CN105886528A - 一种用乳管特异性启动子获得橡胶树转基因植株的方法 - Google Patents

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Abstract

本发明公开了一种克隆橡胶树乳管特异性强启动子PHEV2.1，与天然橡胶生物合成途径的关键限速酶HbHMGR1基因连接构建植物表达载体，转化橡胶树易碎胚性愈伤组织，获得转基因植株的方法。本发明从橡胶树优良品种材料中克隆PHEV2.1和HbHMGR1基因，构建乳管特异性植物表达载体pCAMBIA2301‑PHEV2.1‑HbHMGR1，转化橡胶树易碎胚性愈伤组织，得到了橡胶树转基因胚状体和转基因植株，用GUS染色、PCR和反向PCR证明得到了转基因植株，用荧光定量PCR技术检测证明HbHMGR1基因在橡胶树转基因胚状体和转基因植株中表达量显著提高，为用基因工程方法提高橡胶产量奠定了基础。

Description

一种用乳管特异性启动子获得橡胶树转基因植株的方法
技术领域
本发明属于植物基因工程技术领域，具体地说，涉及一种用乳管特异性启动子获得橡胶树转基因植株的方法。
背景技术
橡胶树是重要的热带经济作物，其产生的天然橡胶是重要的战略物资。近年来，随着国民经济和国防事业的快速发展，我国天然橡胶的自给率逐年下降，进口依赖度不断攀升(王少明等，2011)。然而橡胶树适种区域有限，扩大种植面积增加橡胶产量的潜力极小，所以开展橡胶树品种改良、提高橡胶单产的研究更为迫切。天然橡胶生物合成是影响橡胶树胶乳产量的重要因素(吴春太等，2009)，改进其调控机理有可能对提高橡胶树胶乳产量产生积极作用。
橡胶蛋白(hevein)是胶乳的主要成分，它在乳管中高表达，占可溶性蛋白质的50％～70％(Parijs等，1991；Montoro等，2008)。橡胶蛋白早在上世纪60年代便已被认识(Acher等，1960)，然而在随后的40年间，除Broekaert等(1990)克隆过一个编码橡胶蛋白的cDNA序列(GenBank M36986)外，有关编码橡胶蛋白的基因及启动子的研究鲜有报道。2005年，Pujade-Renaud等利用文库筛选法，从橡胶树基因组DNA中分离得到5个编码橡胶蛋白(hevein)的基因，首次证明橡胶蛋白是由一个小基因家族编码的。Pujade-Renaud等还克隆了HEV1.1启动子(PHev1.1)和HEV2.1启动子(PHEV2.1)，并融合报告基因uidA转化水稻，结果发现，两个启动子在转基因水稻中均能驱动uidA基因的表达，而序列最长的PHEV2.1功能最强，它驱动uidA基因在转基因水稻的许多组织中高水平地表达，并且机械损伤和真菌感染能诱导其驱动uidA基因的上调表达。2008年，Motoro等利用PHEV2.1融合报告基因uidA，转化橡胶树并分析其表达特性，结果表明，PHEV2.1驱动uidA基因在根、茎、叶的乳管中特异性强表达，印证了Archer等(1969)关于橡胶蛋白在乳管细胞中是特异性表达的报道；他们还发现，PHEV2.1可以受光诱导，驱动uidA在叶片所有细胞类型中表达。
天然橡胶生物合成是一种典型的类异戊二烯途径的次生代谢(段翠芳等，2004)。HbHMGR1是橡胶树特有的，在非产胶植物中没有相应基因成员，它在乳管中特异性表达，它的酶是类异戊二烯生物合成的关键酶(Chye等，1992；Venkatachalam等，2009)。橡胶树3-羟基-3-甲基戊二酸单酰辅酶A还原酶(HbHMGR)是橡胶生物合成途径的关键限速酶，其活性远远低于其它参与该途径的酶，约为其它酶活性的1/1000(Lynen，1969)。Chye等(1991,1992)发现在橡胶中，存在HMGR的小的基因家族，它包含3个基因hmg1、hmg2和hmg3。hmg1(即HbHMGR1)是橡胶树特有的，在非产胶植物中没有相应基因成员，它主要在乳管中特异性表达，并由乙烯诱导，其编码的酶被认为参与橡胶生物合成。hmg3的表达不受乙烯影响，它作为“看家基因”在组织中呈组成型表达，无细胞类型特异性。hmg2和hmg3不参与橡胶生物合成，它们编码的酶参与看家性质的类异戊二烯的生物合成(如激素、光合色素、线粒体电子传递链组分、多萜醇等)。Schaller等(1995)发现，转橡胶树HbHMGR1基因烟草的甾醇含量比对照提高了6倍。Dong等(2013)也发现，转构巢曲霉HMGR的部分银胶菊表现出胶乳产量的增加，有力地证明了HMGR是类异戊二烯合成途径的关键限速酶。
尽管有关启动子PHEV2.1和HbHMGR1基因的研究分别已有报道，但尚未见到有利用PHEV2.1构建HbHMGR1的乳管特异性表达载体转化橡胶树的研究。本发明方法利用PHEV2.1构建HbHMGR1的乳管特异性表达载体，并转化橡胶树，得到转基因植株，用荧光定量PCR技术检测验证HbHMGR1基因在转基因胚状体和转基因植株中的表达，这对于用基因工程方法进行橡胶树遗传改良、提高橡胶产量有重要意义。
发明内容
本发明的目的是提供一种用乳管特异性启动子获得橡胶树转基因植株的方法，为用基因工程方法进行橡胶树遗传改良、提高橡胶产量提供了新的途径。
为了实现本发明的目的，本发明一种用乳管特异性启动子获得橡胶树转基因植株的方法包括如下八个步骤：
步骤1.天然橡胶生物合成关键限速酶基因HbHMGR1克隆
1.1橡胶树总RNA提取和cDNA第一条链合成
橡胶树胶乳总RNA提取用Trizol法，按照Revert Aid TM cDNA第一链合成试剂盒说明书合成cDNA第一条链，-20℃保存待用。
1.2HbHMGR1基因cDNA链合成
依据NCBI登录号X54659.1的HbHMGR1基因，利用Primer 5.0设计1对特异引物用以扩增HbHMGR1基因cNDA全长(1728bp)：
上游引物H1F：5'-GCTCTAGAATGGACACCACCGGCC-3；
下游引物H1R：5'-CCCCCCGGGCTAAGATGCAGCTTTAGAC-3
其中，在上游引物5’端加上XbaI酶切位点(TCTAGA)，下游引物5’端加上XmaI酶切位点(CCCGGG)。以橡胶树胶乳cDNA为模板，进行PCR扩增，产物经过电泳、胶回收、纯化之后利用TA克隆连接到pMD 19-T载体上，转化大肠杆菌，经过菌落PCR检测后，挑选阳性克隆的菌落进行基因测序。
1.3HbHMGR1基因点突变
根据HbHMGR1基因序列(NCBI登录号X54659.1)设计特异引物，用橡胶树胶乳作材料，通过反转录PCR克隆HbHMGR1基因，目的片段长1728bp，把X54659.1的1031位碱基由G点突变为A，使得该Pst Ⅰ酶切位点消失。
步骤2.橡胶树乳管特异性启动子PHEV2.1克隆
2.1橡胶树叶片基因组DNA的提取
用改良的CTAB法从橡胶树叶片小量提取基因组DNA，具体步骤如下：
⑴称取0.2g橡胶树的新鲜叶片于液氮预冷的研钵中，迅速将其研磨成粉末，转入2ml冰上预冷的离心管中。
⑵在盛有样品的离心管中加入1ml的65℃预热的2×CTAB裂解液(裂解液用前加入3％的β-巯基乙醇)，涡旋混匀。
⑶转移离心管至65℃水浴锅中恒温水浴30min，期间每隔5～6min轻轻颠倒混匀10次，使CTAB充分裂解细胞。
⑷取出离心管，于高速离心机中25℃、12000rpm、离心5min。
⑸轻轻取出离心管，小心转移上清液至新的2ml离心管。加入等体积的氯仿：异戊醇(24:1)，轻轻颠倒混匀数次，4℃、12000rpm离心5min。
