CN114317811B

CN114317811B - 一种鉴定苦荞脱壳性状的snp位点、kasp分子标记引物组及其应用

Info

Publication number: CN114317811B
Application number: CN202210184442.0A
Authority: CN
Inventors: 孙朝霞; 侯思宇; 韩渊怀; 王欣芳; 杜伟
Original assignee: Shanxi Agricultural University
Current assignee: Shanxi Agricultural University
Priority date: 2022-02-25
Filing date: 2022-02-25
Publication date: 2023-06-23
Anticipated expiration: 2042-02-25
Also published as: CN114317811A

Abstract

本发明属于生物技术领域，具体涉及一种鉴定苦荞脱壳性状的SNP位点、KASP分子标记引物组及其应用。本发明提供的SNP位点位于苦荞第1号染色体上第8250379bp，所述位点上存在G/A碱基突变，与苦荞脱壳性状具有显著的相关性。当所述位点为A时，所述苦荞脱壳性状为易脱壳。利用该SNP位点，能将不易脱壳苦荞和易脱壳苦荞区分开。

Description

一种鉴定苦荞脱壳性状的SNP位点、KASP分子标记引物组及其应用

技术领域

本发明属于SNP分子标记技术领域，具体涉及一种鉴定苦荞脱壳性状的SNP位点、KASP分子标记引物组及其应用。

背景技术

苦荞属于双子叶植物纲，蓼目，蓼科，荞麦属一年生的草本植物。苦荞的整个生长周期短，对逆境适应力强，耐贫瘠性也强，是一种良好的填闲、救灾作物。

苦荞皮壳是指荞麦籽粒的外种皮，占籽粒总重量的25％-30％，是荞麦籽粒的天然保护层，具有柔韧而坚实的结构，是苦荞籽粒木质化程度最高的部位，苦荞仁脆性大，仁与壳之间缝隙较小，导致苦荞脱壳难。苦荞脱壳效率，主要是检查是否能保存完整的苦荞仁，完整的苦荞仁对苦荞加工产品的价值有一定的影响。目前苦荞的脱壳工艺，需要高温蒸煮熟化后进行机械磨盘式脱壳，整半仁率仅能达到约40％。随着消费者对苦荞加工产品的热爱，在针对苦荞壳的厚度相关研究，培育易脱壳表型品种已成为苦荞研究的重点。

发明内容

本发明的目的在于提供一种鉴定苦荞脱壳性状的SNP位点、KASP分子标记引物组及其应用，快速筛选和鉴定苦荞脱壳性状，提高易脱壳苦荞种质的选育效率。

本发明提供了一种鉴定苦荞脱壳性状的SNP位点，所述SNP位点位于苦荞第1号染色体上第8250379bp处，且多态性为G/A。

优选的，所述SNP的多态性位点位于SEQ ID No.1所示的核苷酸序列第151bp处。

本发明还提供了一种鉴定所述的SNP位点的KASP分子标记引物组，所述KASP分子标记引物组包括序列为SEQ ID NO.2所示的正向引物1、序列为SEQ ID NO.3所示的正向引物2和序列为SEQ ID NO.4所示的反向引物。

优选的，所述引物组中正向引物1和正向引物2的使用浓度独立为100μmol/L；所述引物组中的反向引物的浓度为100μmol/L。

本发明还提供了所述的SNP位点或所述的KASP分子标记引物组在苦荞育种中的应用。

本发明还提供了所述的SNP位点或所述的KASP分子标记引物组在筛选易脱壳苦荞中的应用。

本发明还提供了一种鉴定苦荞脱壳性状的方法，包括如下步骤：

利用所述的引物组对苦荞基因组DNA进行PCR扩增，得到扩增产物；

对扩增产物进行KASP基因分型检测，当KASP基因分型检测结果为GG型时，鉴定苦荞脱壳性状为不易脱壳；当KASP基因分型检测结果为AA型时，鉴定苦荞脱壳性状为易脱壳；当KASP基因分型检测结果为GA型时，鉴定苦荞脱壳性状为不易脱壳。

优选的，所述PCR扩增使用的反应体系以10μL计包括：苦荞基因组DNA 2μL，引物组0.14μL，HiGeno 2x Probe Mix A溶液5μL和余量的ddH₂O；

所述PCR扩增反应的程序为：第一阶段95℃预变性10min；第二阶段95℃变性20s，55℃～61℃退火40s，共10个循环；第三阶段95℃变性20s，55℃退火40s，共31个循环。

