约3周，其间每8天更换一次培养基，获得愈伤组织或不定芽，最后选择长势良好的不定芽用于下一步。
上述芽分化培养基的组成为：MS 4.4052g+6-BA 4mg+IAA 6mg+Hygr 30mg+Tim0.2mg+蔗糖30g+琼脂粉8g，蒸馏水定容至1L。
(8)芽伸长培养：将上述不定芽转入芽伸长培养基中2100LUX，26℃进行培养，至不定芽的长度至2-3cm。
上述芽伸长培养基的组成为：MS 4.4052g+IAA 5.5mg+Hygr 30mg+GA30.5mg+蔗糖30g+琼脂粉8g，蒸馏水定容至1L。
(9)生根培养：将上述不定芽移到生根选择培养基中2000LUX，26℃培养，直至长成完整的再生植株。
上述生根培养基的组成为：MS 4.4052g+IAA 5.5mg+Tim 500mg+蔗糖30g+琼脂粉8g，蒸馏水定容至1L。
本实施例的验证步骤的操作与实施例1相同，辣椒转基因再生植株移栽成活率96％，培养过程中再生植株形成率27％，转基因植株阳性率82％。
实施例5-8
实施例5-8的植物材料、转化载体、质粒为均与实施例1相同，各个试剂的来源均与实施例1相同，所有的培养基均经过121℃灭菌15min。
实施例5与实施例1、实施例6与实施例2、实施例7与实施例3、实施例8与实施例4的步骤(1)-(6)、(8)-(9)、验证步骤的操作和参数均相同，步骤(7)的培养条件和操作也与实施例1相同，区别在于芽分化培养基的组成。
实施例5
芽分化培养基的组成为：MS 4.4052g+6-BA 5mg+IAA 5mg+2IP 2mg+IBA 1.5mg+酵母提取物0.2％+Hygr 30mg+Tim 0.2mg+蔗糖30g+琼脂粉8g，蒸馏水定容至1L。
实施例6
芽分化培养基的组成为：MS 4.4052g+6-BA 5.5mg+IAA 5.5mg+2IP 2mg+IBA1.5mg+酵母提取物0.2％+Hygr 30mg+Tim 0.2mg+蔗糖30g+琼脂粉8g，蒸馏水定容至1L。
实施例7
芽分化培养基的组成为：MS 4.4052g+6-BA 6mg+IAA 4mg+2IP 2mg+IBA 1.5mg+酵母提取物0.2％+Hygr 30mg+Tim 0.2mg+蔗糖30g+琼脂粉8g，蒸馏水定容至1L。
实施例8
芽分化培养基的组成为：MS 4.4052g+6-BA 4mg+IAA 6mg+2IP 2mg+IBA 1.5mg+酵母提取物0.2％+Hygr 30mg+Tim 0.2mg+蔗糖30g+琼脂粉8g，蒸馏水定容至1L。
实施例9
本实施例的植物材料、转化载体、质粒为均与实施例1相同，各个试剂的来源均与实施例1相同，所有的培养基均经过121℃灭菌15min。
本实施例与实施例1的步骤(1)-(6)、(8)-(9)、验证步骤的操作和参数均相同，步骤(7)的培养条件和操作也与实施例1相同，区别在于芽分化培养基的组成如下：
MS 4.4052g+6-BA 5mg+IAA 5mg+2IP 3mg+IBA 1.0mg+酵母提取物0.1％+Hygr30mg+Tim 0.2mg+蔗糖30g+琼脂粉8g，蒸馏水定容至1L。
实施例10
本实施例的植物材料、转化载体、质粒为均与实施例1相同，各个试剂的来源均与实施例1相同，所有的培养基均经过121℃灭菌15min。
本实施例与实施例1的步骤(1)-(6)、(8)-(9)、验证步骤的操作和参数均相同，步骤(7)的培养条件和操作也与实施例1相同，区别在于芽分化培养基的组成如下：
MS 4.4052g+6-BA 5mg+IAA 5mg+2IP 1mg+IBA 1.5mg+酵母提取物0.4％+Hygr30mg+Tim 0.2mg+蔗糖30g+琼脂粉8g，蒸馏水定容至1L。
实施例5-10验证步骤的操作与实施例1相同，转基因再生植株移栽成活率、再生植株形成率、转基因植株阳性率如下表：
Figure BDA0002320496380000171
实施例2-10中，步骤(7)的不定芽分化率分别为：59％、62％、61％、75％、73％、72％、74％、73％、73％。。

