CN107058516A - 一种水稻粒宽基因gw2的分子标记及其应用 - Google Patents

Abstract

本发明提供了一种水稻粒宽基因GW2的分子标记和应用，属于植物生物技术领域。本发明的分子标记通过两条正向引物和一条反向引物PCR扩增得到，前述引物的核苷酸序列分别如SEQ ID NO.1‑3所示。利用该水稻粒宽基因GW2的分子标记，只需通过简单的PCR即可完成对GW2的基因分型，预测水稻粒宽变异。本发明具有操作简便、分型快速、结果准确、成本低廉等优势，能提高性状选择效率，满足大规模分子标记辅助选择的需求。

Description

一种水稻粒宽基因GW2的分子标记及其应用

技术领域

本发明属于植物生物技术领域，具体地说，涉及一种水稻粒宽基因GW2的分子标记及其应用。

背景技术

我国是最主要的水稻生产与消费大国，在过去的几十年间，水稻产量翻了几番，水稻产量相关基因的研究也取得巨大突破，包括qGL3、GW2、qSW5/GW5、GS3、GS5、GW8等基因相继被克隆。水稻的产量主要取决于穗数、每穗粒数和粒重，而粒重则主要由粒形的长、宽、厚三个基本性状决定。在构成水稻产量的三要素中，粒重(通常用千粒重表示)的遗传比较稳定，同时，由于粒重又与水稻的外观品质和蒸煮食味品质等存在着密切的关系，因而一直倍受水稻育种家和科研工作者的重视。

水稻GW2是Song等(Song X J,Huang W,Shi M,et al.A QTL for rice grainwidth and weight encodes a previously unknown RING-type E3ubiquitinligase.Nature Genetics,2007,39:623-630)克隆到的一个控制粒宽和粒重的主效基因。其功能性碱基突变为宽粒水稻的GW2等位基因在第四外显子上缺失了一个A，导致蛋白翻译提前终止，丢失310个氨基酸残基。GW2编码一个新类型的RING型E3泛素连接酶，通过将其底物锚定到蛋白酶体进行降解，从而负调节细胞的分裂。大粒水稻中氨基酸残基的缺失使GW2无法结合底物，无法控制泛素介导的蛋白质降解，进而导致颖花外壳细胞分裂和细胞数目增加，从而正调控颖花外壳的宽度，增加了粒重。

目前已报道的能用于GW2基因型筛选的标记有张亚东等(张亚东，梁彦丽，郑佳等.极端粒形水稻粒宽基因GW2的序列分析和效应.中国水稻科学，2014，28(6)：581-588)设计的一个dCAPS标记，利用该标记他们检测8个籼稻骨干恢复系和10个江苏省主栽粳稻品种，结果没有发现宽粒表型GW2等位基因的存在，证明GW2基因在水稻育种应用中还比较有限，表明GW2基因利用潜能巨大。

虽然利用张亚东等设计的dCAPS功能分子标记，能准确鉴定GW2基因型。但该标记在进行PCR后还需要进行酶切反应，操作过程相对繁琐、实验成本上也相对较高，在检测通量上也受到限制。因此，开发一种成本更低、检测准确性和通量更高的分子标记用于GW2基因分型，将极大促进水稻宽粒新种质的筛选和突变型GW2基因在粒型改良中的应用。

发明内容

本发明的目的在于克服现有技术存在的缺点与不足，提供一种水稻粒宽基因GW2的分子标记。

本发明的第二个目的是提供利用上述分子标记鉴定水稻粒宽基因GW2基因型的方法及其应用。

本发明的第三个目的是提供利用上述分子标记鉴定水稻粒宽或同时鉴定水稻粒宽基因GW2基因型和水稻粒宽的方法及其应用。

本发明提供的一种水稻粒宽基因GW2的分子标记，其通过核苷酸序列如SEQ IDNO.1-3所示的引物扩增得到。

本发明提供了上述分子标记在鉴定水稻粒宽基因GW2基因型中的应用。

本发明提供了上述分子标记在鉴定水稻粒宽中的应用。

本发明提供了上述分子标记在水稻育种中的应用。

本发明提供了用于检测水稻粒宽基因GW2的特异性引物组合，含有核苷酸序列如SEQ ID NO.1-3所示的引物。

其中，SEQ ID NO.1所示的正向引物GW2-F1:CACAATGTCCATTCTGCCAACT，SEQ IDNO.2所示的正向引物GW2-F2:AGCCTACACAATGTCGATTCTGCAAAAC，和SEQ ID NO.3所示的反向引物GW2-R:TGTTCTATGCTCCTTTCCTCCTTTG。

