CN114606339B

CN114606339B - 与南瓜肌醇含量主效qtl连锁的kasp分子标记及其应用

Info

Publication number: CN114606339B
Application number: CN202210312573.2A
Authority: CN
Inventors: 钟玉娟; 黄河勋; 薛舒丹; 杜虎; 谢大森; 陆森; 林越; 姚春鹏
Original assignee: Vegetable Research Institute of Guangdong Academy of Agriculture Sciences
Current assignee: Vegetable Research Institute of Guangdong Academy of Agriculture Sciences
Priority date: 2022-03-28
Filing date: 2022-03-28
Publication date: 2022-10-28
Anticipated expiration: 2042-03-28
Also published as: CN114606339A

Abstract

本发明公开了与南瓜肌醇含量主效QTL连锁的KASP分子标记及其应用。在本发明中，所述SNP分子标记为(1)～(2)中的至少一种，其中，(1)位于中国南瓜15号染色体上第2459706位碱基，其碱基为G或A；(2)为位于中国南瓜15号染色体上第2715672位碱基，其碱基为T或C。而针对这两个分子标记开发的KASP引物对能够快速且准确的对南瓜肌醇含量高的品种进行鉴定，有助于南瓜的分子育种改良，相比传统育种筛选，其可检测的样本量大，大大节约了成本和时间。

Description

与南瓜肌醇含量主效QTL连锁的KASP分子标记及其应用

技术领域

本发明属于分子检测技术及南瓜遗传育种技术领域，具体涉及与南瓜肌醇含量主效QTL连锁的KASP分子标记及其应用。

背景技术

南瓜属葫芦科植物，是一种可药食两用的蔬菜。南瓜含有一些特异性的功能代谢物，如多糖、肌醇、甘露醇、生物碱、葫芦巴碱等。相关技术中，南瓜正在作为特效保健食品和功能蔬菜进行开发，而且开发前景可观。南瓜的一些成分，如多糖和肌醇，对糖尿病具有良好食疗效果。肌醇包括肌-肌醇和D-手性肌醇，它们在胰岛素作用的信号传递中起重要作用。相关技术中发现正常人血液及尿液中含有一定浓度的肌醇，而II型糖尿病人中则几乎检测不到肌醇。其中，D-手性肌醇对II型糖尿病具有更加显著疗效，而肌-肌醇除其降糖功能，也是动物重要的生长因子，是国际婴儿配方奶粉的添加物之一，同时也广泛应用于饲料、医药和化妆品等行业。

单核苷酸多态性位点(Single Nucleotide Polymorphism，SNP)是新一代的分子标记，在植物的基因组中出现的频率十分高，通过基因组测序来检测SNP是一种高效的检测群体内变异情况的手段。其中，用QTL mapping的方法对数量性状进行遗传分析，鉴定相关性状的控制位点，从而可以有效确定哪些位点可以作为辅助育种的分子标记。竞争性等位基因特异性PCR(Kompetitive Allele Specific PCR，KASP)是对SNPs和特定位点上的InDels进行精准的双等位基因判断的方法，被广泛应用于对SNP的标记开发。

发明内容

本发明旨在至少解决上述现有技术中存在的技术问题之一。为此，本发明提出一种与南瓜肌醇含量主效QTL连锁的KASP分子标记及其应用，通过该SNP分子标记能够有效检测出高肌醇含量的南瓜品种，从而为南瓜品种的选育提供有力的技术支持。

本发明的第一个方面，提供SNP分子标记，所述SNP分子标记为(1)～(2)中的至少一种：

(1)位于中国南瓜15号染色体上第2459706位碱基，其碱基为G或A；

(2)位于中国南瓜15号染色体上第2715672位碱基，其碱基为T或C；

所述SNP分子标记位于南瓜肌醇含量连锁的主效QTL位。

在本发明的一些实施方式中，所述(1)为SNP分子标记340813，所述(2)位SNP分子标记341335。上述两个SNP分子标记定位于中国南瓜15号染色体上，分别位于肌醇基因两侧。

