CN116590451A - 用于检测不同甜玉米类型的kasp引物组合及其应用 - Google Patents
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Abstract
本发明涉及分子生物学及植物分子育种技术领域，具体公开了用于检测不同甜玉米类型的KASP引物组合及其应用。本发明的KASP引物组合，其包括sh2‑R‑KASP和/或su1‑KASP检测引物组合；sh2‑R‑KASP检测引物组合包括两条序列如SEQ ID NO.4‑5所示的特异性引物和两条序列如SEQ ID NO.6‑7所示的通用引物；su1‑KASP检测引物组合包括两条序列如SEQ ID NO.1‑2所示的特异性引物和一条序列如SEQ ID NO.3所示的通用引物。本发明的检测引物组合能够高通量快速准确鉴定su1su1Sh2Sh2、Su1Su1sh2sh2和su1su1sh2sh2不同类型甜玉米及携带su1和sh2突变的鲜食玉米育种中间材料。
Description
技术领域
本发明涉及分子生物学及植物分子育种技术领域，具体地说，涉及用于检测不同甜玉米类型的KASP引物组合及其应用。
背景技术
鲜食玉米种植面积大，其中甜玉米、甜加糯玉米种植面积占比大，很受消费者欢迎，可创造可观的经济价值。甜玉米由淀粉合成途径中基因发生隐性纯和突变导致切断了部分还原糖向淀粉转化而产生。甜玉米主要分为普通甜玉米(susu)、加强甜玉米(su1su1se1se1)和超甜玉米(shsh，btbt)三种遗传类型，不同类型具有不同的优缺点和食用加工用途。
普通甜玉米由su1或su2基因隐性纯和突变控制，乳熟期其含糖量是普通玉米的2倍左右，可溶性多糖(WSP)含量显著增加，故而吃起来除了甜味还有一定的糯性口感，其干籽粒表面皱缩，胚乳呈半透明状。加强甜玉米是在su1基因的基础上加入修饰基因se1，其含糖含量比普通甜玉米提高了1倍左右，同时含有大量的WSP。普通甜和加强甜型玉米均存在采收期短、不耐储存的缺点。超甜玉米由sh1、sh2、bt1或bt2等基因隐性纯和突变控制，含糖量是普通甜玉米的2倍以上，由于WSP太少，导致缺乏糯性口感。该类型玉米胚乳中淀粉含量急剧减少，在籽粒成熟时呈凹陷状态。
sh2和su1是鲜食玉米生产上应用广泛的甜基因类型。Su1编码淀粉去分支酶，存在su1-Ref和su1-st等多种等位变异。su1-Ref编码蛋白发生单个氨基酸替换导致蛋白失活，而su1-st等位变异在第10外显子内存在638bp转座子序列插入导致mRNA剪接异常。Sh2编码ADP-葡萄糖焦磷酸化酶大亚基，存在sh2-R和sh2-i等位变异。sh2-i通过EMS诱导变异产生，其在第二内含子末端存在G→A转变，而导致90％的转录本剪接异常，而sh2-R源于sh2基因结构重排而导致蛋白活性完全缺失。
su1和sh2是目前生产上常用的甜基因类型。随着鲜食玉米多样性的蓬勃发展，如su1su1型普甜玉米、su1su1se1se1加强甜玉米、sh2sh2型超甜玉米、sh2sh2wxwx型甜加糯等，迫切需要开发高通量筛选和鉴定sh2和su1基因的分子标记来辅助鲜食玉米多样性选育。KASP标记技术具有成本低、高通量和检测速度快(扩增时间短)的绝对优势，因此开发su1和sh2 KASP检测引物组合对甜玉米、甜加糯玉米的遗传改良育种具有很大的应用潜力。
发明内容
随着鲜食玉米市场的快速发展，对鲜食甜玉米类型多样性的需求持续增加。目前育种中应用的鲜食甜玉米有su1su1、sh2sh2和su1su1sh2sh2多种类型，但缺乏区分和鉴定三种甜玉米类型的技术方法。本发明的目的是提供一种高通量快速准确鉴定su1su1Sh2Sh2、Su1Su1sh2sh2和su1su1sh2sh2不同类型甜玉米的KASP检测引物组合。所开发的sh2-R-KASP和su1-KASP检测引物组合可通过分子标记辅助育种的方法在甜玉米的鉴别和选育中得到应用。
