CN101210251A

CN101210251A - 烟草s期激酶蛋白1基因序列及其编码蛋白质序列和应用

Info

Publication number: CN101210251A
Application number: CNA2006101558237A
Authority: CN
Inventors: 杜昱光; 张付云; 白雪芳
Original assignee: Dalian Institute of Chemical Physics of CAS
Current assignee: Dalian Institute of Chemical Physics of CAS
Priority date: 2006-12-29
Filing date: 2006-12-29
Publication date: 2008-07-02

Abstract

本发明涉及S期激酶相关蛋白1(S－PHASEKINASE－ASSOCIATEDPROTEIN1，SKP1)；具体地说是真核生物(烟草)中普遍存在的一类蛋白，是泛素连接酶3SCF复合体的核心亚单位，与烟草的抗病毒活性相关，分子量为17527.78Da，等电点4.57，定位于细胞质，其Skp1结构域位于4－105位氨基酸。本发明对生物农药的应用具有明显指导作用；该基因的克隆对于揭示壳寡糖诱导植物抗性反应的分子信号通路很有价值，并在寡糖生物农药的应用方面具有重要的理论指导意义。

Description

烟草S期激酶蛋白1基因序列及其编码蛋白质序列和应用

技术领域

本发明涉及S期激酶相关蛋白1基因，具体地说是一种来源于抗病烟草品种枯斑三生烟(Nicotiana tabacum var.Samsun NN)的烟草S期激酶蛋白1基因序列及其编码蛋白质序列和应用。

背景技术

S期激酶相关蛋白1(S-PHASE KINASE-ASSOCIATED PROTEIN1，SKP1)是真核生物(烟草)中普遍存在的一类蛋白，是泛素连接酶3SCF复合体的核心亚单位。近几年来研究发现，SCF介导的泛素系统在茉莉酸信号途径和R-基因介导的抗性等生物反应过程中均有作用，但具体通路尚不太清楚，尤其是在壳寡糖的诱抗中的作用尚无报道。

发明内容

本发明目的在于提供一种烟草S期激酶蛋白1基因序列及其编码蛋白质序列和应用。

一种烟草S期激酶蛋白1基因序列，具有序列表中SEQ ID NO.1碱基序列。

所述的烟草S期激酶蛋白1cDNA基因序列的编码蛋白，具有序列表中SEQ ID NO.2编码的氨基酸序列。

应用基因序列的壳寡糖诱导植物抗性反应，从而可将所述基因序列用于制备生物农药。

本发明所具有的优点：

1.真核生物烟草中普遍存在的一类蛋白，是泛素连接酶3SCF复合体的核心亚单位，与烟草的抗病毒活性相关，分子量为17527.78Da，等电点4.57，定位于细胞质，其Skp1结构域位于4-105位氨基酸。

2.对生物农药的应用具有明显指导作用；该基因的克隆对于揭示壳寡糖诱导植物抗性反应的分子信号通路很有价值，并在寡糖生物农药的应用方面具有重要的理论指导意义。

附图说明

图1为本发明S期激酶相关蛋白1(SKP1)根据衍射数据得到三纬结构模型图。

具体实施方式

S期激酶相关蛋白1(S-PHASE KINASE-ASSOCIATED PROTEIN1，SKP1)是真核生物(烟草)中普遍存在的一类蛋白，是泛素连接酶3SCF复合体的核心亚单位。近几年来研究发现，SCF介导的泛素系统在茉莉酸信号途径和R-基因介导的抗性等生物反应过程中均有作用，功能上具有多样性，调节过程广泛；烟草SKP1是在壳寡糖处理条件下特异表达的，因此与壳寡糖诱导的植物抗性信号传导有着密切的关系。

实施例1

1.烟草(枯斑三生烟)的S期激酶相关蛋白1基因的cDNA的克隆及序列

1)50mg/L的壳寡糖喷施烟草叶片，喷水作对照，分别在8h和168h取样提取总RNA进行DDRT-PCR，将差异片段回收并亚克隆后，测序获得3′端序列，该片段与本塞姆氏烟草的SKP1(S-PHASEKINASE-ASSOCIATED PROTEIN1)基因同源性为82％。

2)利用CLONTECH公司的试剂盒获得枯斑三生烟草的SKP1基因的5′端及cDNA的全长，进而推导出氨基酸序列。

3)可被壳寡糖诱导的枯斑三生烟草SKP1具有以下cDNA碱基(参见序列表1)和蛋白质的氨基酸序列(参见序列表2)。

烟草S期激酶相关蛋白1基因(SKP1)的cDNA序列特征：基因组序列：653bp，核苷酸、线性双链，最初来源枯斑三生烟草(Nicotiana tabacumvar.samsun NN)；

