CN110157834B

CN110157834B - 与玉米高赖氨酸性状相关的snp位点oe2-5及其应用

Info

Publication number: CN110157834B
Application number: CN201910584407.6A
Authority: CN
Inventors: 宋伟; 赵久然; 苏爱国; 王帅帅; 卢柏山; 史亚兴; 徐丽
Original assignee: Beijing Academy of Agriculture and Forestry Sciences
Current assignee: Beijing Academy of Agriculture and Forestry Sciences
Priority date: 2019-07-01
Filing date: 2019-07-01
Publication date: 2022-04-19
Anticipated expiration: 2039-07-01
Also published as: CN110157834A

Abstract

本发明公开了与玉米高赖氨酸性状相关的SNP位点OE2‑5及其应用。本发明提供了检测玉米基因组中opaque‑2基因(o2基因)的SNP位点OE2‑5的基因型的物质在鉴定或辅助鉴定待测玉米籽粒赖氨酸含量中的应用；所述SNP位点OE2‑5为玉米基因组中opaque‑2基因的第五外显子区域第2136位。本发明的实验证明，OE2‑5标记与籽粒赖氨酸含量表型具有很好的相关性，即OE2‑5标记可以作为赖氨酸含量的分子标记，用于辅助高赖氨酸糯玉米种质改良。利用OE2‑5标记进行高赖氨酸opaque‑2基因的分子标记辅助选择，可以在回交转育过程的回交群体中鉴定筛选到基因型为O2o2的个体。

Description

与玉米高赖氨酸性状相关的SNP位点OE2-5及其应用

技术领域

本发明属于生物技术领域，尤其涉及一种与玉米高赖氨酸性状相关的SNP位点OE2-5及其应用。

背景技术

普通玉米籽粒中蛋白质含量一般为10％左右，并且其中50-60％是营养价值极低的醇溶胶蛋白，这种蛋白缺乏人体和单胃动物营养所必需的氨基酸，特别是赖氨酸(lysine)和色氨酸。赖氨酸是防癌抗癌、增强免疫功能，促进人体正常发育的关键物质，但是不能自身合成，只能从体外摄入。鲜食玉米风味独特，营养丰富，是一种作为水果和蔬菜直接进行食用的玉米类型。

利用回交转育的方法，可以实现高赖氨酸性状o2基因的定向改良。利用传统的育种方法把高赖氨酸基因导入到轮回亲本选育自交系时，由于该性状是隐性单基因控制，需要对回交1代自交，在分离的自交后代中选择籽粒赖氨酸含量高的植株继续回交，然后自交、回交、再自交，直至回交多代遗传背景与轮回亲本基本一致，再自交2代，才能获得性状稳定的高赖氨酸自交系。而且籽粒赖氨酸含量的测定方法复杂，成本高。可见，利用常规回交转育方法，对于隐性单基因控制的性状来说，需要使用回交、自交交替的方法，同时依赖表型鉴定才能将目标性状准确的选择出来，选系时间长、成本高、效率低。

分子标记辅助育种，不依赖于表型选择，即不受环境、基因互作、基因与环境互作等因素的影响，而是直接对基因型进行选择，因而能大大提高育种效率。SNP标记作为第三代分子标记，与SSR标记相比具有以下优势：一是在基因组中密度更高分布更均匀；二是易实现数据整合比较；三是多数SNP变异与基因功能密切相关；四是易实现数据统计的自动化。因此，开发高赖氨酸SNP分子标记，利用分子标记对玉米高赖氨酸性状进行选择，对高赖氨酸鲜食玉米自交系选育有着独特的优势。