本发明上述引物组合是针对宽粒水稻GW2等位基因第四外显子上，一个导致蛋白翻译提前终止并丢失310个氨基酸残基的碱基缺失设计、筛选后获得。GW2-F1和GW2-F2的引物结合位置相同，但3’末端碱基分别为CT和AC，只能分别与突变型(宽粒)和野生型(窄粒)品种的GW2进行碱基配对。此外GW2-F2的5’端增加了特异序列AGCCTA用以引入扩增片段长度多态性，GW2-F1的3’端第5个碱基引入了A→C的突变，GW2-F2的3’端第13个碱基引入了C→G的突变用以扩大GW2-F1和GW2-F2对目标序列识别能力的差异。GW2-R可以分别与GW2-F1和GW2-F2配对扩增出81bp和88bp的PCR产物。

本发明提供了前述特异性引物组合在鉴定水稻粒宽基因GW2基因型中的应用。

本发明提供了前述特异性引物组合在鉴定水稻粒宽中的应用。

本发明提供了前述特异性引物组合在水稻种质资源改良中的应用。

进一步地，本发明提供了检测水稻粒宽基因GW2基因型的方法，首先对待测样本提取基因组DNA后，利用SEQ ID NO.1和SEQ ID NO.2所示的正向引物、SEQ ID NO.3所示的反向引物进行PCR，对PCR扩增产物大小进行分析，

若扩增产物只出现88bp条带，则表明待测样品的GW2基因为野生型；若只出现81bp条带，则表明待测样品的GW2基因为突变型；若同时出现88bp和81bp条带，则表明待测样品的GW2基因为杂合型。

81bp条带的参考序列如SEQ ID NO.4所示，88bp条带的参考序列如SEQ ID NO.5所示。本领域技术人员应当理解，由于水稻品种的差异，设计引物时预测的PCR产物序列只能作为参考序列，而从不同品种中扩增出来的产物的序列可能和参考序列完全一致，也可能与参考序列有部分碱基差异，但这种差异通常不会影响标记的使用。

本发明还提供了一种检测水稻粒宽的方法，对待测样本提取基因组DNA后，利用SEQ ID NO.1和SEQ ID NO.2所示的正向引物、SEQ ID NO.3所示的反向引物进行PCR，对PCR扩增产物大小进行分析，

若扩增产物只出现88bp条带，则表明待测样品的谷粒较窄；若只出现81bp条带，则表明待测样品的谷粒较宽；若同时出现88bp和81bp条带，则待测样品的粒宽处于两亲本之间。

进一步地，上述PCR的反应体系为：Biomiga的2×Bench Top^TM Taq master mix 5μL，10μM的两个正向、一个反向引物各0.5μL，10％DMSO 0.5μL，模板DNA约50-100ng，补灭菌ddH₂O至10μL；

PCR反应条件为：94℃，4min；94℃，30s，60℃，30s，72℃，20s，共35个循环；72℃，5min，16℃，1min。

在本发明的一个实施例中，是通过将PCR扩增产物进行PAGE胶电泳进行判断，PAGE胶电泳条件为：6％PAGE胶，U＝2000V，I＝200mA，P＝85W，电泳50min。

含有本发明所述的特异性引物组合的试剂盒也属于本发明的保护范围。

本发明提供了上述含有SEQ ID NO.1-3所示引物的试剂盒在宽粒型水稻选育中的应用。

本发明提供了上述含有SEQ ID NO.1-3所示引物的试剂盒在水稻种质资源筛选和改良中的应用。

与现有技术相比，本发明具有以下有益效果：本发明基于水稻粒宽基因GW2第四个外显子上的一个功能性碱基缺失，设计开发了一种扩增片段短，特异性强的三引物分子标记。利用该标记，只需通过简单的PCR和PAGE凝胶电泳检测即可完成对GW2的基因分型，预测水稻粒宽。本发明具有基因分型更准确、成本更低廉、检测通量更高等优势，更适合在大规模分子标记辅助选择中运用。

附图说明

图1是本发明分子标记的引物设计示意图。包括两条正向引物GW2-F1和GW2-F2，一条公共反向引物GW2-R。其中，GW2-F1和GW2-F2的引物结合位置相同，但3’末端碱基分别为CT和AC，只能分别与突变型(gw2，宽粒)和野生型(GW2，窄粒)品种进行碱基完全匹配；GW2-F2的5’端增加了特异序列AGCCTA用以引入扩增片段长度多态性，GW2-F1的3’端第5个碱基引入了A→C的突变，GW2-F2的3’端第13个碱基引入了C→G的突变用以扩大GW2-F1和GW2-F2对目标序列识别能力的差异。单碱基缺失位点用红色方框标出，引入的碱基突变用下划线标出。

图2是用本发明分子标记检测10个水稻品种/品系的PAGE胶电泳图。泳道1-10分别为N411、五丰B、华占、R51084、青丰1号B、南H197、元丰9918S、9311、岳4B、H28B。PCR产物大小标记在胶图右侧。

