CN104178502A - 梨己糖激酶基因PbHXK1及其应用 - Google Patents

Abstract

本发明公开了梨己糖激酶基因PbHXK1及其应用。该基因的核苷酸序列如序列表SEQ ID NO.1所示，其对应的氨基酸序列如序列表SEQ ID NO.2所示。将本发明所述的基因PbHXK1导入到番茄进行功能验证，以野生型番茄植株为对照，获得的转基因番茄植株的PbHXK1基因表达量和己糖激酶活性明显升高，而植株生长受到明显的抑制、可溶性糖含量显著降低，表明本发明所克隆的PbHXK1基因是编码己糖激酶的功能结构基因，具有磷酸化己糖的功能，在果实的糖积累过程中起着负调控的作用，同时还参与调控植株的生长发育。

Description

梨己糖激酶基因PbHXK1及其应用

技术领域

本发明属于植物基因工程领域。具体涉及梨己糖激酶基因PbHXK1及其应用。

背景技术

梨是世界上主栽的果树树种之一。梨果实的品质决定了商品价值，而果实可溶性糖是构成果实品质的一个重要经济性状，糖代谢调控可直接影响糖的含量及组成。果糖的甜度是葡萄糖的2倍，是蔗糖的1.8倍，己糖的磷酸化作用与蔗糖、己糖含量密切相关，因而，己糖代谢是糖代谢的一个重要组成部分。因此，筛选梨果实己糖代谢过程中的关键基因资源，有助于了解植物己糖激酶参与的糖代谢分子生理机制及糖信号转导耦合激素信号转导调控植株生长发育的过程，为利用基因工程的手段改善果实品质的研究提供新的基因资源。

蔗糖可以转化为贮藏物质，也可以在蔗糖合酶(Sucrose Synthase)或转化酶(Invertase)的作用下水解为果糖和葡萄糖，果糖和葡萄糖经己糖激酶磷酸化，生成果糖-6-磷酸和葡萄糖-6-磷酸，可作为中间代谢产物参与糖酵解途径、磷酸戊糖途径以及淀粉的合成，为生命活动提供能量和中间代谢产物，也可作为糖信号受体，参与调控植物的生长发育。Dai等(1999)在番茄中过量表达拟南芥AtHXK1基因，转AtHXK1基因番茄植株生长受到抑制的程度与AtHXK1基因的表达水平及AtHXK1的催化活性密切相关，即与AtHXK1基因的拷贝数有关。嫁接实验表明，当AtHXK1基因在光合组织中表达时，植株的生长受到抑制。AtHXK1催化活性的增加伴随着叶片叶绿素含量减少、光合速率下降以及光系统Ⅱ反应中心的电子传递效率减低。此外，转基因植株的果实质量、幼果中淀粉含量和成熟果实可溶性糖含量也低于对照。Veramendi等(1999)在马铃薯中分别正义和反义表达马铃薯StHK1基因，结果发现正义表达StHK1基因提高了转基因马铃薯植株叶片和块茎中己糖激酶的催化活性，反义表达抑制了转基因马铃薯植株叶片和块茎中己糖激酶的磷酸化作用，增加了转基因马铃薯植株叶片的淀粉含量，而正义和反义表达转基因马铃薯植株块茎的产量、淀粉含量、糖含量以及代谢水平无显著差异。而Jang等(1997)在拟南芥中过量表达AtHXK1发现，转基因植株中光合相关基因的表达减少、下胚轴伸长被抑制、子叶变黄。分子遗传学、细胞学及生化分析表明拟南芥AtHXK1介导的葡萄糖信号转导与乙稀、脱落酸等多种激素的信号转导密切相关(Cho etal，2010；Karve et al，2012)。Sarowar等(2008)用甲基紫精和病原菌对超表达拟南芥HXK1和HXK2基因的拟南芥转基因株系进行处理的研究表明，己糖激酶可提高植物对非生物和生物胁迫的抗性。此外，HXK还可调控细胞程序性死亡(Kim et al，2006)、种子发育(Troncoso-Ponce et al，2011)、淀粉含量(Giese et al，2005)及花粉萌发(Xu et al，2008)。因此，植物HXK除了具有磷酸化己糖的酶学功能和参与糖信号转导功能，可能还协同营养及激素信号网络共同调控植物的生长发育。