本发明研究发现：微胚乳玉米HuajianF和Huada165为新的甜玉米类型，其芽率高并且籽粒含糖量高。B73×HuajianF F2代籽粒分离出圆粒、透明粒和凹陷粒三种类型，符合9:3:4分离(χ2 9:3:4＝2.19，P＝0.67)，表明籽粒透明和凹陷表型分别受隐性单基因控制。透明粒和凹陷粒含糖量高，为甜玉米粒，其调控基因与HuajianF的高含糖量表型有关。以BSR-seq将B73×HuajianF F2透明粒调控基因定位到4号染色体上的35-42Mb区域，根据基因功能注释推测GRMZM2G138060(Su1)为候选基因。su1su1等位测验结果也证实B73×HuajianFF2透明粒的透明表型受su1控制，表明微胚乳玉米HuajianF携带su1su1突变。对HuajianF和Huada165中su1基因cDNA进行序列分析，发现其在第13外显子第145个核苷酸处发生T-C(Trp-Arg)突变，基于该突变开发了su1的KASP检测引物组合，命名为su1-KASP。以BSR-seq将B73×HuajianF F2凹陷粒调控基因定位到3号染色体上的216-218Mb区域，根据基因功能注释推测GRMZM2G429899(Shrunken 2,Sh2)为候选基因，sh2sh2等位测验进一步证实了B73×HuajianF的F2凹陷粒的凹陷表型受sh2控制，表明微胚乳玉米HuajianF携带sh2sh2突变。对HuajianF和Huada165中sh2基因DNA序列进行分析，发现在第二内含子和第6-8外显子区域没有PCR扩增产物，表明这些区域的序列存在变异，与已报道的sh2-R等位变异突变方式(在第二内含子有5451bp的插入突变，在第七外显子第121个核苷酸之后有49442bp的插入变异，以及从第七外外显子的第121个碱基到第20外显子之间发生倒位突变)吻合，推测HuajianF和Huada165中sh2突变为sh2-R。针对sh2-R第二内含子内5451bp的插入突变开发KASP检测引物组合，命名为sh2-R-KASP。sh2-R-KASP对HuajianF和Huada165检测结果进一步表明其携带sh2-Rsh2-R。联合sh2-R-KASP和su1-KASP检测引物组合对现代育种中利用的183个甜玉米自交系进行检测，基因分型显示有169个甜玉米自交系携带sh2-Rsh2-R纯合突变，34个甜玉米自交系携带su1su1纯和突变，以及20个甜玉米自交系同时携带sh2-Rsh2-R和su1su1突变，该基因分型结果与预期一致，表明联合使用sh2-R-KASP和su1-KASP检测引物组合能够高通量快速准确鉴定玉米是否携带sh2或su1甜基因，进而提出本发明。
本发明的技术方案如下：
本发明提供用于检测不同甜玉米类型的KASP引物组合，其包括sh2-R-KASP检测引物组合和/或su1-KASP检测引物组合；
sh2-R-KASP检测引物组合包括两条特异性引物和两条通用引物，其中，所述特异性引物的序列如SEQ ID NO.4-5所示，所述通用引物的序列如SEQ ID NO.6-7所示；两条所述特异性引物分别标记有产生不同荧光色的荧光报告基团；
su1-KASP检测引物组合包括两条特异性引物和一条通用引物，其中，所述特异性引物的序列如SEQ ID NO.1-2所示，所述通用引物的序列如SEQ ID NO.3所示；两条所述特异性引物分别标记有产生不同荧光色的荧光报告基团。
本发明通过分析甜玉米关键调控基因su1和sh2序列变异特征，根据序列变异关键位点开发出了基因功能性KASP检测引物组合。
本发明提供的甜玉米KASP检测引物组合为sh2-R-KASP、su1-KASP，及两者的组合。sh2-R-KASP检测引物组合可在sh2sh2纯合型玉米中检测到5451bp(AACCATTNCACCAAC/AACCATTNCACCAAC)插入突变，在Sh2Sh2野生型玉米中检测无插入(-/-)，在sh2Sh2杂合型玉米中同时检测到无插入和插入突变(-/AACCATTNCACCAAC)；su1-KASP检测引物组合在su1su1纯合型中检测到的SNP为C，在Su1Su1野生型中检测到的SNP为T，而在su1Su1杂合型玉米种检测到的SNP为C/T。
本发明中AACCATT为sh2突变型中插入的5451bp的前面7个bp，CACCAAC为最后7个bp，其余的中间大片段碱基序列以N代表。
