CN110592079A - 水稻细长粒基因slg7分子标记引物及其应用 - Google Patents

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Abstract

本发明提供了一种水稻细长粒基因SLG7分子标记引物，包括：上游引物：核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示；下游引物：核苷酸序列如SEQ ID NO.2所示。还提供了水稻细长粒基因SLG7分子标记，以所示分子标记引物对水稻基因组DNA进行PCR扩增得到。该标记引物用于扩增水稻基因组模板，PCR扩增产物进行凝胶电泳，检测PCR产物的带型若扩增出一98bp条带，即为SLG7基因型；若扩增条出一109bp条带，即为slg7基因型；若扩增出98bp和109bp两条带，即为杂合型。该分子标记引物可用于鉴定水稻长粒基因SLG7的基因型和水稻分子育种。

Description

水稻细长粒基因SLG7分子标记引物及其应用
技术领域
本发明涉及水稻遗传育种领域，尤其涉及水稻细长粒基因SLG7分子标记引物及其应用。
背景技术
水稻是我国重要的粮食作物，60％以上的人口以稻米为主食。近年来，随着经济发展和人民生活水平的提高，消费观念由量向质的转变，市场对优质大米的需求日趋增加。根据国内稻米市场供求调查，一般年份低、中档米供过于求，高档长粒型籼米缺口较大，必须大量从泰国进口。因此，水稻长粒性的深入研究以及水稻长粒品种的培育，对于改良我国籼稻品质提升我国自产高档籼米的市场竞争力，提高人民生活水平有着十分重要的意义。
SLG7是扬州大学梁国华教授团队利用美国超长粒粳稻品种Azucena和我国籼稻骨干品种9311构建遗传群体图位克隆的一个水稻重要粒形基因，形态学和细胞学机制研究表明，来源于Azucena的SLG7基因通过纵向增加细胞长度横向减少细胞宽度而产生纤细的颗粒，使谷粒变得细长，外观品质更好(Zhou Y，et al.Natural variations in SLG7regulate grain shape in rice.Genetics，2015，201：1591–1599)。分子标记是一种快速、简便、成本低廉并可在水稻生长早期进行无损检测的一种技术，在作物育种中已开始广泛利用，但目前还没有对水稻细长粒基因SLG7特异性分子标记开发和利用的报道。
发明内容
本发明的目的在于提供了一种水稻细长粒基因SLG7分子标记引物及其应用，该分子标记引物可用于鉴定水稻长粒基因SLG7的基因型和水稻分子育种。
本发明的目的之一在于提供一种水稻细长粒基因SLG7分子标记引物，该分子标记引物包括：
上游引物：核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示；
下游引物：核苷酸序列如SEQ ID NO.2所示。
本发明的目的之二在于提供水稻细长粒基因SLG7分子标记，该分子标记以SEQ IDNO.1所示的上游引物和SEQ ID NO.2所示的下游引物对水稻基因组DNA进行PCR扩增得到。
该分子标记包括11bp的InDel位点，该InDel位点的核苷酸序列如SEQ ID NO.3所示。
本发明的目的之三在于提供所述的分子标记引物在鉴定水稻长粒基因SLG7的基因型中的应用。
本发明的目的之四在于提供所述的分子标记引物在水稻分子育种中的应用。
本发明的目的之五在于提供一种鉴定水稻长粒基因SLG7的基因型的方法，所述方法包括如下步骤：
步骤1、提取水稻基因组DNA；
步骤2、以水稻基因组DNA为模板，以如SEQ ID NO.1，SEQ ID NO.2所示的引物进行PCR扩增，获得PCR扩增产物；
步骤3、将PCR扩增产物进行凝胶电泳，检测PCR产物的带型并进行基因型判定：
若扩增出一98bp条带，即为SLG7基因型；
若扩增条出一109bp条带，即为slg7基因型；
