CN105400783B - 莲藕淀粉合成相关酶基因hxk功能分子标记引物及应用 - Google Patents

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Abstract

本发明公开了一种莲藕淀粉合成相关酶基因HXK功能分子标记引物及应用，属于生物技术领域。本发明发现的莲藕淀粉合成相关酶基因HXK功能分子标记的序列如SEQ ID NO.1所示，针对该分子标记开发的引物为HXKF1：TCTAAATCCCAATCCGTCC，HXKR1：GCACGAACTCTTGGCAATC。使用该引物进行PCR扩增，根据有无目的条带来鉴定莲藕淀粉含量的高低。本发明的应用包括鉴定不同淀粉含量的莲藕品系，莲藕的育种筛选。本发明所用引物少、且效率高，可以加快育种速度、降低育种成本；并具有操作简单、成本低廉、周期短的优点，适于推广应用。

Description

莲藕淀粉合成相关酶基因HXK功能分子标记引物及应用
技术领域
本发明属于生物技术领域，具体涉及莲藕淀粉合成相关酶基因HXK(己糖激酶，HXKase)功能分子标记引物及应用。
背景技术
莲藕是多年生水生草本植物，是具有许多单子叶植物特征的最古老的双子叶植物之一，中国是原产地之一，在中国南方普遍种植。莲产品包括鲜藕、藕粉、藕带和莲籽，是公认的滋补食品，含丰富的淀粉、蛋白质、多种维生素和矿物质，是特色蔬菜和副食佳品，具有很高的营养保健功能，深受消费者喜爱。随着中国加入WTO，莲藕加工产品盐渍藕、水煮藕及藕粉等远销日本、韩国及欧、美等国家和地区，莲藕已成为中国重要的出口创汇特色蔬菜之一。
不同的莲藕产品对莲藕品质的要求不一样，藕莲按淀粉含量和种类可以分为粉藕和脆藕两类不同质地的品种，粉藕品种的藕身硬度、纤维素含量、淀粉含量等都比脆藕品种高，但水分含量比脆藕品种低；鲜粉藕品种中，直链淀粉含量、支链淀粉含量及支直比均比脆藕高，口感粉糯。粉藕品种适合于煨汤，脆藕品种适合于炒藕片。影响莲藕加工和蒸煮品质的主要因素是以淀粉为主的碳水化合物和淀粉中直链淀粉、支链淀粉含量。
目前国内外对莲藕地下茎碳水化合物代谢的研究，仅见莲藕膨大过程中和田间越冬过程中淀粉等主要碳水化合物的含量变化，及成熟期地下茎淀粉粒形态和淀粉糊化特性的报道；而对于地下茎中淀粉的积累与淀粉合成相关酶活性的关系研究较少。所以开发一种依据基因型选择不同淀粉含量的莲藕品系的技术，可以有效的鉴别粉藕和脆藕，具有重要的育种利用价值。
发明内容
本发明的目的在于提供了一种莲藕淀粉合成酶相关基因HXK功能分子标记引物，其为：HXKF1：TCTAAATCCCAATCCGTCC，HXKR1：GCACGAACTCTTGGCAATC。该引物可用于鉴别莲藕中的支、直链淀粉含量。
本发明的另一个目的在于提供了一种莲藕淀粉合成酶相关基因HXK功能分子标记引物的应用，该应用包括鉴定不同直链淀粉含量的莲藕品系，莲藕的早期育种筛选。
为了实现上述的目的，本发明采用以下技术措施：
本发明发现HXK等位基因中第一个引物扩增序列存在差异，将该功能分子标记命名为FMHXK-1。一种莲藕淀粉相关基因HXK功能分子标记FMHXK-1，其序列如SEQ ID NO.1和图1所示。基于该分子标记设计的引物如下：
一种莲藕淀粉相关基因HXK功能分子标记引物，其为：
HXKF1：TCTAAATCCCAATCCGTCC，
HXKR1：GCACGAACTCTTGGCAATC。
一种莲藕淀粉相关基因HXK功能分子标记或分子标记引物的应用，包括莲藕淀粉含量的测定，莲藕的育种筛选(如在幼苗阶段筛选)。
所述的应用通过以下方式实现：利用引物HXKF1：TCTAAATCCCAATCCGTCC，HXKR1：GCACGAACTCTTGGCAATC对莲藕DNA进行PCR扩增，对PCR产物进行聚丙烯酰胺凝胶电泳，电泳结果为320bp的A条带和/或308bp的a条带，根据A条带的有无来确定莲藕淀粉的含量。将扩增的A和a两条带进行测序，部分序列的比对如图2所示。
本发明与现有技术相比，具有以下优点和效果：
(1)本发明所用引物少、且效率高，可以加快育种速度、降低育种成本；并具有操作简单、成本低廉、周期短的优点，适于推广应用，为莲藕种质资源鉴定和莲藕育种选择提供了一种快捷的方法，具有很高的应用价值。