KASP技术检测扩增片段大小在40-150bp之间，为了检测大片段InDel位点需要设计4条引物。所设计的4条引物需至少同时兼顾如下条件：4条引物长度在18-30bp之间，上下游引物间不宜相差太大；退火温度在55-61℃之间，上下游引物退火温度相差不超过2度；避免形成引物二聚体；引物GC含量在40-60％之间；3’端也不能发生错配。
而本领域公知，Indel位点涉及多个缺失或插入的碱基，当以插入或缺失片段的不同位置碱基作为特异性引物的3’端时，对引物的检测效果影响较大且无一定的规律性。此外，为了对不同来源玉米材料都能进行检测，引物设计需满足不同遗传背景玉米材料的检测需求。这些均给研发出灵敏度高且特异性强的引物组合带来了困难。
本发明的KASP引物组合中，所述荧光报告基团为选自FAM、HEX、JOE、TET、CY3、CY5、ROX、Texas中的任一种。
本发明还提供上述KASP引物组合在制备用于检测不同甜玉米类型的检测试剂或试剂盒中的应用。
本发明另提供用于检测不同甜玉米类型的检测试剂或试剂盒，其包含上述KASP引物组合。
本发明再提供一种用于检测不同甜玉米类型的方法，其以待测玉米样品的基因组DNA为检测模板，利用KASP引物组合进行PCR检测，所述KASP引物组合如上所述；
在使用su1-KASP检测引物组合进行检测时，若只检测到如SEQ ID NO.1所示特异性引物携带的荧光信号，则判定所述待测玉米样品在su1基因SNP位点的多态性为T，待测玉米为Su1野生型玉米(不携带su1突变)；
若只检测到如SEQ ID NO.2所示特异性引物携带的荧光信号，则判定所述待测玉米样品在su1基因SNP位点的多态性为C，待测玉米为su1突变型玉米；
若同时检测到如SEQ ID NO.1和SEQ ID NO.2所示特异性引物携带的荧光信号，则判定所述待测玉米样品为Su1su1基因杂合型；
在使用sh2-R-KASP检测引物组合进行检测时，若只检测到如SEQ ID NO.4所示特异性引物携带的荧光信号，则判定所述待测玉米样品在sh2基因Indel位点的多态性为含有5451bp插入，待测玉米为sh2突变型玉米；
若只检测到如SEQ ID NO.5所示特异性引物携带的荧光信号，则判定所述待测玉米样品在sh2基因Indel位点的多态性为不含5451bp插入(-)，待测玉米为Sh2野生型玉米；
若同时检测到如SEQ ID NO.4和SEQ ID NO.5所示特异性引物携带的荧光信号，则判定所述待测玉米样品为Sh2sh2基因杂合型。
本发明中SEQ ID NO.4和7用于检测的多态性情况为5451bp插入，SEQ ID NO.5和6用于检测的多态性情况为无插入。
本发明还提供一种判断玉米甜度的方法，其以待测玉米样品的基因组DNA为检测模板，利用KASP引物组合进行PCR检测，所述KASP引物组合如上所述；
在使用su1-KASP检测引物组合进行检测时，若只检测到如SEQ ID NO.2所示特异性引物携带的荧光信号，则判定所述待测玉米样品的含糖量高；
在使用sh2-R-KASP检测引物组合进行检测时，若只检测到如SEQ ID NO.4所示特异性引物携带的荧光信号，则判定所述待测玉米样品的含糖量高。
本发明的方法中，PCR检测的反应体系以总体积4μL计包括：KASP Master Mix(2×)1.9-2.0μl、混合引物的溶液0.05-0.07μl；
当所述混合引物为sh2-R-KASP检测引物组合时，混合引物的溶液中，两条特异性引物的浓度分别为6μmol/L、两条通用引物的浓度分别为15μmol/L；
当所述混合引物为su1-KASP检测引物组合时，混合引物的溶液中，两条特异性引物的浓度分别为12μmol/L、通用引物的浓度为30μmol/L。
PCR检测的反应程序如下：94℃15min；94℃20s，61-55℃1min，每个循环下降0.6℃，共10个循环；94℃20s，55℃1min，26个循环。
本发明另提供上述KASP引物组合或检测试剂或试剂盒或方法在以下任一方面的应用：
(1)鉴别不同甜玉米类型；
(2)鉴别玉米sh2基因和su1基因的类型；
(3)玉米分子标记辅助育种；
(4)鉴别玉米甜度。
本发明的有益效果至少在于：