优选的，所述引物组中，正向引物1、正向引物2和反向引物的体积比为2:2:5。

优选的，所述苦荞基因组DNA的浓度为50～100ng/μL。

本发明提供的SNP位点，位于苦荞第1号染色体上第8250379bp处，且多态性为G/A；当碱基为A时，所述苦荞脱壳性状为易脱壳。利用该SNP位点，能将不易脱壳苦荞和易脱壳苦荞区分开。

本发明采用KASP分子标记引物对苦荞脱壳性状进行选择，只需通过简单的DNA提取、PCR特异性扩增、KASP基因分型检测即可完成对样品的鉴定，能够得到易脱壳苦荞，该分子标记物用于鉴定苦荞脱壳性状是切实有效的，利用本发明分子标记辅助选择可提高易脱壳苦荞种质选育效率，为苦荞脱壳性状相关优异等位变异的利用提供依据，加快育种进程。

附图说明

为了更清楚地说明本发明实施例或现有技术中的技术方案，下面将对实施例中所需要使用的附图作简单地介绍。

图1不同基因型下苦荞开裂情况；

图2为实施例1KASP实验结果(KASP-379)；

图3为对比例1KASP实验结果(KASP-339)；

图4为苦荞第1号染色体上第8250379bp基因连锁图。

具体实施方式

本发明提供了一种鉴定苦荞脱壳性状的SNP位点，含有位于苦荞第1号染色体上第8250379bp处多态性为G/A的核苷酸序列；碱基为A时，所述苦荞脱壳性状性状为易脱壳。

在本发明中，所述SNP位点位于苦荞第1号染色体上第8250379bp处，所述位点上存在G/A碱基突变，与苦荞脱壳具有显著的相关性。本发明所述SNP位点位于苦荞第1号染色体上(参考基因组：http://www.mbkbase.org/Pinku1/)。本发明所述SNP位点优选含有如SEQID No.1所示的核苷酸序列，所述SNP的多态性位点位于第151bp处，且多态性为G/A。通过对所述SNP位点进行分型可确定待测苦荞脱壳性能：当所述位点为A碱基时，所述苦荞脱壳性状为易脱壳；当所述位点为G碱基时，所述苦荞不易脱壳。

本发明提供了所述的SNP位点的KASP分子标记，所述KASP分子标记的引物组包括序列为SEQ ID NO.2所示的正向引物1、序列为SEQ ID NO.3所示的正向引物2和序列为SEQID NO.4所示的反向引物。

在本发明中，以SEQ ID NO.1所示的核苷酸序列设计SEQ ID NO.2、SEQ ID NO.3和SEQ ID NO.4组成的引物组，由所述序列为SEQ ID NO.2、SEQ ID NO.3和SEQ ID NO.4组成的引物组用于检测位于苦荞第1号染色体上第8250379bp的多态性。。

本发明提供了用于检测所述的SNP位点的试剂盒，包括所述引物组。本发明所述引物组中正向引物1和正向引物2的使用浓度独立为100μmol/L；所述引物组中的反向引物的浓度为100μmol/L。本发明对所述试剂盒中含有的其他组分不做严格要求，选择本领域熟知的能够用于检测所述的SNP位点的试剂即可。

本发明还提供了所述的SNP位点或所述的KASP分子标记在苦荞育种中的应用，所述育种优选包括筛选易脱壳苦荞。本发明所述SNP位点与苦荞脱壳性状具有显著的相关性，利用所述的SNP位点的KASP分子标记可对材料的基因型进行检测，其结果几乎不受环境影响，实验结果稳定可靠。

利用所述引物组对苦荞基因组DNA进行PCR扩增，得到扩增产物；

对所述扩增产物进行KASP基因分型检测，根据分型检测结果鉴定苦荞脱壳性状；

所述苦荞脱壳性状判定的方法为：当KASP基因分型检测结果为AA型时，鉴定苦荞脱壳性状为易脱壳纯合子(籽粒表现为种壳开裂)；当KASP基因分型检测结果为GG型时，鉴定苦荞脱壳性状为不易脱壳纯合子(籽粒表现为种壳不开裂；当KASP基因分型检测结果为GA型时，鉴定苦荞脱壳性状为不易脱壳杂合子，具体见附图1，其中附图1从上到下依次为测试例1编号为F2-K1和F2-K4杂交群体对应的苦荞开裂情况。

本发明首先提取待测苦荞基因组DNA。本发明对所述待测谷苦荞的种类没有特殊要求，任何种类的苦荞均可。本发明对所述待测苦荞基因组的提取方法没有特殊限定，采用本领域常规的植物细胞基因组提取方法即可。在本发明具体实施过程中，以待测苦荞新鲜叶片为材料，利用CTAB法进行提取。

