CN114317810B

CN114317810B - 一种鉴别谷子叶酸性状的snp位点、kasp分子标记引物组及其应用

Info

Publication number: CN114317810B
Application number: CN202210175844.4A
Authority: CN
Inventors: 侯思宇; 孙朝霞; 韩渊怀; 门艺涵
Original assignee: Shanxi Agricultural University
Current assignee: Shanxi Agricultural University
Priority date: 2022-02-25
Filing date: 2022-02-25
Publication date: 2023-07-14
Anticipated expiration: 2042-02-25
Also published as: CN114317810A

Abstract

本发明属于生物技术领域，具体涉及一种鉴别谷子叶酸性状的SNP位点、KASP分子标记引物组及其应用。本发明提供的SNP位点位于谷子SiADCL1基因第1号外显子上，且在SiADCL1基因第1号外显子164bp位点，所述位点上存在T/C碱基突变，与谷子叶酸具有显著的相关性。当所述位点为C碱基时，所述谷子叶酸性状为高叶酸；当所述位点为T碱基时，所述谷子无高叶酸性状。利用本发明所述SNP位点能够筛选高叶酸谷子，有利于谷子种质育种。

Description

一种鉴别谷子叶酸性状的SNP位点、KASP分子标记引物组及其应用

背景技术

本发明属于生物技术领域，具体涉及一种鉴别谷子叶酸性状的SNP位点、KASP分子标记引物组及其应用。

技术领域

谷子是我国重要的粮食作物之一，种植面广，受众面广。随着环境和人们生活需求的改变，优良谷子品种的选育工作仍然势在必行。谷子品种的选育主要包括传统杂交育种和现代分子标记选育技术，传统杂交育种依靠天然基因的不同组合，首先需要选择目的性状优良的父本和母本，该方法对杂交方法和设备要求不高，但是耗时长。

现代分子标记选育技术是近年来逐渐兴起的育种技术，利用分子标记能够反映生物个体或种群间基因组中某种差异的特性，能够针对谷子不同性状进行选育，目的性更强，效果更佳明显，且耗时短，所以是目前谷子品种选育的热门技术。

叶酸是一种水溶性维生素，是维持生命活动的重要维生素，其能够参与遗传物质和蛋白质的代谢，促进动物繁殖和生长和提高免疫力。目前妊娠妇女或者计划妊娠妇女均提倡服用叶酸，用以预防胎儿发育缺陷。因此培育高叶酸含量的谷子品种，对于提高人膳食中叶酸的摄入量具有重要健康价值。然而，现有技术并未出现关于谷子叶酸分子标记的研究。

发明内容

本发明的目的在于提供一种鉴别谷子叶酸性状的SNP位点、KASP分子标记引物组及其应用，快速筛选和鉴定谷子叶酸性状，提高高叶酸谷子种质的选育效率。

本发明提供了一种鉴别谷子叶酸性状的SNP位点，所述SNP位点位于谷子SiADCL1基因第1号外显子上，且在第1号外显子的164bp处多态性为T/C。

优选的，所述SNP的多态性位点位于SEQ ID No.1所示的核苷酸序列的第164bp处，且多态性为T/C。

本发明还提供了一种鉴别上述SNP位点的KASP分子标记引物组，包括序列为SEQID NO.3所示的正向引物1、序列为SEQ ID NO.4所示的正向引物2和序列为SEQ ID NO.5所示的反向引物。

本发明还提供了一种用于检测上述SNP位点的试剂盒，包括上述的KASP分子标记引物组；

所述引物组中正向引物1和正向引物2的使用浓度独立为4～10μmol/L；所述引物组中的反向引物的浓度为4～10μmol/L。

本发明还提供了上述SNP位点或KASP分子标记引物组在谷子育种中的应用。

本发明还提供了上述SNP位点或KASP分子标记引物组在筛选高叶酸谷子中的应用。

本发明还提供了一种鉴别谷子叶酸性状的方法，包括如下步骤：

利用上述引物组对谷子基因组DNA进行PCR扩增，得到扩增产物；

对所述扩增产物进行KASP基因分型检测，根据分型检测结果鉴别谷子叶酸性状；

所述谷子叶酸性状判定的方法为：当KASP基因分型检测结果为CC型时，鉴定谷子叶酸性状为高叶酸；当KASP基因分型检测结果为TT型或CT型时，鉴定谷子叶酸性状为非高叶酸。

