CN108148927A - 与水稻饭味相关qtl紧密连锁的分子标记及其筛选方法 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种与水稻饭味相关QTL紧密连锁的分子标记及其筛选方法，该分子标记的核苷酸序列如序列表SEQ ID NO:1所示，筛选方法包括：构建F4代分离群体；提取父母本、F1代、F4代个体基因组DNA；构建遗传连锁图谱；利用遗传连锁图谱结定位水稻饭味相关QTL；开发与水稻饭味相关QTL紧密连锁的分子标记；制备分子标记。基于本技术方案筛选出与水稻饭后回甜基因紧密连锁的分子标记，应用分子标记可快速检测水稻是否含有饭味回甜基因，可简便、快速、高通量地进行水稻育种实践。

Description

与水稻饭味相关QTL紧密连锁的分子标记及其筛选方法

技术领域

本发明涉及基因工程技术领域，尤其涉及一种与水稻饭味相关QTL紧密连锁的分子标记及其筛选方法。

背景技术

水稻是我国最重要的粮食作物之一，种植面积占粮食作物面积30％，产量占粮食总产量40％，稻谷是我国60％以上人口的主食。因此，水稻生产水平的提高一直是关系我国农业发展和民生安定的重大问题。然而，目前水稻生产需求在过去追求产量的同时对水稻品质的要求也不断提高。尤其在我国，随着经济高速发展，人们生活水平不断提高，因此，我国水稻生产必须在兼顾产量的同时进一步培育口味、外形更为优质的新品种。稻米品质是指从稻谷生产到加工成直接消费品的全部过程中作为粮食或商品的各种特性。人们通常把稻米的品质分为外观品质、碾磨品质、蒸煮与食味品质以及营养品质等4个方面。生活水平的提高，使得人们对高品质大米的需求越来越高，近年来国家更是把优质稻育种和种植提上了新高度。在国内优质稻产区如华南油粘米和东北稻花香系列，稻谷收购价是普通稻谷的1.5至2倍。油粘米是一种优质米类，米粒细长，晶莹剔透，油光发亮，香滑软熟，饭后齿颊留香。用砂锅煲饭香味四溢，饭面泛起油光，把饭粒放到纸上有油迹留下，故称之为油粘米。其优质的香软和饭后回甜的口感受到越来越多消费者的喜欢，市场的需求也日益增加。而目前关于此方面的研究还未见文献报道。因此，开展水稻香软和饭后回甜的遗传及分子机理进行研究对水稻优质育种具有重要的指导意义。

分子标记辅助选择(Marker Assisted Selection，MAS)是借助与目标基因紧密连锁的分子标记鉴定群体中是否含有目标基因个体的技术。MAS技术可以大大缩短育种选育的周期，使育种家更快获得遗传稳定的目标单株。对于蒸煮食味性状这类的数量性状而言，利用分子标记能够在育种中对有利的QTL进行动态跟踪，可以把这些有利的QTL位点聚合到目标育种材料中，从而培育出性能更加优秀的新品种。因此，开展MAS的关键在于重要性状相关QTL的定位及相关分子标记开发。

研究表明水稻的食味品质复杂，受多基因控制，属于复杂性状。在食味品质研究报道中，直链淀粉含量和支链淀粉结构对其影响较大，也定位或克隆了多个淀粉含量和合成相关的QTL或基因。