发明内容

为了开发玉米高赖氨酸SNP分子标记，本发明提供了如下技术方案：

本发明提供了检测玉米基因组中opaque-2基因(o2基因)的SNP位点OE2-5的基因型的物质在鉴定或辅助鉴定待测玉米籽粒赖氨酸含量中的应用；

所述SNP位点OE2-5为玉米基因组中opaque-2基因的第五外显子区域第2136位。

上述应用中，所述SNP位点OE2-5基因型为TT或CC或TC。

或，本发明提供了检测玉米基因组中opaque-2基因的SNP位点OE2-5的基因型的物质在选育籽粒高赖氨酸玉米中的应用；

上述应用中，所述检测玉米基因组中opaque-2基因的SNP位点OE2-5基因型的物质如下1)或2)：

1)KASP成套引物，

所述KASP成套引物由序列表中序列1所示的单链DNA分子或其衍生物、序列表中序列2所示的单链DNA分子或其衍生物和序列表中序列3所示的单链DNA分子或其衍生物组成；

2)含有所述成套引物的PCR试剂或试剂盒。

上述应用中，所述序列表中序列1所示的单链DNA分子的衍生物为如下1)或2)：

1)序列1所示的单链DNA分子的5'端连接一种荧光序列或荧光基团；

2)序列1所示的单链DNA分子经过一个或几个核苷酸的取代和/或缺失和/或添加且与序列1具有相同功能的DNA分子的5'端连接一种荧光序列或荧光基团；

所述序列表中序列2所示的单链DNA分子的衍生物为如下3)或4)：

3)序列2所示的单链DNA分子的5'端连接另一种荧光序列或荧光基团；

4)序列2所示的单链DNA分子经过一个或几个核苷酸的取代和/或缺失和/或添加且与序列2具有相同功能的DNA分子的5'端连接另一种荧光序列或荧光基团；

所述序列表中序列3所示的单链DNA分子的衍生物为序列3所示的单链DNA分子经过一个或几个核苷酸的取代和/或缺失和/或添加且与序列3具有相同功能的DNA分子；

或，所述荧光基团为FAM或HEX。

或，本发明提供了一种鉴定或辅助鉴定待测玉米籽粒赖氨酸含量的方法，为检测玉米基因组中opaque-2基因上的SNP位点OE2-5的基因型是TT还是CC,SNP位点OE2-5基因型为TT的待测玉米的籽粒赖氨酸含量大于SNP位点OE2-5基因型为CC的待测玉米的籽粒赖氨酸含量。

或，本发明提供了一种选育籽粒高赖氨酸含量玉米的方法，为检测玉米基因组中opaque-2基因上的SNP位点OE2-5基因型是TT还是CC,

选育SNP位点OE2-5基因型为TT的待测玉米，得到籽粒高赖氨酸含量的玉米；

上述方法中，所述检测玉米基因组中突变基因opaque-2上的SNP位点OE2-5基因型是TT还是CC的方法，或所述检测玉米基因组中突变基因opaque-2上的SNP位点OE2-5基因型是TT、CC还是TC的方法，为如下A)或B)：

A)直接测序；

B)用上述成套引物对所述待测玉米基因组DNA进行KASP检测，实现基因分型。

或，本发明提供了一种鉴定或辅助鉴定待测玉米赖氨酸含量的产品，为上述应用中的检测玉米基因组中opaque-2基因上的SNP位点OE2-5的基因型的物质。

上述待测玉米为高赖氨酸含量玉米和其他非高赖氨酸玉米杂交后的自交F2代，具体为JN6和CML165杂交后的自交F2代群体或BN2和CML189杂交后的自交F2代群体或表2所示的19种种质。

本发明的实验证明，利用OE2-5标记进行高赖氨酸opaque-2基因的分子标记辅助选择，一是可以在回交转育过程的回交群体中鉴定筛选到基因型为O2o2的个体，而利用化学分析法检测表型则无法筛选出基因型杂合的个体，因为opaque-2基因为隐性突变，只有基因型为o2o2时才表现为高赖氨酸；二是可以在自交分离群体中鉴定筛选到基因型为o2o2的个体，比利用常规化学分析法进行高赖氨酸表型数据检测成本低、速度快；三是利用OE2-5标记直接对opaque-2基因进行检测，可以在鲜食玉米植株生长的早期提取叶片DNA，不需要等到适采期籽粒灌浆结束以后；四是利用常规化学法对玉米籽粒进行高赖氨酸表型检测，需要剥取籽粒，对果穗产生破坏；而利用OE2-5标记检测opaque-2基因，可以利用叶片提取DNA。

