CN111394492B - 调控稻米直链淀粉含量和胶稠度相关的多效qtl、分子标记及应用 - Google Patents

Abstract

本发明涉及水稻育种及分子生物学技术领域，公开了调控稻米直链淀粉含量和胶稠度相关的多效QTL、分子标记及应用。其中多效QTL命名为qAC&GC‑1，位于4号染色体DNA片段上，遗传距离为10.1cM‑12.2cM，物理距离为4207206bp‑4766887bp，直链淀粉含量和胶稠度的LOD值分别为6.03和5.48。分子标记分别命名为Indel Tal‑1和Indel Tal‑2。该多效QTL可有效增加稻米直链淀粉含量和胶稠度，在水稻分子辅助育种的过程中，可以加快培育出稻米直链淀粉含量适中和胶稠度较高的水稻，优化稻米品质。该方法简便易行，安全有效，有益于提升稻米品质，适于大规模推广应用。

Description

调控稻米直链淀粉含量和胶稠度相关的多效QTL、分子标记及应用

技术领域

本发明涉及水稻育种及分子生物学技术领域，尤其涉及调控稻米直链淀粉含量和胶稠度相关的多效QTL、分子标记及应用。

背景技术

水稻是主要的粮食作物，随着科技的发展以及生活水平的日益提高，人们对于稻米品质的检查以及评价体系都提出了更高的要求。在稻米的评价体系中，主要参考的数据为稻米的外观、加工、蒸煮、营养和食味等方面。其中蒸煮品质是最为重要的项目，其特征主要由以下三个理化指标来评价，分别是直链淀粉含量（Amylose Content，AC）、胶稠度（GelConsistency，GC）以及糊化温度（Gelatinization Temperature，GT），其中最主要的是直链淀粉含量。

直链淀粉含量作为三个理化指标中最重要的指标，历来受到育种家的关注。一般而言直链淀粉含量适中的品种，其口感较好。近年来随着需求的多样化，高直链淀粉含量的稻米也受到人们的喜爱，主要是因为直链淀粉含量高的稻米生糖指数低，能够有效降低人体血糖含量。同时此类稻米也是良好的膳食纤维材料，因为高直链淀粉具有改善肠胃的功能，可以作为保健食品。另有研究发现，高直链淀粉有预防肠道癌心血管疾病的功能。在稻米蒸煮过程中，AC值直接影响稻米水分的吸收、体积的扩张及饭粒的裂性，是决定食味品质和加工特性最为重要的性状之一，因此如何快速准确测量出稻米中的直链淀粉含量对于优质稻米的选育具有重大的意义。

胶稠度指的是稻米淀粉经稀碱热糊化后冷却一段时间，放置在水平台上，米胶能够延伸的长度。胶稠度与米饭的口感、黏滞性和硬度等指标有着显著的直接关联性，故而该指标对于快速评价稻米食味品质也具有重要的意义。研究发现，在一定的范围内，胶稠度越软，米饭越柔软。

目前由于稻米品质遗传的复杂性和传统育种手段的局限性，稻米品质改良进展较慢。为了持续开发出具有合适直链淀粉含量和合适胶稠度的水稻新品种，这一现状亟需改变。

发明内容

为了解决上述技术问题，本发明提供了调控稻米直链淀粉含量和胶稠度相关的多效QTL、分子标记及应用。本发明发现的与稻米直链淀粉含量和胶稠度相关的多效QTL可以有效地增加稻米直链淀粉含量和胶稠度，在育种过程中可以使稻米的蒸煮品质得到有效提升，同时可加快优化水稻品种的进程。在水稻分子辅助育种的过程中，可以培育稻米直链淀粉含量和胶稠度较合适的水稻，优化稻米品质。此种方法简便易行，安全有效，有益于提升稻米品质，从而提高水稻品种的经济价值，适于大规模推广应用。

本发明的具体技术方案为：

第一方面，本发明发现了一个调控稻米直链淀粉含量和胶稠度相关的多效QTL，命名为 qAC&GC-1，位于水稻4号染色体DNA片段上，遗传距离为10.1cM-12.2cM，物理距离为4207206bp-4766887bp，直链淀粉含量和胶稠度的LOD值分别为6.03和5.48。