直链淀粉含量是衡量稻米蒸煮食味品质优劣的重要指标之一。水稻中催化直链淀粉合成的颗粒淀粉结合酶(GBSS，granles bound starch synthase)由水稻蜡质基因(Wx)编码，位于第6染色体上。直链淀粉含量的合成和Wx基因的表达除受Wx本身的影响外，还受低直链淀粉含量突变体基因的调控。目前报道的控制低直链淀粉含量的突变基因分为与Wx基因等位和非等位两大类。研究者利用NIL10定位了qAC2，位于chr02上，是一个能够与Wx互作控制水稻低直链淀粉含量的QTL。在6号染色体长臂上840-kb区间内，SSR标记RM20662和RM412之间定位到du12(t)，与RM3765和RM176共分离。另有研究人员在10号染色体上克隆Dul，该基因编码一个新的Prp1蛋白，通过作用Wxb前提mRNA的剪切从而调控直链淀粉的合成。利用突变体2035和EM47可将低直链淀粉基因du定位于水稻第6染色体上,利用低直链淀粉突变体2120在水稻第9染色体上定位到一个du基因。研究人员用8个低直链淀粉含量的突变体与正常水稻品种杂交，分析F1和F2种子的直链淀粉含量，发现突变体的低直链淀粉含量受隐性单基因控制，这样的基因位点共发现有5个，分别命名为du-1,du-2,du-3,du-4和du-5。这些位点与wx不等位，具有加性效应，其中，du-1定位于水稻第7染色体，du-4定位于第4染色体。

稻米支链淀粉结构影响淀粉的糊化问题。支链淀粉的链长及链长分布，平均链长及中心链长分布决定这淀粉的糊化温度，分支链越长，则糊化温度越高。ALK基因编码可溶性淀粉合酶Ⅱ，控制着稻米的糊化温度。研究者用双科早和C堡做亲本将ALK定位于水稻第6染色体上，ALK基因编码产物中氨基酸的改变可能造成了淀粉合成酶活性的变化，从而影响支链淀粉的中等长度分支链的合成，使晶体层结构改变，最终表现为糊化温度改变。淀粉合成酶IIIa影响水稻籽粒中支链淀粉的结构、直链淀粉含量和淀粉粒理化性质，编码IIIa的基因如果缺失或突变，将导致籽粒内淀粉相关性状的变化。科研人员通过逆转座子Tos17插入和MNU处理各获得1份IIIa突变体，这2份突变系等位。突变体中聚合度(DP)大于30的B2支链到B4支链减低到野生型中的60％；聚合度6-9的支链和聚合度16-19的支链减少而聚合度在10-15和20-25的支链增加；直链淀粉的含量和支链淀粉超长链(DP大于500)分别增加1.3倍和12倍；突变体的淀粉颗粒是更小的圆形，并且淀粉颗粒很少是透明的，淀粉合成酶Ⅲa位于水稻第8染色体上，已克隆。

目前关于水稻淀粉含量和淀粉合成基因遗传及QTLs定位研究较多，并已经定位了一定数量的主效基因。但在稻米食口性，包括软硬、饭后回甜等仍然缺乏足够QTLs及分子标记。

发明内容

本发明的目的在于提供一筛选与水稻饭味相关QTL紧密连锁的分子标记的方法。为了实现上述目的，本发明提供如下技术方案：一种与水稻饭味相关QTL紧密连锁的分子标记，所述分子标记的核苷酸序列如序列表SEQ ID NO:1所示。

优选地，所述分子标记的引物为：

正向引物：ATCGTCCACTCAGCTGAGCT

反向引物：CAACACGTCGTTTCCGGTTT

一种筛选与水稻饭味相关QTL紧密连锁分子标记的方法，包括如下步骤：

(1)构建F4代分离群体：父本、母本杂交获取F1后单粒传获得F4代群体；

(2)提取父母本、F1代、F4代个体基因组DNA备用；

(3)对F4群体进行基因分型，获取基因型数据，构建遗传连锁图谱；

(4)利用遗传连锁图谱结合表型数据进行QTL分析，定位水稻饭味相关QTL；

(5)开发与水稻饭味相关QTL紧密连锁的分子标记：选择靠近上述饭味相关QTL所在区段的分子标记，设计引物，通过PCR扩增和琼脂糖凝胶电泳检测来筛选具有多态性并扩增稳定的分子标记；