附图说明

图1为高赖氨酸标记OE2-5和OE2-1在F2群体中的分型图。

具体实施方式

下述实施例中所使用的实验方法如无特殊说明，均为常规方法。

下述实施例中所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。

下述实施例中部分材料如下：

玉米材料CML165记载在如下文献中：外引优质蛋白玉米自交系利用潜力评析，广西农业科学，2001，4：177-179；

玉米材料CML189记载在如下文献中：外引优质蛋白玉米自交系利用潜力评析，广西农业科学，2001，4：177-179；

京科糯2000母本京糯6记载在如下文献中：不同新型除草剂加倍糯玉米单倍体的效率研究，种子，2017，36(5)：71-73；

京科糯2000父本BN2记载在如下文献中：不同新型除草剂加倍糯玉米单倍体的效率研究，种子，2017，36(5)：71-73。

下述实施例中赖氨酸含量检测方法如下：

用化学分析法测定赖氨酸含量(干基)的方法参照农业行业标准NY/T56-1987。

实施例1、与高赖氨酸相关的SNP位点OE2-5的筛选及KASP引物的获得

将高赖氨酸(opague-2)玉米材料CML165和CML189作为供体，自主选育优良品种京科糯2000的双亲京糯6(以下简写JN6)和BN2作为受体，开发高赖氨酸opaque-2基因的SNP分子标记，用于材料改良过程中的分子标记辅助前景选择。

一、与高赖氨酸相关的SNP位点的筛选

1、试验材料

京科糯2000的母本京糯6，父本BN2，为国内优良糯玉米骨干系，由北京市农林科学院玉米研究中心选育并提供，赖氨酸含量分别为0.33％、0.32％。

CML165和CML189为引自CIMMYT高赖氨酸(opague-2，基因型o2o2)种质材料，赖氨酸含量均为0.46％(玉米籽粒中赖氨酸含量在0.4％以上，即为高赖氨酸玉米)。

2、SNP标记开发

利用NCBI基因组数据库(https://www.ncbi.nlm.nih.gov/)，下载玉米参考基因组B73的opague-2基因(简称o2)序列(LOCUS，NC_024465)。

Primer-BLAST软件设计引物，扩增上述4个自交系该基因的编码区序列。扩增引物序列信息为F：GTTTTGCCGTGCTTGACCAT，R：TCTTCGCCGTTCATCAGCTT。SanPrep柱式DNA胶回收试剂盒回收PCR扩增产物，连接于T-Vector pMD19载体，由北京天一辉远生物科技有限公司测序。

利用Lasergene的MegAlign软件，比对高赖氨酸组(CML165和CML189)和低赖氨酸组(JN6和BN2)opague-2基因的编码区序列。

序列比对分析发现，高、低赖氨酸材料在opaque-2基因的第五外显子区域第2136bp处存在稳定的T/C的碱基变异、在第六外显子区域第2372、2373bp处存在TG/的2bp插入缺失变异。根据LGC公司的KASP高通量技术平台SNP标记引物设计原则，设计分子标记OE2-5和OE2-1，用于高赖氨酸材料改良过程中的分子标记辅助选择。

KASP引物序列如下：

OE2-5：

Primer AlleleFAM：CCTGCTGAGGCGCATTGCC(序列1)，5'末端标记FAM基团(蓝色)；

Primer AlleleHEX：GCCTGCTGAGGCGCATTGCT(序列2)，5'末端标记HEX基团(红色)；

Primer Common：CGTTAGCGTCGTTGTACTTCTGGTT(序列3)

OE2-5标记对应的SNP位点OE2-5为玉米基因组中o2基因(opaque-2基因，opaqueendosperm 2,NC_024465，提交日2017.12.18，序列4)的第五外显子区域第2136bp位，SNP位点OE2-5基因型为TT或CC或TC。