优选的，所述PCR扩增使用的反应体系以10μL计包括：谷子基因组DNA2μL，引物组0.14μL，2x Probe MixA溶液5μL和余量的ddH₂O；

所述PCR扩增反应的程序为：第一阶段95℃预变性10min；第二阶段95℃变性20s，61℃退火40s，共10个循环；第三阶段95℃变性20s，55℃退火40s，共31个循环；第四阶段25℃保持10min。

优选的，所述引物组中，正向引物1、正向引物2和反向引物的体积比为2:2:5。

优选的，所述谷子基因组DNA的浓度为50～100ng/μL。

本发明提供的SNP位点，位于谷子SiADCL1基因第1号外显子上，且在第1号外显子的164bp处多态性为T/C；当碱基为C时，所述谷子叶酸性状为高叶酸；当碱基为T时，所述谷子叶酸性状为低叶酸。利用该SNP位点，能将谷子高叶酸和低叶酸区分开。

本发明采用KASP分子标记引物组对谷子叶酸性状进行选择，只需通过DNA提取、PCR特异性扩增、KASP基因分型检测即可完成对样品的鉴别，能够得到高叶酸谷子，该分子标记物用于鉴定谷子叶酸是切实有效的，利用本发明分子标记辅助选择可提高高叶酸谷子种质选育效率，为谷子叶酸含量相关优异等位变异的利用提供依据，加快育种进程。

附图说明

为了更清楚地说明本发明实施例或现有技术中的技术方案，下面将对实施例中所需要使用的附图作简单地介绍。

图1为实施例1 SiADCL上SNP(T164C)的KASP实验结果；

图2为实施例1不同基因型材料叶酸含量分布情况。

具体实施方式

本发明提供了一种鉴别谷子叶酸性状的SNP位点，含有位于谷子SiADCL1基因第1号外显子上第164bp处多态性为T/C的核苷酸序列；碱基为C时，所述谷子叶酸性状为高叶酸。

在本发明中，所述SNP位点位于谷子SiADCL1基因第1号外显子上第164bp位点，所述位点上存在T/C碱基突变，与谷子叶酸具有显著的相关性。本发明所述SNP位点优选含有如SEQ ID No.1所示的核苷酸序列，所述SNP的多态性位点位于第164bp处，且多态性为T/C。通过对所述SNP位点进行分型可确定待测谷子叶酸性能：当所述位点为C碱基时，所述谷子叶酸性状为高叶酸；当所述位点为T碱基时，所述谷子无高叶酸性状。本发明所述SNP位点位于SiADCL1基因第1号外显子上，该基因的结构信息来源于谷子多组学数据库(http://foxtail-millet.biocloud.net/home)，用于查询的编号为Si1g12410；NCBI登录号为XP_004952187，具体核苷酸序列如SEQ ID No.2所示。

本发明提供了所述的SNP位点的KASP分子标记，所述KASP分子标记的引物组包括序列为SEQ ID NO.3所示的正向引物1、序列为SEQ ID NO.4所示的正向引物2和序列为SEQID NO.5所示的反向引物。

本发明提供了用于检测所述的SNP位点的试剂盒，包括所述引物组。本发明所述引物组中正向引物1和正向引物2的使用浓度优选独立为4～10μmol/L，进一步优选为5～8μmol/L，更优选为6～7μmol/L；所述引物组中的反向引物的浓度为4～10μmol/L，进一步优选为5～8μmol/L，更优选为6～7μmol/L。本发明对所述试剂盒中含有的其他组分不做严格要求，选择本领域熟知的能够用于检测所述的SNP位点的试剂即可。

本发明还提供了所述的SNP位点或所述的KASP分子标记在谷子育种中的应用，所述育种优选包括筛选高叶酸谷子。本发明所述SNP位点与谷子叶酸具有显著的相关性，利用所述的SNP位点的KASP分子标记可对材料的基因型进行检测，其结果几乎不受环境影响，实验结果稳定可靠。