根据N端氨基酸序列，植物HXK主要分为2种类型：A型和B型(Olsson et al，2003)。A型HXK包含1个叶绿体运输信号肽，约30个氨基酸，B型HXK的N端共有1个疏水膜锚定结构域，约24个氨基酸，可能与膜有关。目前已经克隆研究的植物HXK基因有：小立豌藓PpHXK1、PpHXK2(Olsson et al，2003)，番茄LeHXK1、LeHXK2、LeHXK3和LeHXK4(Dai et al，2002；Menu et al，2001；Kandel-Kfir et al，2006)，向日葵HaHXK1(Troncoso-Ponce et al，2011)，马铃薯StHK1、ScHK2(Veramendi et al，1999；Claeyssen et al，2006)，菠菜SoHXK1(Wiese et al，1999)，水稻OsHXK1、OsHXK2、OsHXK3、OsHXK4、OsHXK5、OsHXK6、OsHXK7、OsHXK8、OsHXK9、OsHXK10(Choet al，2006)，烟草NtHXK1、NtHXK1a、NtHXK2、NtHXK3、NtHXK4a、NtHXK4b、NtHXK5、NtHXK6、NtHXK7(Kim et al，2013)，拟南芥AtHXK1、AtHXK2、AtHXK3(Gonzali et al，2002；Karve et al，2008)。未见梨己糖激酶基因相关的研究报道，本发明克隆梨果实己糖激酶基因PbHXK1，对了解果实糖代谢调控的分子生理机制及品质育种研究具有重要的意义。

发明内容

本发明的目的在于提供了一种从梨(Pyrus bretschneideri)中分离克隆的具有催化己糖磷酸化功能的基因。

本发明的另一目的是提供该基因的应用。

为了实现以上目的，本发明采用的技术方案如下：

申请人从梨(Pyrus bretschneideri)中分离克隆得到一个新基因PbHXK1，其核苷酸序列如序列表SEQ ID NO.1所示，包含1497bp的开放阅读框，146-1642bp的核苷酸序列为该基因的编码区；该基因编码498个氨基酸，氨基酸序列如序列表SEQ IDNO.2所示，等电点为5.89，分子量为53.9kDa。

申请人设计了两对引物，利用巢式PCR技术克隆得到上述基因PbHXK1的cDNA全长序列。

第一轮普通PCR引物对的核苷酸序列如下所示：

正向引物PbHXK1-F1：5’-CGTATCCCTCCCCGAAAGTCC-3’，如序列表SEQ ID NO.3所示；

反向引物PbHXK1-R1：5’-CGAAGGAAATAGTGAGAAGATAGGGT-3’，如序列表SEQ IDNO.4所示；

第二轮巢式PCR引物对的核苷酸序列如下：

正向引物PbHXK1-F2：5’-CTCACTACCCAAACTTTCTCACTCAT-3’，如序列表SEQ IDNO.5所示；

反向引物PbHXK1-R2：5’-CACTTCATTCATCTACCTGGTCTTG-3’，如序列表SEQ ID NO.6所示。

利用qRT-PCR技术分析了在不同梨品种的果实发育过程中PbHXK1基因的表达模式，并对PbHXK1相对表达量和己糖激酶活性进行了相关性分析，相关性分析结果表明PbHXK1相对表达量与己糖激酶活性成显著的正相关，表明本发明克隆的梨PbHXK1基因是己糖激酶候选基因。

含有所述的基因PbHXK1的重组表达载体。

所述的重组表达载体优选将所述的基因PbHXK1插入到pCAMBIA1301的NcoΙ和BstE II位点之间得到，该重组表达载体命名为‘PbHXK1-pCAMBIA1301。

含有权利要求1所述的基因PbHXK1的基因工程菌。

所述的基因PbHXK1在调节植株生长和可溶性糖含量中的应用。

所述的应用，构建所述梨己糖激酶基因PbHXK1的植物超表达载体并转化番茄，以野生型番茄植株为对照，获得的转基因番茄植株的PbHXK1基因表达量和己糖激酶活性明显升高，而植株生长受到明显的抑制、可溶性糖含量显著降低。

所述的应用，抑制所述的基因PbHXK1的表达，可促进植株生长、可溶性糖含量提高。

有益效果：本发明构建梨PbHXK1基因的植物超表达载体，利用农杆菌介导的遗传转化方法将梨PbHXK1基因转化番茄，获得的转基因植株经生物学功能分析，表明本发明克隆的PbHXK1基因具有磷酸化己糖的功能，在果实的糖积累过程中具有负调控的作用，同时还参与调控植株的生长发育。