⑹轻轻取出离心管，转移上清液至新的2ml离心管，加入等体积的酚：氯仿：异戊醇(25:24:1)，轻轻颠倒混匀数次，4℃、12000rpm离心5min。
⑺取上清液，再加入等体积的氯仿：异戊醇(24:1)抽提一次，条件同(5)。
⑻取上清液至新的2ml离心管，加入1/10体积3M预冷的NaAc，轻轻混匀，然后加入等体积预冷的异丙醇，轻轻摇匀，置于-20℃冰箱中充分沉淀30min。
⑼取出离心管，4℃、12000rpm离心10min，弃上清液，用70％的乙醇洗涤沉淀物两次并转入1.5ml小管，尽可能地吸干管里的酒精。
⑽将沉淀物置于超净工作台上静置10min，然后用100μl的无菌双蒸水溶解沉淀物。
⑾于上面提取的DNA中加入2.5μl(10mg/ml)的RNaseA，在37℃水浴锅中水浴酶解1～2h。
⑿酶解期间，每30min取5μl进行琼脂糖凝胶电泳，检测RNA是否彻底消化。
⒀加入等体积的氯仿：异戊醇(24:1)，轻轻颠倒翻转50次后，在4℃、12000rpm离心10min。
⒁取上清液，加入1/10体积的3M NaAc(pH5.2)，混匀，加入2倍体积的无水乙醇，上下翻转混匀5min后，在-20℃沉淀1h。
⒂在4℃、12000rpm离心10min。
⒃用70％的酒精洗涤沉淀物2次。
⒄将沉淀物置于超净工作台上静置10min，用50μl的无菌双蒸水溶解沉淀物。
⒅取2μl的DNA溶液进行琼脂糖凝胶电泳和紫外分光光度计检测浓度。
2.2橡胶树乳管特异性启动子PHEV2.1克隆
根据HEV2.1序列(NCBI登录号：AY247789.1)，截取起始密码子前的1830bp碱基序列，用Primer5.0设计一对特异性引物PHF1和PHR1，上游引物为PHF1：5’-CCCAAGCTTCTTGTTTGCACATGATGCGTTCAGGTGACC-3’，下游引物为PHR1：5’-TTCCAATGCATTGGCTGCAGAACTCTTCCCATTTCTTCCC-3’，下划线部分为在引物两端引入的酶切位点HindIII和PstI酶切位点。以2.1中提取的基因组DNA为模板，以PHF1和PHR1为引物进行PCR扩增，扩增产物经琼脂糖凝胶电泳、回收、加尾“A”后，克隆到pMD19-T vecor上，转化大肠杆菌Trans5α，经12～16h的培养后，挑取单菌落进行菌液PCR，选取PCR检测为阳性的菌落送往测序公司进行测序。测序结果用NCBI网上的BLASTN工具进行序列同源性分析。
步骤3.构建HbHMGR1基因的乳管特异性植物表达载体pCAMBIA2301-PHEV2.1-HbHMGR1
先利用XbaI和Xma Ⅰ分别对pCAMBIA3301和pCAMBIA2301-HbHMGR1进行双酶切，酶切产物经1.0％的琼脂糖凝胶电泳后，分别切胶回收pCAMBIA3301的大片段和pCAMBIA2301-HbHMGR1的小片段(HbHMGR1基因)，将两片段用T4 DNA连接酶连接，转化大肠杆菌Trans5α，过夜培养后挑取单菌落进行菌落PCR检测，提取阳性重组质粒pCAMBIA3301-HbHMGR1；再用HindIII和PstI分别对pCAMBIA3301-HbHMGR1和pMD19-T-PHEV2.1进行双酶切，电泳结束后，分别对pCAMBIA3301-HbHMGR1的大片段和pMD19-T-PHEV2.1的小片段(PHEV2.1)进行切胶回收，回收产物用T4 DNA连接酶连接过夜，转化大肠杆菌，过夜培养后挑取单菌落进行菌液PCR，提取阳性重组质粒，并用HindⅢ、Pst Ⅰ和Xma Ⅰ对其进行酶切鉴定，确认得到的阳性重组质粒为pCAMBIA3301-PHEV2.1-HbHMGR1；最后用HindⅢ和Xma Ⅰ将PHEV2.1-HbHMGR1重组片段从pCAMBIA3301-PHEV2.1-HbHMGR1上切下，将其连接到pCAMBIA2301-MCS的HindⅢ和Xma Ⅰ间，得到植物表达载体pCAMBIA2301-PHEV2.1-HbHMGR1，转化大肠杆菌，挑取单菌落进行菌落PCR，提取阳性重组质粒，用HindⅢ和Xma Ⅰ进行酶切鉴定，确认HbHMGR1乳管特异性植物表达载体构建成功。
步骤4.橡胶树易碎胚性愈伤组织的培养
取橡胶树单核靠边期花蕾，先用流水冲洗后，在超净台上再用75％乙醇表面消毒1min，再以0.1％(w/v)HgCl2溶液浸泡消毒10min，最后用无菌水冲洗3次，每次3min。剥出花蕾中的花药，接种到花药胚性愈伤组织诱导培养基(M1)[改良的MS培养基并添加2.0mg/L2,4-D、1.0mg/L NAA、1.0mg/L KT、0.1g/L肌醇、70g/L蔗糖、5％(v/v)CW、2.0g/L植物凝胶(phytagel,Sigma)]，培养50d，诱导出初生愈伤组织后，再将生长状态良好的初生愈伤组织转入到新鲜的M1上继代培养，每10天继代一次。生长良好的花药初生愈伤组织经多次选择继代，直至诱导出颜色鲜黄、结构疏松、颗粒状的易碎胚性愈伤组织。以这些易碎胚性愈伤组织为转化受体材料。易碎胚性愈伤组织置于高钙离子浓度(11.0mmol/L)的继代培养基中继代培养，每隔20d继代1次，经过5次以上的继代后，筛选出适合长期继代培养的易碎胚性愈伤组织。橡胶树胚性愈伤组织培养使用的培养基及成分见表1。
步骤5.橡胶树继代易碎胚性愈伤组织遗传转化
根据β-葡糖醛酸酶(β-glucuronidase,GUS)基因(uidA)瞬时表达率的多少和细胞存活率的高低，结合影响根癌农杆菌遗传转化的相关因素，相关因素包括预培养时间、菌液浓度、乙酰丁香酮AS浓度、侵染时间、共培养时间和共培养温度，设计实验，确定橡胶树连续继代易碎胚性愈伤组织遗传转化的优化条件；
以橡胶树易碎胚性愈伤组织在含有Kan浓度梯度的继代增殖培养基中的生长速率为指标，测定易碎胚性愈伤组织对卡那霉素(Kan)敏感浓度为75～100mg/L，用于抗性愈伤组织的筛选。
5.1根癌农杆菌EHA105感受态细胞的制备方法
(1)从-80℃冰箱中取1管保存的EHA105菌种于冰上溶解。
(2)用接种环蘸取一点菌液，然后于含有75mg/L利福平和75mg/L链霉素的LB固体培养基上划平板，培养36～48h。
(3)挑取一个单菌落，接种于2ml LB液体培养基(含有75mg/L利福平和75mg/L链霉素)，28℃、200rpm培养16～24h。
(4)将(3)中的2ml培养物转接到100ml LB液体培养基中，28℃、200rpm培养至菌液浓度为OD600约为0.5左右。
(5)将培养物分装到两个50ml的离心管中，置于冰上冰浴30min，4℃、5000rpm离心10min。
(6)弃上清液，收集菌体，用10ml预冷的0.15mol/L NaCl悬浮，4℃、5000rpm离心5min，收集菌体。
(7)再悬浮菌体于10ml预冷的20mmol/L CaCl2溶液中，再次同上离心并收集菌体。
(8)用1ml预冷的含有10％甘油的20mmol/L CaCl2溶液悬浮菌体，然后按照50μl/管分装，液氮速冻后置于-80℃超低温冰箱中备用。
5.2植物表达载体pCAMBIA2301-PHEV2.1-HbHMGR1转化农杆菌
根癌农杆菌EHA105的转化方法采用冻融法。取1管农杆菌EHA105感受态细胞置于冰上溶解，在菌液中加入0.5μg重组质粒pCAMBIA2301-PHEV2.1-HbHMGR1，轻轻震荡混匀，冰浴30min；液氮中速冻1min，再于37℃温育5min；取出样品，迅速置于冰上冷却5min；加入1ml无抗生素的LB液体培养基，于摇床中28℃温和振荡(100rpm)培养4h；5000rpm离心5min，收集菌体，悬浮于300μl LB液体培养基中；将转化细胞在含有50mg/L利福平(Rif)、50mg/L链霉素(Str)和50mg/L卡那霉素(Kan)的LB固体培养基上涂平板，28℃培养2～3d；菌落长出后，用特异引物PHF1和H1R对单菌落进行菌落PCR扩增，选取PCR检测为阳性的菌株制备工程菌，以作后续侵染。