图3是用本发明分子标记检测N411/五丰B的F₂代单株的PAGE胶电泳图。泳道1-16为不同的F₂单株，17为N411，18为五丰B。PCR产物大小标记在胶图右侧。

具体实施方式

以下实施例用于说明本发明，但不用来限制本发明的范围。在不背离本发明精神和实质的情况下，对本发明方法、步骤或条件所作的修改或替换，均属于本发明的范围。

若未特别指明，实施例中所用的技术手段为本领域技术人员所熟知的常规手段；若未特别指明，实施例中所用试剂均为市售。

实施例1水稻GW2基因分子标记的引物设计及扩增片段分析

1、引物设计

通过对水稻粒宽基因GW2在宽粒和窄粒品种中等位基因的序列比对，分析得到了宽粒和窄粒品种在GW2编码区第四外显子上的一个功能性单碱基缺失。根据该碱基位点上下游的序列设计引物组合：

GW2-F1:CACAATGTCCATTCTGCCAACT(SEQ ID NO.1)，

GW2-F2:AGCCTACACAATGTCGATTCTGCAAAAC(SEQ ID NO.2)，

和GW2-R:TGTTCTATGCTCCTTTCCTCCTTTG(SEQ ID NO.3)(引物设计示意图见图1)。

2、扩增片段分析

用上述引物组合对水稻粒宽基因GW2进行扩增，窄粒粒材料将只能扩出一条88bp条带，宽粒材料将只能扩出一条81bp条带。81bp和88bp条带的核苷酸序列分别如SEQ IDNO.4和SEQ ID NO.5所示。

实施例2用本发明分子标记鉴定水稻品种/品系的GW2基因型

1、水稻粒宽测量方法：每个品种/品系随机挑选3株，每株挑选10粒饱满籽粒背腹相连测量平均粒宽代表各株的粒宽，3株粒宽的平均值代表该品种/品系粒宽。

2、水稻粒重测量方法：每个品种/品系随机挑选3株，每株挑选100粒饱满籽粒测量百粒重，3株百粒重的平均值代表该品种/品系粒重。

3、水稻基因组DNA的提取

用N411、五丰B、华占、中香黄占、R51084、青丰1号B、南H197、福丰恢1658、元丰9918S、9311、岳4B、H28B等12个水稻品种/品系为材料，采用CTAB法提取水稻基因组DNA，具体步骤如下：取3cm长的水稻叶片，在800μL抽提缓冲液[1.5％(w/v)CTAB，1.05mol/L NaCl，75mmol/L Tris-HCl(pH 8.0)，15mmol/L EDTA(pH 8.0)]中磨碎，收集到一个1.5mL离心管中。65℃水浴30min，间或颠倒混匀。加入800μL氯仿∶异戊醇(体积比24∶1)，颠倒混匀15min。12000r/min室温离心10min。吸上清450μL，转移到一个新的1.5mL离心管中，加入2倍体积95％乙醇，混匀后-20℃沉淀30min。12000r/min离心15min。倒掉95％乙醇，用75％乙醇洗沉淀。倒掉75％乙醇，干燥后加100μL灭菌ddH₂O溶解DNA。

3、PCR扩增

利用实施例1筛选得到的特异性引物组合(GW2-F1，GW2-F2，GW2-R)对本实施例所述12个水稻品种/品系的DNA进行PCR扩增，PCR的反应体系为：Biomiga的2×Bench Top^TMTaq master mix 5μL，10μM的两个正向、一个反向引物各0.5μL，10％DMSO 0.5μL，模板DNA约50-100ng，补灭菌ddH₂O至10μL；

PCR反应条件为：94℃，4min；94℃，30s，60℃，30s，72℃，20s，共35个循环；72℃，5min，16℃，1min。

4、PCR产物检测

扩增产物经6％PAGE胶电泳检测，电泳条件为：U＝2000V，I＝200mA，P＝85W，电泳50min。电泳完成后用0.1％AgNO₃染色，观片灯上观察拍照。

5、结果与分析

粒宽(以10粒稻谷总粒宽表示)测量表明，水稻品种/品系N411的粒宽为4.77±0.05cm，百粒重为6.950±0.10g，其它品种的粒宽为2.43±0.05到3.03±0.05cm，百粒重为1.826±0.04g到3.134±0.07g，N411的粒宽和粒重均明显大于其它品种的粒宽和粒重(表1)。用本发明实施例1的分子标记的引物组合扩增这些品种/品系，发现只有N411扩增出了一条81bp的带，为纯合突变基因型，而所有其它品种/品系都只扩增出了一条88bp的带，为纯合野生基因型(见图2和表1)。这些结果表明突变型GW2在现有水稻栽培品种中分布稀少，只存在于少数特异的宽粒种质资源中。此外，和野生型GW2相比，突变型GW2确实有使谷粒变宽的效应。最后，野生型和突变型GW2与粒宽的对应关系验证了本发明分子标记在鉴定GW2基因型时的准确性和可靠性。