上述多效QTL与稻米直链淀粉含量和胶稠度显著相关。由于稻米直链淀粉含量和胶稠度是检测稻米蒸煮品质的重要指标，对改良水稻蒸煮品质及稻米口感具有重要意义，因此，在获得该多效QTL后，进一步开发该多效QTL紧密连锁的分子标记，检测水稻品种或品系中是否该QTL，即可加快水稻优异品种的选育进程。

第二方面，本发明提供了上述多效QTL的定位方法，包括以下步骤：

1）以粳稻热研2号（中高直链淀粉含量和软胶稠度）、籼稻华占（中等直链淀粉含量和中胶稠度）为亲本进行杂交，通过单粒传法，获得120个稳定遗传的株系，共同组成RILs群体；

2）考察RILs群体稻米直链淀粉含量和胶稠度相关表型数据；

3）利用SNP和Indel标记构建的遗传图谱，通过R-QTL专业软件分析整个染色体组的标记和数量性状表型值的关系，将QTL逐一定位到连锁群的相应位置，并估计其遗传效应；若检测到LOD>3的分子标记，则认为LOD值最高处对应的2个标记间存在1 个QTL。

第三方面，本发明提供了与上述多效QTL紧密连锁的两对分子标记，分别命名为Indel Tal-1和Indel Tal-2；

其中，所述Indel Tal-1的引物对如下：

上游引物的序列如SEQ ID NO:1所示：5’-ACGCCAGCTCAAGAATCAAG-3’，

下游引物的序列如SEQ ID NO:2所示：5’-TGGTTCTTGTGGTGAGGTTATG-3’；

所述Indel Tal-2的引物对如下：

上游引物的序列如SEQ ID NO:3所示：5’-GTCGATCATTAGGGCTCTCG-3’，

下游引物的序列如SEQ ID NO:4所示：5’-ATGCAGGGCCATTTGTTAAG-3’。

上述两对分子标记的标记多态性好，选择方便，高效。

第四方面，本发明将两对分子标记在选育合适稻米直链淀粉含量和合适胶稠度水稻品种中的应用：通过分子标记检测水稻品种或品系中是否具有与稻米直链淀粉含量和胶稠度相关的多效QTL。

本发明利用分子标记方法进行筛选，可鉴别不同稻米直链淀粉含量和胶稠度，从而定向选择，大大提高了育种效率，可加快水稻优异品种的选育进程。

具体地，对待鉴定水稻材料的DNA进行PCR扩增，扩增产物进行电泳检测，如扩增出目的DNA片段，则标志着存在调控稻米直链淀粉含量和胶稠度的多效QTL。

作为优选，PCR扩增时的PCR反应体系为：

上游引物1μL；

下游引物1μL；

DNA模板2μL；

mix酶6μL。

反应程序为：94℃预变性3min，94℃预变性30s，57℃退火30s，72℃延伸30s，扩增38个循环，最后72℃终延伸10min。

作为优选，所述PCR扩增产物在4%琼脂糖凝胶中进行电泳检测。

与现有技术对比，本发明的有益效果是：

1、目前由于稻米品质遗传的复杂性和传统育种手段的局限性，稻米品质改良进展较慢。本发明以粳稻品种热研2号为母本、籼稻品种华占为父本杂交，通过单粒传法，获得120个稳定遗传的株系，共同组成RILS群体，对这套群体各个株系稻米直链淀粉含量和胶稠度进行了测定，同时利用该群体已构建的加密遗传图谱对数据进行QTL作图分析，结果检测到1个同时调控稻米直链淀粉含量和胶稠度的多效QTL位点，其LOD值分别高达6.03和5.48。本发明的发明点在于构建的遗传连锁图谱密度高，有4858个标记均匀分布于12条染色体上，QTL定位更精确。