5.3花药易碎胚性愈伤组织的转化及GUS组织化学染色
易碎胚性愈伤组织的转化，对愈伤组织进行侵染、共培养、抑菌和筛选。将筛选得到的抗性愈伤组织进行GUS组织化学染色，选取GUS染色阳性的抗性愈伤组织继续继代培养增殖，形成愈伤组织系，以便用于后续的分子检测和体细胞胚发生。
步骤6.获得胚状体和再生植株
共培养结束后，将橡胶树易碎胚性愈伤组织转入抑菌培养基中进行抑菌处理，18天后，转移到卡那霉素为75～100mg/L的筛选培养基中，经过4个月的筛选，长出鲜黄色的抗性愈伤组织，把经过GUS染色为阳性的愈伤组织增殖1～2个月后诱导胚状体和植株再生，获得抗性易碎胚性愈伤组织系，从抗性愈伤组织诱导出胚状体和转化植株。
橡胶树组织培养和遗传转化中使用的培养基及成分见表1。
表1：橡胶树组织培养和遗传转化中使用的培养基及成分
橡胶树愈伤组织培养培养基为经改良的MS培养基(改良成份为MgSO4·7H2O500mg/L，KH2PO4 400mg/L，CaCl2 250mg/L，MnSO4·H2O 35mg/L，CuSO4·5H2O 0.2mg/L)，再添加不同的其他培养基成分，pH值为5.8，在0.2MPa压力、121℃条件下高温高压灭菌20min。易碎胚性愈伤组织继代增殖培养、胚状体诱导均采用暗培养，植株再生在光照条件下进行，培养温度均为25～27℃。
步骤7.组织化学检测和分子检测
取橡胶树抗性转化胚状体、抗性转化植株叶片进行GUS染色，结果呈蓝色阳性。取抗性转化材料和对照材料一起进行分子检测，包括(PCR和反向PCR)，证明得到了转基因植株。
7.1抗性愈伤组织的PCR检测
以非转化愈伤组织(对照)和筛选6个月以上的抗性愈伤组织为材料，分别提取基因组DNA；根据T-DNA上的uidA、NPTII和PHEV2.1-HbHMGR1的序列，用Primer5.0分别设计一对特异引物，引物分别命为：
UF:5’-GCGAAGTCTTTATACCGAAAGGTTG-3’,
UR：5’-ACGATGCCATGTTCATCTGCCCAG-3’；
NPT-F:5’-TCAGAAGAACTCGTCAAGAAG-3’,
NPT-R:5’-ATGGGGATTGAACAAGATGGAT-3’；
PHHF:5’-CTTGTTTGCACATGATGCGTTCAGGTGACC-3’；
PHHR：5’-TCCCCCCGGGCTAAGATGCAGCTTTAGAC-3’，
三对引物扩增的PCR产物长度分别为829bp、797bp、3592bp。
7.2反向PCR扩增抗性愈伤组织外源基因插入位点的左旁侧序列
根据植物表达载体的T-DNA序列，在T-DNA内部的EcoR Ⅰ至左边界(TL)的序列上设计一对反向引物：
Eco-F:5’-CTGCTCTAGCCAATACGCAAACC-3’，
和TL-R:5’-GTGAGTAGTTCCCAGATAAGGGAAT-3’；
将抗性愈伤组织的基因组DNA经过一系列的酶切、纯化和T4DNA连接酶环化后，以环化产物为模板，以Eco-F和TL-R为引物进行反向扩增，每个系做3个重复；扩增产物经琼脂糖凝胶电泳，回收阳性条带测序，进行同源性分析，验证其是否为橡胶树基因组上的片段。
步骤8.转基因材料的荧光定量PCR检测
用荧光定量PCR技术分析转基因愈伤组织、转基因胚状体和转基因植株中外源基因HbHMGR1的表达情况，以橡胶树18S rRNA基因为内参基因。
8.1引物序列设计
用Primer Premier 5.0软件。
18S-F:5’-GCTCGAAGACGATCAGATAC-3'
18S-R:5’-TTCAGCCTTGCGACCATAC-3'146bp
HbHMGR1-F:5'GTCGGAGGTGGAACTCAACTT3'58.1
HbHMGR1-R:5'GCTCACCAGCCAAAACTGAA3'58.6 139bp
8.2RNA抽提
操作步骤详见生工生物工程(上海)股份有限公司柱式植物总RNA抽提纯化试剂盒(SK8661)。
电泳检测-RNA电泳结果(1.5％琼脂糖，1×TAE电泳缓冲液，紫外透射光下观察并拍照)。
8.3反转录
8.3.1实验试剂
第一链cDNA合成试剂盒(AMV First Strand cDNA Synthesis Kit)(SK2445)。
8.3.2cDNA第一链合成
(1)在0.2ml PCR管中加入以下试剂：
5μl total RNA
1μl Random Primer p(dN)6(0.2μg/μl)
5μl Rnase-free ddH2O
(2)70℃温浴5min。
(3)冰浴10sec，离心加入下列试剂：
4.0μl 5*Reaction Buffer
2.0μl dNTP Mix(10mmol/L)
1.0μl Rnase inhibitor(20U/μl)
2.0μl AMV Reverse Transcriptase(10U/μl)
(4)37℃温浴5min。
(5)42℃温浴60min。
(6)70℃温浴10min。终止反应。
(7)将上述溶液-20℃保存。
8.4标准品制备
8.4.1PCR反应体系
25μl体系的配制
模板cDNA 0.5μl
引物F(10μM) 0.5μl
引物R(10μM) 0.5μl
dNTP(10mM) 0.5μl
Taq Buffer(10×) 2.5μl
MgCl2(25mM) 2μl
Taq酶(5U/μl) 0.2μl
H2O 18.3μl
8.4.2PCR反应条件
8.4.3PCR电泳
2％琼脂糖凝胶，1×TAE，150V，100mA，20min电泳观察。
8.4.4PCR回收
目的条带用手术刀切下，按试剂盒回收(见试剂盒SK8131)。
8.4.5克隆测序
A.连接反应
5μl Solution
10ng18-T Vector
5μl PCR Product
Final Volume 10μl
4℃过夜连接。
B.连接产物转化
使用生工一步法快速感受态细胞制备试剂盒(产品编号SK9307)，转化步骤如下：
a.100μl感受态细胞，置于冰上，完全解冻后轻轻将细胞均匀悬浮。
b.加入10μl连接液，轻轻混匀。冰上放置30分钟。
c.42℃水浴热激45秒。冰上放置15～20分钟。
d.加600μl SOC培养基，37℃200～250rpm振荡培养1小时。
e.室温下4000rpm离心5分钟，用枪头吸掉400μl上清液，用剩余的培养基将细胞悬浮。
f.将细菌涂布在预先用20μl 100mM IPTG和100μl 20mg/ml X-gal涂布的氨苄青霉素平板上。
g.平板在37℃下正向放置1小时以吸收过多的液体，然后倒置培养过夜。
C.质粒提取
使用生工质粒提取试剂盒SK8191 SanPrep柱式质粒DNA小量抽提试剂盒提取质粒DNA。
8.4.6定量质粒信息
质粒M13+/-测序。
构建好的质粒经测序鉴定无误后用紫外分光光度计测定质粒OD260的值，通过公式换算成拷贝数(copies/μl)。
A.(1)：质粒浓度换算公式(copies/μl)＝(mol数/μl)×6.02×1023＝[质量(g)/分子量]/μl×6.02×1023＝[质量(ng)×10-9/分子量]/μl×6.02×1023＝浓度(ng/μl)×6.02×1014/分子量