附图说明

图1为本发明克隆的梨PbHXK1基因的琼脂糖凝胶电泳图。M：Marker；H：本发明克隆的梨PbHXK1基因。

图2为本发明克隆的梨PbHXK1基因编码蛋白的系统进化树。Nt：烟草；So：菠菜；Nb：烟草；Le：番茄；Sc：马铃薯；Pb：梨；Ha：向日葵；At：拟南芥；Os：水稻；Pp：小立豌藓；PbHXK1为本发明克隆的梨PbHXK1基因编码的蛋白。

图3为本发明克隆的梨PbHXK1基因编码蛋白PbHXK1与番茄LeHXK3(NP_001234710.1)、拟南芥AtHXK1(AAB49908.1)、AtHXK2(AAB49911.1)、向日葵HaHXK1(ABI18156.1)的氨基酸序列比对结果。PbHXK1包含4个己糖激酶特征保守结构域(a、b、c、d均用方框标出)，其中a和c为磷酸化作用位点，b为底物结合位点，d为ATP结合位点。

图4为本发明克隆的梨PbHXK1基因在不同梨品种果实发育过程中的qRT-PCR分析。(a)：‘鸭梨’(Pyrus bretschneideri Rehd.cv.Yali)；(b)：‘爱甘水’(Pyruspyrifolia Nakai.cv.Aikansui)。以‘鸭梨’和‘爱甘水’为试材，盛花后10d开始采集果实样品，每20d采一次样，果肉样品用液氮处理，-80℃保存。对不同发育时期梨果实的PbHXK1基因相对表达量进行了多重比较(P≤0.01)；*表示盛花后70d的‘爱甘水’果实的PbHXK1基因表达量显著低于盛花后30d的(P≤0.05)。

图5为不同梨品种果实发育过程中的己糖激酶活性。(a)：‘鸭梨’；(b)：‘爱甘水’。以‘鸭梨’和‘爱甘水’为试材，盛花后10d开始采集果实样品，每20d采一次样，果肉样品用液氮处理，-80℃保存。对不同发育时期梨果实的己糖激酶活性进行了多重比较(P≤0.05)。37℃，每毫克蛋白1min增加的A₃₄₀定义为1个酶活单位，即1U＝ΔA₃₄₀min^-1·mg^-1protein。

图6为本发明克隆的梨PbHXK1基因的植物超表达载体构建流程图。

图7为本发明克隆的梨PbHXK1基因在番茄植株不同组织中的相对表达量。(a)：番茄叶片；(b)：番茄幼嫩果实；(c)番茄成熟果实。WT：野生型番茄植株；#93、#95、#98：阳性转PbHXK1基因番茄株系。**表示转PbHXK1基因株系与野生对照的差异达极显著水平(P≤0.01)；*表示转PbHXK1基因株系与野生对照的差异达显著水平(P≤0.05)。

图8为本发明克隆的梨PbHXK1基因在番茄植株中过量表达对植株生长的影响。WT：野生型番茄植株；#93、#95、#98：阳性转PbHXK1基因番茄株系。

图9为本发明克隆的梨PbHXK1基因在番茄植株过量表达对己糖激酶活性的影响。(a)：番茄叶片；(b)：番茄幼嫩果实；(c)番茄成熟果实。WT：野生型番茄植株；#93、#95、#98：阳性转PbHXK1基因番茄株系。**表示转PbHXK1基因株系与野生对照的差异达极显著水平(P≤0.01)；*表示转PbHXK1基因株系与野生对照的差异达显著水平(P≤0.05)；ns表示转PbHXK1基因株系与野生对照的差异不显著(P>0.05)。37℃，每克鲜样1min A340增加0.001定义为1个酶活单位，即1U＝0.001ΔA₃₄₀min^-1·g^-1FW。

图10为本发明克隆的梨PbHXK1基因在番茄植株中过量表达对可溶性糖含量的影响。(a)：蔗糖含量(mg·g^-1FW)；(b)：葡萄糖含量(mg·g^-1FW)；(c)：果糖含量(mg·g^-1FW)。**表示转PbHXK1基因株系与野生对照的差异达极显著水平(P≤0.01)；*表示转PbHXK1基因株系与野生对照的差异达显著水平(P≤0.05)。