通过本发明提供的技术方法，能够高通量快速准确鉴定Su1和/或Sh2基因的突变情况，区分su1su1Sh2Sh2、Su1Su1sh2sh2和su1su1sh2sh2不同类型甜玉米；并且可用于鉴定携带su1和sh2突变的鲜食玉米育种中间材料，如su1Su1Sh2Sh2、su1Su1sh2Sh2、su1Su1sh2sh2、Su1Su1sh2Sh2和su1su1sh2Sh2。
sh2-R-KASP和su1-KASP检测引物组合适于早期快速筛选，大大加速甜玉米种质资源的选育进程；KASP标记以DNA的形式表现，在玉米的各个组织中均存在，取材便利。
附图说明
图1为本发明实施例1中三种类型甜玉米籽粒形态和含糖量检测结果。图中，A为玉米干籽粒图片，标尺＝1cm。B为玉米籽粒总糖含量检测结果。
图2为本发明实施例1中B73×HuajianF F2籽粒形态及含糖量检测结果。图中，A显示B73×HuajianF F2籽粒分离出圆粒(黄圆和白圆)、透明皱缩粒和凹陷粒三种类型。标尺＝1cm。B为不同类型B73×HuajianF F2籽粒含糖量检测结果。
图3为本发明实施例2中B73×HuajianF F2透明粒调控基因BSR-seq定位、验证结果及序列变异特征。图中，A为BSR-seq将B73×HuajianF F2透明粒调控基因定位到4号染色体的结果。B为su1su1基因等位测验结果，图中左侧为B73×HuajianF F2透明粒形态，右侧为B73×HuajianF F2透明粒与T9(su1su1纯和突变)杂交形态。标尺＝1cm。C显示的为su1基因突变位点。
图4为本发明实施例3中B73×HuajianF F2凹陷粒调控基因BSR-seq定位、验证结果及序列变异特征。图中，A为BSR-seq将B73×HuajianF F2凹陷粒调控基因定位倒3号染色体的结果。B为sh2sh2基因等位测验结果，图中左侧为B73×HuajianF F2凹陷粒形态，右侧为B73×HuajianF F2凹陷粒与SH251(sh2sh2纯和突变)杂交形态。标尺＝1cm。C显示的为sh2基因突变位点。
图5为本发明实施例4中su1-KASP和sh2-R-KASP检测引物组合对183个甜玉米自交系进行检测的结果。图中，A为以su1-KASP进行检测的结果，B为以sh2-R-KASP进行检测的结果。
图6为本发明实施例4中su1-KASP和sh2-R-KASP检测引物组合对282份玉米育种中间材料进行检测的结果。图中，A为以su1-KASP进行检测的结果，B为以sh2-R-KASP进行检测的结果。
具体实施方式
下面将结合实施例对本发明的优选实施方式进行详细说明。需要理解的是以下实施例的给出仅是为了起到说明的目的，并不是用于对本发明的范围进行限制。本领域的技术人员在不背离本发明的宗旨和精神的情况下，可以对本发明进行各种修改和替换。
下述实施例中所使用的实验方法如无特殊说明，均为常规方法。下述实施例中所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到或按本领域常规方法制备。
本发明所利用的玉米自交系均来自于北京市农林科学院玉米研究所种质资源库，本领域技术人员可根据常规方式获得。
实施例1微胚乳玉米表型特征及遗传分离规律
骨干甜玉米自交系T9由su1su1纯和突变导致，甜玉米自交系SH251为sh2sh2纯和突变导致。甜玉米自交系T9籽粒为顶部皱缩，籽粒呈透明状；而甜玉米自交系SH251在胚乳面有大的凹陷(参见图1中的A)。微胚乳玉米HuajianF和Huada165为已知新的甜玉米类型(HuajianF为玉米杂交品种华健1号(陈元华，《农家科技》2018，含油率高达26％的玉米“华健1号”产业商机巨大5:18)的父本，Huada165在北京市农林科学院玉米研究所种质资源库中的编号为Huada165)，其籽粒呈明显的干瘪皱缩。参照中华人民共和国国家标准(GB/T3543.1-1995)进行发芽率试验，每组进行3个生物学重复，发现T9、SH251、HuajianF和Huada165的发芽率分别为91.33±4.37％、92.00±3.06％、100.00±0.00％和98.00±2.00％，表明甜玉米种质HuajianF和Huada165品质优良，发芽率很高。总糖含量测定试剂盒(索莱宝科技有限公司)分析发现微胚乳玉米HuajianF籽粒中的总糖量最高，为205.2±1.94mg/g，微胚乳玉米Huada165为169.2±0.65mg/g，甜玉米SH251为192.8±2.59mg/g，甜玉米T9总糖含量最低，为154.3±2.63mg/g(参见图1中的B)，每组进行3个生物学重复。