OE2-1(针对第六外显子区域第2372、2373bp处2bp插入缺失变异设计的OE2-1)：

Primer AlleleFAM：GGCATGGACGACGGCACTC，该核苷酸的5'末端标记FAM基团；

Primer AlleleHEX：GGCATGGACGACGGCACTG，该核苷酸的5'末端标记HEX基团；

Primer Common：AAGCGGGTGATAGAGATGAGCTCAT

OE2-1标记对应的INDEL位点OE2-1为玉米基因组中o2基因(opaque endosperm2,NC_024465，提交日2017.12.18，序列4)的第六外显子区域第2372、2373位，INDEL位点OE2-1的基因型为TG/TG或-/-或TG/-。

3、SNP标记检测

1)DNA提取

第一年5月在北京基地(春播)，将自交系JN6和BN2作为母本，分别与高赖氨酸的自交系CML165和CML189进行杂交，组配2组F1代材料(JN6/CML165、BN2/CML189)。同年10月在三亚基地(秋播)种植F1自交，收获2个组合对应的F2果穗。次年5月在北京基地播种2个组合的F2群体，单株挂牌取样提取DNA。以亲本JN6、BN2、CML165和CML189为对照。

2)KASP检测

以上述1)的DNA为模板，用OE2-5标记进行KASP扩增；

KASP筛选引物试验的简要工作流程为：将母液板DNA稀释到20ng/μl为Master板；利用LGC公司的Replikator孔板复制机，选定合适的模式进行分液至1536孔的Working板，并将分液数据导入Kraken系统；利用干燥箱，烘干Working板中的DNA；利用Merdian微量分液器，加入对应的引物和反应液，同时保存分液信息；Fusion激光封膜仪进行样品孔封口后，利用Hydrocycler水浴锅进行Touch-down PCR反应；最后利用BMG Pherastar激光扫描仪识别PCR的荧光探针，Kluster Caller软件分析SNP等位点并生成基因分型图。

采用LGC的1536板进行SNP位点检测，Working板的DNA分液体积均为1.5μl。KASP反应体系为1μl，包括0.014μl的Primer mix和0.986μl1×KASP master mix(Primer mix和KASP master mix均由LGC公司提供)。

Touch-down PCR反应程序为：94℃15min；94℃20s，61～55℃60s，10个循环；94℃20s，55℃60s，26个循环。

KASP扩增产物采用激光扫描仪照射后，若产物仅显示序列1所示引物5'端连接荧光序列的颜色(蓝色)，则待测玉米opaque-2基因的SNP位点OE2-5基因型为CC；若所述PCR产物仅显示序列2所示引物5'端连接荧光序列的颜色(红色)，则待测玉米opaque-2基因的SNP位点OE2-5基因型为TT；若所述PCR产物显示序列1所示引物5'端连接荧光序列与序列2所示引物5'端连接荧光序列的混合色(绿色)，则待测玉米opaque-2基因的SNP位点OE2-5基因型为TC。

OE2-5标记在CML165和CML189样品上的基因型均为纯合的TT，而在JN6和BN2样品上的基因型为纯合的CC。

采用同样的方法，用OE2-1标记进行KASP扩增，作为对照。

JN6/CML165和BN2/CML189F2群体的KASP检测结果如图1所示，左图为OE2-5标记，右图为OE2-1标记，可以看出，OE2-5标记在高低赖氨酸自交系和F2群体材料中具有很好的分型效果，检测的2个分离群体基因型均符合1:2:1的分离比例；而OE2-1标记在高低赖氨酸自交系和F2群体材料中分型效果较差，不能用来区分高低赖氨酸材料。

4、赖氨酸含量检测

在JN6/CML165、BN2/CML189的两个F2群体中，分别取OE2-5标记检测为TT和CC两种基因型的6个单株，收获自交果穗，取部分籽粒用化学分析法测定赖氨酸含量(干基)，结果如表1所示。

表1为F2群体不同基因型单株的籽粒赖氨酸含量

由表1可以看出，

JN6/CML165F2群体中SNP位点OE2-5基因型为TT的6个单株籽粒的赖氨酸含量为0.42-0.49％，均值为0.45％；SNP位点OE2-5基因型为CC的6个单株籽粒的赖氨酸含量为0.28-0.34％，均值为0.32％。