烟草S期激酶相关蛋白1基因(SKP1)的氨基酸序列特征：线性、单链、155氨基酸。

4)根据枯斑三生烟SKP1基因的cDNA全长序列和pET-23b(+)的特点，设计SKP1基因原核表达的PCR引物序列，分别在引物skp1es和skp1ea的5′端引入了Nde I和Xhol I酶切位点(下划线部分)，另在下游引物的酶切位点后面去掉目的基因的终止密码子以产生融合有His标签的融合蛋白，引物序列入下：SKP1上游表达引物(skp1es)5′CGGCCCATATGTCCTCCTCAAAGATGATC 3′；SKP 1下游表达引物(skp1ea)5′GCCGCCTCGAGCTCAAATGCCCAAGCATT 3′，以枯斑三生烟草总RNA为模板扩增待表达的基因片段，克隆到表达载体pET-23b(+)上，转化表达菌株BL21(DE3)诱导表达，表达出与预期蛋白相符的目的蛋白，且该蛋白的大量表达可以抑制大肠杆菌的增殖，因此该蛋白具有一定的抑菌活性，可增强植物的抗病性。

5)根据枯斑三生烟SKP1基因的cDNA全长序列设计RNA干扰引物，扩增目的片段，克隆到干扰载体pHANNIBAL上构建干扰重组质粒pHANNIBAL-skp1a-skp1s，将其转化农杆菌LBA4404，然后侵染烟草获得转基因烟草，结果证明有干扰片段插入的烟草植株抗烟草花叶病毒的抗性减弱，因此SKP1基因的正常表达对烟草的抗病性起关键的作用。

6)根据枯斑三生烟SKP1基因的cDNA全长序列设计植物过表达扩增引物：SKP1上游表达引物(skp1SLs)-5′CGGCCAGATCTATGTCCTCCTCAAAGATG 3′和SKP1下游表达引物(skp1SLa)-5′GCCGCACTAGTCTCAAATGCCCAAGCATT 3′，分别在引物skp1SLs和skp1SLa的5′端引入了BgI II和Spe I酶切位点(下划线部分)，经过酶切和连接后构建出植物过表达重组质粒pCAMBIA1 1302-SKP1，转化农杆菌LBA4404然后侵染烟草，实验结果表明在SKP1过表达的情况下，植物体抗病性和抗逆性都由明显提高。

实施例2

1.mRNA差异显示及3′末端的克隆材料

感病烟草品种枯斑三生烟(Nicotiana tabacum var.sam sun NN)于温室中培养至幼苗为4-5片叶时，叶面喷施50mg/L壳寡糖，叶面喷施双蒸水作为对照，分别在8小时和168小时取材。

2.总RNA提取，定量与完整性检测

用双蒸水洗去叶表面尘土，在液氮中研磨，用TRIZOL(Gibco BRL)试剂提取RNA。(1)定量：测260、280nm处的吸光值，计算A₂₆₀/A₂₈₀的值以估计总RNA的纯度。通过A₂₆₀的值计算总RNA的量。(2)RNA完整性检测：在1％甲醛变性琼脂糖凝胶上分离总RNA，若有两条清晰的带，且大分子量(28SrRNA)的亮度近似为小分子量(18SrRNA)的亮度的2倍，则说明总RNA完整。

3.mRNA差异显示及差异片段的回收、载体连接

用RNAase free DNAase I去除总RNA中的DNA污染。第一条cDNA合成：在20μl反应体系中加入2.0μl浓度为0.1μg/μl的总RNA，2.0μl锚定引物AP(2μM)混匀，70℃温育5min立即置冰上冷却，加7.8μl灭菌的DEPC水，5×反转录缓冲液4.0μl，2.0μl的dNTP混合液(250μM每种)，2.0μl的DTT(100mM)，0.2μl SuperScript II RT enzyme(200U/μl)；反应程序为：42℃5分钟，50℃50分钟，70℃15分钟，hold at 4℃。DD-PCR：在10μl反应体系中加入1.95μl灭菌的DEPC水，10×PCR缓冲液1μl(无MgCl₂)，1.5μl MgCl₂(25mM)，2μldNTPmix(250μM每种)，1.75μl随机引物(2μM)，0.7lμ四甲基诺丹明标记的相应的锚定引物(TMR-AP，5μM)，1μl反转录产物，0.1μl 5Units/μl的AmpliTaq^R酶；反应程序为：95℃变性2分钟；92℃15秒，50℃30秒，72℃2分钟为一个反应循环，重复4次；92℃15秒，60℃30秒，72℃2分钟为一个反应循环，重复30次；72℃延伸7分钟；Hold at 4℃。将来自经壳寡糖诱导的8h和168h材料的同一对引物RT-PCR产物(4.0μlDD-PCR样品+1.5μl荧光差显示染料)并排在5.6％聚丙烯酰胺尿素胶上分离，55℃，3000V，100W 5小时，荧光检测，回收差异条带。经AP和ARP两端的T₇和M13通用引物对回收条带再扩增，扩增产物连接到PMD 18-T载体(大连宝生物工程有限公司)上。