将微胚乳玉米HuajianF(干瘪皱缩)与普通玉米自交系B73(圆粒)杂交，B73×HuajianF的F2代籽粒分离出圆粒、透明粒和凹陷粒三种类型(参见图2中的A)，符合9:3:4分离(χ2 9:3:4＝2.19，P＝0.67)，表明分离出的籽粒透明和凹陷表型分别受隐性单基因控制。分离出的黄圆、白圆、透明粒和凹陷粒的总糖含量分别为24.07±1.54mg/g，21.03±3.92mg/g、84.37±17.51mg/g和139.3±21.33mg/g(参见图2中的B)，每组进行3个生物学重复，表明B73×HuajianF的F2代透明粒和凹陷粒含糖量高，微胚乳玉米HuajianF的高含糖量受B73×HuajianF的F2代透明粒调控基因和凹陷粒调控基因同时调控。
实施例2甜玉米关键调控基因su1的BSR-seq定位、序列分析及检测引物组合开发
用30个F2透明籽粒和30个F2非透明籽粒(11个白圆籽粒，11个黄圆籽粒，8个凹陷籽粒)发苗(F2籽粒来源于B73×HuajianF)，取单株叶片等量混合后用总RNA提取试剂盒(天根生化科技有限公司)提取总RNA，制备透明粒和非透明粒RNA混池。用IllμMina NovaSeq6000(IllμMina)系统测序，先过滤掉低分值(<15分)数据，然后在GSNAP软件中与B73RefGen_v3参考基因进行序列比对。在GATK软件进行SNP Calling，并用经验的贝叶斯方法计算SNP与目标性状的连锁概率。统计分析结果发现有500个SNP的连锁概率大于0.05，其中99％位于4号染色体。利用滑动窗口法(窗口大小为20个SNP；步长为5个SNP)对这些SNP进行扫描，将定位区间进一步缩小到4号染色体上的35-42Mb区域(参见图3中的A)。根据该基因组区域内基因功能注释推测GRMZM2G138060(Su1)为候选基因，该基因编码淀粉去分支酶，其突变造成籽粒呈透明状。B73×HuajianF的F2透明粒生长植株与玉米自交系T9(携带su1su1纯合突变)杂交，杂交种籽粒均呈透明状(参见图3中的B)。su1su1等位测验结果表明B73×HuajianF的F2透明粒的透明表型由su1控制，该突变基因来源于HuajianF。
用总RNA提取试剂盒(天根生化科技有限公司)提取HuajianF和Huada165总RNA，用PrimeScriptTMII 1st Strand cDNA Synthesis Kit(Takara)反转录试剂盒将RNA反转成cDNA。对HuajianF和Huada165中su1基因cDNA序列进行分析，发现其在第13外显子第145个核苷酸处发生T-C(Trp-Arg)突变(参见图3中的C)。该突变位点位于su1基因(maizeGDB数据库中编号GRMZM2G138060)的第6695bp处。基于该突变位点开发了su1的KASP检测引物组合，命名为su1-KASP，KASP引物见表1。
表1 KASP引物信息
在检测时，在两条特异性引物AlleleX和AlleleY上分别标记产生不同荧光色的荧光报告基团。
实施例3甜玉米关键调控基因sh2的BSR-seq定位、序列分析及检测引物组合开发