在本发明的一些实施方式中，所述(1)位于SEQ ID NO：1所示序列自5’端起第150位碱基。

在本发明的一些实施方式中，所述(2)位于SEQ ID NO：2所示序列自5’端起第150位碱基。

本发明的第二个方面，提供本发明第一个方面所述的SNP分子标记在制备筛选不同肌醇含量的南瓜的产品中的应用。

在本发明中，发明人通过构建用于检测本发明第一个方面所述的SNP分子标记的KASP检测引物对来实现对于不同肌醇含量的南瓜品种的筛选。

本发明的第三个方面，提供用于检测本发明第一个方面所述的SNP分子标记的产品。

根据本发明的第三个方面，在本发明的一些实施方式中，所述产品包括探针、引物对、检测试剂、检测试剂盒、芯片。

在本发明的一些实施方式中，所述产品为引物对。

在本发明的一些实施方式中，所述引物对为KASP引物对。

在本发明的一些优选实施方式中，所述KASP引物对的核苷酸序列为：

上游分型F1：

(SEQ ID NO:3)；

上游分型F2：

(SEQ ID NO:4)；

上游引物(上游分型F1和上游分型F2)则由依次由3个部分组成：通用接头序列、普通扩增引物序列和分型序列(位点)。下划线部分为通用接头序列，斜体部分为普通扩增引物序列，3’末尾的加粗的一个碱基G(针对SEQ ID NO:3)和A(针对SEQ ID NO:4)为分型位点(序列)。

下游引物R：5’-CATTCCACTCGCAACCAATG-3’；

或

上游分型F1：

(SEQ ID NO:6)；

上游分型F2：

(SEQ ID NO:7)；

下划线部分为通用接头序列，斜体部分为普通扩增引物序列，3’末尾的加粗的一个碱基T(针对SEQ ID NO:6)和C(针对SEQ ID NO:6)为分型位点(序列)。

下游引物R：5’-TTCCCCATAATCTAACATTTCCTAT-3’。

在本发明的一些实施方式中，引物对SEQ ID NO：3～5用于检测分子标记340813。

在本发明的一些实施方式中，引物对SEQ ID NO：6～8用于检测分子标记341335。

在利用分子标记340813基因分型检测肌醇含量分布时，当分子标记340813所在的等位基因中均为G时，检测样品会与特定的HEX检测引物结合并释放出绿色荧光基团，随着PCR反应的指数增长，绿色荧光信号被增强，从而可以通过荧光颜色判断其为南瓜果实中肌醇含量高的基因型(KASP标记的分型结果定义为：HEX)。当所在位点的等位基因碱基均为A时，检测样品会与特定的FAM检测引物结合并释放出蓝色荧光基团，随着PCR反应的指数增长，蓝色荧光信号被增强，从而可以通过荧光颜色判断其为南瓜果实中肌醇含量低的基因型(KASP标记的分型结果定义为：FAM)。若所在位点的等位基因碱基为A和G杂合时，绿色(与特定的HEX检测引物结合并释放出绿色荧光)和红色荧光信号均会出现，鉴定为杂合，从而可以判断其为南瓜果实中肌醇含量低的基因型(KASP标记的分型结果定义为：FAMHEX)。

在利用分子标记341335基因分型检测肌醇含量分布时，当分子标记341335所在的等位基因中均为T时，检测样品会与特定的FAM检测引物结合并释放出蓝色荧光基团，随着PCR反应的指数增长，蓝色荧光信号被增强，从而可以通过荧光颜色判断其为南瓜果实中肌醇含量高的基因型(KASP标记的分型结果定义为：FAM)。当分子标记341335所在的等位基因中均为C时，检测样品会与特定的HEX检测引物结合并释放出绿色荧光基团，随着PCR反应的指数增长，绿色荧光信号被增强，从而可以通过荧光颜色判断其为南瓜果实中肌醇含量高的基因型(KASP标记的分型结果定义为：HEX)。若所在位点的等位基因碱基为T和C杂合时，红色和蓝色荧光信号均会出现，从而可以判断其为南瓜果实中肌醇含量低的基因型(KASP标记的分型结果定义为：FAMHEX)。

