CN105349650B - 一种定性检测水稻耐消化淀粉含量的方法 - Google Patents

一种定性检测水稻耐消化淀粉含量的方法 Download PDF

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Abstract

本发明公开了一种定性检测水稻耐消化淀粉含量的方法,该方法包括:以待测水稻的基因组DNA为模板,采用如SEQ ID NO.1和SEQ ID NO.2所示核苷酸序列的引物对进行PCR扩增;若所述水稻为籼稻时,扩增产物包含106bp和473bp两种条带,若所述水稻为粳稻时,扩增产物包含93bp、106bp和380bp三种条带,则说明待测水稻中耐消化淀粉含量高于25%,否则,耐消化淀粉含量低于25%。本发明方法可从F2苗期进行耐消化淀粉含量高的水稻品种的筛选,既加快了育种进度又节省了种植成本,并且可以对目标性状逐代追踪,在回交过程中不易丢失目标性状。

Description

一种定性检测水稻耐消化淀粉含量的方法
技术领域
本发明涉及水稻基因分子标记技术领域,尤其涉及一种定性检测水稻耐消化淀粉含量的方法。
背景技术
谷物淀粉是人类生存所需能量的主要来源,其中,水稻是当今世界1/2人口的主粮,水稻的生产在我国举足轻重。经过育种工作者的不懈努力,我国在水稻生产上取得了巨大的进步,杂交育种技术日益成熟,水稻的食味、蒸煮品质不断提升。而伴随人民温饱问题的解决,生活水平的提高,具有调控血糖功能的功能型水稻成为水稻育种的新方向。
淀粉作为血糖的直接供给来源,其消化特性也不断为人们所认知。按消化特性,1992年Englyst等将淀粉分类为快消化淀粉(RDS),缓慢消化淀粉(SDS)和抗性淀粉(RS),该分类方法是由Englyst根据生理解剖分析得出的。其中,快消化淀粉为进食后20min内可被消化的淀粉;缓慢消化淀粉是进食后20~120min之间被消化的淀粉;而进食120min后不被消化,不在小肠内消化吸收,却在大肠中发酵的则是抗性淀粉。由于缓慢消化淀粉(SDS)和抗性淀粉(RS)对于人体均有益,所以,我们定义耐消化淀粉(Endurance Starch,ES)为缓慢消化淀粉(SDS)和抗性淀粉(RS)之和,即ES=SDS+RS;或者ES=TS(总淀粉)-RDS(抗性淀粉)。
2002年Ludwig临床研究表明,控制餐后血糖平稳对于人体健康大有脾益,长期食用快消化淀粉含量高的食物会导致餐后血糖指数迅速升高,相关激素分泌调控压力变大,进而导致糖尿病、心血管疾病和肥胖等诸多慢性疾病的发生。同时,由于谷物抗性淀粉含量较低,血糖调控能力有限,提高耐消化淀粉含量,成为稳定餐后血糖的主要途径。
目前,水稻耐消化淀粉含量的测定采用Englyst方法或者AACC方法,对于杂交后代育种材料,上述方法一般都需要获得F3代后才能进行耐消化品质检测;增加了育种成本和育种的工作量。分子标记辅助选择(Marker-assisted selection,MAS)技术给水稻育种提供了新的途径,可通过该技术筛选水稻中耐消化淀粉含量高的材料,并将其用于杂交育种中稻米食味品质和缓慢消化功能特性的组合育种中,显著加快了优质功能型水稻的育种进度。
现有研究表明,自然稻米米粉的ES含量在11.0%~24.2%之间(Patindol,J.,Guraya,H.,Champagne,E.,Chen,M.H.,&McClung,A.2010.Relationship of cooked‐ricenutritionally important starch fractions with other physicochemicalproperties.Starch‐62(5),246-256),日本晴(粳稻)和R7954(籼稻)的ES含量分别为17.4%和20.0%,而浙江大学通过钴-60伽玛射线诱变常规水稻筛得的一份耐消化淀粉含量高的水稻株系es1的耐消化淀粉含量高达28.7%。
因此,有必要通过分子标记辅助选择技术获取上述水稻株系es1中与高耐消化淀粉含量性状连锁的分子标记,以改善现有技术中常规耐消化淀粉含量测定方法育种成本高、育种进度慢的问题,为加快优质功能型水稻的育种进度提供保障。
发明内容
本发明的目的在于提供一种定性检测水稻耐消化淀粉含量的方法以及与水稻高耐消化淀粉含量性状紧密连锁的分子标记,通过该分子标记,可以筛选耐消化淀粉含量高的水稻品种,用于高耐消化淀粉含量水稻品种的辅助选择选育。
一种定性检测水稻耐消化淀粉含量的方法,包括以下步骤:
以待测水稻的基因组DNA为模板,采用如SEQ ID NO.1和SEQ ID NO.2所示核苷酸序列的引物对进行PCR扩增,获得扩增产物;
所述水稻为籼稻时,若扩增产物包含106bp和473bp两种条带,则说明待测水稻中耐消化淀粉含量高于25%,否则,耐消化淀粉含量低于25%;
所述水稻为粳稻时,若扩增产物包含3bp、106bp和380bp三种条带,则说明待测水稻中耐消化淀粉含量高于25%,否则,耐消化淀粉含量低于25%。
具体地,所述的限制性内切酶为Hae II。
所述PCR扩增的反应体系为:基因组DNA 50ng,1×PCR buffer2.0μl,0.2mMdNTPs1.6μl,0.5μM上游引物0.5μl,0.5μM下游引物0.5,Taq酶1U,总体积20μl。
所述PCR扩增的反应条件为:94℃预变性5min;94℃变性30s,55℃复性30s,72℃延伸1min,循环30次;72℃延伸7min。
本发明提供了一种引物对,所述引物对的上游引物和下游引物的核苷酸序列如下所示:
es1f:5’-GAGCGACGAGGAAAAGCACAAG-3’(SEQ ID NO.1);
es1r:5’-TGCAGACGAGCCACTATCAGACC-3’(SEQ ID NO.2)。
本发明还提供了一种用于定性检测水稻耐消化淀粉含量的分子标记,所述分子标记的核苷酸序列如下所示:
SEQ ID NO.3:GAGCGACGAGGAAAAGCACAAG;
SEQ ID NO.4:TGCAGACGAGCCACTATCAGACC。
该分子标记可用于鉴定普通水稻品种、其突变体、种质资源和育种株系中是否含有高耐消化淀粉含量基因,并确定上述水稻的耐消化淀粉含量的高低。
其中,SEQ ID NO.3所示核苷酸序列为常规籼稻品种es1分子标记序列;SEQ IDNO.4所示的核苷酸序列为常规粳稻品种es1的分子标记序列。
本发明还提供了上述SEQ ID NO.3或SEQ ID NO.4所示的核苷酸序列在定性检测水稻耐消化淀粉含量中的应用。