Claims (23)

1.一种辣椒遗传转化体系的制备方法，其特征在于：所述制备方法包括：
预培养步骤：将辣椒外植体置于预培养基进行预培养，得到预培养外植体；
所述预培养基包括：在MS基本培养基的基础上，添加：吲哚乙酸至终浓度2-8mg/L，蔗糖至终浓度20-40 g/L，琼脂粉至终浓度5-10 g /L；
所述预培养步骤中，所述预培养的时间为3-4天；所述预培养的光照条件为弱光，在1800-2300LUX下，用薄纸覆盖培养器；所述预培养的温度为24-28℃；
侵染步骤：将所述预培养外植体于农杆菌侵染液中进行侵染，得到侵染后的外植体；
共培养步骤：将所述侵染后的外植体移入共培养基进行共培养，得到共培养外植体；
所述共培养基包括：在MS基本培养基的基础上，添加：6-苄氨基嘌呤至终浓度2-8mg/L，吲哚乙酸至终浓度2-8mg/L，蔗糖至终浓度20-40 g/L，琼脂粉至终浓度5-10 g /L；
所述共培养步骤中，所述共培养的时间为1-3天，温度为25℃，光照条件为黑暗；
芽分化步骤：将所述共培养外植体移入芽分化培养基进行芽分化培养，得到不定芽；
所述芽分化培养基包括：在MS基本培养基的基础上，添加：6-苄氨基嘌呤至终浓度2-8mg/L，吲哚乙酸至终浓度2-8mg/L，潮霉素至终浓度10-30 mg/L，头孢氨苄至终浓度0.1-0.3 mg/L，蔗糖至终浓度20-40 g/L，琼脂粉至终浓度5-10 g /L，2-异戊烯腺嘌呤至终浓度1.0-3.0mg/L，吲哚丁酸至终浓度1-3mg/L和酵母提取物，所述酵母提取物与MS基本培养基的质量百分比为0.1-0.4%；
所述芽分化步骤中，所述芽分化培养的时间为2-4周，温度为26-28℃，光照条件为每天16h光照8h黑暗，其间每5-7天更换一次培养基；
芽伸长培养步骤：将所述不定芽移入芽伸长培养基进行芽伸长培养，得到伸长芽；
所述芽伸长培养基包括：在MS基本培养基的基础上，添加：吲哚乙酸至终浓度2-8mg/L，潮霉素至终浓度20-40 mg/L，赤霉素至终浓度0.5-1.5mg/L，蔗糖至终浓度20-40 g/L，琼脂粉至终浓度5-10 g /L；
所述芽伸长培养步骤中，所述芽伸长培养的光照条件为1800-2300LUX，温度为24-28℃；
生根培养步骤：将所述伸长芽移入生根培养基进行生根培养，得到转基因再生植株；
所述生根培养基包括：在MS基本培养基的基础上，添加：吲哚乙酸至终浓度2-8mg/L，头孢氨苄至终浓度100-600mg/L，蔗糖至终浓度20-40 g/L，琼脂粉至终浓度5-10 g /L；
所述生根培养步骤中，所述生根培养的光照条件为1800-2300LUX，温度为24-28℃；
所述辣椒品种选自国福403。
2.根据权利要求1所述制备方法，其特征在于：所述农杆菌为根癌农杆菌；转入所述农杆菌的质粒载体为双元质粒载体。
3.根据权利要求2所述制备方法，其特征在于：所述农杆菌为LBA4404 菌株；转入所述农杆菌的质粒载体为pCAMBIA1302质粒载体。
4.根据权利要求1所述制备方法，其特征在于：所述外植体为辣椒子叶。
5.根据权利要求1所述制备方法，其特征在于：所述预培养步骤中，所述预培养的时间为4天；光照条件为弱光，在2000LUX下，用薄纸覆盖培养器；温度为25℃。
6.根据权利要求1所述制备方法，其特征在于：所述预培养基包括：在MS基本培养基的基础上，添加：吲哚乙酸至终浓度5 mg/L，蔗糖至终浓度30 g/L，琼脂粉至终浓度8 g /L。
7.根据权利要求1所述制备方法，其特征在于：所述侵染步骤中，所述农杆菌侵染液的制备方法包括：将含有质粒载体的单菌落接种于LB液体培养基，再培养至OD600值为0.4-0.6，之后进行离心处理保留沉淀物，再向所述沉淀物中加入1/2MS液体培养基并混匀，得到所述农杆菌侵染液。
8.根据权利要求7所述制备方法，其特征在于：OD600值为0.5。