得苦荞基因组DNA后，本发明以待测苦荞基因组DNA为模板，利用所述引物组进行PCR扩增反应获得扩增产物。本发明中所述PCR扩增反应使用的反应体系以10μL计优选的包括：苦荞基因组DNA 2μL，引物组0.14μL，HiGeno 2x Probe Mix A溶液5μL和余量的ddH₂O。本发明所述引物组中正向引物1、正向引物2和反向引物的体积比优选为2:2:5。本发明所述HiGeno 2x Probe Mix A溶液购买自北京嘉程生物科技有限公司(www.jasongen.com)。本发明所述苦荞基因组DNA的浓度优选为50～100ng/μL，进一步优选为60～80ng/μL，更优选为65～70ng/μL；所述基因组DNA的OD₂₆₀/OD₂₈₀比值优选为1.7～2.0。

本发明所述PCR扩增反应的程序优选为：

第一阶段：95℃预变性10min；

第二阶段：95℃变性20s，55℃～61℃退火40s，共10个循环；

第三阶段：95℃变性20s，55℃退火40s，共31个循环。

在本发明中，进行所述PCR扩增反应的第二阶段时，优选第一个循环的退火温度为61℃，每增加一个循环退火温度降低0.6℃。本发明优选在第三阶段完成后，进行第四阶段：25℃保持。

本发明在所述PCR扩增完成后，优选的将PCR扩增产物保存于4℃。本发明所述PCR扩增反应结束后，所述PCR扩增产物中含有目标SNPs位点所在的DNA片段。

得PCR扩增产物后，本发明对所述PCR扩增产物进行KASP基因分型检测，确定所述SNP位点的基因型，根据分型检测结果鉴定苦荞脱壳性状。本发明所述检测优选采用ABI7500采集荧光数据后，利用Taqman Genotyper Software软件进行数据分析。本发明优选获取PCR扩增产物的HEX和FAM对应的相对荧光值，根据相对荧光值进行聚类分簇，根据样品簇确定基因型，具体的，当扩增产物的荧光信号为红色时，鉴定苦荞脱壳性状为易脱壳纯合子，对应的基因型为A/A；当扩增产物的荧光信号为蓝色时，鉴定苦荞脱壳性状为不易脱壳纯合子，对应的基因型为G/G；当扩增产物的荧光信号为绿色时，鉴定苦荞脱壳性状为不易脱壳杂合子，对应的基因型为A/G。

为了进一步说明本发明，下面结合附图和实施例对本发明提供的技术方案进行详细地描述，但不能将它们理解为对本发明保护范围的限定。

实施例1

一种利用KASP技术检测苦荞脱壳性状的方法

1、实验材料

以ND89品种和籽粒壳裂突变体KZ1杂交F2代群体植株(102份不易脱壳，25份易脱壳)为检测对象，

2、基因组DNA的提取

(1)对实验材料进行育苗，取新鲜中等大小叶片于液氮中速冻，并将获得的材料保存于-80℃冰箱中用于提取DNA；

(2)利用CTAB法进行提取DNA，得基因组DNA，OD₂₆₀/OD₂₈₀比值须在1.7～2.0之间。

3、KASP技术进行基因分型

针对苦荞第1号染色体上第8250379bp位点设计引物组(序列信息来源于http:// www.mbkbase.org/Pinku1/)，具体以SEQ ID NO.1所示的核苷酸序列设计引物，标记位点记为KASP-379)，对步骤2得到的基因组DNA进行PCR扩增：

PCR扩增引物的5’-3’核苷酸序列如下：

正向引物1(SEQ ID NO.2)：5’-AACTCTCTCGTCTCTCTCCCCG-3’，正向引物15’末端连接激发荧光基团FAM；

正向引物2(SEQ ID NO.3)：5’-AAACTCTCTCGTCTCTCTCCCCA-3’，正向引物25’末端连接激发荧光基团HEX；

反向引物(SEQ ID NO.4)：5’-AGAGGGTTACCTGATGCCAACAC-3’；

上述引物由生工生物工程(上海)股份有限公司合成。

KASP检测流程如下：

1)提取待测苦荞的基因组DNA；

2)以待测苦荞的基因组DNA为模板，利用上述正向引物1、正向引物2和反向引物(所有引物母液均为100μM)进行PCR扩增反应，得PCR扩增产物；

3)分析PCR扩增产物，从而对苦荞第1号染色体上第8250379bp的基因型进行判定。

其中，PCR扩增反应使用的反应体系以10μL计为：50ng/μL基因组DNA 2μL、引物mix0.14μL(由12μL正向引物1-FAM+12μL正向引物2-HEX+30μL反向引物+46μLddH₂O混合配制得到引物mix)、HiGeno 2x Probe Mix A溶液5μL和ddH₂O 2.86μL；