2、本发明发现的与稻米直链淀粉含量和胶稠度相关的多效QTL与稻米直链淀粉含量和胶稠度显著相关，本发明的分子标记，其标记多态性非常好，对水稻后代筛选更方便、高效；在育种过程中可以使稻米的蒸煮品质得到有效提升，同时可加快优化水稻品种的进程。在水稻分子辅助育种的过程中，可以培育稻米直链淀粉含量和胶稠度较合适的水稻，优化稻米品质。此种方法简便易行，安全有效，有益于提升稻米品质，从而提高水稻品种的经济价值，适于大规模推广应用。

附图说明

图1是调控稻米直链淀粉含量和胶稠度的多效QTL定位方法中遗传材料构建流程图。

图2是对RILs群体中稻米直链淀粉含量的统计柱状图。其中，HZ代表亲本华占，NK2代表亲本热研2号。

图3是对RILs群体中稻米胶稠度的统计柱状图。其中，HZ代表亲本华占，NK2代表亲本热研2号。

图4是分子标记Indel Tal-1的引物对在亲本热研2号、93-11及其F₁代和以93-11为轮回亲本的BC₃F₁代中扩增产生的电泳图。其中，1为热研2号、2为93-11、3为热研2号/93-11杂交后代F₁、4-10为以93-11为轮回亲本的BC₃F₁代中扩增产生的电泳图。

图5是分子标记Indel Tal-2的引物对在亲本热研2号、93-11及其F₁代和以93-11为轮回亲本的BC₃F₁代中扩增产生的电泳图。其中，1为热研2号、2为93-11、3为热研2号/93-11杂交后代F₁、4-10为以93-11为轮回亲本的BC₃F₁代中扩增产生的电泳图。

图6是调控稻米直链淀粉含量和胶稠度的多效QTL  qAC&GC-1在4号染色体上的位置。

具体实施方式

下面结合实施例对本发明作进一步的描述。

实施例

1、实验材料的获取

水稻品种华占直链淀粉含量和胶稠度较低，以华占为供体亲本，本地水稻品种热研2号为受体亲本，进行杂交构建RILs，利用单粒传法（即，对F₁进行套袋单株受种处理，直至后代株系表型不发生分离），最终得了120个稳定遗传的株系（F₁₃，所有株系表型稳定），如图1所示。

选取亲本与各株系种子（F₁₃）各60粒，表面消毒后浸种2天，再用湿润的毛巾包裹，置于37℃恒温箱中催芽48 h后，挑选露白一致的种子播种。30天后，选择生长状况相似的亲本及各株系秧苗各24株移栽，所有水稻材料种植于浙江省金华市浙江师范大学生化学院试验田，常规管理。

2、直链淀粉含量的测定

将稻米粉碎至细粉以破坏淀粉的胚乳结构，使其易于完全分散及糊化，准确称取待用的稻米样品50 mg，置于50 mL容量瓶中，加入0.5 mL 95%乙醇，轻轻摇晃容量瓶，使得样品湿润充分，再加入4.5 mL 1.00 mol/L的氢氧化钠溶液，加入的过程中，使碱液沿颈壁缓慢留下，旋转容量瓶，使碱液冲洗沾附于瓶壁上的样品。37℃恒温过夜，取出后冷却至室温，加蒸馏水定容。吸取0.5 mL样品溶液，加入已有蒸馏水的5 mL试管中，再在试管中加入0.1 mL 1.00 mol/L的乙酸溶液，使样品酸化，加入0.2 mL碘液，充分摇匀。用蒸馏水定容，静置20分钟。以0.09 mol/L氢氧化钠溶液代替样品，配制空白溶液。用空白溶液于分光光度计波长620 nm处调节零点并测出有色样品液的吸光值。

标准曲线的绘制：称取与待测样品保存在同样条件下三天以上的高、中、低已知直链淀粉含量的标准样品（其直链淀粉含量预先经ISO 6647-1987或GB 7648方法准确测定）各0.1000 g，用上述改进简化法与待测样品同时进行测定。以标样的直链淀粉含量为纵坐标，以相对的吸光度为横坐标，绘制标准曲线并列出曲线的回归方程。

稻米样品的直链淀粉的含量以直链淀粉占干重的百分比表示，可根据样品的吸光度值从直链淀粉标准曲线上直接读出，或从标准曲线的回归方程式中求出。重复测定二次，记录各组数据，计算平均值。