用30个F2凹陷籽粒和30个F2圆籽粒(15个黄圆籽粒和15个白圆籽粒)发苗(F2籽粒来源于B73×HuajianF)，单株叶片等量混合后用总RNA提取试剂盒(天根生化科技有限公司)提取RNA，制备凹陷粒和圆粒RNA混池。用IllμMina NovaSeq 6000(IllμMina)系统测序，先过滤掉低分值(<15分)数据，然后在GSNAP软件中与B73RefGen_v3参考基因进行序列比对。在GATK软件进行SNP Calling，并用经验的贝叶斯方法计算SNP与目标性状的连锁概率。统计分析结果发现有211个SNP的连锁概率大于0.05，其中97％位于3号染色体。用滑动窗口法(窗口大小为20个SNP；步长为5个SNP)对这些SNP进行扫描，将定位区间进一步缩小到3号染色体上的216-218Mb区域(参见图4中的A)。根据该基因组区域内基因功能注释推测GRMZM2G429899(Shrunken 2,Sh2)为候选基因，该基因编码ADP-葡萄糖焦磷酸化酶大亚基，其突变导致玉米籽粒凹陷。B73×HuajianF的F2凹陷粒生长植株与玉米自交系系SH251(携带sh2sh2纯合突变)杂交，杂交种籽粒均为凹陷粒(参见图4中的B)。sh2sh2等位测验结果表明B73×HuajianF的F2凹陷粒的凹陷表型受sh2控制，该突变基因也来源于HuajianF。
对HuajianF和Huada165中sh2基因DNA序列进行分析，发现在第二内含子和第6-8外显子区域没有PCR扩增产物，表明这些区域的序列存在变异。携带sh2-R等位变异的甜玉米自交系Ia453基因组测序结果表明sh2-R等位变异在第二内含子有5451bp的插入突变，在第七外显子第121个核苷酸之后有49442bp的插入变异，以及从第七外外显子的第121个碱基到第20外显子之间发生倒位突变。据此推测HuajianF和Huada165中sh2突变为sh2-R。针对第二内含子内5451bp的插入突变(参见图4中的C)，本发明开发了sh2-R的KASP检测引物组合，命名为sh2-R-KASP，KASP引物见表1。用该检测引物组合对HuajianF和Huada165进行检测，检测结果与预期一致，即HuajianF和Huada165均携带sh2-R。
实施例4sh2-R-KASP和su1-KASP检测引物组合在甜玉米育种中的应用
将所开发的sh2-R-KASP和su1-KASP检测引物组合同时对在现代育种中利用的来源于不同地区或国家的183个甜玉米自交系(均可获得于北京市农林科学院玉米研究所种质资源库)进行检测。所述不同地区指：中国北京市、中国吉林省、中国广西省、中国台湾省，所述不同国家指：美国、加拿大。具体信息见表2。
表2 183份甜玉米自交系编号、来源及基因分型结果
具体方法为：
1)提取待测玉米基因组DNA；
2)以玉米基因组DNA为模板，利用sh2-R-KASP和su1-KASP检测引物组合分别进行PCR检测。
PCR反应体系以总体积以4μL计，包括：KASP Master Mix(2×)1.97μl、混合引物的溶液0.06μl。
混合引物的溶液制备方法如下：
针对su1-KASP检测引物组合，三条引物混合方法：三管引物干粉分别用DNase/RNase-Free双蒸水溶解至100μM，2条上游引物和一条下游通用引物分别取12μl，12μl，30μl混合，补充46μl水，最用各引物浓度分别为12μmol/L、12μmol/L和30μmol/L。
针对sh2-R-KASP检测引物组合，四条引物混合方法：四管引物干粉分别用DNase/RNase-Free双蒸水溶解至100μM，2条上游引物和2条下游通用引物分别取6μl，6μl，15μl和15μl混合，补充58μl水，最用各引物浓度分别为6μmol/L、6μmol/L、15μmol/L和15μmol/L。
PCR反应程序如下：PCR程序为:94℃15min；94℃20s 61-55℃1min(每个循环下降0.6℃)，共10循环；94℃20s 55℃1min，26个循环。
3)基因型判断：
在使用su1-KASP检测引物组合进行检测时，若PCR产物只检测到如SEQ ID NO.1所示特异性引物携带的荧光信号，则判定所述待测玉米样品在su1基因SNP位点的多态性为T，待测玉米为Su1野生型玉米；若只检测到如SEQ ID NO.2所示特异性引物携带的荧光信号，则判定所述待测玉米样品在su1基因SNP位点的多态性为C，待测玉米为su1突变型玉米；
若同时检测到如SEQ ID NO.1和SEQ ID NO.2所示特异性引物携带的荧光信号，则判定所述待测玉米样品为Su1su1基因杂合型；
特异性引物为AlleleX:TTCAAATTACCTCCCCACAATTCCA，多态性位点为T，待测玉米不携带su1突变；特异性引物为AlleleY:CAAATTACCTCCCCACAATTCCG，多态性位点为C，待测玉米携带su1突变。