(2)：分子量＝(载体片段碱基对+PCR产物碱基对)×650
(3)：双链DNA分子的分子量(道尔顿)＝碱基对数目×650
(4)：一个DNA碱基对(钠盐)的平均分子量＝650道尔顿
B.标准曲线样品的制备
10倍梯度稀释构建好的各质粒，90μl稀释液+10μl质粒，一般做4-6个点，通过预实验选取合适标准品用于制备标准曲线。
8.5荧光定量PCR检测
8.5.1实验样本样品提取RNA后反转录成的cDNA，稀释10倍上机。
8.5.2PCR反应步骤
A.配制主混液
注：每20μl体系加2μl cDNA模板。
B.PCR循环条件
C.仪器的操作
完成上述步骤后，把加好样品的96/384孔板放在LightCycler 480 SoftwareSetup(Roche罗氏)中进行反应。
本发明一种用乳管特异性启动子获得橡胶树转基因植株的方法是用橡胶树乳管特异性强启动子与天然橡胶生物合成途径的关键限速酶基因连接，构建植物表达载体，转化橡胶树易碎胚性愈伤组织，获得转基因植株，用荧光定量PCR技术证明转基因胚状体和转基因植株中目的基因的表达量显著提高。它为用基因工程方法进行橡胶树遗传改良、提高橡胶产量提供了新的途径，为橡胶树遗传转化和用基因工程方法提高橡胶产量奠定了基础。
关于HbHMGR1基因点突变，目前，NCBI网上关于天然橡胶生物合成关键限速酶基因HbHMGR1有3条序列：GenBank AY706757.1、X54659.1、AB294692.1，都克隆自国际上橡胶树优良品种(X54659.1来源于品种RRIM600、AY706757.1来源于品种RRII105、AB294692.1来源于品种RRIM600)，相互间只有1～2个碱基的差异。X54659.1和AB294692.1的第1031位碱基都为G，为Pst Ⅰ酶切位点[ctgcag(1029..1034)]，AY706757.1的1031位碱基为A，非Pst Ⅰ酶切位点[ctacag(1029..1034)]。X54659.1和AY706757.1只有这1个碱基的差异，DNA序列相似率为99.9％。相应地，X54659.1和AY706757.1的蛋白质序列第344位氨基酸残基分别为C(半胱氨酸,Cys)、Y(酪氨酸,Tyr)。其它的氨基酸残基相同。蛋白质序列相似率为99.8％。
本实验室根据已经报道的HbHMGR1基因序列(NCBI登录号X54659.1)设计特异引物，以中国橡胶树优良品种热研7-33-97胶乳为材料，通过反转录PCR克隆HbHMGR1基因，深圳华大基因公司测序结果表明，目的片段长1728bp，与NCBI GenBank Accession:X54659.1的HbHMGR1基因核苷酸序列相比，完全一致，同源性100％。委托生工生物工程(上海)股份有限公司把X54659.1的1031位碱基由G点突变为A。使得该Pst Ⅰ酶切位点消失，以利于后续的植物表达载体构建的工作。
吴春太等(2009)以NCBI GenBank AB294692.1对HbHMGR1蛋白质进行了生物信息学分析和同源模建。HbHMGR1蛋白质在空间分成3个域，这3个域之间形成一个口袋，通过对SIM(辛伐他汀)、ADP以及底物HMG-CoA的定位，此口袋为HMGR的活性中心(Wang etal.1990)。与SIM发生作用形成氢键的残基E254、K430和与ADP作用的残基N262保守性较高，对HMGR的活性有重要影响。即HbHMGR1基因的第1031位碱基和相应氨基酸残基不处于活性中心的重要位置。因为国际上橡胶树不同优良品种RRII 105、RRIM 600HbHMGR1基因的第1031位碱基有差异，把其中1个优良品种的该碱基突变为另1个优良品种的相应碱基对产量无负面影响。
原始的植物表达载体pCAMBIA2301只有唯一的1个Pst Ⅰ限制性酶切位点，在核苷酸序列10864位置。一些实际应用中的pCAMBIA2301载体分子上有2个突变增加的Pst Ⅰ酶切位点，其中1个约在1178位置，在UidA基因(2053bp)上，此点突变不影响UidA基因的功能；另1个在约5408位置(非T-DNA功能区)。这2个突变增加的Pst Ⅰ酶切位点给载体构建带来了障碍，使该载体上有3个Pst Ⅰ酶切位点，难以用该酶酶切。载体pCAMBIA3301上有唯一的1个Pst Ⅰ酶切位点(在10550位置)。本发明把PHEV2.1、HbHMGR1先构建到pCAMBIA3301上，再用酶一起切下来克隆到pCAMBIA2301上，克服了pCAMBIA2301上出现Pst Ⅰ突变、阻碍载体构建的难题。
中间植物表达载体的构建过程见说明书附图1，植物表达载体的构建过程见附图2。
附图说明：
图1：中间植物表达载体的构建过程
图2：植物表达载体的构建过程
图3：改良CTAB法提取的橡胶树品种热研7-33-97叶片基因组DNA
图4：HEV2.1启动子的PCR扩增
图5：pCAMBIA3301-PHEV2.1-HbHMGR1酶切鉴定
图中：M1:1Kb DNA Ladder Marker；M2:DL5000 DNA Marker；1:pCAMBIA3301载体；2:pCAMBIA3301-PHEV2.1-HbHMGR1载体；3:pCAMBIA3301-PHEV2.1-HbHMGR1经HindⅢ、Pst Ⅰ和Xma Ⅰ三酶切的结果；4:pCAMBIA3301-PHEV2.1-HbHMGR1经HindⅢ和Xma Ⅰ双酶切的结果。
图6：PHEV2.1-HbHMGR1的PCR扩增产物
图中：M:DL5000DNAMarker；1,2,3:PHEV2.1-HbHMGR1扩增产物。
图7：pCAMBIA2301-PHEV2.1-HbHMGR1的酶切鉴定
图中：M1:1Kb DNA Ladder Marker；M2:DL 5000 DNA Marker；-:pCAMBIA2301-MCS双酶切鉴定(HindⅢ,Xma Ⅰ)；+:pCAMBIA3301-PHEV2.1-HbHMGR1双酶切(Hind Ⅲ,Xma Ⅰ)；1:pCAMBIA2301-PHEV2.1-HbHMGR1双酶切(HindⅢ,XmaI)。
图8：乳管特异性植物表达载体pCAMBIA2301-PHEV2.1-HbHMGR1的T-DNA结构
图9：pCAMBIA2301-PHEV2.1-HbHMGR1的PCR检测
图10：pCAMBIA2301-PHEV2.1-HbHMGR1转化的抗性愈伤组织的GUS染色鉴定结果
图中：A:阴性对照；B:筛选的卡那霉素抗性愈伤组织。
图11：抗性胚状体的GUS染色
图中：A:非转化胚状体(对照)；B：抗性胚状体。
图12：转基因植株及其叶片GUS染色
图中：A.转基因植株；B.转基因植株叶片GUS染色；CK.非转化植株叶片GUS染色(对照)。
图13：抗性愈伤组织系uidA基因的PCR鉴定结果
图中：M:DL2000 DNA Marker；-：阴性对照；+：pCAMBIA2301-PHEV2.1-HbHMGR1载体uidA产物；1、2：2号抗性愈伤组织系uidA特异PCR产物；3、4：11号抗性愈伤组织系uidA特异PCR产物。
图14：抗性愈伤组织系NPTII基因PCR鉴定结果
图中：M:DL2000 DNA Marker；-：阴性对照；+：pCAMBIA2301-PHEV2.1-HbHMGR1载体NPTII产物；1、2：2号抗性愈伤组织系NPTII PCR产物；3、4：11号抗性愈伤组织系NPTII PCR产物。
图15：抗性愈伤组织系PHEV2.1-HbHMGR1的PCR检测