4.阳性克隆片段的鉴定

将各连接产物转化大肠杆菌Novanblue，经蓝白斑筛选，分别挑取10个白斑液体扩大培养并提取质粒(王关林，方宏筠，2002)1％琼脂糖电泳检测后，选取迁移略慢的质粒经ECOR I和Hind III双酶切，1％琼脂糖凝胶电泳检测。

5.反向Northern点杂交分析

取插入片段一致且与PCR产物大小一致的的质粒2μl(0.5μg/μl)点到Hybond-N⁺尼龙膜上，80℃烘烤2小时固定，用DIG-dUTP标记探针，按照地高辛试剂盒操作说明进行杂交分析后由大连宝生物工程有限公司用FPrimer(M13-47)CGCCAGGGTTTTCCCAGTCACGAC在ABI PRISM^TM377×L DNASequencer上测序。

6.序列同源性比较

用核苷酸序列同源性比较软件(BLAST)在基因核苷酸数据库中进行同源性比较分析。结果获得诱导表达的SKP1基因的3′端序列：

CGACACCAGCATCCCCCTTCCTAATGTGACCAGCAAAATCTTGGCTAA

GGTTATCGAGTACTGCAAGCGCCATGTTGATGCTACCAAAACTGAGGA

TAAGGCTTCTGAGGATGAGCTTAAGGGCTTTGATTCTGATTTCGTTAA

AGTTGACCATGCCACCCTATTCGATCTCATCTTGGCTGCCAACTACTTG

AACATCAAGAGCCTGCTTGATCTCACATGTCAAACTGTGGCTGACATG

ATTAAAGGGAAGACACCAGAGGAGATCCGGAAGACCTTTAACATCAA

GAATGACTTCACTCCAGAGGAAGAAGAGGAGGTTAGGAGGGAGAAT

GCTTGGGCATTTGAGTGAACTTTAAATCTCATAATCTGGGGATAAATTT

GGAATATATAATCGTATGAACAATCTTTTGTGTTAGTAAATGTGTGAGT

ACGGTATTTGCTTTTGGACCCCTGACTTTGTTATTCGATGAAGTGGCTT

GGCCCTCCTTTTGCTGGTATGAAGTCTTGGTTTAATGTGGAAAAAAAA

AAA

7.cDNA的5′末端及全长的克隆

cDNA5′末端快速扩增按照Clontech公司的SMART RACE cDNA扩增试剂盒说明书进行。1μg喷施壳寡糖8h后的烟草总RNA用于cDNA的合成，2.5μL逆转录产物用通用引物混合物(Long：5′-CTAATACGACTCACTATAGGGCAAGCAGTGGTATCAACGCAGAGT-3′和Short：5′-CTAATACGACTCACTATAGGGC-3′)和根据3′端序列设计的5′RACE基因特异引物(5′-TGAGATCGAATAGGGTGGCATGGTC-3′)按照试剂盒说明书扩增目的基因。扩增产物经1％琼脂糖电泳检测并纯化后连接到PMD18-T载体上，转化大肠杆菌Novanblue，蓝白斑筛选及酶切鉴定后，由宝生物工程(大连)有限公司测序。获得5′端序列：

GATTTTAGCATCCATTAACTCTCTCTCTCTCTCTCTCTCTCTCTCTATCTC

AAAAAATCTCAATTCTAGGGTTAGGGTTACTACGATGTCCTCCTCAAAGA

TGATCGTATTGAAGAGCTCGGACGGCGAGACTTTCGAGGTGGAGGAAGCG

GTGGCTTTGGAATCTCAGACGATAAAGCATATGATTGAAGATGATTGCGC

CGACACCAGCATCCCCCTTCCTAATGTGACCAGCAAAATCTTGGCTAAGG

TTATCGAGTACTGCAAGCGCCATGTTGATGCTACCAAAACTGAGGATAAG

GCTTCTGAGGATGAGCTTAAGG

用Clone Manager软件分析并与3′序列拼接，根据拼接序列设计扩增全长的特异引物(5’-TAACAAAGTCAGGGGTCCAAAAGC-3’)与通用引物(Long：5′-CTAATACGACTCACTATAGGGCAAGCAGTGGTATCAACGCAGAGT-3′和Short：5′-CTAATACGACTCACTATAGGGC-3′)一起以5′-RACE-Ready cDNA为模板扩增差显片段的cDNA全长，连接到PMD18-T载体上转化大肠杆菌Novablue，蓝白斑筛选及酶切鉴定后，由宝生物工程(大连)有限公司测序，获得枯斑三生烟草的SKP1基因cDNA的全长参见序列表1，