本发明的第四个方面，提供本发明第三个方面所述的产品在南瓜基因分型或品种选育中的应用。

本发明的第五个方面，提供一种辨别南瓜品种的方法，包括如下步骤：提取待测南瓜核酸样品，使用本发明第三个方面所述的产品进行检测，根据SNP位点上的等位基因情况判定南瓜品种。

在本发明的一些实施方式中，检测体系为：

试剂	体积	终浓度
			2×PARMS master mix	5μL	1×
上游分型F1(10μM)	0.15μL	150nM
			上游分型F2(10μM)	0.15μL	150nM
下游引物R(10μM)	0.4μL	400nM
			DNA template	10-100ng	10-100nM
ddH<sub>2</sub>O	补至10μL

检测条件为：

在本发明的一些实施方式中，判断方法是基于荧光情况进行判定(荧光颜色)，当然，使用其他公知的方法对分子标记340813和分子标记341335进行检测，确定其SNP情况，也可以达到相同的目的。

本发明的有益效果是：

本发明对南瓜的RIL群体的南瓜肌醇含量进行了数量性状定位，筛选得到了两个与南瓜肌醇含量连锁的分子标记340813和分子标记341335，针对分子标记340813和分子标记341335进行KASP标记开发能快速批量的对南瓜肌醇含量高的品种进行鉴定，有助于南瓜的分子育种改良，相比传统育种筛选，大大节约了成本和时间。

附图说明

图1为高肌醇含量的母本COM-E(P1)和低肌醇含量的父本COM-X(P2)的实物对比图。

图2为南瓜肌醇基因在高密度遗传连锁图谱的初步定位结果图：横坐标表示连锁群的位置，纵坐标表示LOD值；灰色线标记的阈值是代表p<0.05的关联阈值，表示关联性显著。

图3为分子标记340813的荧光信号基因分型结果，绿色为基因型HEX，蓝色为基因型FAM，红色为杂合基因型FAMHEX。

图4为分子标记341335的荧光型号基因分型结果，绿色为基因型HEX，蓝色为基因型FAM，红色为杂合基因型FAMHEX。

图5为检测不同样品后基于分子标记340813基因分型的肌醇含量品种分布情况。

图6为检测不同样品后基于分子标记341335基因分型的肌醇含量品种分布情况。

具体实施方式

为了使本发明的发明目的、技术方案及其技术效果更加清晰，以下结合具体实施方式，对本发明进行进一步详细说明。应当理解的是，本说明书中描述的具体实施方式仅仅是为了解释本发明，并非为了限定本发明。

所使用的实验材料和试剂，若无特别说明，均为常规可从商业途径所获得的耗材和试剂。

遗传群体的构建及遗传分析

(1)供试植物材料的选择：

在下述实施例中，供试植物材料以中国南瓜高代自交系COM-E(P₁)和COM-X(P₂)为亲本构建得到的重组自交群体(RIL)F₈，共包含122个株系，于2019年春季种植于广东省农业科学院蔬菜研究所白云基地试验田内。

其中，亲本COM-E(P₁)和COM-X(P₂)的果实样品图片如图1所示。

(2)南瓜果实肌醇含量的确定和遗传规律分析：

将上述122株RIL群体单株南瓜果实粉碎，冷冻干燥后研磨，称取各样品粉末20mg，溶于60％-70％甲醇溶液中。加入松醇标准品至终浓度0.01g/L，50℃-70℃下水浴至少1h。离心，取上清进行真空干燥。真空干燥后的样品中加入硅烷化试剂(BSTFA)，于80℃水浴下反应至少1h。室温冷却。经硅烷化后的样品加入等体积的己烷，采用气相色谱法–质谱法(GC-MS)测定溶液中的肌醇含量。