具体实施方式

以下结合具体实施例对本发明做出详细的描述。根据以下描述和实施例，本领域技术人员可以确定本发明的基本特征，并且在不偏离本发明精神和范围的情况下，可以对本发明做出各种改变和修改，以使其适用各种用途和条件。

实施例1，梨PbHXK1基因的克隆

以盛花后50d的‘鸭梨’果肉为试材，提取总RNA并反转录，所得的第一链cDNA用于扩增PbHXK1基因。利用CTAB法(CTAB提取缓冲液包括2％CTAB、2％PVP K-30、0.05％亚精胺、10mM Tris·HCl(pH＝8.0)、25mM EDTA、2M NaCl)提取总RNA，取1μg RNA样品，经1U DNase I(购自Fermentas公司)37℃孵育30min后，加入1μLEDTA(25mM)65℃孵育10min。第一链cDNA的合成用TOYOBO反转录试剂盒(购自TakaRa公司，按照试剂盒说明书操作。)

利用巢式PCR技术扩增得到PbHXK1基因的cDNA全长序列，扩增PbHXK1基因的第一轮普通PCR引物对的核苷酸序列如下所示：

正向引物PbHXK1-F1：5’-CGTATCCCTCCCCGAAAGTCC-3’(对应SEQ ID NO.3)，

反向引物PbHXK1-R1：5’-CGAAGGAAATAGTGAGAAGATAGGGT-3’(对应SEQ ID NO.4)。

25μL PCR反应体系包括：1×PCR缓冲液(购自TakaRa公司)，2.5mM MgCl₂(购自TakaRa公司)，0.25mM dNTPs(购自TakaRa公司)，0.32μM正向引物PbHXK1-F1，0.32μM反向引物PbHXK1-R1，100ng cDNA，1U Taq DNA聚合酶(购自TakaRa公司)。第一轮普通PCR反应程序为：94℃预变性3min；94℃变性30s，58℃退火40s，72℃延伸3min，35个循环；循环完成后72℃延伸10min。

扩增PbHXK1基因的第二轮巢式PCR引物对的核苷酸序列如下所示：

正向引物PbHXK1-F2：5’-CTCACTACCCAAACTTTCTCACTCAT-3’(SEQ ID NO.5)，

反向引物PbHXK1-R2：5’-CACTTCATTCATCTACCTGGTCTTG-3’(SEQ ID NO.6)。

25μL PCR反应体系包括：1×PCR缓冲液(购自TakaRa公司)，2.5mM MgCl₂(购自TakaRa公司)，0.25mM dNTPs(购自TakaRa公司)，0.32μM正向引物PbHXK1-F2，0.32μM反向引物PbHXK1-R2，1μL第一轮普通PCR的产物，1U Taq DNA聚合酶(购自TakaRa公司)。第二轮巢式PCR反应程序为：94℃预变性3min；94℃变性30s，56℃退火40s，72℃延伸3min，35个循环；循环完成后72℃延伸10min。

第二轮巢式PCR结束后，PCR产物经1％琼脂糖凝胶电泳后，产生一条单一的目的条带(图1)，用DNA凝胶回收试剂盒(购自Omega公司)回收，回收步骤参照使用说明书。回收纯化的PCR产物与pMD19-T Vector(购自TakaRa公司)进行连接反应，连接反应体系包括：4.5μL回收纯化的PCR产物，0.5μL pMD19-T Vector和5.0μL Solution I(购自TakaRa公司)。16℃连接5h。取10μL连接产物，采用热击法转化大肠杆菌DH5α，在含有100mg·L^-1氨苄青霉素的固体LB平板中筛选阳性克隆，挑取5个阳性克隆测序(由英潍捷基公司完成)，测序结果表明，本发明扩增的目的片段长度为1673bp，其核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示，通过序列比对分析，确定该序列是本发明需要的目的基因，将这个基因命名为PbHXK1。

PbHXK1基因包括1497bp的开放阅读框，编码498个氨基酸，等电点为5.89，分子量为53.9kDa。构建了22个植物HXK基因编码蛋白的系统进化树(图2)，分析结果表明PbHXK1属于B型植物己糖激酶，分析预测PbHXK1可能定位在线粒体。氨基酸序列比对结果显示PbHXK1基因编码的蛋白包含4个植物己糖激酶特征的保守结构域(图3)，具体包含2个磷酸化作用位点、1个ATP结合位点和1个底物结合位点，这些结构域是植物己糖激酶生物学功能所必需的，在已研究报道的己糖激酶中高度保守。