图中：M:DL2000 DNA Marker；-：阴性对照；+：pCAMBIA2301-PHEV2.1-HbHMGR1载体PHEV2.1-HbHMGR1 PCR产物；1、2：2号抗性愈伤组织系的PHEV2.1-HbHMGR1 PCR产物；3、4：11号抗性愈伤组织系的PHEV2.1-HbHMGR1 PCR产物。
图16：pCAMBIA2301-PHEV2.1-HbHMGR1转化的抗性愈伤组织的反向PCR鉴定
图中：－：阴性对照；1、2、3：2号抗性愈伤组织系IPCR鉴定；4、5、6：11号抗性愈伤组织系IPCR鉴定。
图17：IPCR扩增片段测序结果分析
图中：黑色加粗序列：反向引物序列；底纹加粗序列：EcoRI识别序列；水平下划线序列：与载体T-DNA完全比对上的序列；波浪下划线序列：缺失的T-DNA左边界及左边界附近的序列；中间序列：IPCR扩增的未知DNA序列。
图18：未知DNA序列在橡胶树品种热研7-33-97基因组数据库的同源性搜索结果
图19：愈伤组织、转基因胚状体和转基因植株样品RNA电泳
图20：HbHMGR1、Hb18SrRNA基因扩增结果
图21：内参基因Hb18S rRNA梯度稀释样品扩增曲线
图22：内参基因Hb18S rRNA熔解曲线
图23：内参基因Hb18S rRNA标准曲线结果
图中：纵坐标是CT值；横坐标LogCO，LogCO是指Log浓度即取浓度的对数。Slope＝-3.358；扩增效率：E＝10-1/斜率-1＝10-1/-3.358-1＝98.5％；相关系数：R2＝0.9959；YIntercept:39.90；Error:0.128。
图24：目的基因HbHMGR1梯度稀释样品扩增曲线
图25：目的基因HbHMGR1溶解曲线结果
图26：目的基因HbHMGR1标准曲线结果
图中：纵坐标是CT值；横坐标LogCO，LogCO是指Log浓度即取浓度的对数。Slope＝-3.225；扩增效率：E＝10-1/斜率-1＝10-1/-3.225-1＝104.2％；相关系数：R2＝0.9977；YIntercept:38.00；Error:0.0823。
图27：内参基因Hb18S rRNA扩增曲线
图28：内参基因Hb18S rRNA溶解曲线
图29：目的基因HbHMGR1扩增曲线
图30：目的基因HbHMGR1溶解曲线
具体实施方式
以下实施例用于说明本发明，但不用来限制本发明的范围。下面结合附图及具体实施例对本发明的应用原理作进一步描述。
本发明一种用乳管特异性启动子获得橡胶树转基因植株的方法，具体步骤如下：
步骤1.天然橡胶生物合成关键限速酶基因HbHMGR1克隆
1.1橡胶树总RNA提取和cDNA第一条链合成
橡胶树胶乳总RNA提取用Trizol法(萨姆布鲁克等，1996)。按照Revert Aid TMcDNA第一链合成试剂盒说明书合成cDNA第一条链，-20℃保存待用。
1.2HbHMGR1基因cDNA链合成
依据NCBI登录号X54659.1的HbHMGR1基因，利用Primer5.0设计1对特异引物用以扩增HbHMGR1基因cNDA全长(1728bp)：
上游引物H1F：5'-GCTCTAGAATGGACACCACCGGCC-3；
下游引物H1R：5'-CCCCCCGGGCTAAGATGCAGCTTTAGAC-3
其中，在上游引物5’端加上XbaI酶切位点(TCTAGA)，下游引物5’端加上XmaI酶切位点(CCCGGG)。以橡胶树胶乳cDNA为模板，进行PCR扩增，产物经过电泳、胶回收、纯化之后利用TA克隆连接到pMD 19-T载体上，转化大肠杆菌，经过菌落PCR检测后，挑选阳性克隆的菌落送到测序公司(例如深圳华大基因公司)进行基因测序。
1.3HbHMGR1基因点突变
根据已经报道的HbHMGR1基因序列(NCBI登录号X54659.1)设计特异引物，以中国橡胶树品种热研7-33-97胶乳为材料，通过反转录PCR克隆HbHMGR1基因，目的片段长1728bp，把X54659.1的1031位碱基由G点突变为A，使得该Pst Ⅰ酶切位点消失，以利于后续的植物表达载体构建的工作。
步骤2.从橡胶树优良品种材料中克隆乳管特异性强启动子PHEV2.1
2.1橡胶树叶片基因组DNA的提取
用改良的CTAB法从橡胶树优良品种热研7-33-97叶片小量提取基因组DNA，具体步骤如下：
⑴称取0.2g橡胶树热研7-33-97的新鲜叶片于液氮预冷的研钵中，迅速将其研磨成粉末，转入2ml冰上预冷的离心管中。
⑵在盛有样品的离心管中加入1ml的65℃预热的2×CTAB裂解液(裂解液用前加入3％的β-巯基乙醇)，涡旋混匀。
⑶转移离心管至65℃水浴锅中恒温水浴30min(可以适当延长)，期间每隔5～6min轻轻颠倒混匀10次，使CTAB充分裂解细胞。
⑷取出离心管，于高速离心机中25℃、12000rpm、离心5min。
⑸轻轻取出离心管，小心转移上清液至新的2ml离心管。加入等体积的氯仿：异戊醇(24:1)，轻轻颠倒混匀数次，4℃、12000rpm离心5min。
⑹轻轻取出离心管，转移上清液至新的2ml离心管，加入等体积的酚：氯仿：异戊醇(25:24:1)，轻轻颠倒混匀数次后，在4℃、12000rpm离心5min。
⑺取上清液，再加入等体积的氯仿：异戊醇(24:1)抽提一次，条件同(5)。
⑻取上清液至新的2ml离心管，加入1/10体积3M预冷的NaAc，轻轻混匀，然后加入等体积预冷的异丙醇，轻轻摇匀，置于-20℃冰箱中充分沉淀30min(可以适当延长)。
⑼在4℃、12000rpm离心10min，弃上清液，用70％的乙醇洗涤沉淀物两次并转入1.5ml小管，尽可能地吸干管里的酒精。
⑽将沉淀物置于超净工作台上静置10min，然后用100μl的无菌双蒸水溶解沉淀物。
⑾于上面提取的DNA中加入2.5μl(10mg/ml)的RNaseA，在37℃水浴锅中水浴酶解1～2h。
⑿酶解期间，每30min取5μl进行琼脂糖凝胶电泳，检测RNA是否彻底消化。
⒀加入等体积的氯仿：异戊醇(24:1)，轻轻颠倒翻转50次后，在4℃、12000rpm离心10min。
⒁取上清液，加入1/10体积的3MNaAc(pH5.2)，混匀，加入2倍体积的无水乙醇，上下翻转混匀5min，-20℃沉淀1h。
⒂在4℃、12000rpm离心10min。
⒃用70％的酒精洗涤沉淀物2次。
⒄沉淀物置于超净工作台上静置10min，用50μl的无菌双蒸水溶解沉淀物。
⒅取2μl的DNA溶液进行琼脂糖凝胶电泳和紫外分光光度计检测浓度。
2.2橡胶树乳管特异性启动子PHEV2.1的克隆
根据法国农业研究国际合作中心(CIRAD)的Pujade-Renaud等(2005)报道的HEV2.1序列(NCBI登录号：AY247789.1)，截取起始密码子前的1830bp碱基序列，用Primer5.0设计一对特异性引物PHF1和PHR1，上游引物为PHF1：5’-CCCAAGCTTCTTGTTTGCACATGATGCGTTCAGGTGACC-3’，下游引物为PHR1：5’-TTCCAATGCATTGGCTGCAGAACTCTTCCCATTTCTTCCC-3’，下划线部分为在引物两端引入的酶切位点HindIII和PstI酶切位点。以从中国橡胶树优良品种热研7-33-97叶片提取的基因组DNA为模板，以PHF1和PHR1为引物进行PCR扩增，扩增产物经琼脂糖凝胶电泳、回收、加尾“A”后，克隆到pMD19-Tvecor上，转化大肠杆菌Trans5α，经12～16h的培养后，挑取单菌落进行菌液PCR，选取PCR检测为阳性的菌落送往生工生物工程(上海)股份有限公司进行测序。测序结果用NCBI网上的BLASTN工具进行序列同源性分析。