在使用sh2-R-KASP检测引物组合进行检测时，若只检测到如SEQ ID NO.4所示特异性引物携带的荧光信号，则判定所述待测玉米样品在sh2基因Indel位点的多态性为5451bp插入(AACCATTNCACCAAC/AACCATTNCACCAAC)，待测玉米为sh2突变型玉米；
若只检测到如SEQ ID NO.5所示特异性引物携带的荧光信号，则判定所述待测玉米样品在sh2基因Indel位点的多态性为无插入，待测玉米为Sh2野生型玉米；
若同时检测到如SEQ ID NO.4和SEQ ID NO.5所示特异性引物携带的荧光信号，则判定所述待测玉米样品为Sh2sh2基因杂合型。
特异性引物对AlleleX:TTTGCACCCTCAATAGTTCAACCATT和Common2:GAGTGAGGGTGCTGTGTGAGATTAA检测到5451bp插入，待测玉米为携带sh2突变；特异性引物对AlleleY:GCACCCTCAATAGTTCAACCATC和Common1:GGGTGGGGTCGGGATACATAAATTT检测为无插入，待测玉米为不携带sh2突变玉米。
单独对sh2-R-KASP、su1-KASP检测引物组合的PCR结果进行判断，可分别获得待测玉米在sh2、su1基因突变位点的多态性，从而判断待测玉米的sh2、su1基因型。结合两组检测引物组合的判断结果，可准确鉴定不同类型甜玉米(su1su1Sh2Sh2、Su1Su1sh2sh2和su1su1sh2sh2，以及携带su1或sh2突变的鲜食玉米育种中间材料)。
su1-KASP检测引物组合在su1su1纯合型玉米中检测到的SNP为C，在Su1Su1野生型中检测到的SNP为T，在su1Su1杂合型玉米种检测到的SNP为C/T。sh2-R-KASP检测引物组合在sh2sh2纯合型玉米中检测到5451bp(AACCATTNCACCAAC/AACCATTNCACCAAC)插入突变，在Sh2Sh2野生型玉米中检测无插入(-/-)，在sh2Sh2杂合型玉米中同时检测到无插入和插入突变(-/AACCATTNCACCAAC)。
基因分型显示183个甜玉米自交系中有169个甜玉米自交系携带sh2-Rsh2-R纯合突变，34个甜玉米自交系携带su1su1纯和突变，以及20个甜玉米自交系同时携带sh2-Rsh2-R和su1su1突变(参见图5中的A和B)。该基因分型结果与各甜玉米自交系表型的实际情况一致，表明联合使用sh2-R-KASP和su1-KASP检测引物组合能够高通量快速准确鉴定玉米是否携带sh2或su1甜基因。
本实施例进一步以上述sh2-R-KASP和su1-KASP检测引物组合同时对282份玉米育种中间材料进行分析，发现282份玉米均不携带su1突变，其中8份玉米材料为Su1Su1sh2Sh2型，携带sh2突变，其余274份材料为Su1Su1Sh2Sh2型，进一步表明sh2-R-KASP和su1-KASP检测引物组合联合使用可快速鉴定玉米是否携带sh2或su1甜基因(参见图6中A和B)。
虽然，上文中已经用一般性说明及具体实施方案对本发明作了详尽的描述，但在本发明基础上，可以对之作一些修改或改进，这对本领域技术人员而言是显而易见的。因此，在不偏离本发明精神的基础上所做的这些修改或改进，均属于本发明要求保护的范围。
Claims (9)
1.用于检测不同甜玉米类型的KASP引物组合，其特征在于，包括sh2-R-KASP检测引物组合和/或su1-KASP检测引物组合；
sh2-R-KASP检测引物组合包括两条特异性引物和两条通用引物，其中，所述特异性引物的序列如SEQ ID NO.4-5所示，所述通用引物的序列如SEQ ID NO.6-7所示；两条所述特异性引物分别标记有产生不同荧光色的荧光报告基团；
su1-KASP检测引物组合包括两条特异性引物和一条通用引物，其中，所述特异性引物的序列如SEQ ID NO.1-2所示，所述通用引物的序列如SEQ ID NO.3所示；两条所述特异性引物分别标记有产生不同荧光色的荧光报告基团。