本发明提供的技术方案还可制备包含上述引物对的用于定性检测水稻耐消化淀粉含量的试剂盒。该试剂盒可用于定性检测水稻耐消化淀粉含量。
与现有技术相比,本发明具有以下有益效果:
(1)本发明分子标记与高耐消化淀粉含量性状不仅紧密连锁,而且在植株后代中,该分子标记与高耐消化淀粉含量形状共分离,使得相应的鉴定方法具有很高的可靠性;
(2)通常,对于杂交后代育种材料,一般要在F3代才能进行耐消化品质检测;本发明方法为耐消化淀粉性状水稻品种的辅助育种提供了一条途径,可免除育种群体繁杂且昂贵的稻米消化特征鉴定工作,利用该分子标记可以从F2苗期进行筛选,既加快了育种进度又节省了种植成本,并且可以对目标性状逐代追踪,在回交过程中不易丢失目标性状。
附图说明
图1为分子标记es1在F2群体中与耐消化淀粉特性的连锁分析;
其中:1为高耐消化淀粉含量突变体es1;2为日本晴(Nipponbare);M为分子量标记,其余为F2群体高耐消化淀粉含量的单株。
图2为分析标记es1检测消化特征不同的品种及其代表品种资源;
其中:1-10号泳道分别为高耐消化淀粉含量株系es1、日本晴、浙辐111、ZF04、宁粳3号、武运粳23、秀水110、TF5、NHR111S、ZF12号的PCR产物经过酶解后的条带。
具体实施方式
下面结合实施例对本发明作进一步说明。
以下实施例所使用的分子生物学和生物化学方法均为已知的技术,在Ausubel编写的由John Wiley and Sons公司出版的Current Protocols in Molecular Biology和J.Sambrook等编写的由Cold Spring Harbor Laboratory Press(2001)出版的MolecularCloning:A Laboratory Mannual,3rd ED.等文献均有详细的说明。以下实施例中所用的实验材料如无特殊说明均为市售购买产品。
本实施例在以本发明技术方案为前提下进行实施,给出了详细的实施方式和过程,但本发明的保护范围包括但不限于下述的实施例。
实施例1 es1分子标记的确定
(1)植物材料
以耐消化淀粉含量较低的常规水稻日本晴(Nipponbare)为母本,耐消化淀粉含量高的株系es1为父本。其中,株系es1是浙江大学原子核农业科学研究所通过钴-60伽玛射线诱变常规稻R7954筛得的一份耐消化淀粉含量显著提高的水稻株系。
将Nipponbare与株系es1杂交,F1单株收获。F1单株种子繁殖成F2代分离群体,将F2代继续种植,共获得2607个可育F2单株,种植在浙江大学紫金港校区农场,常规水肥管理,F3代种子进行淀粉消化特征分析。
(2)水稻耐消化淀粉特性的鉴定
取0.5g米粉于50ml螺口离心管中,加25mg瓜尔胶,12.7mm×3mm磁力转子,10ml醋酸缓冲液(0.1M,pH=5.2);拧好盖子,37℃下水浴10min,转子的速度为160rpm;然后,加入2.5ml混合酶液(3800U/ml胰淀粉酶,188U/ml转化酶和13U/ml淀粉葡萄糖苷酶Sigma–Aldrich,St.Louis,MO,USA);分别于20min和120min取0.25ml反应液,沸水浴5min,用葡萄糖试剂盒测水解葡萄糖的含量。
耐消化淀粉(ES)=总淀粉-快消化淀粉(20min内被消化淀粉)。
(3)分子标记引物设计
依据国际水稻基因组计划测序获得的水稻品种日本晴的序列,寻找耐消化淀粉特性的紧密连锁分子标记。根据前期目的基因定位所在染色体区域范围,取出日本晴基因组第8染色体上该范围内基因序列和旁翼序列,对突变体基因扩增并且测序,通过rice tigr网站(http://rice.plantbiology.msu.edu/analyses_search_blast.shtml),与Nipponbare和93-11的序列进行比对。找到多样性SNP位点,分别用Primer Premier 5.0和SNP2CAPS软件设计dCAMPs引物。
引物的序列如下:
es1f:5’-GAGCGACGAGGAAAAGCACAAG-3’(SEQ ID NO.1);
es1r:5’-TGCAGACGAGCCACTATCAGACC-3’(SEQ ID NO.2)。
(4)基因组DNA提取
采用CTAB方法提取Nipponbare、es1及其F2单株叶片基因组DNA,浓度调至50ng.μl-1左右。
(5)反应及电泳
PCR反应的总体积为20μ1,反应液的组成为1×PCR buffer 2.0μ1,0.2mM dNTPs1.6μ1,0.5μM上游引物0.5μl,0.5μM下游引物0.5μl,50ng基因组DNA,1U Taq酶。
PCR反应程序为:94℃预变性5min;然后每个循环:94℃变性30s,55℃复性30s,72℃延伸1min,循环30次;最后72℃延伸7min。用0.8%的聚丙烯酰胺凝胶电泳进行检测。
(6)遗传分析
将株系es1与Nipponbare杂交,收获F1代单株,共获得F2为2562个单株。
以耐消化淀粉含量>25%为耐消化淀粉含量高,<25%为耐消化淀粉含量低为标准,采用步骤(2)中水稻耐消化淀粉特性的鉴定方法对F2代单株进行检测。
如图1所示,结果表明,F2代单株耐消化淀粉含量分型分明,高耐消化淀粉含量单株618株,低含量耐消化淀粉单株1989株,严格符合3:1,可用于基因的分子标记定位。
(7)群体单株的分子检测
采用引物es1扩增618株高耐消化淀粉含量的单株,所有单株扩出的DNA带型都与突变体亲本es1一致,没有Nipponbare带型,表明F2耐消化淀粉高含量单株中没有发生染色体交换事件,表明此sds1标记与耐消化淀粉合成相关基因共分离。
实施例2分子标记的验证
为了进一步验证分子标记es1是否在能区分更多品种的耐消化水平,因此,对耐消化淀粉含量不同的品种及目前推广的部分品种进行分子检测。
由于es1分子标记与高耐消化淀粉含量的突变性状高度紧密连锁,通过若干常规水稻品种验证是否存在自然突变。
所以,我们选择了消化特征不同的育种品系及代表品种资源进行验证。如附图2所示:1-10号泳道分别为es1、日本晴、浙辐111、ZF04、宁粳3号、武运粳23、秀水110、NHR111S、Y58S、甬优12号的pcr产物经过酶解后的条带。结果表明,es1背景衍生的突变株系扩出与es1带型一致的DNA片段,其它品种扩出的DNA带型与es1带型都不一致(附图2)。
因此,es1引物可作为筛选高耐消化淀粉含量基因的分子标记。