从橡胶树优良品种热研7-33-97叶片提取的基因组DNA，取2μl稀释5倍后进行琼脂糖凝胶电泳，检测其纯度，结果见图3。从图3可见，提取得到的橡胶树叶片基因组DNA条带整齐、清晰、完整性好、无明显的杂质和降解现象。利用微型紫外分光光度计测其浓度，浓度大约为100ng/μl左右。
以橡胶树优良品种热研7-33-97的叶片基因组DNA为模板，用特异性引物PHF1和PHR1进行PCR扩增，得到一条近2000bp左右的条带(图4)。经生工生物工程(上海)股份有限公司测序结果证明，从热研7-33-97基因组中扩增得到的PHEV2.1为1852bp。将所得序列录入NCBI的BLASTN数据库中与Pujade-Renaud等(2005)报道的PHEV2.1序列(GenBank：AY247789.1)进行同源性比较分析，结果显示，所克隆的PHEV2.1启动子序列与AY247789.1的启动子序列的同源性为98.6％。
步骤3.构建HbHMGR1基因的乳管特异性植物表达载体pCAMBIA2301-PHEV2.1-HbHMGR1
HbHMGR1乳管特异性植物表达载体pCAMBIA2301-PHEV2.1-HbHMGR1的构建及酶切鉴定：先利用XbaI和Xma Ⅰ分别对pCAMBIA3301和pCAMBIA2301-HbHMGR1进行双酶切，酶切产物经1.0％的琼脂糖凝胶电泳后，分别切胶回收pCAMBIA3301的大片段和pCAMBIA2301-HbHMGR1的小片段(HbHMGR1基因)，将两片段用T4DNA连接酶连接，转化大肠杆菌Trans5α，过夜培养后挑取单菌落进行菌落PCR检测，提取阳性重组质粒pCAMBIA3301-HbHMGR1；再用HindIII和PstI分别对pCAMBIA3301-HbHMGR1和pMD19-T-PHEV2.1进行双酶切，电泳结束后，分别对pCAMBIA3301-HbHMGR1的大片段和pMD19-T-PHEV2.1的小片段(PHEV2.1)进行切胶回收，回收产物用T4 DNA连接酶连接过夜，转化大肠杆菌，过夜培养后挑取单菌落进行菌液PCR，提取阳性重组质粒，用HindⅢ、Pst Ⅰ、Xma Ⅰ和HindⅢ、Xma Ⅰ分别对其进行三酶切和双酶切，三酶切得到一条与双酶切等大的大片段和一条近2000bp的条带，近2000bp的条带为大小相近的PHEV2.1片段和HbHMGR1片段，前者为1852bp，后者为1728bp，两者由于大小相近而显示为一条带，另外，双酶切得到的小片段间于3000bp至5000bp之间，与3592bp的PHEV2.1-HbHMGR1重组片段的大小一致(图5)；再用PHEV2.1的上游引物PHHF和HbHMGR1的下游引物PHHR对pCAMBIA3301-PHEV2.1-HbHMGR1进行PCR扩增，也得到一条间于3000bp至5000bp之间的条带，与双酶切得到的小片段大小相符(图6)，证明中间表达载体pCAMBIA3301-PHEV2.1-HbHMGR1已经构建成功。
最后用HindⅢ和Xma Ⅰ将PHEV2.1-HbHMGR1重组片段从pCAMBIA3301-PHEV2.1-HbHMGR1上切下，将其连接到pCAMBIA2301-MCS的HindⅢ和Xma Ⅰ间，得到植物表达载体pCAMBIA2301-PHEV2.1-HbHMGR1，转化大肠杆菌，挑取单菌落进行菌落PCR，提取阳性重组质粒pCAMBIA2301-PHEV2.1-HbHMGR1，以pCAMBIA2301-MCS为阴性对照，pCAMBIA3301-PHEV2.1-HbHMGR1为阳性对照，用HindⅢ和Xma Ⅰ分别对其进行双酶切，pCAMBIA2301-PHEV2.1-HbHMGR1的酶切结果为得到一条与阳性对照小片段等大且间于3000bp至5000bp的小片段和一条10000bp以上的大片段(图7)，小片段与PHEV2.1-HbHMGR1的预期大小3592bp相符，证明乳管特异性植物表达载体pCAMBIA2301-PHEV2.1-HbHMGR1已经构建成功，其T-DNA结构见图8。
步骤4.橡胶树易碎胚性愈伤组织的培养
橡胶树优良品种易碎胚性愈伤组织的培养：先取中国橡胶树优良高产品种热研8-79单核靠边期花蕾，用流水冲洗后，在超净台上再用75％乙醇表面消毒1min，再以0.1％(w/v)HgCl2浸泡消毒10min，然后用无菌水冲洗3次，每次3min。剥出花蕾中的花药，接种到花药胚性愈伤组织诱导培养基(M1)[改良的MS培养基并添加2.0mg/L2,4-D、1.0mg/L NAA、1.0mg/L KT、0.1g/L肌醇、70g/L蔗糖、5％(v/v)CW、2.0g/L植物凝胶(phytagel,Sigma)]，培养50d，诱导出初生愈伤组织后，再将生长状态良好的初生愈伤组织转入到新鲜的M1上继代培养，每10天继代一次。生长良好的花药初生愈伤组织经多次选择继代，直至诱导出颜色鲜黄、结构疏松、颗粒状的花药胚性愈伤组织。它们可以诱导出胚状体和再生植株。以这些易碎胚性愈伤组织为转化受体材料。易碎胚性愈伤组织置于高钙离子浓度(11.0mmol/L)的继代培养基中继代培养，每隔20d继代1次，经过5次以上的继代后，筛选出适合长期继代培养的易碎胚性愈伤组织。
步骤5.橡胶树连续继代易碎胚性愈伤组织遗传转化
5.1根癌农杆菌EHA105感受态细胞的制备方法
(1)从-80℃冰箱中取一管保存的EHA105菌种于冰上溶解。
(2)用接种环蘸取一点菌液，然后于含有75mg/L利福平和75mg/L链霉素的LB固体培养基上划平板，培养36～48h。
(3)挑取一个单菌落，接种于2ml LB液体培养基(含有75mg/L利福平和75mg/L链霉素)，在28℃、200rpm培养16～24h。
(4)将(3)中的2ml培养物转接到100ml LB液体培养基中，在28℃、200rpm培养至菌液浓度为OD600约为0.5左右。
(5)将培养物分装到两个50ml的离心管中，置于冰上冰浴30min，在4℃、5000rpm离心10min。
(6)弃上清液，收集菌体，用10ml预冷的0.15mol/L NaCl悬浮，在4℃、5000rpm离心5min，收集菌体。
(7)再悬浮菌体于10ml预冷的20mmol/L CaCl2溶液中，再次同上离心并收集菌体。
(8)用1ml预冷的含有10％甘油的20mmol/L CaCl2溶液悬浮菌体，然后按照50μl/管分装，液氮速冻后置于-80℃超低温冰箱中备用。
5.2植物表达载体pCAMBIA2301-PHEV2.1-HbHMGR1转化农杆菌
根癌农杆菌EHA105的转化方法采用冻融法。取一管农杆菌EHA105感受态细胞置于冰上溶解，在菌液中加入0.5μg重组质粒pCAMBIA2301-PHEV2.1-HbHMGR1，轻轻震荡混匀，冰浴30min；液氮中速冻1min，再于37℃温育5min；取出样品，迅速置于冰上冷却5min；加入1ml无抗生素的LB液体培养基，于摇床中28℃温和振荡(100rpm)培养4h；5000rpm离心5min，收集菌体，悬浮于300μl LB液体培养基中；将转化细胞在含有50mg/L卡那霉素、50mg/L利福平和50mg/L链霉素的LB培养基上28℃培养36～48h后，挑取5个单菌落，用特异引物PHF1、PHR1和H1F、H1R对单菌落进行菌落PCR，检测结果均为阳性(图9)，证明植物表达载体已经成功转化到根癌农杆菌中。选取PCR检测为阳性的菌株制备工程菌，以作后续侵染。
