CN101880723A - 水稻稻米胶稠度调控基因分子标记及其应用 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了水稻稻米胶稠度调控基因分子标记及其应用。本发明提供了辅助鉴别具有不同稻米胶稠度的水稻的方法:以基因组DNA为模板,用WxM1PCR,如得到252bpDNA,水稻为I型或II型,如得到275bp DNA,水稻为III型;以基因组DNA为模板,用WxM12PCR,NheI酶切,如得到1018bp DNA,水稻为I型或III型,如得到644bp和374bp DNA,水稻为II型;稻米胶稠度III型高于I型高于II型;序列1和2所示DNA组成WxM1;序列3和4所示DNA组成WxM2。本发明在稻米品质改良方面具有重要的理论价值和实践意义,在利用基因工程技术有目的改造稻米品质或分子标记辅助育种方面有直接的应用价值,在研究植物淀粉生物合成的机理方面有一定的理论价值。
Description
技术领域
本发明涉及水稻稻米胶稠度调控基因分子标记及其应用。
背景技术
培育高产、优质的水稻新品种是育种学家长期以来追求的目标。经过几十年的努力,尤其是杂交稻技术的利用,我国在水稻生产上取得了举世公认的成就。但是由于过去一直把如何解决人们的温饱问题放在第一位,所以水稻育种工作的重点大部分集中于水稻高产新品种的培育上,从而导致优质稻米的育种工作相对滞后,尤其是一些高产的杂交稻品质普遍偏差。
导致稻米品质改良进展较慢的一个主要原因是其遗传上的复杂性和传统研究手段的局限性。稻米的品质性状包括外观品质、加工品质、蒸煮品质、营养品质和食味品质等诸多方面。其中稻米蒸煮品质是评价稻米品质的最重要指标。蒸煮品质是指稻米在蒸煮过程中所表现出来的特性,主要由直链淀粉含量(Amylose Content,AC)、胶稠度(Gel Consistency,GC)、糊化温度(Gelatinization Temperature,GT)三个理化指标来评价。不同稻米品种的稻米品质变化范围很大,即使是在同一杂交组合后代中不同个体也有较大的差异,这说明稻米品质不仅仅受到单个基因的控制,可能受到多个基因的共同调控。GC是一个比较复杂的品质性状,各品种的差异较大,遗传基础比较复杂,所以研究进展一直较慢,并且各实验室对GC的QTL分析结果很不一致。导致稻米品质改良进展较慢的另一个主要原因是在传统育种手段的局限性。传统育种方法主要是对有利目标性状进行定向选择和固定,培育出优良新品种,这具有很大的盲目性和不可预测性(黎志康.我国水稻分子育种计划的策略.分子植物育种2005,3,603-608)。并且,个体选择的方法是对符合育种目标的农艺性状进行直接选择,即选择的是个体表现型而不是基因型。由于基因间存在一因多效、多因一效、调控基因以及修饰基因等的作用,个体的表现型与基因型往往存在较大差异,因而通过田间表型性状进行个体选择的准确性较差。分子标记辅助选择(Marker-assisted Selection,MAS)技术给水稻育种提供了新的途径,与传统育种技术相结合可大大提高育种效率,缩短育种周期。MAS的核心是把常规育种中的表型选择转化为基因型选择,它直接反映了DNA的序列差异,不受基因表达的影响,结果可靠性强,并且不受植物的生长发育阶段及环境条件的影响(冯建成.分子标记辅助选择技术在水稻育种上的应用.中国农学通报2006,22,43-47.)。但迄今可直接应用于GC育种的分子标记很少,如果能将阐明的控制稻米GC的各个基因的遗传变异转化为可操作的分子标记,结合MAS应用于稻米品质育种工作中,必将有效推进稻米品质的改良。
发明内容
本发明的目的是提供水稻稻米胶稠度调控基因分子标记及其应用。
本发明提供了一种辅助鉴别具有不同稻米胶稠度的水稻的方法,包括如下步骤:以待测水稻的基因组DNA为模板,用WxM1引物对进行PCR扩增,如果得到252bp的DNA片段,待测水稻的基因型为I型或II型,如果得到275bp的DNA片段,待测水稻的基因型为III型;以水稻的基因组DNA为模板,用WxM2引物对进行PCR扩增,用限制性内切酶Nhe I酶切PCR扩增产物,如果得到1018bp的DNA片段,待测水稻的基因型为I型或III型,如果得到644bp和374bp的DNA片段,待测水稻的基因型为II型;基因型为III型的水稻的稻米胶稠度高于基因型为I型的水稻的稻米胶稠度,基因型为I型的水稻的稻米胶稠度高于基因型为II型的水稻的稻米胶稠度;所述WxM1引物对由序列表的序列1所示DNA和序列2所示DNA组成;所述WxM2引物对由序列表的序列3所示DNA和序列4所示DNA组成。