实施例2，梨果实发育过程中PbHXK1基因表达量和己糖激酶活性的相关性分析

1、梨PbHXK1基因在梨果实发育过程中的qRT-PCR分析

梨果肉总RNA的提取、cDNA合成的方法同实施例1。用梨tubulin(AB239681)作为内对照，引物的核苷酸序列如下：

正向引物PbHXK1-F3：5’-TGGGCTTTGCTCCTCTTAC-3’，

反向引物PbHXK1-R3：5’-CCTTCGTGCTCATCTTACC-3’(。

利用Primer Premier 5.0在PbHXK1基因的开放阅读框内设计基因特异的qRT-PCR引物对，引物的核苷酸序列如下：

正向引物PbHXK1-F4：5’-TCCTTGAGTTTGCTCCCGAC-3’，

反向引物PbHXK1-R4：5’-TGGAGTGGGGTAACTTTCGC-3’。

qRT-PCR采用SYBR Green试剂盒(购自TaKaRa公司，按照试剂盒说明书操作)。20μL qRT-PCR反应体系包括：10μL 2×SYBR Premix ExTaq，0.4μL正向引物，0.4μL反向引物，1μL cDNA，8.2μL无菌双蒸水。使用96孔qRT-PCR板(购自Roche公司)，运用qRT-PCR仪(型号：LightCycler 480，Roche公司)进行PCR。qRT-PCR反应程序为：95℃预变性10min；95℃变性15s，60℃退火15s，72℃延伸20s，40个循环。每个cDNA样品重复3次，计算出每个cDNA样品的平均Ct值，通过计算2^-ΔΔCt得出PbHXK1基因的相对表达量。

2、梨果实发育过程中己糖激酶的活性变化

取梨果肉样品于预冷的研钵中，加液氮充分研磨成粉末，称取0.500g于2mL离心管，加入1mL预冷的提取缓冲液(缓冲液组成为：200mM磷酸钾，1mM EDTA，10mM抗坏血酸钠，1mM DTT，0.1％Tween-20，5％PVPP，1mM MgCl₂，2mM PMSF，pH＝7.8)，充分混匀，冰浴提取。4℃、10000rpm离心15min，上清液即为粗酶液，用于酶活分析。己糖激酶活性的测定采用己糖激酶(HK)测试盒(南京建成生物工程研究所)，按说明书进行操作，用核酸蛋白检测仪(型号：M200，瑞士TECAN公司)测定340nm处的吸光值。

测定了不同梨品种果实发育过程中果实的己糖激酶活性(图5)，并利用qRT-PCR技术分析了梨果实中PbHXK1基因的相对表达量(图4)。相关性分析结果表明PbHXK1基因的相对表达量与己糖激酶活性成显著的正相关(表1)，表明本发明克隆的梨PbHXK1基因是一种己糖激酶候选基因。

表1梨果实发育过程中PbHXK1基因的相对表达量与己糖激酶活性的相关性分析

*表示相关性达显著性水平(P≤0.05)

实施例3，构建梨PbHXK1基因的植物超表达载体

对pCAMBIA1301载体的多克隆位点和梨PbHXK1基因的核苷酸序列进行了分析，在引物PbHXK1-F2和PbHXK1-R2的5’端分别加上酶切位点NcoΙ和BstE II，即得到相应的引物PbHXK1-F5和PbHXK1-R5，其核苷酸序列如下所示：

正向引物PbHXK1-F5：5’-CATGCCATGGCTCACTACCCAAACTTTCTCACTCAT-3’(SEQ IDNO.11)，

反向引物PbHXK1-R5：5’-CGGGTAACCCACTTCATTCATCTACCTGGTCTTG-3’(SEQ IDNO.12)。

用含有100mg·L^-1氨苄青霉素的液体LB培养基悬浮培养成功转化‘PbHXK1-pMD19-T’重组质粒的大肠杆菌DH5α，37℃、220rpm培养12h。提取‘PbHXK1-pMD19-T’重组质粒作为模板进行PCR，25μL PCR反应体系包括：1×LA PCRBuffer II(Mg²⁺free)(购自TakaRa公司)，2.5mM MgCl₂，0.4mM dNTPs，0.4μM正向引物PbHXK1-F5，0.4μM反向引物PbHXK1-R5，100ng重组质粒，1.25U TakaRa LATaq聚合酶(购自TakaRa公司)。PCR反应程序为：94℃预变性5min；94℃变性30s，60℃退火40s，72℃延伸3min，35个循环；循环完成后72℃延伸10min。目的片段的回收纯化、与pMD19-T Vector的连接、阳性克隆的获得与测序，均同实施例1。测序正确的结果包括上游酶切位点NcoΙ、PbHXK1基因和下游酶切位点BstE II。