5.3花药易碎胚性愈伤组织的转化及GUS组织化学染色
易碎胚性愈伤组织的转化，对愈伤组织进行侵染、共培养、抑菌和筛选。将筛选得到的抗性愈伤组织进行GUS组织化学染色。以含有载体质粒pCAMBIA2301-PHEV2.1-HbHMGR1的根癌农杆菌侵染橡胶树品种热研8-79的花药易碎胚性愈伤组织，经过4～6个月的筛选，得到GUS组织化学染色阳性的卡那霉素抗性愈伤组织系。图10为一个抗性愈伤组织系的GUS染色结果，说明植物表达载体pCAMBIA2301-PHEV2.1-HbHMGR1的T-DNA已经成功转入易碎愈伤组织细胞中。
选取GUS染色阳性的抗性愈伤组织继续继代培养增殖，以便用于后续的分子检测和体细胞胚发生。
步骤6.获得胚状体和再生植株
共培养结束后，将橡胶树品种热研8-79易碎胚性愈伤组织转入抑菌培养基中进行抑菌处理，18天后，转移到卡那霉素为75～100mg/L的筛选培养基中，经过4个月的筛选，长出鲜黄色的抗性愈伤组织，把经过GUS染色为阳性的愈伤组织增殖1～2个月后诱导胚状体和植株再生，获得了抗性易碎胚性愈伤组织系，从抗性愈伤组织诱导出胚状体和转化植株。
橡胶树组织培养和遗传转化中使用的培养基及成分见表2。
表2：橡胶树组织培养和遗传转化中使用的培养基及成分
橡胶树愈伤组织培养培养基为经改良的MS培养基(改良成份为MgSO4·7H2O500mg/L，KH2PO4 400mg/L，CaCl2 250mg/L，MnSO4·H2O 35mg/L，CuSO4·5H2O 0.2mg/L)，再添加不同的其他培养基成分，pH值为5.8，在0.2MPa压力、121℃条件下高温高压灭菌20min。易碎胚性愈伤组织继代增殖培养、胚状体诱导均采用暗培养，植株再生在光照条件下进行，培养温度均为25～27℃。非转化胚状体(对照)、转化抗性胚状体及组织化学GUS染色情况举例见图11。转基因植株及其叶片GUS染色检测情况见图12。
步骤7.组织化学检测和分子检测
取橡胶树抗性转化胚状体、抗性转化植株叶片进行GUS染色，结果呈蓝色阳性。取抗性转化材料和对照材料一起进行分子检测，包括(PCR和反向PCR)，证明得到了转基因植株。
7.1抗性愈伤组织的PCR检测
以非转化愈伤组织(对照)和筛选6个月以上的抗性愈伤组织为材料，分别提取基因组DNA；根据T-DNA上的uidA、NPTII和PHEV2.1-HbHMGR1的序列，用Primer5.0分别设计一对特异引物，引物分别命为：
UF:5’-GCGAAGTCTTTATACCGAAAGGTTG-3’,
UR：5’-ACGATGCCATGTTCATCTGCCCAG-3’；
NPT-F:5’-TCAGAAGAACTCGTCAAGAAG-3’,
NPT-R:5’-ATGGGGATTGAACAAGATGGAT-3’；
PHHF:5’-CTTGTTTGCACATGATGCGTTCAGGTGACC-3’；
PHHR：5’-TCCCCCCGGGCTAAGATGCAGCTTTAGAC-3’，
三对引物扩增的PCR产物长度分别为829bp、797bp、3592bp。
从筛选得到的2号、11号抗性愈伤组织系分别提取基因组DNA，以非转化愈伤组织系基因组DNA为阴性对照，以植物表达载体pCAMBIA2301-PHEV2.1-HbHMGR1为阳性对照，用uidA、NPTII和PHEV2.1-HbHMGR1的特异引物进行PCR扩增，每个系做两个重复，结果发现2个抗性愈伤组织系均能扩增出与阳性对照相同的特异片段，其目的片段大小分别为829bp(图13)、797bp(图14)和3592bp(图15)。
7.2反向PCR扩增抗性愈伤组织外源基因插入位点的左旁侧序列
根据植物表达载体的T-DNA序列，在T-DNA内部的EcoR Ⅰ至左边界(TL)的序列上设计一对反向引物：
Eco-F:5’-CTGCTCTAGCCAATACGCAAACC-3’，
和TL-R:5’-GTGAGTAGTTCCCAGATAAGGGAAT-3’；将抗性愈伤组织的基因组DNA经过一系列的酶切、纯化和T4DNA连接酶环化后，以环化产物为模板，以Eco-F和TL-R为引物进行反向扩增，每个系做3个重复；扩增产物经琼脂糖凝胶电泳，回收阳性条带送往测序公司测序[例如生工生物工程(上海)股份有限公司]；测序所得未知序列利用中国热带农业科学院橡胶研究所和中科院北京基因组研究所合作测序建立的橡胶树品种热研7-33-97的基因组数据库，进行同源性分析，验证其是否为橡胶树基因组上的片段。
经反向PCR(IPCR)鉴定，11号抗性愈伤组织系扩增出一条近2000bp的条带，而2号抗性愈伤组织系未能扩增出阳性条带(图16)。对11号系IPCR扩增所得片段进行测序鉴定，结果显示该片段大小为1803bp，其中包含反向引物能扩增到的T-DNA序列和一段未知的DNA序列(图17)。未知序列经方永军博士在橡胶树品种热研7-33-97的基因组数据库进行同源性分析，结果发现在其基因组中存在一段与未知序列98.7％相同的序列(图18)，证明所得未知片段为橡胶树基因组的一部分，植物表达载体的T-DNA已经成功整合到橡胶树品种热研8-79的染色体上，所得到的11号抗性愈伤组织系为转基因愈伤组织系。
步骤8.转基因材料的荧光定量PCR检测
用荧光定量PCR技术分析转基因愈伤组织、转基因胚状体和转基因植株中外源基因HbHMGR1的表达情况，以橡胶树18SrRNA基因为内参基因。
研究样品信息见表3。
表3转基因愈伤组织、转基因胚状体和转基因植株样品信息
8.1引物序列设计
用Primer Premier5.0软件。
18S-F:5’-GCTCGAAGACGATCAGATAC-3'
18S-R:5’-TTCAGCCTTGCGACCATAC-3' 146bp
HbHMGR1-F:5' GTCGGAGGTGGAACTCAACTT 3' 58.1
HbHMGR1-R:5' GCTCACCAGCCAAAACTGAA 3' 58.6 139bp
8.2RNA抽提
操作步骤详见生工生物工程(上海)股份有限公司柱式植物总RNA抽提纯化试剂盒(SK8661)。
电泳检测-RNA电泳结果(1.5％琼脂糖，1×TAE电泳缓冲液，紫外透射光下观察并拍照)见图19。
8.3反转录
8.3.1实验试剂
第一链cDNA合成试剂盒(AMV First Strand cDNA Synthesis Kit)(SK2445)。
8.3.2cDNA第一链合成
(1)在0.2ml PCR管中加入以下试剂：
5μl total RNA
1μl Random Primer p(dN)6(0.2μg/μl)
5μl Rnase-free ddH2O
(2)70℃温浴5min。
(3)冰浴10sec，离心加入下列试剂：
(4)37℃温浴5min。
(5)42℃温浴60min。
(6)70℃温浴10min。终止反应。
(7)将上述溶液-20℃保存。
8.4标准品制备
8.4.1PCR反应体系
25μl体系的配制
模板cDNA 0.5μl
引物F(10μM) 0.5μl
引物R(10μM) 0.5μl
dNTP(10mM) 0.5μl
TaqBuffer(10×) 2.5μl
MgCl2(25mM) 2μl
Taq酶(5U/μl) 0.2μl
H2O 18.3μl
8.4.2PCR反应条件
8.4.3PCR电泳
2％琼脂糖凝胶，1×TAE，150V，100mA，20min电泳观察(见图20)。
8.4.4PCR回收
目的条带用手术刀切下，按试剂盒回收(见试剂盒SK8131)。
8.4.5克隆测序：
A.连接反应
B.连接产物转化