2.根据权利要求1所述的KASP引物组合，其特征在于，所述荧光报告基团为选自FAM、HEX、JOE、TET、CY3、CY5、ROX、Texas中的任一种。
3.权利要求1或2所述的KASP引物组合在制备用于检测不同甜玉米类型的检测试剂或试剂盒中的应用。
4.用于检测不同甜玉米类型的检测试剂或试剂盒，其特征在于，包含权利要求1或2所述的KASP引物组合。
5.一种用于检测不同甜玉米类型的方法，其特征在于，以待测玉米样品的基因组DNA为检测模板，利用KASP引物组合进行PCR检测，所述KASP引物组合如权利要求1所述；
在使用su1-KASP检测引物组合进行检测时，若只检测到如SEQ ID NO.1所示特异性引物携带的荧光信号，则判定所述待测玉米样品在su1基因SNP位点的多态性为T，待测玉米为Su1野生型玉米；
若只检测到如SEQ ID NO.2所示特异性引物携带的荧光信号，则判定所述待测玉米样品在su1基因SNP位点的多态性为C，待测玉米为su1突变型玉米；
若同时检测到如SEQ ID NO.1和SEQ ID NO.2所示特异性引物携带的荧光信号，则判定所述待测玉米样品为Su1su1基因杂合型；
在使用sh2-R-KASP检测引物组合进行检测时，若只检测到如SEQ ID NO.4所示特异性引物携带的荧光信号，则判定所述待测玉米样品在sh2基因Indel位点的多态性为含有5451bp插入，待测玉米为sh2突变型玉米；
若只检测到如SEQ ID NO.5所示特异性引物携带的荧光信号，则判定所述待测玉米样品在sh2基因Indel位点的多态性为不含5451bp插入，待测玉米为Sh2野生型玉米；
若同时检测到如SEQ ID NO.4和SEQ ID NO.5所示特异性引物携带的荧光信号，则判定所述待测玉米样品为Sh2sh2基因杂合型。
6.一种判断玉米甜度的方法，其特征在于，以待测玉米样品的基因组DNA为检测模板，利用KASP引物组合进行PCR检测，所述KASP引物组合如权利要求1所述；
在使用su1-KASP检测引物组合进行检测时，若只检测到如SEQ ID NO.2所示特异性引物携带的荧光信号，则判定所述待测玉米样品的含糖量高；
在使用sh2-R-KASP检测引物组合进行检测时，若只检测到如SEQ ID NO.4所示特异性引物携带的荧光信号，则判定所述待测玉米样品的含糖量高。
7.根据权利要求5或6所述的方法，其特征在于，PCR检测的反应体系以总体积4μL计包括：KASP Master Mix(2×)1.9-2.0μl、混合引物的溶液0.05-0.07μl；
当所述混合引物为sh2-R-KASP检测引物组合时，混合引物的溶液中，两条特异性引物的浓度分别为6μmol/L、两条通用引物的浓度分别为15μmol/L；
当所述混合引物为su1-KASP检测引物组合时，混合引物的溶液中，两条特异性引物的浓度分别为12μmol/L、通用引物的浓度为30μmol/L。
8.根据权利要求5-7任一项所述的方法，其特征在于，PCR检测的反应程序如下：94℃15min；94℃20s，61-55℃1min，每个循环下降0.6℃，共10个循环；94℃20s，55℃1min，26个循环。
9.根据权利要求1或2所述的KASP引物组合或权利要求4所述的检测试剂或试剂盒或权利要求5-8任一项所述的方法在以下任一方面的应用：
(1)鉴别不同甜玉米类型；
(2)鉴别玉米sh2基因和su1基因的类型；
(3)玉米分子标记辅助育种；
(4)鉴别玉米甜度。
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Legal Events
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| PB01 | Publication | ||
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| SE01 | Entry into force of request for substantive examination | ||
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