分别提取‘NcoΙ-PbHXK1-BstE II-pMD19-T’重组质粒和pCAMBIA1301的质粒进行双酶切。40μL双酶切体系包括：质粒8μL，10×K缓冲液(购自TakaRa公司)4μL，0.1％BSA 4μL，NcoΙ和BstPΙ(BstE II的同工酶)各2μL，无菌双蒸水20μL。37℃酶切过夜后分别纯化回收PbHXK1基因和pCAMBIA1301载体。连接反应体系包括：pCAMBIA1301载体2μL，PbHXK1基因6μL，10×T4DNA连接缓冲液(购自TakaRa公司)1μL，T4DNA连接酶(购自TakaRa公司)1μL。16℃孵育12h。取10μL连接产物，采用热击法转化大肠杆菌DH5α，在含有50mg·L^-1卡那霉素的固体LB平板中筛选阳性克隆，进行测序(由英潍捷基公司完成)。测序正确的结果包括上游酶切位点NcoΙ、PbHXK1基因和下游酶切位点BstE II，且无核苷酸变异。同时提取‘NcoΙ-PbHXK1-BstE II-pCAMBIA1301’重组载体进行双酶切验证，双酶切体系同上。获得含有插入PbHXK1基因的重组载体，将其命名为‘PbHXK1-pCAMBIA1301’重组载体，应用冻融法将重组载体‘PbHXK1-pCAMBIA1301’导入到农杆菌GV3101中。植物超表达载体‘PbHXK1-pCAMBIA1301’的构建流程如图6所示。

实施例4，番茄的遗传转化

1.根癌农杆菌介导的番茄遗传转化方法参照王保全(2006)，具体操作步骤如下：

(1)番茄种子的消毒灭菌：先用70％乙醇处理番茄种子30s，然后用无菌水洗涤3遍，再用2.5％次氯酸钠处理5min，最后用无菌水洗涤4遍。将种子接种至萌发培养基M1(表2)上，25℃培养，首先在暗条件下培养3d，然后移至光照强度为2000-3000lux、昼夜比为16/8h的光周期条件下培养4-5d。

(2)番茄外植体的培养：取播种7-8d的番茄无菌苗，在超净工作台上用无菌的手术刀将番茄子叶切成0.5cm²的小块，置于培养基M2(表2)上25℃培养1d，光照强度为2000-3000lux，光周期昼夜比为16/8h。

(3)根癌农杆菌的培养：取超低温冰箱中保存的根癌农杆菌(含有‘PbHXK1-pCAMBIA1301’重组载体)，在含有50mg·L^-1卡那霉素和20mg·L^-1利福平的固体LB培养基划线培养，28℃培养2d，挑取单菌落至1mL含有同样抗生素的液体LB培养基中，28℃、180rpm培养过夜，取50μL菌液至50mL LB液体培养基中，28℃、180rpm培养至OD₆₀₀＝0.5。

(3)侵染转化：取事先培养好的根癌农杆菌，转至50mL离心管，3800rpm离心7min，然后用MS液体培养基重悬沉淀，将重悬根癌农杆菌菌液转至无菌锥形瓶，将经过预培养1d的番茄外植体浸入重悬根癌农杆菌菌液中5min，侵染期间每30s振荡一下。用无菌滤纸吸干外植体表面多余的菌液，将其置于培养基M2(表2)上25℃暗培养2d。

(5)潮霉素筛选抗性芽：经暗培养2d的番茄子叶外植体，将其继代于筛选培养基M3(表2)上进行潮霉素抗性筛选，待番茄子叶外植体长出有效愈伤组织，将其继代于筛选培养基M4(表2)上进行潮霉素抗性不定芽的诱导。

(6)生根诱导与移栽：待抗性芽伸长至1.5cm左右且有明显的节间，切取抗性芽扦插于培养基M5(表2)中诱导生根。从生根培养基中取出根系生长良好的番茄再生植株，用自来水将其根系冲洗干净，置于灭菌的蛭石中遮荫保湿炼苗，25℃光照培养箱中培养7-10d。抗性植株适应外部环境后，将其转移至营养土中，25℃自然光照生长。