GCATTCACTCTCTCT

CTCTCTCTCTCTCTCTCTATCTCAAAAAATCTCAATTCTAGGGTTAGGGTTACTACG

ATGTCCTCCTCAAAGATGATCGTATTGAAGAGCTCGGACGGCGAGACTTTCGAGGTG

GAGGAAGCGGTGGCTTTGGAATCTCAGACGATAAAGCATATGATTGAAGATGATTGC

GCCGACACCAGCATCCCCCTTCCTAATGTGACCAGCAAAATCTTGGCTAAGGTTATC

GAGTACTGCAAGCGCCATGTTGATGCTACCAAAACTGAGGATAAGGCTTCTGAGGAT

GAGCTTAAGGGCTTTGATTCTGATTTCGTTAAAGTTGACCAGGCCACCCTATTCGAT

CTCATCTTGGCTGCCAACTACTTGAACATCAAGAGCCTGCTTGATCTCACATGTCAA

ACTGTGGCTGACATGATTAAAGGGAAGACACCAGAGGAGATCCGGAAGACCTTTAAC

ATCAAGAATGACTTCACTCCAGAGGAAGAAGAGGAGGTTAGGAGGGAGAATGCTTGG

GCATTTGAGTGAACTTTAAATCTCATAATCTGGGGATAAATTTGGAATATATAATCG

TATGAACAATCTTTTGTGTTAGTAAATATGTGAGTACGGTATTTGCTTTTGGACCCC

TGACTTTGTTA

并推导出氨基酸序列参见序列表2：

M S S S K M I V L K S S D G E T F E V¹⁹

E E A V A L E S Q T I K H M I E D D C³⁸

A D T S I P L P N V T S K I L A K V I⁵⁷

E Y C K R H V D A T K T E D K A S E D⁷⁶

E L K G F D S D F V K V D Q A T L F D⁹⁵

L I L A A N Y L N I K S L L D L T C Q¹¹⁴

T V A D M I K G K T P E E I R K T F N¹³³

I K N D F T P E E E E E V R R E N A W¹⁵²

A F E¹⁵⁵

实施例3

1.SKP1蛋白的原核表达

(1)根据SKP1 cDNA序列设计并在TaKaRa公司合成了SKP1基因的表达蛋白的引物：

SKP1上游表达引物(skp1es)-5′

CGGCCCATATGTCCTCCTCAAAGATGATC 3′

SKP1下游表达引物(skp1ea)-5′

GCCGCCTCGAGCTCAAATGCCCAAGCATT 3′

参考pET-23b(+)的多克隆位点，分别在引物skp1es和skp1ea的5′端引入了Nde I和Xhol I酶切位点(下划线部分)。

(2)SKP1 cDNA的合成

以SKP1全长亚克隆质粒pMD18-SKP1质粒为模板扩增待表达的SKP1 cDNA序列，PCR扩增反应在25μl反应体系中进行：

PCR反应体系： [stock] 1×r×n(50μl) [final]

无菌双蒸水： 18.75μl

PCR缓冲液： 10× 2.5μl 1×

dNTP混合液(I∶1∶1∶1) 250μM 2.0μl 20μM

skp1es 10μM 0.5μl 0.2μM

skp1ea 10μM 0.5μl 0.2μM

LATag酶 5u/μl 0.25μl 0.05u/μl

Skp1全长质粒DNA 0.5μl

PCR扩增反应条件：

95℃， 2min

4个循环： 94℃ 15sec，52℃ 30sec，72℃ 2min；

30个循环：94℃ 15sec，68℃ 30sec，72℃ 2min；

72℃， 10min→ 4℃，hold

将PCR反应扩增的目的片段按照Agarose Gel DNA Purification KitVer.2.0的操作程序回收纯化，在50μl反应液体系中用Nde I和Xho I酶切回收的PCR产物和pET23b载体，

反应液体系A： 10×H缓冲液 5μl

SKP1扩增产物 40μl

Xho I(10U/μl) 1.5μl

Nde I(8U/μl) 2μl

无菌H₂O 1.5μl

反应液体系B： 10×H缓冲液 5μl

pET23b质粒 8μl

Xhol I(10U/μl) 1μl

Nde I(8U/μl) 2μl

无菌H₂O 34μl

37℃反应15h，1％琼脂糖凝胶电泳检测酶切结果。

其中，10X H缓冲液组分：500mM Tris-HCl(pH7.5)，100mMMgCl2，10mM Dithiothreitol，1000mM NaCl；

分别将双酶切后的skp1-e片段和pET-23b载体按照Agarose Gel DNAPurification Kit Ver.2.0的操作程序回收纯化，在25μl体系中用T4 DNA连接酶将skp1-e与pET23b片段连接。