使用生工一步法快速感受态细胞制备试剂盒(产品编号SK9307)，转化步骤如下：
a.100μl感受态细胞，置于冰上，完全解冻后轻轻将细胞均匀悬浮。
b.加入10μl连接液，轻轻混匀。冰上放置30分钟。
c.42℃水浴热激45秒。冰上放置15～20分钟。
d.加600μlSOC培养基，37℃200～250rpm振荡培养1小时。
e.室温下4000rpm离心5分钟，用枪头吸掉400μl上清液，用剩余的培养基将细胞悬浮。
f.将细菌涂布在预先用20μl 100mM IPTG和100μl 20mg/ml X-gal涂布的氨苄青霉素平板上。
g.平板在37℃下正向放置1小时以吸收过多的液体，然后倒置培养过夜。
C.质粒提取
使用生工质粒提取试剂盒SK8191 SanPrep柱式质粒DNA小量抽提试剂盒提取质粒DNA。
8.4.6定量质粒信息
质粒M13+/-测序。
构建好的质粒经测序鉴定无误后用紫外分光光度计测定质粒OD260的值，通过公式换算成拷贝数(copies/μl)。
A.(1)：质粒浓度换算公式(copies/μl)＝(mol数/μl)×6.02×1023＝[质量(g)/分子量]/μl×6.02×1023＝[质量(ng)×10-9/分子量]/μl×6.02×1023＝浓度(ng/μl)×6.02×1014/分子量
(2)：分子量＝(载体片段碱基对+PCR产物碱基对)×650
(3)：双链DNA分子的分子量(道尔顿)＝碱基对数目×650
(4)：一个DNA碱基对(钠盐)的平均分子量＝650道尔顿
B.标准曲线样品的制备
10倍梯度稀释构建好的各质粒，90μl稀释液+10μl质粒，一般做4-6个点，通过预实验选取合适标准品用于制备标准曲线。
8.5荧光定量PCR检测
8.5.1实验样本样品提取RNA后反转录成的cDNA，稀释10倍上机。
8.5.2PCR反应步骤
A.配制主混液
注：每20μl体系加2μlcDNA模板。
B.PCR循环条件
C.仪器的操作
完成上述步骤后，把加好样品的96/384孔板放在LightCycler480Software Setup(Roche罗氏)中进行反应。
8.6荧光定量PCR研究结果
8.6.1绝对定量标准曲线结果
(1)内参基因Hb18S rRNA：
梯度稀释样品扩增曲线见图21；熔解曲线结果见图22；标准曲线结果见图23。
(2)目的基因HbHMGR1：
梯度稀释样品扩增曲线见图24；溶解曲线结果见图25；标准曲线结果见图26。
8.6.2基因扩增
(1)内参基因Hb18S rRNA扩增曲线见图27；溶解曲线结果见图28。
(2)目的基因HbHMGR1扩增曲线见图29；溶解曲线结果见图30。
8.6.3相对定量结果
(1)平均拷贝数
(2)Ct值
8.6.4结果分析
用荧光定量PCR方法特异性地扩增了样品中表达的目的基因HbHMGR1，这从HbHMGR1的扩增溶解曲线也反映出来。经过荧光定量PCR检测，以橡胶树品种热研8-79非转化易碎胚性愈伤组织(对照)HbHMGR1的表达量为1，光照绿色胚状体(对照)该基因的表达量相对值为3.115259，转入乳管特异性启动子PHEV2.1驱动的HbHMGR1的转基因系H6系、H9系、H11系光照绿色转基因胚状体该基因的表达量相对值分别为3.964885、45.41104、102.2583，表达量相对于非转化对照愈伤组织和非转化对照胚状体中有显著提高。在橡胶树胚状体中已有乳管分化(史敏晶等2012)。转基因植株中该基因的表达量相对值为10.18455，相对于非转化对照愈伤组织和非转化对照植株(4.294341)亦有显著提高。表明本实验室以橡胶树乳管特异性强启动子PHEV2.1与天然橡胶生物合成途径的关键限速酶基因HbHMGR1连接构建植物表达载体，转化橡胶树易碎胚性愈伤组织，获得转基因植株的方法是成功、有效的，转基因胚状体和转基因植株中该基因的表达量都有显著提高。这为用基因工程方法对橡胶树进行遗传改良、提高产量打下了良好基础。
虽然，上文中已经用一般性说明及具体实施方案对本发明作了详尽的描述，但在本发明基础上，可以对之作一些修改或改进，这对本领域技术人员而言是显而易见的。因此，在不偏离本发明精神的基础上所做的这些修改或改进，均属于本发明要求保护的范围。

Claims (1)

1.一种用乳管特异性启动子获得橡胶树转基因植株的方法，其特征在于包括天然橡胶生物合成关键限速酶基因HbHMGR1克隆，橡胶树乳管特异性强启动子PHEV2.1的克隆，构建HbHMGR1基因的乳管特异性植物表达载体pCAMBIA2301-PHEV2.1-HbHMGR1，橡胶树易碎胚性愈伤组织的培养，橡胶树继代易碎胚性愈伤组织遗传转化，获得胚状体和再生植株，组织化学检测和分子检测，转基因胚状体、转基因植株和对照材料的荧光定量PCR检测；
所述的橡胶树乳管特异性启动子PHEV2.1的克隆是根据HEV2.1基因序列(NCBI登录号：AY247789.1)，截取起始密码子前的1830bp碱基序列，用Primer5.0设计一对特异性引物PHF1和PHR1，上游引物为PHF1：5’-CCCAAGCTTCTTGTTTGCACATGATGCGTTCAGGTGACC-3’，下游引物为PHR1：5’-TTCCAATGCATTGGCTGCAGAACTCTTCCCATTTCTTCCC-3’，下划线部分为在引物两端引入的酶切位点HindIII和PstI酶切位点；提取橡胶树优良品种叶片基因组DNA为模板，以PHF1和PHR1为引物进行PCR扩增，扩增产物经琼脂糖凝胶电泳、回收、加尾“A”后，克隆到pMD19-T vecor上，转化大肠杆菌Trans5α，经12～16h的培养后，挑取单菌落进行菌液PCR，选取PCR检测为阳性的菌落送往测序公司进行测序；测序结果用NCBI网上的BLASTN工具进行序列同源性分析；
所述的构建HbHMGR1基因的乳管特异性植物表达载体pCAMBIA2301-PHEV2.1-HbHMGR1是先利用XbaI和XmaⅠ分别对pCAMBIA3301和pCAMBIA2301-HbHMGR1进行双酶切，酶切产物经1.0％的琼脂糖凝胶电泳后，分别切胶回收pCAMBIA3301的大片段和pCAMBIA2301-HbHMGR1的小片段(HbHMGR1基因)，将两片段用T4DNA连接酶连接，转化大肠杆菌Trans5α，过夜培养后挑取单菌落进行菌落PCR检测，提取阳性重组质粒pCAMBIA3301-HbHMGR1；再用HindIII和PstI分别对pCAMBIA3301-HbHMGR1和pMD19-T-PHEV2.1进行双酶切，电泳结束后，分别对pCAMBIA3301-HbHMGR1的大片段和pMD19-T-PHEV2.1的小片段(PHEV2.1)进行切胶回收，回收产物用T4DNA连接酶连接过夜，转化大肠杆菌，过夜培养后挑取单菌落进行菌液PCR，提取阳性重组质粒，并用HindⅢ、PstⅠ和XmaⅠ对其进行酶切鉴定，确认得到的阳性重组质粒为pCAMBIA3301-PHEV2.1-HbHMGR1；最后用HindⅢ和XmaⅠ将PHEV2.1-HbHMGR1重组片段从pCAMBIA3301-PHEV2.1-HbHMGR1上切下，将其连接到pCAMBIA2301-MCS的HindⅢ和XmaⅠ间，得到植物表达载体pCAMBIA2301-PHEV2.1-HbHMGR1，转化大肠杆菌，挑取单菌落进行菌落PCR，提取阳性重组质粒，用HindⅢ和XmaⅠ进行酶切鉴定，确认HbHMGR1乳管特异性植物表达载体构建成功。
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