PCR扩增反应的扩增程序为：95℃预变性10min；95℃变性20s，61℃退火40s，10个循环；95℃变性20s，55℃退火40s，31个循环；16℃保持；4℃保存。

扩增结束后，基于AQP基因分型系统操作说明(购自北京嘉程生物科技有限公司)进行KASP检测，设定ABI7500 qPCR仪上PCR程序为温度55℃保持时间30s，导出结果文件，进一步根据样品簇确定基因型在Taqman Genotyper Software软件上进行结果分析，获取每一个PCR反应孔的HEX和FAM对应的相对荧光值(FAM荧光标签序列在激发光485nm，发射光520nm波长下观察读值，HEX荧光标签序列在激发光528nm，发射光560nm波长下观察读值)。根据相对荧光值，对样品进行分型分类。检测结果如图1所示。

由图1可看出该位点有3种基因型，蓝色点代表基因型为G/G的材料(共36份检测样品)，红色点代表基因型为A/A的材料(共25份检测样品)，绿色点代表基因型为A/G的材料(共66份检测样品)。

对比例1

同实施例1，区别在于：

以实施例1材料为检测对象，针对苦荞第1号染色体上第9888339bp位点设计引物组(序列信息来源于http://www.mbkbase.org/Pinku1/，具体以SEQ ID NO.5所示的核苷酸序列设计引物，标记位点记为KASP-339，所述位点上存在G/A碱基突变)，对步骤2得到的基因组DNA进行PCR扩增：

PCR扩增引物的5’-3’核苷酸序列如下：

正向引物1(SEQ ID NO.6所示)：5’-AAGCTTGCAAAGGGGGTCG-3’，正向引物15’末端连接激发荧光基团FAM；

正向引物2(SEQ ID NO.7所示)：5’-AAGCTTGCAAAGGGGGTCA-3’，正向引物25’末端连接激发荧光基团HEX；

反向引物(SEQ ID NO.8所示)：5’-GACTGTCCAAGTGGCCAAGATAAT-3’；

上述引物由生工生物工程(上海)股份有限公司合成。

扩增结束后，基于AQP基因分型系统操作说明(北京嘉程生物科技有限公司)进行KASP检测，设定ABI7500 qPCR仪上PCR程序为55℃保持30s，导出结果文件，进一步根据样品簇确定基因型在Taqman Genotyper Software软件上进行结果分析，获取每一个PCR反应孔的HEX和FAM对应的相对荧光值(FAM荧光标签序列在激发光485nm，发射光520nm波长下观察读值，HEX荧光标签序列在激发光528nm，发射光560nm波长下观察读值)。根据相对荧光值，对样品进行聚类分簇。检测结果如图2所示。

由图2可看出该位点有3种基因型，蓝色点代表基因型为G/G的材料(共33份检测样品)，红色点代表基因型为A/A的材料(共26检测样品)，绿色点代表基因型为G/A的材料(共68检测样品)。

测试例1

分别检测实施例1和对比例1检测苦荞材料籽粒表型性状与分型结果的吻合度，详细内容见表1～3。

表1籽粒表型性状与分型结果对应情况

注：图中FK表示不易脱壳；K表示易脱壳。

表2实施例1F2代KASP基因分型与表型统计结果

表3对比例1F2代KASP基因分型与表型统计结果

根据表1～3记载的内容可以看出，实施例1KASP实验结果与待测样品的实际脱壳性状相同，检测到36份G/G的材料(蓝色点)，25份A/A的材料(红色点)和66份G/A的材料(绿色点)，即检测到102份不易脱壳苦荞，25份易脱壳苦荞，并且与实际检测材料的实际性状吻合度达100％。说明利用该分子标记对待测材料进行KASP实验，能够有效检测其基因型，从而完成种质的鉴定。

对比例1KASP实验结果与待测样品的实际脱壳性状相同较大，检测到33份G/G的材料(蓝色点)，26份A/A的材料(红色点)和68份G/A的材料(绿色点)，KASP实验结果与待测样品的实际脱壳性状相似度较低，结果吻合度较低，其中不易脱壳性状与基因型吻合率达77.67％，即(27+53)/(27+53+23)，易脱壳性状与基因型吻合率为12.50％，即3/(3+15+6)，说明该分子标记对待测材料进行KASP实验，不能有效检测其基因型。