表1水稻品种/品系的基因型、粒宽和百粒重

实施例3本发明分子标记的应用

1、水稻材料水稻品种N411与五丰B的F₂代16个单株。

2、水稻基因组DNA的提取在苗期提取叶片基因组DNA，具体方法同实施例2。

3、PCR扩增和产物判断标准参见实施例2。

4、水稻粒宽和粒重测量方法参见实施例2。

5、结果与分析用本发明实施例1的分子标记(特异性引物组合GW2-F1，GW2-F2，GW2-R通过PCR扩增得到)在苗期检测N411与五丰B的16个F₂单株中GW2的基因型，发现有8个单株只扩增出了88bp条带，有2个单株只扩增出了81bp条带，有6个单株同时扩增出了88bp和81bp条带(见图3)。对杂合F₁自交收种单株的粒宽和粒重进行鉴定，发现平均粒宽为3.77±0.05cm，百粒重为4.495±0.03g，粒宽小于N411但大于五丰B，粒重小于N411但大于五丰B(见表1)。说明本发明分子标记能在N411的杂交后代中有效区分不同基因型，在大规模育种实践中能较为准确的对水稻粒宽基因GW2进行辅助选择。

SEQUENCE LISTING

<110> 海南波莲水稻基因科技有限公司

<120> 一种水稻粒宽基因GW2的分子标记及其应用

<130> KHP171111207.1TQ

<160> 5

<170> PatentIn version 3.5

<210> 1

<211> 22

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 1

cacaatgtcc attctgccaa ct 22

<210> 2

<211> 28

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 2

agcctacaca atgtcgattc tgcaaaac 28

<210> 3

<211> 25

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 3

tgttctatgc tcctttcctc ctttg 25

<210> 4

<211> 81

<212> DNA

<213> 水稻

<400> 4

cacaatgtcc attctgccaa ctcccagtta tgctgtggag tatcgtggtg taaagacaaa 60

ggaggaaagg agcatagaac a 81

<210> 5

<211> 88

<212> DNA

<213> 水稻

<400> 5

agcctacaca atgtcgattc tgcaaaactc ccagttatgc tgtggagtat cgtggtgtaa 60

agacaaagga ggaaaggagc atagaaca 88

Claims (10)

1.一种水稻粒宽基因GW2的分子标记，其特征在于，通过核苷酸序列如SEQ ID NO.1-3所示的引物扩增得到。

2.权利要求1所述的分子标记在鉴定水稻粒宽基因GW2基因型中的应用。

3.权利要求1所述的分子标记在水稻育种中的应用。

4.用于检测水稻粒宽基因GW2的特异性引物组合，其特征在于，含有核苷酸序列如SEQID NO.1-3所示的引物。

5.权利要求4所述的特异性引物组合在鉴定水稻粒宽基因GW2基因型中的应用。

6.权利要求4所述的特异性引物组合在水稻种质资源改良中的应用。

7.检测水稻粒宽基因GW2基因型的方法，其特征在于，对待测样本提取基因组DNA后，利用SEQ ID NO.1和SEQ ID NO.2所示的正向引物、SEQ ID NO.3所示的反向引物进行PCR，对PCR扩增产物大小进行分析，根据PCR产物大小确定GW2的基因型；

若扩增产物只出现88bp条带，则表明待测样品的GW2基因为野生型；若只出现81bp条带，则表明待测样品的GW2基因为突变型；若同时出现88bp和81bp条带，则表明待测样品的GW2基因为杂合型。

8.一种检测水稻谷粒宽度的方法，其特征在于，对待测样本提取基因组DNA后，利用SEQID NO.1和SEQ ID NO.2所示的正向引物、SEQ ID NO.3所示的反向引物进行PCR，对PCR扩增产物大小进行分析，根据PCR产物大小推测水稻粒宽变化；

若扩增产物只出现88bp条带，则表明待测样品的谷粒较窄；若只出现81bp条带，则表明待测样品的谷粒较宽；若同时出现88bp和81bp条带，则待测样品的粒宽处于两亲本之间。

9.如权利要求7或8所述的方法，其特征在于，PCR的反应体系为：Biomiga的2×BenchTop^TM Taq master mix 5μL，10μM的两个正向、一个反向引物各0.5μL，10％DMSO 0.5μL，模板DNA约50-100ng，补灭菌ddH₂O至10μL；

PCR反应条件为：94℃，4min；94℃，30s，60℃，30s，72℃，20s，共35个循环；72℃，5min，16℃，1min。

10.含有权利要求4所述的特异性引物组合的试剂盒。