如图2所示，NK2代表水稻品种热研2号，HZ代表水稻品种华占；根据图2可得知稻米直链淀粉含量数据表现为连续正态分布且范围广泛，有较多超亲个体存在，表现出数量性状的遗传特点。

3、胶稠度的测定

将稻米粉碎至细粉以破坏淀粉的胚乳结构，使其易于完全分散及糊化，将样品过100目的尼龙筛，标记待用。称量待测样品烘干前的质量，并记为m1，105℃下烘干至恒重（时间大约在8小时左右），测得样品烘干后的质量为m2，则种子水分（%）=（m1-m2）/m1×100%，测得样品的水分后，称取88 mg干重精米粉样，置于试管内，加入0.20 mL百里酚蓝指示剂，用振荡器加以振荡，并使得样品充分湿润分散。准确加入0.200 mol/L氢氧化钾溶液2.0 mL，再次用振荡器充分振荡。混合均匀后立即放入剧烈沸腾的水浴中，用玻璃球盖住试管口，调节水面高度，使沸腾的米胶高度始终维持在试管长度的三分之二左右，糊化时间为8分钟。糊化完毕后，取出试管，取下玻璃球，在室温下冷却5分钟后，再将试管放置在冰水浴中冷却20分钟。在室温25±2℃下，将试管水平放置在水平台上。1小时后，用游标卡尺量出试管底至冷胶前沿的长度，以毫米表示，即为样品的胶稠度。重复测定两次，记录各组数据，计算平均值。

如图3所示，NK2代表水稻品种热研2号，HZ代表水稻品种华占；根据图3可得知稻米胶稠度数据表现为连续正态分布且范围广泛，有较多超亲个体存在，表现出数量性状的遗传特点。

4、QTL定位分析

利用实验室前期开发的大量的SNP和Indel标记构建的遗传图谱，对稻米直链淀粉含量和胶稠度分别进行数量性状座位（QTL）区间作图，通过R-QTL专业软件分析整个染色体组的标记和数量性状表型值的关系，将QTL逐一定位到连锁群的相应位置，并估计其遗传效应。若检测到LOD>3的分子标记，则认为LOD值最高处对应的2个标记间存在1个QTL(如图6所示)。在整个染色体组中我们找到位于第4染色体上的Indel Tal-1标记和Indel Tal-2标记之间的一个多效QTL，其遗传距离为10.1cM-12.2cM，物理距离为4207206bp-4766887bp，并命名为 qAC&GC-1 (如图6所示)。

5、与稻米直链淀粉含量和胶稠度相关的多效QTL位点的分子标记的应用

在QTL位点 qAG&GC-1上下游分别设定分子标记Indel Tal-1和分子标记IndelTal-2。取亲本热研2号、华占及其F₁代和RILs群体的水稻叶片，提取基因组DNA，利用上述分子标记对其基因组DNA进行PCR扩增，PCR反应体系：上游引物（序列如SEQ ID NO:1或SEQ IDNO:3所示）1μL，下游引物（序列如SEQ ID NO:2或SEQ ID NO:4所示）1μL，DNA模板2μL，mix酶6μL。反应程序为DNA94℃预变性3min，94℃预变性30s，57℃退火30s，72℃延伸30s，扩增38个循环，最后72℃终延伸10min。PCR扩增产物在4%琼脂糖凝胶电泳检测。通过带型分析来确定是否存在相应的标记，若条带趋向于亲本热研2号，则说明该株系稻米的直链淀粉含量偏中高和胶稠度偏中等，若趋向华占则说明直链淀粉含量偏低和胶稠度偏软。随后对受试株系稻米的直链淀粉含量和胶稠度与预测结果进行比对，结果显示预测结果与实际检测结果相吻合。

6、稻米直链淀粉含量和胶稠度相关的QTL在水稻育种中的应用

5中设定的分子标记可应用于水稻分子辅助育种，具体实施方式为，将其他稻米直链淀粉含量和胶稠度较高的水稻品种，如93-11，与热研2号进行杂交，获得相应的F₁，以93-11为轮回亲本进行回交，至BC₃F₁代。提取BC₃F₁代部分单株DNA，然后用Indel标记Tal-1和Tal-2的引物进行PCR扩增，通过带型分析来确定是否存在相应的标记（如图4和图5所示）。利用该方法进行筛选，定向选择，可获得稻米直链淀粉含量低和胶稠度偏软且保留了93-11优良性状的水稻，大大提高了育种效率。