南瓜遗传图谱构建和肌醇含量高低的初步定位

(1)南瓜基因组DNA的提取：

使用CTAB法提取南瓜亲本(COM-E和COM-X)及122株RIL群体的基因组DNA，CTAB法的具体操作步骤参考本领域常规操作。提取得到的DNA用于后续文库构建。

(2)遗传图谱的构建：

利用重测序技术和HighMap软件对上述中国南瓜RIL遗传分离群体(包括2个亲本和122个子代)开发高密度SNP，并进行遗传图谱的构建。

(3)肌醇基因的QTL定位：

利用MapQTL5软件采用复合区间作图法(MQM)对上述收集得到的群体表型数据和遗传图谱信息进行分析和计算，以获得性状相关的QTL。通过置换检测(Permutation test，PT)检验1000次，以进行阈值设定。其中，QTL判断标准为：p值小于0.05时对应的LOD值作为筛选的阈值。

结果如图2所示。

如图2所示，图中灰色的部分为筛选的阈值范围。而超过阈值表示为一个基因的连锁定位区间，从图2可以看出，肌醇基因定位在15号染色体，定位在15号染色体的两个SNP标记340813和341335之间，区间从2459706bp到2715672bp。

其中，经过测序可得SNP标记340813的序列为：

5’-TCTTCTATCCATCCCAACCTTTGAATTAATTAAATTAATCAATTCATTCTATAATTTAGCCAACATTAAAAAATAATAATAATAATAATAAAATATATATATAAAAGAAACTAAAATATAGGAAGTTGGTCAATGTACGTGTGACGTGGCGGAGGGCAGGCCGCGCGCGCGCACAAGGTGGCGTGCGGAAGGCGTGTGGCGTTCCATTGGTTGCGAGTGGAATGCAATATTTATTACAGAAAAGGCATCAAAATAAAGTATGAAGCATGCCCTCATATCCACTGCCTCCTAGTAACGTACC-3’(SEQ ID NO:1)。

其中，下划线标记的G具有G→A的变化(即自SEQ ID NO:1所示序列的5’端起第150位碱基是SNP位点，其碱基为G或A)。

SNP标记341335的序列为：

5’-TTCCATGAGATATAGGGTTCATGAGGCAATGCAGTTTCCCCATAATCTAACATTTCCTATCAACACCCATAGAATCGCACACAACACTCCAATAATTGAAAACAATAAGAATCCTTTATTCATACCCGTCCTCCTTGCACCGGTAACGGGATTACCGACGGCGACATTGGCGTTGTTAAGGGTGTTCAGTGTATTTAGTTTCAATCTGCTGAAACTAGACATCCGCTCGAAAGCGCGGTTGACATTCTCTGAAGCTGATGCAGGAGTGGTCGGTATCGACTCTACGAACGCCCACAAATTG-3’(SEQ ID NO:2)。

其中，下划线标记的A具有A→G的变化(即自SEQ ID NO:2所示序列的5’端起第150位碱基是SNP位点，其碱基为A或G)。

KASP分子标记的开发和验证

根据上述实施例中获得的分子标记340813和分子标记341335的SNPs标记信息，设计KASP引物。

在发明实施例中，其设计得到的KASP引物由3条序列组成：上游分型F1、上游分型F2和下游引物R。

其中，下游引物R与普通PCR引物结构和设计方法一样。

上游引物(上游分型F1和上游分型F2)则由依次由3个部分组成：通用接头序列、普通扩增引物序列和分型序列(位点)。

其中，用于扩增分子标记340813的具体KASP引物序列如下所示：

上游分型F1：

(SEQ ID NO:3)；

上游分型F2：

(SEQ ID NO:4)；

其中，上游引物中的下划线部分为通用接头序列，斜体部分为普通扩增引物序列，3’末尾的加粗的一个碱基G(针对SEQ ID NO:3)和A(针对SEQ ID NO:4)为分型位点(序列)。