若扩增出98bp和109bp两条带，即为杂合型。
本发明的有益效果：
1、本发明利用204份中国栽培稻微核心种质对SLG7进行等位基因多态性分析、单倍型分型和粒长关联分析，在SLG7基因起始密码子ATG上游-104bp处发现一个11bp大小的显著性连锁的InDel位点，SLG7长粒亲本Azucena所在的单倍型为-11bp(基因型SLG7)，另外4种单倍型均为+11bp(基因型slg7)。因此对该InDel位点的分型可以准确判断SLG7基因的基因型。针对此位点设计开发出来的标记为功能性分子标记即水稻细长粒基因SLG7分子标记，并设计水稻细长粒基因SLG7分子标记引物，含有此标记的就是SLG7长粒型，否则就是slg7短粒型。与利用少数亲本的差异分析开发的分子标记只能检测一个或者少数几个亲本来源的分离群体，本研究分子标记位点因为是用核心种质群体关联分析得到，因此适用于所有的SLG7分离群体，具有更好的适应性和运用价值。
2、本发明提供的水稻细长粒基因SLG7分子标记引物可以准确判断SLG7基因的基因型。适于在育种中早世代和生育早期进行SLG7优异等位基因大规模快速鉴定，加快优质稻水稻的选育进程。
附图说明
图1为本发明的水稻细长粒基因SLG7分子标记引物(M-SLG7)对不同水稻骨干品种SLG7基因扩增示意图；M：DL500 DNA marker；1-10分别是：鄂中5号，9311，玉晶91，玉针香，象牙香针，黄毛占，象牙香占，黄华占，16Q1303，丰银占；11-12：(16Q1303/玉针香)F1代；
图2为本发明的水稻细长粒基因SLG7分子标记引物(M-SLG7)在种质资源筛选中的应用；Marker为DL500 DNA marker；1-32分别是：鄂香2号、稻花香2号、CLJ-AN、CLJ-YD、中科804、CLJ-HB、CLJ-JX、日本晴、R193、R1127、R7272、香5、9311、15Q340、R835、黄毛占、洋西早、华润2号、超级巴斯马蒂、鉴真2号、玉晶91、玉针香、鄂中5号、Y58s、培矮64s、广占63-4s、福稻88、16Q1303、鄂丰丝苗、R476、华润1号、E农1s；
图3为本发明的水稻细长粒基因SLG7分子标记引物(M-SLG7)在H2育种群体筛选中的应用；Marker为DL500 DNA marker；1-40是部分H2代株系；
图4本发明的水稻细长粒基因SLG7分子标记引物(M-SLG7)在F3育种群体筛选中的应用；Marker为DL500 DNA marker；1-20是F3代株系。
具体实施方式
实施例1InDel位点的发掘
通过对中国栽培稻微核心种质的SLG7等位基因进行了序列分析、单倍型分析和关联分析表明，SLG7包含5种主要的单倍型,其中单倍型I为长粒单倍型，其他单倍型均为短粒，其中SLG7基因起始密码子ATG上游-104bp处的一个11bp大小的InDel位点表现出显著特异性(该InDel位点的核苷酸序列如SEQ ID NO.3所示)，SLG7长粒亲本Azucena所在的单倍型I为-11bp(基因型SLG7)，另外4种单倍型均为+11bp(基因型slg7)
实施例2水稻细长粒基因SLG7分子标记引物
本实施例中未特别说明的实验方法即为分子生物学常规方法。本研究所用Taq酶及dNTP产自北京全式金生物技术有限公司，其余均为常规生化试剂。
本发明实施例所用的分子标记M-SLG7的引物为：核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示；SLG7R：核苷酸序列如SEQ ID NO.2所示，扩增方法如下：
1、按照本领域的常规方式提取待测水稻基因的DNA；待测水稻包括：鄂中5号，9311，玉晶91，玉针香，象牙香针，黄毛占，象牙香占，黄华占，16Q1303，丰银占；(16Q1303/玉针香)F1代。
2、PCR：