9.根据权利要求7所述制备方法，其特征在于：所述含有质粒载体的单菌落的制备方法包括：将保存在-80℃的农杆菌在冰上融化，加入质粒载体，再进行冰浴、冷冻、水浴、冰上静置；之后再加入LB液体培养基，再培养后离心取沉淀物，再将所述沉淀物重悬浮得到重悬浮液；再将所述重悬浮液涂布于含有LB固体培养基培养，至长出单菌落。
10.根据权利要求1所述制备方法，其特征在于：所述共培养的时间为2天。
11.根据权利要求1所述制备方法，其特征在于：所述共培养基包括：在MS基本培养基的基础上，添加：6-苄氨基嘌呤至终浓度5 mg/L，吲哚乙酸至终浓度5 mg/L，蔗糖至终浓度30g/L，琼脂粉至终浓度8 g /L。
12.根据权利要求1所述制备方法，其特征在于：所述芽分化步骤中，
所述芽分化培养的时间为3周，温度为26-28℃，光照条件为每天16h光照8h黑暗，其间每5天更换一次培养基。
13.根据权利要求1所述制备方法，其特征在于：所述芽分化培养基包括：在MS基本培养基的基础上，添加：6-苄氨基嘌呤至终浓度5 mg/L，吲哚乙酸至终浓度5 mg/L，潮霉素至终浓度 30mg/L，头孢氨苄至终浓度0.2mg/L，蔗糖至终浓度30 g/L，琼脂粉至终浓度8 g /L。
14.根据权利要求1所述制备方法，其特征在于：所述芽分化培养基还包括：2-异戊烯腺嘌呤至终浓度为2.0 mg/L，吲哚丁酸至终浓度1-3mg/L，酵母提取物，所述酵母提取物与MS基本培养基的质量百分比为0.2%。
15.根据权利要求1所述制备方法，其特征在于：所述芽伸长培养步骤中，
所述芽伸长培养的光照为2000LUX，温度为25℃。
16.根据权利要求1所述制备方法，其特征在于：所述芽伸长培养基包括：在MS基本培养基的基础上，添加：吲哚乙酸至终浓度5 mg/L，潮霉素至终浓度30mg/L，赤霉素至终浓度1mg/L，蔗糖至终浓度30 g/L，琼脂粉至终浓度8 g /L。
17.根据权利要求1所述制备方法，其特征在于：所述生根培养步骤中，所述生根培养基包括：
在MS基本培养基的基础上，添加：吲哚乙酸至终浓度5 mg/L，头孢氨苄至终浓度500mg/L，蔗糖至终浓度30 g/L，琼脂粉至终浓度8 g /L。
18.根据权利要求1所述制备方法，其特征在于：所述方法还包括：验证步骤，包括：以所述转基因再生植株的基因组DNA为模板，进行PCR扩增反应，再对所述PCR扩增反应进行检测，验证所述转基因再生转基因植株是否为阳性。
19.根据权利要求18所述制备方法，其特征在于：所述验证步骤中，
所述PCR扩增反应包括第一PCR扩增反应和第二PCR扩增反应；
所述第一PCR扩增反应的目的片段是pCAMBIA1302 质粒中 GFP基因中808bp的片段；
所述第二PCR扩增反应的目的片段是pCAMBIA1302 质粒中 35S基因中905bp的片段。
20.根据权利要求19所述制备方法，其特征在于：所述验证步骤中，
所述第一PCR扩增反应中，引物的核苷酸序列为：正向5'-CATGGTAGATCTGACTAGTAAAGG-3'和反向5'-CTTTATTGCCAAATGTTTGAACG-3'。
21.根据权利要求19所述制备方法，其特征在于：所述第二PCR扩增反应中，引物的核苷酸序列为：正向5'-AGGCTTTACACTTTATGCTTCCG-3' 和反向 5'-GTCAAGAGTCCCCCGTGTTCTCTC-3'。
22.根据权利要求20所述制备方法，其特征在于：所述验证步骤中，
所述第一PCR扩增反应中，反应程序为：
94℃ 初始变性 5 分钟，然后进行 30 个循环， 94℃ 变性 30 秒， 49℃ 退火 30秒， 72℃ 延伸 50 秒，最后在 72℃ 下延伸 10 分钟，4℃保温。
23.根据权利要求21所述制备方法，其特征在于：所述第二PCR扩增反应中，反应程序为：
94℃初始变性5分钟，然后进行30个循环，94℃变性30秒，54℃退火30秒，72℃延伸55秒，最后在72℃下延伸10分钟，4℃保温。
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