BN2/CML189F2群体中SNP位点OE2-5基因型为TT的6个单株籽粒赖氨酸含量为0.42-0.47％，均值为0.445％；中SNP位点OE2-5基因型为CC的6个单株籽粒赖氨酸含量为0.31-0.34％，均值为0.32％。

可见，两个群体中OE2-5标记基因型为TT的单株，赖氨酸含量均在0.42％以上，而OE2-5标记基因型为CC的单株，赖氨酸含量均在0.34％以下。

通过比对标记基因型和赖氨酸含量表型数据可知，针对上述两个群体，OE2-5标记与赖氨酸含量表型具有很好的相关性，即OE2-5标记可以作为赖氨酸含量的分子标记，用于辅助高赖氨酸糯玉米种质改良。

因此，根据上述建立检测待测玉米籽粒赖氨酸含量的方法，包括如下步骤：检测待测玉米基因组中o2基因(opaque endosperm 2,NC_024465，提交日2017.12.18)的SNP位点OE2-5基因型，

SNP位点OE2-5基因型为TT的待测玉米的籽粒赖氨酸含量大于SNP位点OE2-5基因型为CC的待测玉米的籽粒赖氨酸含量。

检测待测玉米基因组中opaque-2基因的SNP位点OE2-5基因型的方法可为如下：

1)直接测序；

2)用OE2-5标记KASP引物对对待测玉米进行KASP检测，得到SNP位点OE2-5基因型。

上述待测玉米为高赖氨酸含量玉米和其他玉米杂交后的自交二代。

实施例2、SNP位点OE2-5基因型在鉴定待测玉米籽粒赖氨酸含量中的应用

利用19份玉米种质材料鉴定高赖氨酸分子标记OE2-5的适用范围。19份种质材料清单详见表2。

表2为19份种质赖氨酸含量及相关分子标记OE2-5的基因型检测结果

种质参考文献如下：

1)外引优质蛋白玉米自交系利用潜力评析，广西农业科学，2001，4：177-179

2)玉米穗轴对穗粒腐病抗性的遗传研究，2015年，第一届全国玉米生物学学术研讨会论文汇编

3)玉米新品种MC703选育与配套技术，中国种业，2016，62-64

4)基于SNP芯片揭示中国玉米育种种质的遗传多样性与群体遗传结构，中国农业科学，2018,51(4):626-634

5)不同新型除草剂加倍糯玉米单倍体的效率研究，种子，2017，36(5)：71-73

6)杂交玉米新品种MC 817特征特性及配套栽培技术，种子，2018，37(6)：114-115

1、赖氨酸含量(干基)测定

取表2中19份种质的成熟干籽粒30g，分别利用化学分析法进行赖氨酸含量(干基)测定。

结果表明，CML165、CML189、CML191、CML166、CML171、CML172、CML20和先甜5号8份种质材料赖氨酸含量在0.41-0.64％之间，平均值为0.48％；京X005、B73、京糯6、BN2、京724、京92、京2416、京2418、京464、京MC01和掖478等11份种质材料赖氨酸含量在0.3-0.36％之间，平均值为0.32％。

2、SNP位点OE2-5的检测

取19份种质材料的种子室内发苗，混株提取DNA。以上述19份DNA为模板，检测SNP位点OE2-5基因型，方法与实施例1的3相同；

结果如表2所示，表型为高赖氨酸含量(≥0.4％)的8份种质中，OE2-5基因型均为TT，与实施例1中的高赖氨酸材料检测基因型一致。表型为非高赖氨酸含量的11份种质，标记OE2-5基因型均为CC，与实施例1中的非高赖氨酸材料检测基因型一致。可见，OE2-5标记与高赖氨酸(opague-2，基因型o2o2)性状具有很好的相关性，并在多份不同遗传背景的种质材料中均适用。