实施例3

遗传连锁分析

对苦荞杂交群体进行混池测序，利用欧式距离(Euclidean Distance，ED)算法关联分析和SNP-index共定位，在1号染色体上得到2.6Mb的共定位区间，苦荞第1号染色体上第8250379bp、第9888339bp位点见的遗传连锁关系如3。由图3可以看出，苦荞第1号染色体上第8250379bp存在遗传连锁关系，与ch2(壳裂性状)遗传距离为1.83cM。

尽管上述实施例对本发明做出了详尽的描述，但它仅仅是本发明一部分实施例，而不是全部实施例，人们还可以根据本实施例在不经创造性前提下获得其他实施例，这些实施例都属于本发明保护范围。

序列表

<110> 山西农业大学

<120> 一种鉴定苦荞脱壳性状的SNP位点、KASP分子标记引物组及其应用

<160> 8

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 301

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 1

attcaaagca agccaaggag ctaaaggccc taaacaagtc cctcgtttga tgatccacta 60

acccggcccg tcaaacagcc aatagaggaa gggtttttgt ttttctcatt cgcgatttag 120

ggtttggaaa actctctcgt ctctctcccc aataatctgc gacagtctcc ctcttcctcc 180

ggctggatcg gtgttggcat caggtaaccc tctccccgat ttctcccact tcgtccccat 240

ttatttctct gtctcccaga tttctttcac caatgaatac tgatatcctg atttgctttt 300

c 301

<210> 2

<211> 22

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 2

aactctctcg tctctctccc cg 22

<210> 3

<211> 23

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 3

aaactctctc gtctctctcc cca 23

<210> 4

<211> 23

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 4

agagggttac ctgatgccaa cac 23

<210> 5

<211> 301

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 5

attaattata ttaaatttag ttaagtagaa atggatagtg tatatagttt aattaggaaa 60

cgcctctact cctacaaata ttaggagtga tgcacaggtg gaggcctctt atggccttgg 120

ttcgtagaga taaagcttgc aaagggggtc aagatactaa ataccaggtt gtagacccga 180

tcggttcaat tatcttggcc acttggacag tcatctttgg tagaccctaa ttggcccctt 240

catcactcga ataatttggt agactcaaat tggaaaaaaa tagaattaat aaaaattata 300

t 301

<210> 6

<211> 19

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 6

aagcttgcaa agggggtcg 19

<210> 7

<211> 19

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 7

aagcttgcaa agggggtca 19

<210> 8

<211> 23

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 8

gactgtccaa gtggccaaga taa 23

Claims

1.SNP位点在鉴定苦荞脱壳性状中的应用，其特征在于，所述SNP位点位于苦荞第1号染色体上第8250379bp处，且多态性为G/A。

2.根据权利要求1所述的应用，其特征在于，所述SNP的多态性位点位于SEQ ID No.1所示的核苷酸序列第151bp处。

3.一种鉴定权利要求1所述的SNP位点的KASP分子标记引物组，其特征在于，所述KASP分子标记引物组包括序列为SEQ ID NO.2所示的正向引物1、序列为SEQ ID NO.3所示的正向引物2和序列为SEQ ID NO.4所示的反向引物。

4.根据权利要求3所述的KASP分子标记引物组，其特征在于，所述引物组中正向引物1和正向引物2的使用浓度独立为100μmol/L；所述引物组中的反向引物的浓度为100μmol/L。

5.权利要求3或4所述的KASP分子标记引物组在苦荞育种中的应用。

6.权利要求3或4所述的KASP分子标记引物组在筛选易脱壳苦荞中的应用。

7.一种鉴定苦荞脱壳性状的方法，其特征在于，包括如下步骤：

利用权利要求3或4所述的KASP分子标记引物组对苦荞基因组DNA进行PCR扩增，得到扩增产物；

8.根据权利要求7所述的方法，其特征在于，所述PCR扩增使用的反应体系以10μL计包括：苦荞基因组DNA2μL，引物组0.14μL，HiGeno2xProbe MixA溶液5μL和余量的ddH2O；

9.根据权利要求8所述的方法，其特征在于，所述引物组中，正向引物1、正向引物2和反向引物的体积比为2:2:5。

10.根据权利要求8所述的方法，其特征在于，所述苦荞基因组DNA的浓度为50～100ng/μL。