(2)本发明所用引物直接开发于HXK基因上，基因序列的长度差异直接对应于品种的表型差异，具有直接指示作用，可靠性更高。
附图说明
图1是莲藕淀粉相关基因HXK功能分子标记FMHXK-1的序列及引物HXKF1和HXKR1的设计位点图，其中黑色加粗斜体为引物序列。
图2是引物HXKF1和HXKR1扩增条带A和a的部分序列比对图。
图3是引物HXKF1和HXKR1对实施例1中45个莲藕品系DNA扩增的PCR产物条带。
具体实施方式
以下的实施例便于更好地理解本发明，但并不限定本发明。下述实施例中的实验方法，如无特殊说明，均为常规方法。下述实施例中所用的试验材料，如无特殊说明，均在常规生化试剂商店购买得到的。
实施例1 莲藕淀粉合成酶相关基因HXK功能分子标记引物的获得
(1)取45份成熟莲藕样品，测定莲藕(莲地下茎)的支链淀粉占干物质百分含量、直链淀粉占干物质百分含量、总淀粉占干物质百分含量；支链淀粉占总淀粉百分含量、直链淀粉占总淀粉百分含量。测定结果见表1。
表1 莲藕样品的淀粉含量及PCR扩增条带结果
(2)在NCBI中找出莲藕淀粉合成酶相关基因HXK(己糖激酶)的DNA序列，然后使用软件DNAMAN设计引物，下表2列出所设计引物中的17对引物。
表2 17对引物的序列
(3)取步骤(1)中的45份莲样品的嫩叶干燥脱水后，采用天根生化科技(北京)有限公司的Plant Genomic DNA Kit植物基因组DNA提取试剂盒提取莲总DNA。具体如下：
①取30mg干燥的叶片，打磨成粉末。
②将粉末迅速转移到装有700μL 65℃预热缓冲液GP1的离心管中，迅速颠倒混匀后，将离心管放在65℃水浴20min，水浴过程中颠倒离心管以混合样品。
③加入700μL氯仿，充分混匀，12000rpm离心5min。
④小心的将上一步所得上层水相转入一个新的离心管中，加入700μL缓冲液GP2，充分混匀。
⑤将混匀的液体转入吸附柱CB3中，12000rpm离心30s，弃掉废液。
⑥向吸附柱CB3中加入500μL缓冲液GD，12000rmp离心30s，倒掉废液，将吸附柱CB3放入收集管中。
⑦向吸附柱CB3中加入600μL缓冲液PW，12000rmp离心30s，倒掉废液，将吸附柱CB3放入收集管中。
⑧重复操作步骤⑦。
⑨将吸附柱CB3放入收集管中，12000rmp离心2min，倒掉废液。将吸附柱CB3置于室温数分钟，以彻底晾干吸附柱材料中残余的漂洗液。
⑩将吸附柱CB3转入一个干净的离心管中，向吸附膜的中间部位悬空滴加65μL的ddH2O，室温放置2-5min，12000rmp离心2min，将DNA提取液收集到离心管中。
(4)在10μL的PCR反应体系中取上述稀释十倍的DNA提取液1.0μL，按下表3配制反应体系。反应液上加盖半滴矿物油(Sigma)，以防止反应过程中水分蒸发。
表3 PCR反应体系
组分 加入体积
ddH2O 5.5μL
10×Taq酶Buffer 1.0μL
MgCl2(25mM) 0.4μL
dNTPs(10mM) 0.5μL
引物(20μmol/L) 0.6μL+0.6μL(正、反向引物)
Taq酶(2U/μL) 0.4μL
DNA(10ng/μL) 1μL
(5)上述体系在如下PCR反应程序中反应：95℃变性5分钟；95℃预变性30秒，53℃退火45秒，72℃延伸45秒，35个循环；72℃终延伸5分种；4℃保存。
(6)将PCR扩增产物进行6％聚丙烯酰胺凝胶电泳。在10μL PCR扩增产物中加入5μL3×Loading Buffer，混匀后，在95℃变性5min，立即放至冰上冷却5min以上，得到样品。每一个加样孔点入2.5μL样品(分子量标准为marker：pBR322DNA/MspI)，在65W恒功率下电泳约60-80min。电泳结束后，进行银染显色。染色液由2g AgNO3、20mL浓度为65-68％的浓硝酸和2L水组成，染色10-15min。显影液由40g NaOH、1mL 5％依来铬黑T和3mL 37％(体积百分含量)甲醛组成，至带纹出现。定影液为10％(体积百分含量)醋酸水溶液，定影5min。再用ddH2O漂洗5分钟。
(7)电泳结果表明：17对引物中，只有第一对引物HXKF1(正向)和HXKR1(反向)扩增的PCR产物有长度多态性(图3)。