反应液体系A： 10×H缓冲液 5μl

SKP1扩增产物 40μl

Xho I(10U/μl) 1.5μl

Nde I(8U/μl) 2μl

无菌H₂O 1.5μl

反应液体系B： 10×H缓冲液 5μl

pET23b质粒 8μl

Xhol I(10U/μl) 1μl

Nde I(8U/μl) 2μl

无菌H₂O 34μl

2.性质测定

(1)重组子的筛选鉴定

挑取LB/Amp平扳培养基上的单菌落接种于2ml含Amp的液体LB培养基中，37℃，150rpm摇培过夜，按照小量质粒DNA提取法提取质粒，1％琼脂糖凝胶(含0.5μg/ml溴化乙锭)电泳检测质粒质量。

用提取的质粒做模板，在25μl反应体系中PCR扩增反应筛选阳性克隆，

PCR反应体系： [stock] 1×r×n(50μl) [final]

无菌双蒸水： 18.75μl

PCR缓冲液： 10× 2.5μl 1×

dNTP混合液(1∶1∶1∶1) 250μM 2.0μl 20μM

skp1ps 10μM 0.5μl 0.2μM

skp1pa 10μM 0.5μl 0.2μM

LATag酶 5u/μl 0.25μl 0.05u/μl

Skp1全长质粒DNA 0.5μl

PCR反应条件：

95℃， 2min

4个循环： 94℃ 15sec，52℃ 30sec，72℃ 2min；

30个循环：94℃ 15sec，68℃ 30sec，72℃ 2min；

72℃， 10min→ 4℃，hold

1％琼脂糖凝胶(含0.5μg/ml溴化乙锭)电泳检测PCR反应结果，将扩增出目的产物质粒，用Nde I和Xhol I双酶切，反应体系如下，

反应液体系： 10×H缓冲液 3μl

pET23b-SKP1质粒 8μl

Xho I(10U/μl) 1μl

Nde I(8U/μl) 1.5μl

无菌H₂O 16.5μl

37℃反应15h，1％琼脂糖凝胶电泳检测酶切结果，将阳性克隆送宝生物工程(大连)有限公司测序。

(2)枯斑三生烟草SKP1蛋白的结构

初始结晶条件摸索采用Hampton Reasearch的Kit I和Kit II试剂盒，以及实验室自己配置的PEG 4000和PEG 8000Kit的稀疏矩阵采样法.经过对温度、溶液pH、蛋白质浓度、离子强度、添加剂和沉淀剂等条件的摸索，获得一种长柱状的晶体，可基本满足高分辨率的结构解析要求.晶体生长所用的蛋白质最好是当日制备的SKP1新鲜蛋白质。最终的结晶条件如下：50％聚乙二醇(PEG)1000，50mM磷酸钠，50mM柠檬酸钠pH 4.2.

数据在MAR345面探测器上收集，所用光源为RIGUKU的转靶阳极X射线发生器，电压和电流分别为48KV和98Ma，波长为0.15418nm。衍射数据用HKL软件包的DENZO和SCALEPACK程序处理，结果见下表

实施例4

(1)枯斑三生烟草SKP1在大肠杆菌中的诱导表达

将表达菌BL21(DE3)/pET23-skp1及相应的空载体菌接在LB液体培养基/Amp中，37℃培养过夜，次日取或化后的菌液按1％比例继代培养3h，OD值达到0.5-0.6时用终浓度为1mmol/L的IPTG诱导表达，持续振荡培养4h。将1.4ml培养液8000rpm离心10min，将上清转入另一EP管，200μl无菌双蒸水和50μl的5×SDS上样缓冲液吹打悬浮细菌，沸水浴10min，12000rpm离心1min，取15μl上清液进行SDS-PAGE凝胶电泳。结果扩增出预期的目的蛋白，并且该蛋白对大肠杆菌有较强的抑制作用。

(2)该蛋白对大肠杆菌有较强的抑制作用转基因苗的鉴定

①RNAi载体的构建

根据枯斑三生烟SKP1基因的cDNA全长序列设计RNA干扰引物，经SES-WIN软件分析SKP1基因cDNA序列中无Xho I、Kpn I、Cla I和BamH I限制性酶切位点，因此在引物中直接引入这些酶切位点，引物序列如下：

小写为引入酶切位点(Xho I、Kpn I)，导致正向插入：

primer1：SKP1正义引物-5’ctcgag CTACGATGTCCTCCTCAA 3’

primer2：SKP1反义引物-5’ggtacc TCACTCAAATGCCCAAGC 3’