(6)制备分子标记：以父本、F1代或F4代的基因组DNA作为模板，以分子标记扩增引物对进行PCR扩增。

优选地，步骤(1)具体包括：父本和母本杂交得到F1，F1套袋自交得到F2，F2通过单粒传加两代，得到F4；所述父本为育种材料SKO,所述母本为晚97香。

优选地，步骤(2)基因组DNA提取具体包括步骤：

a,称取新鲜叶片，剪碎研磨后加入1.5×CTAB，研磨成匀浆转入离心管中，继续用1.5×CTAB冲洗研钵后转入离心管中，65℃水浴后加入去离子水，使用前再加入巯基乙醇；

b，冷却至室温后加入等体积氯仿/异戊醇，混匀至下层液变为深绿色；

c，离心后将上层水相移到新的离心管，加入2倍体积预冷的无水乙醇，放置沉淀DNA；

d，离心后弃掉上清，加入75％乙醇洗涤沉淀1次，倒置离心管干燥DNA，加入TE溶解DNA；

e，用0.8％的琼脂糖凝胶检测基因组DNA，将得到的父母本以及F1代、F4代个体的基因组DNA储存备用。

优选地，步骤(4)包括：根据F4群体的个体表型，分别标记与父本型性状相似的、与母本型性状相似的、性状居于父本和母本之间的个体表型，将个体的表型数据与基因型数据进行比较，将饭味相关基因定位在遗传连锁图谱上。

优选地，所述步骤(6)中PCR反应体系如下：

优选地，所述步骤(6)中PCR反应条件为：94℃预变性5分钟；94℃变性30秒，60℃退火30秒，72℃延伸40秒，运行35个循环；最后72℃延伸3分钟。

本发明的技术方案公开了分子标记的筛选方法，基于本技术方案筛选出与水稻饭后回甜基因紧密连锁的分子标记M2595，分子标记M2595与水稻饭味回甜基因的遗传连锁距离为1.1cM，用分子标记M2595可以检测水稻是否含有饭味回甜基因，可简便、快速、高通量地进行水稻育种实践。

附图说明

图1，在具体实施例中，筛选与水稻饭味相关QTL紧密连锁的分子标记的流程图。

具体实施方式

为使技术人员更好地理解本发明，下面参照附图对本发明的实施例进行清楚、详细的说明，但不作为对本发明的限定。显然，所描述的实施例仅仅是本发明的一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有作出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。

在具体实施例中，筛选与与水稻饭味相关QTL紧密连锁的分子标记的方法如图1所示，包括如下步骤：

(1)构建F4代分离群体。具体地，父本为育种材料SKO,母本为晚97香，父本和母本杂交得到F1，F1套袋自交得到F2，F2通过单粒传加两代，得到F4。

(2)提取父母本、F1代、F4代个体基因组DNA备用。具体步骤包括：称取新鲜叶片，剪碎研磨后加入1.5×CTAB，研磨成匀浆转入离心管中，继续用1.5×CTAB冲洗研钵后转入离心管中，65℃水浴后加入去离子水，使用前再加入巯基乙醇。随后，冷却至室温后加入等体积氯仿/异戊醇，混匀至下层液变为深绿色。接着进行离心，离心后将上层水相移到新的离心管，加入2倍体积预冷的无水乙醇，放置沉淀DNA。继续离心后，弃掉上清，加入75％乙醇洗涤沉淀1次，倒置离心管干燥DNA，加入TE溶解DNA。最后用0.8％的琼脂糖凝胶检测基因组DNA，将得到的父母本以及F1代、F4代个体的基因组DNA储存备用。

(3)用基于测序的基因分型技术对F4群体单株进行基因分型，获得F4群体的基因型数据，用MSTMap软件进行遗传连锁图谱绘制，得到遗传连锁图。

(4)根据F4群体的个体表型，分别标记与父本型性状相似的、与母本型性状相似的、性状居于父本和母本之间的个体表型，将个体的表型数据与基因型数据进行比较，将饭味相关基因定位在遗传连锁图谱上。