表2番茄遗传转化体系所用的培养基

2.阳性转PbHXK1基因番茄苗的初步鉴定

按照实施例4的方法得到番茄再生植株，按如下步骤提取番茄叶片总DNA：取适量的番茄叶片于1.5mL离心管，加液氮充分研磨；加入700μL 65℃预热的DNA提取缓冲液[提取缓冲液组成为：100mM Tris·HCl(pH＝8.0)，1.5M NaCl，50mM EDTA(pH＝8.0)，1％聚乙烯吡咯烷酮，2％十六烷基三乙基溴化铵，4％(体积)β-巯基乙醇]，65℃水浴90min，每15min上下轻轻颠倒混匀；10000rpm离心10min，取上清，加600μL氯仿：异戊醇(24:1)，轻轻颠倒5min后静置3min；10000rpm离心15min，取上清450μL，加入900μL预冷的无水乙醇和34μL 5M NaCl，轻轻颠倒混匀后，-20℃放置30min；10000rpm离心10min；弃上清，用1mL 75％乙醇洗涤沉淀2次，无菌风吹干，加20μL无菌双蒸水溶解。

阳性植株鉴定步骤如下：用第二轮巢式PCR引物对(PbHXK1-F2和PbHXK1-R2)对上述提取的DNA进行PCR扩增鉴定阳性苗，以水空白和未做侵染转化的番茄叶片DNA作为对照。引物序列、PCR反应程序和反应体系分别如表3、表4和表5所示。水空白和和未做侵染转化的番茄叶片DNA不能扩增出目的条带，能扩增出目的条带的再生番茄植株被初步鉴定为阳性转基因番茄株系。

表3引物序列信息

表4PCR反应程序

表5PCR反应体系

实施例5，梨PbHXK1基因在转基因番茄植株中的超表达分析

梨PbHXK1基因在转基因番茄植株中的表达利用qRT-PCR技术进行了分析，qRT-PCR分析同实施例2，转PbHXK1基因番茄植株叶片、幼嫩果实和成熟果实的RNA提取与cDNA合成的方法同实施例1。利用Primer Premier 5.0在PbHXK1基因的开放阅读框内设计基因特异的qRT-PCR引物对，引物的核苷酸序列如下所示：

正向引物PbHXK1-F4：5’-TCCTTGAGTTTGCTCCCGAC-3’，

反向引物PbHXK1-R4：5’-TGGAGTGGGGTAACTTTCGC-3’。

用番茄actin(FJ532351)作内对照，引物的核苷酸序列如下所示：

正向引物Le-F1：CGGCAAAGCATAACCCTCGT，

反向引物Le-R2：TCAGGCTGTGCTTTCCTTGT。

qRT-PCR分析结果表明，与野生型番茄植株相比，转PbHXK1基因番茄植株叶片、幼嫩果实和成熟果实中PbHXK1基因的表达量均显著升高(图7)。3个阳性转PbHXK1基因番茄株系(#93、#95和#98)用于进一步的生理研究。

实施例6，转PbHXK1基因番茄植株的生理鉴定

1.梨PbHXK1基因在番茄植株中过量表达对植株生长的影响

与野生型番茄植株相比，转PbHXK1基因番茄植株的生长受到明显的抑制，主要表现为节间缩短、植株变矮以及叶面积减小(图8)，表明本研究克隆的梨PbHXK1基因可能参与调控植株的生长发育。

2.梨PbHXK1基因在番茄植株中过量表达对己糖激酶活性的影响

己糖激酶具有磷酸化葡萄糖、果糖等己糖的酶学功能，通过比较转PbHXK1基因番茄植株和野生对照不同组织中己糖激酶的活性，可对梨PbHXK1基因的功能进行分析。以野生型番茄植株为对照，测定了过量表达梨PbHXK1基因的转基因番茄植株叶片、幼嫩果实和成熟果实的己糖激酶活性(图9)。己糖激酶的提取与活性测定同实施例2。分析结果表明，幼嫩果实的己糖激酶活性明显高于成熟果实，与幼嫩果实的新陈代谢旺盛密切相关。在相同的组织中，3个转PbHXK1基因番茄株系的己糖激酶活性均明显高于野生对照，与梨PbHXK1基因在转基因番茄植株中过量表达密切相关。