PCR反应体系为15μL，含1.5μL 10×Buffer，1.0μL dNTPs(10mmol/L)，10μM浓度的上下游引物SLG7F和SLG7R各0.5μL；Taq酶0.2μL(5U/μL)，模板浓度50ng/μL的基因组DNA1.0μL，然后用ddH2O补齐；
PCR反应程序：94℃预变性5min；94℃变性30s，55℃退火30s，72℃延伸30s，共35个循环；72℃延伸5min。扩增产物在6％聚丙烯酰胺凝胶电泳，硝酸银染色显影。
3、判定：
如图1所示，SLG7基因型扩增条带为98bp，slg7基因型扩增条带为109bp，杂合基因型含有98bp和109bp两条带。
水稻品种鄂中5号，玉晶91，玉针香，象牙香针，黄毛占，象牙香占，丰银占均为SLG7基因型，扩增条带为98bp；水稻品种9311，黄华占，16Q1303均为slg7基因型，扩增条带为109bp；(16Q1303/玉针香)F1代为杂合基因型，含有98bp和109bp两条带。
实施例3水稻长粒基因SLG7特异性分子标记的效果验证
一、利用H2群体对水稻长粒基因SLG7特异性分子标记的效果验证
1、生物材料
本实例所用育种群体(鄂中5号/玉针香)//16Q1303是两个含有SLG7的鄂中5号与玉针香杂交，然后与含有slg7的自育亲本16Q1303复交，然后花药培养技术得到的育种群体，共45个株系，在H2代检测SLG7基因型和粒长等表型。
2、PCR：PCR体系同实施例1。
3、结果分析
(1)凝胶电泳结果如图3所示，表明在所检测的45个H2代株系中，有32个是SLG7基因型的，13个是slg7基因型(见图3)。
(2)表型检测结果如表1所示。
表1
项目 粒长范围 平均粒长
SLG7基因型 9.98-12.43mm 11.27mm
slg7基因型 9.10-9.83mm 9.51mm
表1中不同基因型的t检验结果均为P＜0.001，表明水稻育种群体中不同SLG7基因型材料的粒长和长宽比影响都达到了极显著的水平。说明利用本研究发明的特异性分子标记对本群体中SLG7基因和粒长的选择是有效的。
二、利用F2群体对水稻长粒基因SLG7特异性分子标记的效果验证
1、生物材料
本实例所用育种群体(鄂中5号/玉针香)//16Q1303是两个含有SLG7的鄂中5号与玉针香杂交，然后与含有slg7的自育亲本16Q1303复交，然后自交选择得到的育种群体，共20个株系，检测SLG7基因型和粒长等表型。
2、PCR：PCR体系同实施例1。
3、结果分析
(1)凝胶电泳结果如图4所示，表明在所检测的20个F3代株系中，有6个是SLG7基因型，2个是slg7基因型，12个是杂合基因型。
(2)表型检测结果如表2所示。
表2
表2中不同基因型的t检验结果均为P＜0.001，表明F3育种群体中SLG7基因型和slg7基因型的株系的粒长和长宽比呈现极显著差异，杂合基因型株系的粒长和长宽比介于两种纯合基因型之间，表型为部分显性。说明利用本研究发明的特异性分子标记M-SLG7对群体中SLG7基因和粒长的选择是有效的；通过分子标记可以在早世代选择基因纯合单株，也可以避免杂合型基因在后代丢失的风险。
实施例4水稻长粒基因SLG7特异性分子标记M-SLG7在种质资源筛选中的应用
1、生物材料
对本单位搜集保存的60个优质稻骨干亲本，包括鄂香2号、稻花香2号、CLJ-AN、CLJ-YD、中科804、CLJ-HB、CLJ-JX、日本晴、R193、R1127、R7272、香5、9311、15Q340、R835、黄毛占、洋西早、华润2号、超级巴斯马蒂、鉴真2号、玉晶91、玉针香、鄂中5号、Y58s、培矮64s、广占63-4s、福稻88、16Q1303、鄂丰丝苗、R476、华润1号、E农1s；
均于2017年武汉正季种植；成熟后收种用万深SC-E型种子外观品质检测分析仪测量粒长、长宽比指标。
2、按照实施例1的方法对DNA进行PCR扩增，并进行结果分析
(1)在所检测的60个常用亲本中，有20个是SLG7基因型，40个是slg7基因型(见图2)。其中CLJ-AN代表长粒粳(安徽)、CLJ-YD代表长粒粳(扬大)、CLJ-HB代表长粒粳(湖北)、CLJ-JX代表长粒粳(嘉兴)。