SEQUENCE LISTING

<110>北京市农林科学院

<120> 与玉米高赖氨酸性状相关的SNP位点OE2-5及其应用

<160> 4

<170> PatentIn version 3.5

<210> 1

<211> 19

<212> DNA

<213> Artificial sequence

<400> 1

cctgctgagg cgcattgcc 19

<210> 2

<211> 20

<212> DNA

<213> Artificial sequence

<400> 2

gcctgctgag gcgcattgct 20

<210> 3

<211> 25

<212> DNA

<213> Artificial sequence

<400> 3

cgttagcgtc gttgtacttc tggtt 25

<210> 4

<211> 2870

<212> DNA

<213> Artificial sequence

<400> 4

ttcttttttt ttgcctctcc agaagtttct gcagggaggc acagcaagag agagagccca 60

gcactagata agtagggggg gaaagaagag catccaagcg tactcctcga tctccttcaa 120

gcagctaaca taattaactc atgggtgcat agagatatgc cgccgacgac ccatcatatc 180

tatgggtccc tccccttgca ctgcatctcc ttcaattcct agtgtttgct tctccctttc 240

ttgacctttg cttggaacca ttgattgata gttacttatt attgggcatg gagcacgtca 300

tctcaatgga ggagatcctc gggcccttct gggagctgct accaccgcca gcgccagagc 360

cagagccaga gcgagagcag cctccggtaa ccggcatcgt cgtcggcagt gtcatagacg 420

ttgctgctgc tggtcacggt catggtggcg gcgacatgat ggatcagcag cacgccacag 480

agtggacctt tgagaggtta ctggaagagg aggctctgac gacaagcaca ccgccgccgg 540

tggtggtggt gccgaactct tgttgctcag gcgccctaaa tgttgaccgg ccgccggtga 600

tggaagaggc ggtaatgatg gcgcctgcgg cggtgagtag tgccgtagta ggggacccca 660

tggagtacaa tgccatactg aggaggaagc tggaggagga cctcgaggcc ttcaaaatgt 720

ggagggtata tacactgctc gctcttcttc cctatcttta ttattccctc gctatatctt 780

cggcggttta ctcgtctttt atctcttatt ttacacttca ttgttgtata aatagtacaa 840

aacaatgttt tacacggcct gtactgtact ctctatgggc tacagggttt gtagtagtac 900

gtgtgtctta ttaactgggg gtgcaataac tgaaatcggc cggtgccttt tctgacgtac 960

taagtttgta tcacctacat ctagtgcatc caaacacacc ttctaaaagt gatgagggta 1020

ggtaatccat gatctagcta tagagatgtg gtgttctcgt tgagctatat gccatgtttg 1080

gctatacaaa ctgccaaaca aggatgccac atcacaagtc actgtgctta gcttgttctg 1140

tatatatgta tatagcgcta gctagtgtca cgagatttgt gatgttggat ttagcttact 1200

aggttttaca ccacgagtca tgtaaaacct agtaaactaa atccaacatc acaaaaccta 1260

gtaagctaaa tacaaactag caatccattc ttagcttact agtttttttt caaaaaaaac 1320

tacgatagcc actcgatctt tacaaacttt tatttgttga attttaaaac ttgaaatttt 1380

ggcatatata cccatccaca ggcggcctcc agtgttgtga cctcagatca acgttctcaa 1440

ggctcaaaca atcacactgg aggtactata tctactatat atatgtgcca ttattacatt 1500

gtttacagac gtgcttttgt atatagatat atatcctgac tctcgatctg gctcacttag 1560

gtagcagcat caggaataat ccagtgcaga acaagctgat gaacggcgaa gatccaatca 1620

acaataacca cgctcaaacc gcaggccttg gcgtgaggct tgctactagc tcttcctcga 1680