利用所述引物组对谷子基因组DNA进行PCR扩增，得到扩增产物；

所述谷子叶酸性状判定的方法为：当扩增产物的荧光信号为红色时，鉴定谷子叶酸性状为高叶酸；当扩增产物的荧光信号为蓝色时，鉴定谷子叶酸性状为非高叶酸。

本发明首先提取待测谷子基因组DNA。本发明对所述待测谷子的种类没有特殊要求，任何种类的谷子均可。本发明对所述待测谷子基因组的提取方法没有特殊限定，采用本领域常规的植物细胞基因组提取方法即可。在本发明具体实施过程中，以待测谷子新鲜叶片为材料，利用CTAB法进行提取。

得谷子基因组DNA后，本发明以待测谷子基因组DNA为模板，利用所述引物组进行PCR扩增反应获得扩增产物。本发明中所述PCR扩增反应使用的反应体系以10μL计优选的包括：谷子基因组DNA 2μL，引物组0.14μL，2x Probe MixA溶液5μL和余量的ddH₂O。本发明所述引物组中正向引物1、正向引物2和反向引物的体积比优选为2:2:5。本发明所述2x ProbeMixA溶液购买自High Genotyping。本发明所述谷子基因组DNA的浓度优选为50～100ng/μL，进一步优选为60～80ng/μL，更优选为65～70ng/μL；所述基因组DNA的OD₂₆₀/OD₂₈₀比值优选为1.7～2.0。

本发明所述PCR扩增反应的程序优选为：

第一阶段：95℃预变性10min；

第二阶段：95℃变性20s，61℃退火40s，共10个循环；

第三阶段：95℃变性20s，55℃退火40s，共31个循环；

第四阶段：25℃保持10min。

本发明在所述PCR扩增完成后，优选的将PCR扩增产物保存于4℃。本发明所述PCR扩增反应结束后，所述PCR扩增产物中含有目标SNPs位点所在的DNA片段。

得PCR扩增产物后，本发明对所述PCR扩增产物进行KASP基因分型检测，确定所述SNP位点的基因型，根据分型检测结果鉴别谷子叶酸性状。本发明所述检测优选采用TaqmanGenotyper Software软件进行分析。本发明优选获取PCR扩增产物的HEX和FAM对应的相对荧光值，根据相对荧光值进行聚类分簇，根据样品簇确定基因型，具体的，当扩增产物的荧光信号为红色时，鉴定谷子叶酸性状为高叶酸，对应的基因型为CC；当扩增产物的荧光信号为蓝色时，鉴定谷子叶酸性状非高叶酸纯合，即TT；当扩增产物的荧光信号为绿色时，鉴定谷子叶酸性状非高叶酸杂合，即CT。

为了进一步说明本发明，下面结合附图和实施例对本发明提供的技术方案进行详细地描述，但不能将它们理解为对本发明保护范围的限定。

实施例1

一种利用KASP技术检测谷子SiADCL1基因并预测谷子叶酸的方法

1、实验材料

随机选取167份SiADCL1优异等位变异位点上不同基因型的谷子材料(96份非高叶酸材料，71份高叶酸含量材料)为检测对象。

2、基因组DNA的提取

(1)对实验材料进行育苗，取新鲜叶片于液氮中速冻，并将获得的材料保存于-80℃冰箱中用于提取DNA；

(2)利用CTAB法进行提取DNA，得基因组DNA，OD₂₆₀/OD₂₈₀比值须在1.7～2.0之间。

3、KASP技术进行基因分型

针对谷子SiADCL1基因第1号外显子上第164bp位点(NCBI登录号为XP_004952187)设计引物组，对步骤2得到的基因组DNA进行PCR扩增：

PCR扩增引物的5’-3’核苷酸序列如下：

正向引物1(SEQ ID NO.3)：5’-GAAGGTGACCAAGTTCATGCTCCGTGGCTGCCCTGACCA-3’，正向引物15’末端用激发荧光基团FAM标记；

正向引物2(SEQ ID NO.4)：5’-GAAGGTCGGAGTCAACGGATTCCGTGGCTGCCCTGACCG-3’，正向引物15’末端用激发荧光基团HEX标记；