Claims (4)

1.一种定性检测水稻耐消化淀粉含量的方法,其特征在于,包括以下步骤:
以待测水稻的基因组DNA为模板,采用如SEQ ID NO.1和SEQ ID NO.2所示核苷酸序列的引物对进行PCR扩增,获得扩增产物;扩增产物经限制性内切酶HaeII酶切后进行电泳检测;
所述水稻为籼稻时,若扩增产物包含106bp和473bp两种条带,则说明待测水稻中耐消化淀粉含量高于25%,否则,耐消化淀粉含量低于25%;
所述水稻为粳稻时,若扩增产物包含93bp、106bp和380bp三种条带,则说明待测水稻中耐消化淀粉含量高于25%,否则,耐消化淀粉含量低于25%;
所述耐消化淀粉为缓慢消化淀粉与抗性淀粉之和。
2.如权利要求1所述的方法,其特征在于,所述PCR扩增的反应体系为:基因组DNA50ng,1×PCR buffer 2.0μl,0.2mM dNTPs 1.6μl,0.5μM上游引物0.5μl,0.5μM下游引物0.5μl,Taq酶1U,总体积20μl。
3.如权利要求1所述的方法,其特征在于,所述PCR扩增的反应条件为:94℃预变性5min;94℃变性30s,55℃复性30s,72℃延伸1min,循环30次;72℃延伸7min。
4.一种引物对,其特征在于,所述引物对的上游引物和下游引物的核苷酸序列分别如SEQ ID NO.1和SEQ ID NO.2所示。
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