(5)选择靠近上述饭味相关基因所在区段的分子标记，设计引物，通过PCR扩增和琼脂糖凝胶电泳检测来筛选具有多态性并扩增稳定的分子标记。

(6)以父本、F1代或F4代的基因组DNA作为模板，以分子标记扩增引物对进行PCR扩增。PCR反应体系如下：

PCR反应条件为：94℃预变性5分钟；94℃变性30秒，60℃退火30秒，72℃延伸40秒，运行35个循环；最后72℃延伸3分钟。

在具体实施例中，本发明的技术方案公开了与水稻饭味相关QTL紧密连锁的分子标记M2595，该分子标记的核苷酸序列如序列表SEQ ID NO:1所示，核苷酸序列的长度为1407bp。该分子标记距离水稻饭味回甜QTL的遗传连锁距离为1.1cM。分子标记M2595的引物如下表1以及SEQ ID NO:2、SEQ ID NO:3所示：

表1

实施例1

下面以实施例1为例具体说明本发明的技术方案：

1、水稻F4代分离群体的构建

父本选用育种资源材料SKO，母本选用早油粘米品种晚97香。SKO，该品种为籼型水稻，生育期100-105天，株高110厘米至120厘米，株型挺立，叶色较淡绿，主茎叶片数12-15叶。米质检测结果为：糙米率80％，精米率71％，整精米率55％，粒长7毫米。直链淀粉含量17％，饭味很淡，无回甜感。晚97香，该品种为籼型常规稻，生育期85-90天，株型松散，叶色淡绿。米质检测为糙米率78％，精米率68％，整精米率55％，粒长6毫米。直链淀粉含量15％，饭味香甜浓郁，入口即有甜味。因而，父本米饭硬，饭味不回甜；母本米饭软，饭味回甜。

F4代分离群体的构建方法为：父本和母本杂交得到F1，F1代单粒传产生F4代群体，共有200个F4代单株。

2、基因组DNA的提取

本实施例采用CTAB法分别提取父母本、F1代、以及F4代个体的基因组DNA，具体方法依次如下：

A、称取1.0g新鲜叶片，剪碎放入研钵，用液氮研磨后加入3mL 1.5×CTAB，研磨成匀浆转入15mL的离心管中，然后往研钵中加入1mL 1.5×CTAB冲洗再转入离心管中。混匀后于65℃水浴30min，期间不时缓慢摇匀。

其中1.5×CTAB配方如下(1L)：

加去离子水定容至1L，使用前加入终浓度为0.2％(2ml)的巯基乙醇。

B、待冷却至室温，加入等体积氯仿/异戊醇(24：1)，轻轻混匀，至下层液变为深绿色。

C、4200rpm离心10min，将上层水相移到新的15mL离心管，加2倍体积预冷的无水乙醇，混合静止5min。于-20℃放置30min沉淀DNA。

D、4200rpm离心10min，弃掉上清，加入1mL 75％乙醇洗涤沉淀1次，倒置离心管干燥DNA，加入200μL TE溶解DNA。

E、用0.8％的琼脂糖凝胶检测基因组DNA。

F、将得到的父母本以及F1代、F4代个体的基因组DNA存于-20℃备用。

3、遗传图谱构建

用基于RAD-seq的基因分型技术对F4群体的个体进行基因分型，获得F4群体的基因型数据。

用MSTMap软件(http://alumni.cs.ucr.edu/-yonghui/mstmap.html)进行遗传连锁图谱绘制，得到遗传连锁图。

4、水稻饭味相关QTL的定位

根据F4群体的个体表型，与父本型性状相似的记为a，与母本型性状相似的记为b，性状居于父本和母本之间的记为h。得到全部个体的表型数据，将个体的表型数据与之前得到的基因型数据进行比较，将米饭软硬、饭味回甜基因定位在遗传连锁图谱上。