反向引物(SEQ ID NO.5)：5’-GACCTTGCTGCCGTCGATT-3’；

上述引物由上海生工生物工程技术服务有限公司合成。

KASP检测流程如下：

1)提取待测谷子的基因组DNA；

2)以待测谷子的基因组DNA为模板，利用上述正向引物1、正向引物2和反向引物进行PCR扩增反应，得PCR扩增产物；

3)分析PCR扩增产物，从而对谷子SiADCL1基因型进行判定。

其中，PCR扩增反应使用的反应体系以10μL计为：4-50ng/μL基因组DNA2μL、引物mix 0.14μL(由6μL正向引物1+6μL正向引物2+15μL反向引物+23μLddH₂O混合配制得到引物mix)、2x Probe Mix A溶液5μL和ddH₂O 3μL；

PCR扩增反应的扩增程序为：95℃预变性10min；95℃变性20s，61℃退火40s，10个循环；95℃变性20s，55℃退火40s，31个循环；25℃保持10min；4℃保存。

扩增结束后，基于AQP基因分型系统操作说明(北京嘉诚生物科技有限公司AQP基因分析操作系统操作使用说明，(版本号V01/2021))进行KASP检测，设定ABI7500 qPCR仪上PCR程序为35℃保持30s；导出结果文件，进一步根据样品簇确定基因型在TaqmanGenotyper Software软件上进行结果分析，获取每一个PCR反应孔的HEX和FAM对应的荧光值除以该孔参比染料(ROX)的值，将数据荧光值进行标准化处理，得到每一个PCR反应孔的HEX和FAM对应的相对荧光值(FAM荧光标签序列在激发光485nm，发射光520nm波长下观察读值，HEX荧光标签序列在激发光528nm，发射光560nm波长下观察读值)。根据相对荧光值，对样品进行聚类分簇。检测结果如图1所示。

由图1可看出该位点有三种基因型，蓝色点代表基因型为T/T，红色点代表基因型为C/C，绿色点代表基因型为C/T。

测试例1

分析实施例1检测的谷子材料叶酸性状与分型结果的吻合度，谷子材料叶酸性状与分型结果对应情况以及吻合度如表1～2和图2所示。

表1籽粒表型性状与分型结果对应情况

注：图中H表示高叶酸；L表示非高叶酸。

表2实施例1 KASP基因分型与表型统计结果

注：吻合度＝(KASP实验结果与实际材料性状相符合的材料数)/(总材料数)。

根据表1～2和图2记载的内容可以看出，当扩增产物的荧光信号为红色时，鉴定谷子叶酸性状为高叶酸，对应的基因型为CC；当扩增产物的荧光信号为蓝色时，鉴定谷子叶酸性状非高叶酸纯合，即TT；当扩增产物的荧光信号为绿色时，鉴定谷子叶酸性状非高叶酸杂合，即CT。实施例1的KASP实验结果与待测样品的实际叶酸性状相近，检测到90份T/T的材料(蓝色点)，50份C/C的材料(红色点)，27份数TC的材料(绿色点)，其中高叶酸性状与检测材料的实际性状吻合度达70.4％，非高叶酸性状与检测材料的实际性状吻合度达100％，KASP实验结果与测序结果(即测序结果为T/T)的吻合度为93.75％。总体来说，在146份待检测样品中，KASP检测结果与性状吻合度为87.43％，KASP检测结果与测序结果吻合度达83.8％。说明利用该分子标记对待测材料进行KASP实验，能够有效检测其基因型，从而完成种质的鉴定。

尽管上述实施例对本发明做出了详尽的描述，但它仅仅是本发明一部分实施例，而不是全部实施例，人们还可以根据本实施例在不经创造性前提下获得其他实施例，这些实施例都属于本发明保护范围。