综上所述，本发明的与稻米直链淀粉含量和胶稠度相关的多效QTL可以有效地增加稻米直链淀粉含量和胶稠度，在育种过程中可以使稻米的蒸煮品质得到有效提升，同时可加快优化水稻品种的进程。在水稻分子辅助育种的过程中，可以培育稻米直链淀粉含量适中和胶稠度较高的水稻，优化稻米品质。此种方法简便易行，安全有效，有益于提升稻米品质，从而提高水稻品种的经济价值，适于大规模推广应用。

本发明中所用原料、设备，若无特别说明，均为本领域的常用原料、设备；本发明中所用方法，若无特别说明，均为本领域的常规方法。

以上所述，仅是本发明的较佳实施例，并非对本发明作任何限制，凡是根据本发明技术实质对以上实施例所作的任何简单修改、变更以及等效变换，均仍属于本发明技术方案的保护范围。

序列表

<110> 中国水稻研究所

<120> 调控稻米直链淀粉含量和胶稠度相关的多效QTL、分子标记及应用

<130> 2019

<160> 4

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 20

<212> DNA

<213> 水稻分子标记上游引物(Indel Tal-1)

<400> 1

acgccagctc aagaatcaag 20

<210> 2

<211> 22

<212> DNA

<213> 水稻分子标记下游引物(Indel Tal-1)

<400> 2

tggttcttgt ggtgaggtta tg 22

<210> 3

<211> 20

<212> DNA

<213> 水稻分子标记上游引物(Indel Tal-2)

<400> 3

gtcgatcatt agggctctcg 20

<210> 4

<211> 20

<212> DNA

<213> 水稻分子标记下游引物(Indel Tal-2)

<400> 4

atgcagggcc atttgttaag 20

Claims (5)

1.一种与调控稻米直链淀粉含量和胶稠度相关的多效QTL紧密连锁的两对分子标记，其特征在于，

所述多效QTL命名为qAC&GC-1，位于水稻4号染色体DNA片段上，遗传距离为10.1cM-12.2cM，物理距离为4207206bp-4766887bp，直链淀粉含量和胶稠度的LOD值分别为6.03和5.48；

所述两对分子标记分别命名为Indel Tal-1和Indel Tal-2；

其中，所述Indel Tal-1的引物对如下：

上游引物的序列如SEQ ID NO:1所示：5’-ACGCCAGCTCAAGAATCAAG-3’，

下游引物的序列如SEQ ID NO:2所示：5’-TGGTTCTTGTGGTGAGGTTATG-3’；

所述Indel Tal-2的引物对如下：

上游引物的序列如SEQ ID NO:3所示：5’-GTCGATCATTAGGGCTCTCG-3’，

下游引物的序列如SEQ ID NO:4所示：5’-ATGCAGGGCCATTTGTTAAG-3’。

2.如权利要求1所述两对分子标记在选育水稻品种中的应用，其特征在于，通过分子标记检测水稻品种或品系中是否具有与稻米直链淀粉含量和胶稠度相关的多效QTL。

3.如权利要求2所述的应用，其特征在于，对待鉴定水稻材料的DNA进行PCR扩增，扩增产物进行电泳检测，如扩增出目的DNA片段，则标志着存在调控稻米直链淀粉含量和胶稠度的多效QTL。

4.如权利要求3所述的应用，其特征在于，PCR扩增时的PCR反应体系为：

上游引物1μL；

下游引物1μL；

DNA模板2μL；

mix酶6μL；

反应程序为：94℃预变性3min，94℃预变性30s，57℃退火30s，72℃延伸30s，扩增38个循环，最后72℃终延伸10min。

5.如权利要求3或4所述的应用，其特征在于，所述PCR扩增产物在4%琼脂糖凝胶中进行电泳检测。

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