3.梨PbHXK1基因在番茄植株中过量表达对可溶性糖含量的影响

己糖激酶具有磷酸化己糖的功能，是己糖代谢关键酶，与可溶性糖的代谢水平密切相关。因此，测定转PbHXK1基因番茄植株的可溶性糖含量可进一步研究本发明克隆的梨PbHXK1基因的功能。以野生型番茄植株为对照，测定了转PbHXK1基因番茄植株叶片、幼嫩果实和成熟果实的可溶性糖含量(图10)。

可溶性糖的提取步骤如下：准确称取2.0g组织样品于预冷的研钵，加入6mL 80％乙醇，充分研磨匀浆后转入10mL离心管，37℃水浴30min，超声波15min，12000rpm离心15min，上清液转入25mL容量瓶中，重复提取3次，合并上清液并定容。取2mL提取液，用旋转蒸发器(型号：RE-3000，上海亚荣生化仪器厂)蒸干，然后用1mL无菌双蒸水溶解，最后用0.45μm的水系滤器过滤，滤液即用于测定可溶性糖的含量。可溶性糖含量的测定采用高效液相色谱法(HPLC)，高效液相色谱仪为Waters1525系统，采用碳水化合物柱(Transgenomic COREGET-87C；7.8×300mm，5μm)，外加保护柱(Transgenomic CARB Sep Coregel 87C cartridge)，检测器为Waters2414示差检测器，参比池温度为35℃，柱温为85℃，流速为1.0mL·min^-1，流动相为脱气后的超纯水(18.2MΩ·cm)，进样量为5μL。根据样品峰面积和各碳水化合物的标准曲线计算其含量。分析结果表明，与野生型番茄植株为对照，无论是叶片、幼嫩果实还是成熟果实，3个转PbHXK1基因番茄株系的蔗糖、葡萄糖和果糖含量均显著降低，其中，叶片的葡萄糖含量极低，几乎无葡萄糖积累。

4、综合分析表明，将梨PbHXK1基因转化番茄，使其在番茄植株中过量表达，以野生型番茄植株为对照，转PbHXK1基因番茄株系的PbHXK1基因表达量和己糖激酶活性明显升高，而植株的生长受到明显的抑制、可溶性糖含量显著降低，表明梨PbHXK1基因是编码己糖激酶的功能结构基因，具有磷酸化己糖的作用，在果实糖积累过程中起着负调控的作用，可能还参与调控植株的生长发育。

Claims (9)

1.一种分离自梨的具有催化己糖磷酸化功能的基因PbHXK1，其核苷酸序列如序列表SEQ ID NO.1所示，cDNA全长序列为1673bp，包含1497bp的开放阅读框。

2.权利要求1所述的基因PbHXK1编码的蛋白，其氨基酸序列如序列表SEQ IDNO.2所示，编码498个氨基酸，等电点为5.89，分子量为53.9kDa。

3.一种克隆权利要求1或2所述基因cDNA序列的两对引物，第一轮普通PCR引物对的核苷酸序列如下所示：

正向引物PbHXK1-F1：如SEQ ID NO.3所示；

反向引物PbHXK1-R1：如SEQ ID NO.4所示；

第二轮巢式PCR引物对的核苷酸序列如下：

正向引物PbHXK1-F2：如SEQ ID NO.5所示；

反向引物PbHXK1-R2：如SEQ ID NO.6所示。

4.含有权利要求1所述的基因PbHXK1的重组表达载体。

5.根据权利要求4所述的重组表达载体，其特征在于将所述的基因PbHXK1插入到pCAMBIA1301的NcoΙ和BstE II位点之间得到重组表达载体‘PbHXK1-pCAMBIA1301。

6.含有权利要求1所述的基因PbHXK1的基因工程菌。

7.权利要求1所述的基因PbHXK1在调节植株生长和可溶性糖含量中的应用。

8.根据权利要求7所述的应用，其特征在于，构建所述梨己糖激酶基因PbHXK1的植物超表达载体并转化番茄，以野生型番茄植株为对照，获得的转基因番茄植株的PbHXK1基因表达量和己糖激酶活性明显升高，而植株生长受到明显的抑制、可溶性糖含量显著降低。

9.根据权利要求7所述的应用，其特征在于抑制权利要求1所述的基因的表达，可促进植株生长、可溶性糖含量提高。