序列表

<110> 山西农业大学

<120> 一种鉴别谷子叶酸性状的SNP位点、KASP分子标记引物组及其应用

<160> 5

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 199

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 1

atggctcact tccctgccac tccgtcggcc gcggcagcca ccggccaccg ggtctcgccc 60

tcgcctcgct cttccgcttc cctgccgcgg aggacgacct tgctgccgtc gattggagcc 120

gccggaggtc ccccttcgcg gtcgtggagg ggagcggcgg cggcggtcag ggcagccacg 180

ggctcggaca acaaggccg 199

<210> 2

<211> 1155

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 2

atggctcact tccctgccac tccgtcggcc gcggcagcca ccggccaccg ggtctcgccc 60

tcgcctcgct cttccgcttc cctgccgcgg aggacgacct tgctgccgtc gattggagcc 120

gccggaggtc ccccttcgcg gtcgtggagg ggagcggcgg cggcggtcag ggcagccacg 180

ggctcggaca acaaggccgc atcggctggg acaattatca atccaaacga tgtccctgtc 240

ttgtctttct ctgaggttgc tgaaaggctt ggtacgttcc aagcgtctgg tgctaggaat 300

caaaattaca tggccatgta ttctagcatt tttggtggaa ttacaacaga tccttctgca 360

atggtgatac caatcgatga tcacatggtt catagaggtc atggggtttt tgatactgcg 420

gctattatgg atggtcacct ctatgaatta gaacagcacc ttgaccgctt cctgaggtct 480

gcattgatgg ccaaaatacc cttacctttt ggtcgctcaa caatgagaag catgcttatt 540

caaactgtta gtgtatcaaa ctgcactcaa ggttcactca gatactggct gtctgttgga 600

cctggagact tccagttatc ttcatctggc tgtgcaaacc cagccctcta tgctgttgtt 660

attgaaagtc catccataca agtaccatca ggctgcaaag tggtgacatc atctatacca 720

ataaagtcgt cacatttcgc agtcatgaaa agcgtgaatt acctgccgaa tgcactcacc 780

aagtttgaag gcgaagaaaa tggtgcattt actggcattt ggttggatga tgagggcttt 840

gtcgcagagg gttccaacat gaacgttggc tttgtgacgg cgggcaaaga gcttctcatg 900

ccccgtttcg acaagatact cagtgggtgc acagcaaagc gggttctgac cctggctgag 960

cagctagtag ctgatggaag gctcagcagg ataatatcaa ggaatgtgag tgttcaggaa 1020

ggtaaggcgg ctgacgaaat gatgcttatt gggagtggca ttcttgtcaa acctgttgtt 1080

cagtgggatg atcagataat tggctctggt aaggacagct ctacatgctt attacatact 1140

gcatctcaac aataa 1155

<210> 3

<211> 39

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 3

gaaggtgacc aagttcatgc tccgtggctg ccctgacca 39

<210> 4

<211> 39

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 4

gaaggtcgga gtcaacggat tccgtggctg ccctgaccg 39

<210> 5

<211> 19

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 5

gaccttgctg ccgtcgatt 19

Claims

1.SNP位点在鉴别谷子叶酸性状中的应用，其特征在于，所述SNP位点位于谷子SiADCL1基因第1号外显子上；

所述SNP位点的多态性位点位于SEQ ID No.1所示的核苷酸序列的第164bp处，且多态性为T/C。

2.一种鉴别权利要求1所述的SNP位点的KASP分子标记引物组，其特征在于，包括序列为SEQ ID NO.3所示的正向引物1、序列为SEQ ID NO.4所示的正向引物2和序列为SEQ IDNO.5所示的反向引物。

3.一种用于检测权利要求1所述的SNP位点的试剂盒，包括权利要求2所述的KASP分子标记引物组；

所述引物组中正向引物1和正向引物2的使用浓度独立为4~10μmol/L；所述引物组中的反向引物的浓度为4~10μmol/L。

4.权利要求2所述的KASP分子标记引物组或权利要求3所述的试剂盒在谷子育种中的应用。

5.权利要求2所述的KASP分子标记引物组或权利要求3所述的试剂盒在筛选高叶酸谷子中的应用。

6.一种鉴别谷子叶酸性状的方法，其特征在于，包括如下步骤：

利用权利要求2所述的KASP分子标记引物组对谷子基因组DNA进行PCR扩增，得到扩增产物；

7.根据权利要求6所述的方法，其特征在于，所述PCR扩增使用的反应体系以10μL计包括：谷子基因组DNA 2μL，引物组0.14μL，2x Probe Mix A溶液5μL和余量的ddH₂O；

所述PCR扩增反应的程序为：第一阶段95℃预变性10min；第二阶段95℃变性20s，61℃退火/延伸40s，共10个循环；第三阶段95℃变性20s，55℃退火/延伸40s，共31个循环；第四阶段25℃保持10min。

8.根据权利要求7所述的方法，其特征在于，所述引物组中，正向引物1、正向引物2和反向引物的体积比为2:2:5。

9.根据权利要求7所述的方法，其特征在于，所述谷子基因组DNA的浓度为50~100ng/μL。