下游引物R：5’-CATTCCACTCGCAACCAATG-3’(SEQ ID NO:5)。

如图3所示。在利用分子标记340813基因分型检测肌醇含量分布时，当分子标记340813所在的等位基因中均为G时，检测样品会与特定的HEX检测引物结合并释放出绿色荧光基团，随着PCR反应的指数增长，绿色荧光信号被增强，从而可以通过荧光颜色判断其为南瓜果实中肌醇含量高的基因型(KASP标记的分型结果定义为：HEX)。当所在位点的等位基因碱基均为A时，检测样品会与特定的FAM检测引物结合并释放出蓝色荧光基团，随着PCR反应的指数增长，蓝色荧光信号被增强，从而可以通过荧光颜色判断其为南瓜果实中肌醇含量低的基因型(KASP标记的分型结果定义为：FAM)。若所在位点的等位基因碱基为A和G杂合时，绿色和红色荧光信号均会出现，鉴定为杂合，从而可以判断其为南瓜果实中肌醇含量低的基因型(KASP标记的分型结果定义为：FAMHEX)。

用于扩增分子标记341335的具体KASP引物序列如下所示：

上游分型F1：

(SEQ ID NO:6)；

上游分型F2：

(SEQ ID NO:7)；

其中，上游引物中的下划线部分为通用接头序列，斜体部分为普通扩增引物序列，3’末尾的加粗的一个碱基T(针对SEQ ID NO:6)和C(针对SEQ ID NO:6)为分型位点(序列)。

下游引物R：5’-TTCCCCATAATCTAACATTTCCTAT-3’(SEQ ID NO:8)。

如图4所示。在利用分子标记341335基因分型检测肌醇含量分布时，当分子标记341335所在的等位基因中均为T时，检测样品会与特定的FAM检测引物结合并释放出蓝色荧光基团，随着PCR反应的指数增长，蓝色荧光信号被增强，从而可以通过荧光颜色判断其为南瓜果实中肌醇含量高的基因型(KASP标记的分型结果定义为：FAM)。当分子标记341335所在的等位基因中均为C时，检测样品会与特定的HEX检测引物结合并释放出绿色荧光基团，随着PCR反应的指数增长，绿色荧光信号被增强，从而可以通过荧光颜色判断其为南瓜果实中肌醇含量高的基因型(KASP标记的分型结果定义为：HEX)。若所在位点的等位基因碱基为T和C杂合时，红色和蓝色荧光信号均会出现，从而可以判断其为南瓜果实中肌醇含量低的基因型(KASP标记的分型结果定义为：FAMHEX)。

其中，上述分子标记340813和341335基因分型检测体系如表1所示。

表1

PCR扩增反应条件如表2所示。

表2

PCR完成后，使用TECAN infinite M1000酶标仪读取荧光信号，然后利用在线软件snpdecoder(http://www.snpway.com/snpdecoder/)解析转换荧光信号，得到清晰直观的分型图，并根据颜色不同，输出基因型结果(图5和图6)。

根据实验结果两个标记的荧光信号对上述122个样本进行有效的分群，并且分群结果能将高肌醇含量和低肌醇含量区分开，其中高肌醇含量的样本归为两个标记的同一个基因型中，从而表明两个标记可以用于高肌醇含量材料的筛选。

使用其他公知的方法对分子标记340813和分子标记341335进行检测，确定其SNP情况，也可以达到相同的目的。

上述实施例为本发明较佳的实施方式，但本发明的实施方式并不受上述实施例的限制，其他的任何未背离本发明的精神实质与原理下所作的改变、修饰、替代、组合、简化，均应为等效的置换方式，都包含在本发明的保护范围之内。