小写为引入酶切位点(BamH I和Cla I)，导致反向插入：

primer1：SKP1正义引物-5’ggatcc CTACGATGTCCTCCTCAA 3’

primer2：SKP1反义引物-5’atcgat TCACTCAAATGCCCAAGC 3’

2004.10.8

正向插入片段的PCR(以sf-8为模板)

PCR反应体系： [stock] 1×r×n(25μl) [final]

无菌双蒸水： 18.75μl

PCR缓冲液： 10× 2.5μl 1×

dNTP混合液(1∶1∶1∶1) 250μM 2.0μl 20μM

sri-ss/as 10μM 0.5μl 0.2μM

sri-sa/aa 10μM 0.5μl 0.2μM

LATag酶 5u/μl 0.25μl 0.05u/μl

Skp1全长质粒DNA 0.5μl

反应程序：

95℃， 2min

4个循环： 94℃ 15sec，50℃ 30sec，72℃ 2min；

30个循环：94℃ 15sec，68℃ 30sec，72℃ 2min；

72℃， 10min→ 4℃，hold

将PCR产物克隆到PMD18-T载体上形成PSK1(正向片段)和PSK2(含反向片段)质粒转化大肠杆菌NovaBlue菌株(美国Novagen公司)并提质粒，PCR检测重组质粒，然后用与RNAi载体相匹配的限制性酶(Xho I和Kpn I，位于启动子下游和基因内区上游，正义方向)酶切PSK1质粒上克隆的靶基因序列，将酶切后的靶序列以正义方向克隆到RNAi载体pHANNIBAL(5824bp)上形成PHSK1；用与RNAi载体相匹配的限制性内切酶(BamH I和Cla I，位于基因内区下游与OSC3′上游之间，反义方向)分别酶切PSK2上克隆的靶基因序列和PHSK1质粒，将酶切下来的靶基因序列以反以方向克隆到带有靶基因正义片段的RNAi载体PHSK1上形成PHSK2。用Not I酶切PHSK2和二元载体PART27，然后连接二者形成PART27-SKP1。

②农杆菌的转化及烟草叶片外植体的遗传转化

将PART27-SKP1经冻融法(电激法获三亲融合法)导入根癌农杆菌LBA4404(Agrobacterium tumefaciens LBA4404)，经质粒提取酶切鉴定后，将转化的土壤农杆菌接种到含壮观霉素(Spec Resistance)的液体YEB培养基中28℃摇床培养17-20h。然后用此培养物按叶盘法转化烟草：取上述土壤农杆菌培养物稀释到液体MS培养基中，取烟草无菌苗的幼嫩叶片剪成小块在该稀释液中浸5min，吸去多余菌液后，放至含有2.0mg/L6苄基腺嘌呤、200-500mg/L羧苄青霉素、100mg/L卡那霉素和0.5mg/LIAA的固体MS培养基上，在14h白天、14h黑夜的光周期和25℃条件下培养.约3周后，将生长至长1cm以上的小苗转移到含300mg/L羧苄青霉素、100mg/L卡那霉素和5mg/L IAA的固体MS培养基上诱导生根.约2～3周后可见根的形成，从而得到再生完整植株.待这些完整植株生长到大约5cm时，移栽到花盆中，使之在温室中继续生长

③转基因植株的PCR分析

用CTAB法从烟草叶片中分离植物总DNA.取0.5g材料于液氮中研成粉末，移至预热的500μL 2×CTAB缓冲液中(2％CTAB，100mmol/LTrisCl，20mmol/LEDTA，1.4mmol/LNaCl，pH＝8.0)加等体积氯仿∶异戊醇抽提，2/3体积异丙醇沉淀，70％乙醇清洗.用转化植株的总DNA为模板，未转化植株作负对照，进行PCR扩增反应，反应条件为：94℃预变性10min后，94℃变性1min，56℃退火1min，72℃延伸2min，进行30个循环，最后72℃延伸10min.检测结果为阳性的植株。

实施例5

(1)SKP1烟草过表达植株的建立

根据SKP1基因的序列，并参考pCAMBIA1302T-DNA fragment的多克隆位点，设计SKP1基因在植物中过表达的引物skp1SLs和skp1SLa，分别在引物skp1SLs和skp1SLa的5′端引入了BgI II和Spe I酶切位点(下划线部分)：