(8)在该多态性的条带中，将有条带A的莲藕品种和无条带A的莲藕品种分成两组；将两组的数据进行t-检验，得出结果，直链淀粉占干物质百分含量、支链淀粉占总淀粉百分含量、直链淀粉占总淀粉百分含量这三个指标都具有显著性差异水平，详见表4。
表4 t-检验结果
指标 无目的条带A 有目的条带A t值 P值 显著性
1 直链淀粉占干物质百分含量(％) 5.20 3.13 2.02 0.009 *
2 支链淀粉占总淀粉百分含量(％) 77.81 88.08 2.02 0.012 *
3 直链淀粉占总淀粉百分含量(％) 22.17 11.53 2.02 0.009 *
4 支链淀粉占干物质百分含量(％) 24.02 30.69 -1.53 0.133 不显著
5 总淀粉占干物质百分含量(％) 29.23 33.83 -1.11 0.271 不显著
“*”表示显著性相关。
由上述t-检验结果可知HXK功能分子标记引物HXKF1(正向)和HXKR1(反向)可用于筛选和鉴定不同种类淀粉及其淀粉含量的莲藕品系。
(9)多态性的结果及其与表型的关系：根据莲藕样品的淀粉含量及PCR扩增条带A的有无(表1)得出莲藕不同淀粉的含量与条带A之间的关系，详见表5。
表5
表5中表示的是有无条带A的莲藕样品的淀粉含量在某一范围内的概率值，例如：若某个莲藕样品用引物HXKF1和HXKR1进行扩增，没有扩增到A条带，则直链淀粉占干物质百分含量为3.86-6.55％的概率值在95％以上，支链淀粉占总淀粉百分含量为69.98-85.64％的概率值在95％以上，直链淀粉占总淀粉百分含量为14.34-30.01％的概率值在95％以上……。
实施例2
莲藕淀粉相关基因HXK功能分子标记引物的应用，包括鉴定莲藕品系不同淀粉的含量，莲藕的早期育种筛选。以白湖野莲为例，具体如下：
(1)取白湖野莲成熟的莲藕干燥后的嫩叶样品，提取基因组DNA。
(3)用引物HXKF1和HXKR1对白湖野莲基因组DNA进行PCR扩增，PCR扩增方法如实施例1。结果显示白湖野莲基因组DNA进行PCR扩增产物无目的条带A。
利用常规方法对白湖野莲成熟莲藕样品中支链淀粉占干物质百分含量、直链淀粉占干物质百分含量、总淀粉占干物质百分含量；支链淀粉占总淀粉百分含量、直链淀粉占总淀粉百分含量的指标进行检测，结果见表6。
表6
通过常规检测可知，白湖野莲成熟莲藕样品中：
(1)直链淀粉占干物质百分含量为5.79％位于3.86-6.55％之间，不在2.20-4.07％之间；
(2)支链淀粉占总淀粉百分含量为79.45％位于69.98-85.64％之间，不在84.06-92.10％之间；
(3)直链淀粉占总淀粉百分含量为20.55％位于14.34-30.01％之间，不在7.49-15.57％之间；
(4)支链淀粉占干物质百分含量为22.37％位于17.4-30.65％之间，不在24.69-36.73％之间。
这些结果都落在了实施例1没有扩增得到A条带的范围内。上述结果说明利用功能标记检测与常规淀粉含量检测结果一致，表明本发明开发的分子标记引物可对莲藕不同淀粉的含量进行初步确定，同时可以区分支链淀粉含量高或支链淀粉含量低的莲藕品种，直链链淀粉含量高或直链淀粉含量低的莲藕品种。该功能标记可代替常规的淀粉含量检测，提高检测效率。
上述实施例为本发明较佳的实施方式，但本发明的实施方式并不受上述实施例的限制，其他的任何未背离本发明的精神实质与原理下所作的改变、修饰、替代、组合、简化，均应为等效的置换方式，都包含在本发明的保护范围之内。

Claims (4)

1.莲藕淀粉相关基因HXK功能分子标记，其特征在于：序列如SEQ ID NO.1所示。
2.莲藕淀粉相关基因HXK功能分子标记引物，其特征在于：所述的引物为：
HXKF1：TCTAAATCCCAATCCGTCC，
HXKR1：GCACGAACTCTTGGCAATC。
3.权利要求1所述的分子标记或权利要求2所述的分子标记引物在莲藕淀粉含量测定中的应用。
4.权利要求1所述的分子标记或权利要求2所述的分子标记引物在莲藕育种筛选中的应用。
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