5、分子标记开发

根据RAD-seq的测序结果，利用华大开发的SOAP软件比对测序reads，然后用SOAPsv寻找片段差异较大的分子标记，便于用凝胶电泳区分鉴别。选择靠近长粒型基因所在区段的标记作为候选，然后分别设计引物，通过PCR扩增和琼脂糖凝胶电泳检测来筛选具有多态性，扩增稳定的标记。

6、分子标记制备

制备分子标记M2595的方法具体包括：以提取的父母本、F1代或F4代的基因组DNA为模板，以分子标记扩增引物对进行PCR扩增，扩增引物对如表1所示。PCR反应体系如下：

PCR反应程序如下：94℃预变性5分钟；94℃变性30秒，60℃退火30秒，72℃延伸40秒，运行35个循环；最后72℃延伸3分钟。PCR扩增产物可以在4℃保存。经上述扩增过程得到分子标记，优选扩增后将扩增产物进行纯化操作。纯化后进行测序，结果如序列表SEQ IDNO:1所示。

以上所述仅为本发明的优选实施例，并非因此限制本发明的专利范围，凡是在本发明的发明构思下，利用本发明说明及附图内容所作的技术延伸或再创造均包括在本发明的专利保护范围内。

序列表

<110> 深圳盛宝联合谷物股份有限公司

<120> 与水稻饭味相关QTL紧密连锁的分子标记及其筛选方法

<130> JY181-272221

<160> 3

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 1407

<212> DNA

<213> Artificial

<400> 1

aaaacaaatc tagccataat gagttgtacc atcaaagtct atagaatcaa gaacttgtgt 60

taaagagcag aagggctttc atgttaaaga gcagaagggc tttcattaga atgactgatg 120

tcttttttct tcctattttc cactctatcc ggaggaagat agtacaagag atttaggcaa 180

gggctgcaag agattttttt aaaacttttt tttgaagaga ttttttaaaa ctagctagat 240

agaaagtgaa agaaccaaat taataatgga attcccgttt catcataaac aaaagtaatg 300

gactcctctc accgagcgct cacgtgaaca ttatagtcat aattttgagc cgaaaaaccc 360

cttcaaaata tgctacgtat agtacaaaac catatatatt gttcagtccg atatttgcca 420

tgttttttcc ttctttttaa gcttgtgtta agggagggga ctcactcgcg tggtgtacgt 480

gtgtctttga tgtctctgtg taatcatact tgtaagttca tgtatttcac attttgtttg 540

aaaaacatat atagtgttaa caagtttcaa gcagagttgc aattaaagtt accgtttctt 600

ttttactagt tgagacatgt ccaagattga tgcaactaca gatgtgggtg aggtcaggaa 660

atgatggcat ctacctatcc tgaagatgtc atgcacaaat aaataagtac tctactgatg 720

agtctactca tcaattgcaa gcagttttgg tttatgctaa ttttcaaaca catcaatcat 780

tcagctatat ctctcttttg tactcgtgtg cacgtcattc tagctttggg gccttggaca 840

ccacaccgtg catgctggta gcgggtagcc tcgaatcgaa cggcaataat atccctctgt 900

atcattttgt aataataata tttatataat ttgtatatgt acttccatca gcaatccgtt 960

gtagtctagc tggttaggat actcggctct cacccgagag acccgggttc gagtcccggc 1020

aacggaattt ctttttggtt tcataattgt tgaaagatta tttgttaact tttttgtggt 1080

tttttttatc tccgatgtat gatcaatgaa tccaaaattc ttgaaagatt attggttttc 1140

agattcagat gtttgttact tcaccttttc atctcttctc cgatgtatga tcatgtagtg 1200

cgatcaaaaa attgttgaaa gattattcgt tttcagatgc ttgttacttc accttttcat 1260

ttctctctct gtgatatatg atcacgcaag ctgaaattcc taaaagatta ttcattttca 1320

gatctttgtt acttcaccaa aagttctcag tgcaatgtcc cttttcctaa ttcttgagtt 1380

cgtctttttt tacgagaact agtgctg 1407

<210> 2

<211> 20

<212> DNA

<213> Artificial

<400> 2

atcgtccact cagctgagct 20

<210> 3

<211> 20

<212> DNA

<213> Artificial

<400> 3

caacacgtcg tttccggttt 20

Claims (8)