本发明还保护一种专用引物,包括WxM1引物对和WxM2引物对;所述WxM1引物对由序列表的序列1所示DNA和序列2所示DNA组成;所述WxM2引物对由序列表的序列3所示DNA和序列4所示DNA组成。
所述专用引物具体可由所述WxM1引物对和所述WxM2引物对组成。
本发明还保护一种辅助鉴别具有不同稻米胶稠度的水稻的方法,包括如下步骤:以待测水稻的基因组DNA为模板,用WxM1引物对进行PCR扩增,得到252b的DNA片段的待测水稻的稻米胶稠度低于得到275bp的DNA片段的待测水稻的稻米胶稠度;所述WxM1引物对由序列表的序列1所示DNA和序列2所示DNA组成。
本发明同时保护由序列表的序列1所示DNA和序列2所示DNA组成的WxM1引物对。
本发明还保护一种辅助鉴别具有不同稻米胶稠度的水稻的方法,包括如下步骤:以待测水稻的基因组DNA为模板,用WxM2引物对进行PCR扩增,用限制性内切酶Nhe I酶切PCR扩增产物,得到644bp和374bp的DNA片段的待测水稻的稻米胶稠度低于得到1018bp的DNA片段的待测水稻的稻米胶稠度;所述WxM2引物对由序列表的序列3所示DNA和序列4所示DNA组成。
本发明同时保护由序列表的序列3所示DNA和序列4所示DNA组成的WxM2引物对。
所述专用引物、所述WxM1引物对或所述WxM2引物对可用于辅助鉴别具有不同稻米胶稠度的水稻。
所述专用引物、所述WxM1引物对或所述WxM2引物对可用于制备辅助鉴别具有不同稻米胶稠度的水稻的试剂盒。
所述方法、所述专用引物、所述WxM1引物对或所述WxM2引物对可用于水稻育种。
所述待测水稻为日本晴、苏御糯、太湖糯、春江06、江洲香糯、武运粳7号、桂香丝糯、桂朝2号、龙特甫B、台中本地1号、93-11、Kasalath、9308、明恢63和珍汕97B。
本发明涉及调控稻米胶稠度的4个基因,6对用于分子辅助育种的分子标记,本发明还涉及不同分子标记组合在不同栽培品种或育种材料的应用。本发明在明确水稻中控制胶稠度的基因调控网络是由1个主效基因(Wx)和3个微效基因(AGPiso、SBE3和ISA)组成的基础上,根据15个重要水稻材料中的遗传变异,设计了一系列分子标记(6对引物),它们的不同组合可以简便的将不同基因型区分,可直接应用于稻米胶稠度调控基因的分子筛选。本发明在稻米品质改良方面具有重要的理论价值和实践意义,在利用基因工程技术有目的改造稻米品质或分子标记辅助育种方面有直接的应用价值,在研究植物淀粉生物合成的机理方面有一定的理论价值。
附图说明
图1为Wx分子标记的验证a:聚类分析结果;b:应用WxM1引物对的电泳图;c:应用WxM2引物对的电泳图;1为Nipponbare,2为Longtefu B,3为Suyunuo。
图2为AGPiso分子标记的验证a:聚类分析结果;b:应用AGPisoM1引物对的电泳图;c:应用AGPisoM2引物对的电泳图;1为Nipponbare,2为93-11,3为Zhenshan97B,4为Suyunuo,5为Longtefu B。
图3为SBE3分子标记的验证a:聚类分析结果;b:应用SBE3M1引物对的电泳图;1为Nipponbare,2为Longtefu B。
图4为ISA分子标记的验证a:聚类分析结果;b:应用ISAM1引物对的电泳图;1为Nipponbare,2为Longtefu B。
具体实施方式
以下的实施例便于更好地理解本发明,但并不限定本发明。下述实施例中的实验方法,如无特殊说明,均为常规方法。下述实施例中所用的试验材料,如无特殊说明,均为自常规生化试剂商店购买得到的。下述实施例中的%,如无特殊说明,均为质量百分含量。以下实施例中的试验,均设置三次重复实验,结果一致。
调控稻米胶稠度(GC)的基因多态性分子标记引物见表1。
表1调控稻米GC的基因多态性分子标记引物
以下实施例的PCR扩增体系和参数,酶切体系和时间,电泳参数如下:
PCR扩增体系(20.0μl):2.0μl DNA模板,2.0μl引物,2.0μl dNTP,10.0μlGCI缓冲液,0.1μl Taq DNA聚合酶,用去离子水补足到20.0μl;PCR扩增体系中,DNA模板的浓度为0.2μg/μl,上游引物的浓度为2.5μM,下游引物的浓度为2.5μM,dNTP的浓度为2.5mM,Taq DNA聚合酶浓度为5Units/μl。
PCR扩增程序(扩增产物为500bp以上):94℃变性4分钟;然后94℃1分钟,58℃1分钟,72℃1分钟,重复45循环;最后延伸10分钟。
PCR扩增程序(扩增产物为500bp以下):94℃变性4分钟;然后94℃1分钟,58℃30秒,72℃30秒,重复45循环;最后延伸10分钟。
酶切体系(20.0μl):10.0ul DNA扩增产物,0.3ul内切酶,2.0ul缓冲液,用去离子水补足到20.0μl;酶切体系中,DNA扩增产物的浓度为0.05-0.2μg/μl,内切酶的浓度为10Units/μl。
酶切时间为12-16小时。
GCI缓冲液:购自Takara Bio INC(Cat.#RR02AG)。
所有内切酶均购自Biolab公司。
电泳参数:STS标记采用5%琼脂糖电泳,CAPS标记采用2%琼脂糖电泳。
实施例1、Wx分子标记的设计和应用
15个品种的水稻均获自中国农科院水稻研究所。采用《中华人民共和国农业部米质测定标准》所提供的方法检测15个品种的水稻的稻米胶稠度。经过聚类,基于Wx(GENBANK ACCESSION NO.GQ151053),15个水稻品种可分为3种基因型(见图1-a)。III型是栽培品种中的糯米,经过序列测定发现在糯稻中有一个23bp的重复序列插入,导致了基因的提前中止,这就是糯米GC值较高(平均值为91.47)的原因所在。II型的品种GC值较低(平均值为39.55),I型的品种GC值具中(平均值为61.59)。15个水稻品种的胶稠度和基于Wx基因的基因型见表2。
表215个水稻品种的稻米胶稠度和基于Wx基因的基因型
以水稻的基因组DNA为模板,用标记WxM1(序列1和序列2组成的引物对)进行PCR扩增,将PCR扩增产物进行电泳并测序验证电泳结果,I型和II型的品种得到252bp的DNA片段,III型的品种得到275bp的DNA片段。
以水稻的基因组DNA为模板,用标记WxM2(序列3和序列4组成的引物对)进行PCR扩增,用限制性内切酶Nhe I酶切PCR扩增产物,将酶切产物进行电泳并将PCR扩增产物进行测序(验证电泳结果),I型和III型的品种得到1018bp的DNA片段,II型的品种得到644bp和374bp的DNA片段。
结果表明:通过标记WxM1可将III型鉴别出来(见图1-b);用WxM2可将II型鉴别出来(见图1-c);两个分子标记的组合可以将三种不同基因型鉴别出来。
实施例2、AGPso分子标记的设计和应用
经过聚类,基于AGPiso基因,15个水稻品种可分为五种基因型(见图2-a)。在相同Wx基因型背景下,a型比其它基因型GC值略高。不同水稻品种的稻米胶稠度和基于Wx和AGPiso基因的基因型见表3。
表3基于Wx和AGPiso基因型的水稻品种稻米胶稠度
以水稻的基因组DNA为模板,用标记AGPisoM1进行PCR扩增,用限制性内切酶BstXI酶切PCR扩增产物,将酶切产物进行电泳并将PCR扩增产物进行测序(验证电泳结果),b型和c型的品种得到913bp、536bp和377bp的DNA片段,a型、d型和e型的品种得到536bp和377bp的DNA片段。
以水稻的基因组DNA为模板,用标记AGPisoM2进行PCR扩增,将PCR扩增产物进行电泳并测序验证电泳结果,a型的品种得到98bp的DNA片段,b型、c型、d型和e型的品种得到93bp的DNA片段。
结果表明:用AGPisoM1筛选时,带型分为两类,b型和c型带型一致,a型、d型和e型带型一致(见图2-b);用AGPisoM2筛选时,可将a型鉴别出来(见图2-c);但是d型和e型、b型和c型仍无法用这两个标记的组合鉴别,只能采用测序或者SNP的方法进行区分。
实施例3、SBE3分子标记的设计和应用