SKP1上游表达引物(skp1SLs)-5′

CGGCCAGATCTATGTCCTCCTCAAAGATG 3′

SKP1下游表达引物(skp1SLa)-5′

GCCGCACTAGTCTCAAATGCCCAAGCATT 3′

以pMD18-SKP1质粒为模板，用引物skp1SLs和skp1SLa扩增待表达的SKP1基因编码区(去掉终止密码子)片段，PCR扩增反应条件为95℃，2min；94℃，15sec，50℃，30sec，72℃，2min，4个循环；94℃，15sec，68℃，30sec，72℃，2min，30个循环；72℃延伸10min。将PCR反应的产物在1％琼脂糖凝胶(含0.5μg/ml溴化乙锭)中电泳，以DNAMarkIII做为分子量标准，电泳结束后在302nm波长的紫外灯下观察结果拍照并回从胶中收目的片段。分别用BgI II和Spe I酶双酶切回收纯化的SKP1基因目的片段和载体pCAMBIA1302，经1％琼脂糖凝胶电泳分离后，回收纯化目的片段，用T4DNA连接酶将SKP1连接到双元载体pCAMBIA1302的花椰菜花叶病毒35S强启动子下游和GFP完全编码区的上游，连接产物转化大肠杆菌TOP10并用菌落PCR初步筛选阳性重组质粒，将PCR鉴定为阳性的克隆提取质粒并送宝生物工程(大连)有限公司进行测序。

将pCAMBIA-SKP1经冻融法导入根癌农杆菌LBA4404(Agrobacteriumtumefaciens LBA4404)，经质粒提取酶切鉴定后，将转化的土壤农杆菌接种到含卡那霉素的液体YEB培养基中28℃摇床培养17-20h。然后用此培养物按叶盘法转化烟草：取上述土壤农杆菌培养物稀释到液体MS培养基中，取烟草无菌苗的幼嫩叶片剪成小块在该稀释液中浸5min，吸去多余菌液后，放至含有2.0mg/L6苄基腺嘌呤、200-500mg/L羧苄青霉素、100mg/L潮霉素和0.5mg/L IAA的固体MS培养基上，在14h白天、14h黑夜的光周期和25℃条件下培养.约3周后，将生长至长1cm以上的小苗转移到含300mg/L羧苄青霉素、100mg/L卡那霉素和5mg/L IAA的固体MS培养基上诱导生根.约2～3周后可见根的形成，从而得到再生完整植株.待这些完整植株生长到大约5cm时，移栽到花盆中，使之在温室中继续生长。转基因苗的鉴定同实施例4的转基因植株的PCR分析。

实施例6

SKP1在植物抗性中的作用检测

将SKP1干扰的烟草苗、SKP1过表达的烟草苗和正常的苗一起种植在温室内，在烟苗长到5-6叶时，摩擦接种烟草花叶病毒。TMV由本研究组在普通烟(Nicotiana.Tabacum.L)上活体继代保存。取TMV繁殖寄主上较嫩的病叶，以5倍体积0.05mol/L pH5.5磷酸缓冲液(含0.05mol/L KH2PO4和0.05mol/L Na2HPO4)在研钵中研碎，用4层纱布过滤挤出汁液。加入少量细石英砂，用毛笔蘸取汁液摩擦接种，尽量做到用力一致均匀。接毒后每天观察，记录第一批病斑出现的时间和数目。结果为病斑全部产生后的统计数。采用t检验法进行数据显著性分析。

SKP1基因干扰的烟草植株在接毒84h后开始出现病斑，而野生型烟草在接毒120h后开始出现病斑，SKP1基因过表达的烟草植株在接毒200小时后才出现病斑。说明SKP1的沉默使得植株降低了抵抗病毒增殖和(或)其在细胞间移动的能力，提早出现了过敏反应(坏死斑)，而SKP1的过表达使得植株增强了抵抗病毒增殖和(或)其在细胞间移动的能力，使得过敏反应(坏死斑)推迟出现。

分别取8-10叶期的转基因和野生型烟草14棵，半叶法接种TMV，观察病斑发展情况，测量病斑直径，计算平均值。结果野生型中枯斑平均直径为5.9375mm，枯斑总面积占叶片总面积29.375％；SKP1干扰的转基因苗中枯斑平均直径为7.1875mm，枯斑总面积占叶片总面积33.9375％。(P＜0.05t检验后差异显著)，SKP1干扰的转基因苗中枯斑平均直径为3.335mm，枯斑总面积占叶片总面积24.885％。此结果说明，有SKP1蛋白表达的野生型烟草及SKP1蛋白过表达的烟草比不含此基因表达产物的SKP1干扰烟草对TMV的复制有更强的抗性作用。因此，SKP1的正常表达，对于维持植株的抗病性很重要。

序列表

SEQUENCE LISTING

<110>中国科学院大连化学物理研究所

<120>烟草S期激酶蛋白1基因序列及其编码蛋白质序列和应用

<130>

<160>2

<170>Patent In version 3.1

<210>1

<211>653

<212>DNA

<213>枯斑三生烟草(Nicotiana tabacum var.samsun NN)