1.一种与水稻饭味相关QTL紧密连锁的分子标记，其特征在于，所述分子标记的核苷酸序列如序列表SEQ ID NO:1所示。

2.根据权利要求1所述与水稻饭味相关QTL紧密连锁的分子标记，其特征在于，所述分子标记的引物为：

正向引物：ATCGTCCACTCAGCTGAGCT

反向引物：CAACACGTCGTTTCCGGTTT 。

3.一种筛选与水稻饭味相关QTL紧密连锁的分子标记的方法，其特征在于，应用于权利要求1-2任一所述的与水稻饭味相关QTL紧密连锁的分子标记的筛选，包括如下步骤：

(1)构建F4代分离群体：父本、母本杂交获取F1后单粒传获得F4代群体；

(2)提取父母本、F1代、F4代个体基因组DNA备用；

(3)对F4群体进行基因分型，获取基因型数据，构建遗传连锁图谱；

(4)利用遗传连锁图谱结合表型数据进行QTL分析，定位水稻饭味相关QTL；

(5)开发与水稻饭味相关QTL紧密连锁的分子标记：选择靠近上述饭味相关QTL所在区段的分子标记，通过PCR扩增和琼脂糖凝胶电泳检测来筛选具有多态性并扩增稳定的分子标记；

(6)制备分子标记：以父本、F1代或F4代的基因组DNA作为模板，以分子标记扩增引物对进行PCR扩增。

4.根据权利要求3所述的筛选与水稻饭味相关QTL紧密连锁的分子标记的方法，其特征在于，步骤(1)具体包括：

父本和母本杂交得到F1，F1套袋自交得到F2，F2通过单粒传加两代，得到F4；所述父本为育种材料SKO,所述母本为晚97香。

5.根据权利要求3所述的筛选与水稻饭味相关QTL紧密连锁分子标记的方法，其特征在于，步骤(2)基因组DNA提取具体包括步骤：

a,称取新鲜叶片，剪碎研磨后加入1.5×CTAB，研磨成匀浆转入离心管中，继续用1.5×CTAB冲洗研钵后转入离心管中，65℃水浴后加入去离子水，使用前再加入巯基乙醇；

b，冷却至室温后加入等体积氯仿/异戊醇，混匀至下层液变为深绿色；

c，离心后将上层水相移到新的离心管，加入2倍体积预冷的无水乙醇，放置沉淀DNA；

d，离心后弃掉上清，加入75％乙醇洗涤沉淀1次，倒置离心管干燥DNA，加入TE溶解DNA；

e，用0.8％的琼脂糖凝胶检测基因组DNA，将得到的父母本以及F1代、F4代个体的基因组DNA储存备用。

6.根据权利要求3所述的筛选与水稻饭味相关QTL紧密连锁分子标记的方法，其特征在于，所述步骤(4)包括：根据F4群体的个体表型，分别标记与父本型性状相似的、与母本型性状相似的、性状居于父本和母本之间的个体表型，将个体的表型数据与基因型数据进行比较，将饭味相关基因定位在遗传连锁图谱上。

7.根据权利要求3所述的筛选与水稻饭味相关QTL紧密连锁分子标记的方法，其特征在于，所述步骤(6)中PCR反应体系如下：

。

8.根据权利要求7所述的筛选与水稻饭味相关QTL紧密连锁分子标记的方法，其特征在于，所述步骤(6)中PCR反应条件为：94℃预变性5分钟，94℃变性30秒，60℃退火30秒，72℃延伸40秒，运行35个循环；最后72℃延伸3分钟。