(2)表型检测显示，SLG7基因型粒长的平均值为10.62mm(9.28-11.93mm)，slg7基因型粒长的平均值为9.26mm(7.34-10.9mm)；长宽比的平均值是4.34(2.98-5.29)和3.65(2.30-4.22)。t检验结果(P＜0.001)表明，水稻育种亲本中不同SLG7基因型的粒长和长宽比之间达到了极显著差异。
利用本研究发明的分子标记，除了我单位培育的高档优质稻鄂中5号、鄂香2号和虾稻1号，我们还筛选到了湖南的玉晶91、玉针香、贵州大粒香、广东美香占2号多个新的SLG7供体亲本，都是外观和食味品质都很好的高档优质稻，拓宽了SLG7供体基因的高档优质稻亲本选择空间，同时也说明SLG7基因在我国高档优质稻常规育种中已经得到了有效选择，下一步结合分子标记的手段，可以加速高档优质稻品种选育的发展。
以上所述仅为本发明的较佳实施例而已，并不用以限制本发明，凡在本发明的精神和原则之内，所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。
序列表
<110> 湖北省农业科学院粮食作物研究所，扬州大学
<120> 水稻细长粒基因SLG7分子标记引物及其应用
<160> 3
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 1
ccataccaca tctcatctca c 21
<210> 2
<211> 18
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 2
gctcacgcac atccaact 18
<210> 3
<211> 11
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 3
aagaaagtga t 11

Claims (8)

1.一种水稻细长粒基因SLG7分子标记引物，其特征在于，该分子标记引物包括：
上游引物：核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示；
下游引物：核苷酸序列如SEQ ID NO.2所示。
2.一种水稻细长粒基因SLG7分子标记，其特征在于，该分子标记以SEQ ID NO.1所示的上游引物和SEQ ID NO.2所示的下游引物对水稻基因组DNA进行PCR扩增得到。
3.如权利要求2所述的水稻细长粒基因SLG7分子标记，其特征在于，该分子标记包括11bp的InDel位点，该InDel位点的核苷酸序列如SEQ ID NO.3所示。
4.权利要求1所述的水稻细长粒基因SLG7分子标记引物在鉴定水稻长粒基因SLG7的基因型中的应用。
5.权利要求1所述的水稻细长粒基因SLG7分子标记引物在水稻分子育种中的应用。
6.一种鉴定水稻长粒基因SLG7的基因型的方法，其特征在于，所述方法包括如下步骤：
步骤1、提取水稻基因组DNA；
步骤2、以水稻基因组DNA为模板，以如SEQ ID NO.1，SEQ ID NO.2所示的引物进行PCR扩增，获得PCR扩增产物；
步骤3、将PCR扩增产物进行凝胶电泳，检测PCR产物的带型并进行基因型判定：
若扩增出一98bp条带，即为SLG7基因型；
若扩增条出一109bp条带，即为slg7基因型；
若扩增出98bp和109bp两条带，即为杂合型。
7.如权利要求6所述的方法，其特征在于，所述步骤2中PCR反应程序为：94℃预变性5min；94℃变性30s，55℃退火30s，72℃延伸30s，共35个循环；72℃延伸5min。
8.如权利要求6所述的方法，其特征在于，所述步骤3采用6％的PAGE变性凝胶进行凝胶电泳。
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