经过聚类,基于SBE3基因(GENBANK ACCESSION NO.GQ150913),15个水稻品种可分为两种基因型(见图3-a)。a型包括Nipponbare在内的9个品种,b型包括93-11在内的6个品种。在相同Wx基因型背景下,a型比b型GC平均值略高。不同水稻品种的稻米胶稠度和基于Wx和SBE3基因的基因型见表4。
表4基于Wx和SBE3基因型的水稻品种稻米胶稠度
以水稻的基因组DNA为模板,用标记SBE3M1进行PCR扩增,将PCR扩增产物进行电泳并测序验证电泳结果,a型的品种得到238bp的DNA片段,b型的品种得到210bp的DNA片段。
结果表明:通过标记SBE3M1可将两个基因型鉴别出来(见图3-b)。
实施例4、ISA分子标记的设计和应用
经过聚类,基于ISA基因(GENBANK ACCESSION NO.GQ150871),15个水稻品种可分为两种基因型(见图4-a)。a型包括6个品种,b型包括9个品种。在相同Wx基因型背景下,a型比b型GC平均值略高。不同水稻品种的稻米胶稠度和基于Wx和ISA基因的基因型见表5。
表5基于Wx和ISA基因型的水稻品种稻米胶稠度
以水稻基因组DNA为模板,用标记ISAM1进行PCR扩增,将PCR扩增产物进行电泳并测序验证电泳结果,a型的品种得到136bp的DNA片段,b型的品种得到126bp的DNA片段。
结果表明:通过标记ISAM1可将两个基因型鉴别出来(见图4-b)。
Claims (10)
1.一种辅助鉴别具有不同稻米胶稠度的水稻的方法,包括如下步骤:以待测水稻的基因组DNA为模板,用WxM1引物对进行PCR扩增,如果得到252bp的DNA片段,待测水稻的基因型为I型或II型,如果得到275bp的DNA片段,待测水稻的基因型为III型;以水稻的基因组DNA为模板,用WxM2引物对进行PCR扩增,用限制性内切酶Nhe I酶切PCR扩增产物,如果得到1018bp的DNA片段,待测水稻的基因型为I型或III型,如果得到644bp和374bp的DNA片段,待测水稻的基因型为II型;基因型为III型的水稻的稻米胶稠度高于基因型为I型的水稻的稻米胶稠度,基因型为I型的水稻的稻米胶稠度高于基因型为II型的水稻的稻米胶稠度;所述WxM1引物对由序列表的序列1所示DNA和序列表的序列2所示DNA组成;所述WxM2引物对由序列表的序列3所示DNA和序列表的序列4所示DNA组成。
2.专用引物,包括WxM1引物对和WxM2引物对;所述WxM1引物对由序列表的序列1所示DNA和序列表的序列2所示DNA组成;所述WxM2引物对由序列表的序列3所示DNA和序列表的序列4所示DNA组成。
3.如权利要求2所述的专用引物,其特征在于:所述专用引物由所述WxM1引物对和所述WxM2引物对组成。
4.一种辅助鉴别具有不同稻米胶稠度的水稻的方法,包括如下步骤:以待测水稻的基因组DNA为模板,用WxM1引物对进行PCR扩增,得到252bp的DNA片段的待测水稻的稻米胶稠度低于得到275bp的DNA片段的待测水稻的稻米胶稠度;所述WxM1引物对由序列表的序列1所示DNA和序列表的序列2所示DNA组成。
5.由序列表的序列1所示DNA和序列表的序列2所示DNA组成的WxM1引物对。
6.一种辅助鉴别具有不同稻米胶稠度的水稻的方法,包括如下步骤:以待测水稻的基因组DNA为模板,用WxM2引物对进行PCR扩增,用限制性内切酶Nhe I酶切PCR扩增产物,得到644bp和374bp的DNA片段的待测水稻的稻米胶稠度低于得到1018bp的DNA片段的待测水稻的稻米胶稠度;所述WxM2引物对由序列表的序列3所示DNA和序列表的序列4所示DNA组成。
7.由序列表的序列3所示DNA和序列表的序列4所示DNA组成的WxM2引物对。
8.权利要求2或3所述专用引物、权利要求5所述WxM1引物对或权利要求7所述WxM2引物对在辅助鉴别具有不同稻米胶稠度的水稻中的应用。
9.权利要求2或3所述专用引物、权利要求5所述WxM1引物对或权利要求7所述WxM2引物对在制备辅助鉴别具有不同稻米胶稠度的水稻的试剂盒中的应用。
10.权利要求1、4或6所述方法、权利要求2或3所述专用引物、权利要求5所述WxM1引物对或权利要求7所述WxM2引物对在水稻育种中的应用。
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