<220>

<221>CDS

<222>(73)..(537)

<223>

<400>1

gcattcactc tctctctctc tctctctctc tctatctcaa aaaatctcaa ttctagggtt 60

agggttacta cg atg tcc tcc tca aag atg atc gta ttg aag agc tcg gac 111

Met Ser Ser Ser Lys Met Ile Val Leu Lys Ser Ser Asp

1 5 10

ggc gag act ttc gag gtg gag gaa gcg gtg gct ttg gaa tct cag acg 159

Gly Glu Thr Phe Glu Val Glu Glu Ala Val Ala Leu Glu Ser Gln Thr

15 20 25

ata aag cat atg att gaa gat gat tgc gcc gac acc agc atc ccc ctt 207

Ile Lys His Met Ile Glu Asp Asp Cys Ala Asp Thr Ser Ile Pro Leu

30 35 40 45

cct aat gtg acc agc aaa atc ttg gct aag gtt atc gag tac tgc aag 255

Pro Asn Val Thr Ser Lys Ile Leu Ala Lys Val Ile Glu Tyr Cys Lys

50 55 60

cgc cat gtt gat gct acc aaa act gag gat aag gct tct gag gat gag 303

Arg His Val Asp Ala Thr Lys Thr Glu Asp Lys Ala Ser Glu Asp Glu

65 70 75

ctt aag ggc ttt gat tct gat ttc gtt aaa gtt gac cag gcc acc cta 351

Leu Lys Gly Phe Asp Ser Asp Phe Val Lys Val Asp Gln Ala Thr Leu

80 85 90

ttc gat ctc atc ttg gct gcc aac tac ttg aac atc aag agc ctg ctt 399

Phe Asp Leu Ile Leu Ala Ala Asn Tyr Leu Asn Ile Lys Ser Leu Leu

序列表

gat ctc aca tgt caa act gtg gct gac atg att aaa ggg aag aca cca 447

Asp Leu Thr Cys Gln Thr Val Ala Asp Met Ile Lys Gly Lys Thr Pro

110 115 120 125

gag gag atc cgg aag acc ttt aac atc aag aat gac ttc act cca gag 495

Glu Glu Ile Arg Lys Thr Phe Asn Ile Lys Asn Asp Phe Thr Pro Glu

130 135 140

gaa gaa gag gag gtt agg agg gag aat gct tgg gca ttt gag 537

Glu Glu Glu Glu Val Arg Arg Glu Asn Ala Trp Ala Phe Glu

145 150 155

tgaactttaa atctcataat ctggggataa atttggaata tataatcgta tgaacaatct 597

tttgtgttag taaatatgtg agtacggtat ttgcttttgg acccctgact ttgtta 653

<210>2

<211>155

<212>PRT

<213>枯斑三生烟草(Nicotiana tabacum var.samsun NN)

<400>2

Met Ser Ser Ser Lys Met Ile Val Leu Lys Ser Ser Asp Gly Glu Thr

1 5 10 15

Phe Glu Val Glu Glu Ala Val Ala Leu Glu Ser Gln Thr Ile Lys His

20 25 30

Met Ile Glu Asp Asp Cys Ala Asp Thr Ser Ile Pro Leu Pro Asn Val

35 40 45

Thr Ser Lys Ile Leu Ala Lys Val Ile Glu Tyr Cys Lys Arg His Val

50 55 60

Asp Ala Thr Lys Thr Glu Asp Lys Ala Ser Glu Asp Glu Leu Lys Gly

65 70 75 80

Phe Asp Ser Asp Phe Val Lys Val Asp Gln Ala Thr Leu Phe Asp Leu

85 90 95

Ile Leu Ala Ala Asn Tyr Leu Asn Ile Lys Ser Leu Leu Asp Leu Thr

100 105 110

Cys Gln Thr Val Ala Asp Met Ile Lys Gly Lys Thr Pro Glu Glu Ile

115 120 125

Arg Lys Thr Phe Asn Ile Lys Asn Asp Phe Thr Pro Glu Glu Glu Glu

130 135 140

Glu Val Arg Arg Glu Asn Ala Trp Ala Phe Glu

145 150 155

Claims

1.一种烟草S期激酶蛋白1基因序列，其特征在于：具有序列表中SEQID NO.1碱基序列。

2.一种权利要求1所述的烟草S期激酶蛋白1cDNA基因序列的编码蛋白，其特征在于：具有序列表中SEQ ID NO.2编码的氨基酸序列。

3.一种权利要求1所述的烟草S期激酶蛋白1的应用，其特征在于：应用基因序列的壳寡糖诱导植物抗性反应，从而可将所述基因序列用于制备生物农药。