gagatccttc accatcagac gaagacatgg acggagaagt agagattctg gggttcaaga 1740

tgcctaccga ggaaagagtg aggaaaaggt aattccggtt gatttgcagc ttattaattg 1800

tacggttttt ttttactcct gggcttatcg atctgtcact tgattttaat tagaaaggaa 1860

tccaatagag aatcagccag acgctcgaga tacaggaaag ccgctcacct gaaagaactg 1920

gaggaccagg tactgatgcg tagcatcaca aactaaacca tcgatcgtcg ttccatttgc 1980

ctactgaaac cctaaaaaaa aagggttttt taagctggtg ctttccgttt tgctggtgta 2040

gtcgtgtttt ttcgttcagt tttgccgtgc ttgaccatta tattacaggt agcacagcta 2100

aaagccgaga attcttgcct gctgaggcgc attgccgctc tgaaccagaa gtacaacgac 2160

gctaacgtcg acaacagggt gctgagagcg gacatggaga ccctaagagc taaggtacgt 2220

aaccgcggcg ttctccttat tttatgcttg aacgcgtcga cgagcgagct tgcgcgcggt 2280

aatggggagg tatatatgtc tggttgcatg cactcttgca ggtgaagatg ggagaggact 2340

ccctgaagcg ggtgatagag atgagctcat cagtgccgtc gtccatgccc atctcggcgc 2400

cgacccccag ctccgacgct ccagtgccgc cgccgcctat ccgagacagc atcgtcggct 2460

acttctccgc cacagccgca gacgacgatg cttcggtcgg caacggtttc ttgcgactgc 2520

aagctcatca agagcctgca tccatggtcg tcggtggaac tctgagcgcc acagagatga 2580

accgagtagc agcagccacg cattgcgcgg gggccatgga gctcatccag acggcgatgg 2640

gatccatgcc gccgacctcc gcctccggat ctacaccgcc gccgcaggat tatgagctgc 2700

tgggtccaaa tggggccata cacatggaca tgtattaggc actgcgggtt tcgtgatcgc 2760

tgggaacatt ttatttgcag gcgtcgctga ataaggctgg ttgtctcgat ctcccttgac 2820

atgaaatcca aataactcac aattaaccat gagtgttccg tttggtccca 2870

Claims

1.检测玉米基因组中opaque-2基因的SNP位点OE2-5的基因型的物质在鉴定或辅助鉴定待测玉米籽粒赖氨酸含量中的应用,

所述SNP位点OE2-5为序列4第2136位；

所述SNP位点OE2-5基因型为CC或TT或TC；

所述检测玉米基因组中opaque-2基因的SNP位点OE2-5的基因型的物质如下1）或2）：

1）KASP成套引物，

所述KASP成套引物由序列表中序列1所示的单链DNA分子、序列表中序列2所示的单链DNA分子和序列表中序列3所示的单链DNA分子组成；

2）含有所述成套引物的PCR试剂或试剂盒；

所述序列1所示的单链DNA分子的5'端连接FAM荧光基团；

所述序列2所示的单链DNA分子的5'端连接HEX荧光基团。

2.检测玉米基因组中opaque-2基因的SNP位点OE2-5的基因型的物质在选育籽粒高赖氨酸玉米中的应用,

所述SNP位点OE2-5为序列4第2136位；

所述SNP位点OE2-5基因型为CC或TT或TC；选育SNP位点OE2-5基因型为TT的待测玉米，得到籽粒高赖氨酸含量的玉米；

1）KASP成套引物，

2）含有所述成套引物的PCR试剂或试剂盒；

所述序列1所示的单链DNA分子的5'端连接FAM荧光基团；

所述序列2所示的单链DNA分子的5'端连接HEX荧光基团。

3.一种鉴定或辅助鉴定待测玉米籽粒赖氨酸含量的方法，为检测玉米基因组中opaque-2基因上的SNP位点OE2-5的基因型是TT还是CC, SNP位点OE2-5基因型为TT的待测玉米的籽粒赖氨酸含量大于SNP位点OE2-5基因型为CC的待测玉米的籽粒赖氨酸含量；

所述SNP位点OE2-5为序列4第2136位；

所述检测玉米基因组中opaque-2基因上的SNP位点OE2-5的基因型是TT还是CC的方法，为如下A）或B）：

A）直接测序；

B）用权利要求1中的所述成套引物对所述待测玉米基因组DNA进行KASP检测，实现基因分型。

4.一种选育籽粒高赖氨酸含量玉米的方法，为检测玉米基因组中opaque-2基因上的SNP位点OE2-5基因型是TT还是CC,

所述SNP位点OE2-5为序列4第2136位；

所述检测玉米基因组中opaque-2基因上的SNP位点OE2-5基因型是TT还是CC的方法，为如下A）或B）：

A）直接测序；