SEQUENCE LISTING

<110> 广东省农业科学院蔬菜研究所

<120> 与南瓜肌醇含量主效QTL连锁的KASP分子标记及其应用

<130>

<160> 8

<170> PatentIn version 3.5

<210> 1

<211> 301

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 1

tcttctatcc atcccaacct ttgaattaat taaattaatc aattcattct ataatttagc 60

caacattaaa aaataataat aataataata aaatatatat ataaaagaaa ctaaaatata 120

ggaagttggt caatgtacgt gtgacgtggc ggagggcagg ccgcgcgcgc gcacaaggtg 180

gcgtgcggaa ggcgtgtggc gttccattgg ttgcgagtgg aatgcaatat ttattacaga 240

aaaggcatca aaataaagta tgaagcatgc cctcatatcc actgcctcct agtaacgtac 300

c 301

<210> 2

<211> 301

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 2

ttccatgaga tatagggttc atgaggcaat gcagtttccc cataatctaa catttcctat 60

caacacccat agaatcgcac acaacactcc aataattgaa aacaataaga atcctttatt 120

catacccgtc ctccttgcac cggtaacggg attaccgacg gcgacattgg cgttgttaag 180

ggtgttcagt gtatttagtt tcaatctgct gaaactagac atccgctcga aagcgcggtt 240

gacattctct gaagctgatg caggagtggt cggtatcgac tctacgaacg cccacaaatt 300

g 301

<210> 3

<211> 41

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 3

gaaggtgacc aagttcatgc taatgtacgt gtgacgtggc g 41

<210> 4

<211> 42

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 4

gaaggtcgga gtcaacggat tcaatgtacg tgtgacgtgg ca 42

<210> 5

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 5

cattccactc gcaaccaatg 20

<210> 6

<211> 40

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 6

gaaggtgacc aagttcatgc tcaatgtcgc cgtcggtaat 40

<210> 7

<211> 40

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 7

gaaggtcgga gtcaacggat tcaatgtcgc cgtcggtaac 40

<210> 8

<211> 25

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 8

ttccccataa tctaacattt cctat 25

Claims

1.SNP分子标记，其特征在于，所述SNP分子标记为（1）~（2）中的至少一种：

（1）位于SEQ ID NO：1所示序列自5’端起第150位碱基，其碱基为G或A；

（2）位于SEQ ID NO：2所示序列自5’端起第150位碱基，其碱基为T或C；

所述SNP分子标记位于南瓜肌醇含量连锁的主效QTL位。

2.权利要求1所述的SNP分子标记在制备筛选不同肌醇含量的南瓜的产品中的应用。

3.用于检测权利要求1所述的SNP分子标记的产品，其特征在于，所述产品包括引物对，所述引物对为KASP引物对；

所述KASP引物对的核苷酸序列为：

上游引物F1 ：5’-GAAGGTGACCAAGTTCATGCTAATGTACGTGTGACGTGGCG -3’；

上游引物F2 ：5’-GAAGGTCGGAGTCAACGGATTCAATGTACGTGTGACGTGGCA-3’；

下游引物R ：5’-CATTCCACTCGCAACCAATG-3’；

或

上游引物F1: 5’- GAAGGTGACCAAGTTCATGCTCAATGTCGCCGTCGGTAAT-3’；

上游引物F2: 5’-GAAGGTCGGAGTCAACGGATTCAATGTCGCCGTCGGTAAC-3’；

下游引物R：5’-TTCCCCATAATCTAACATTTCCTAT-3’。

4.权利要求3所述的产品在南瓜基因分型或品种选育中的应用。

5.一种辨别南瓜品种的方法，包括如下步骤：

提取待测南瓜核酸样品，使用权利要求3所述的产品进行检测，根据SNP位点的检测情况判定南瓜品种。

6.根据权利要求5所述的方法，其特征在于，检测体系为：