CN116334290A - 一种鉴定水稻功能基因的引物组、试剂盒及应用 - Google Patents
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Abstract
本发明发明了一种鉴定水稻功能基因的引物组、试剂盒及应用。该引物组包括：第1引物对至第30引物对，每个引物对均包括正向引物和反向引物，第1引物对的正向引物、第1引物对的反向引物至第30引物对的正向引物和第30引物对的反向引物依次如序列表中SEQ ID NO：1至SEQ ID NO：60所示。本发明实施例提供的引物组及试剂盒，通过多重扩增和高通量测序获得待测样本中目标基因的数据是一条条的碱基序列，分辨率达到单碱基水平，数据准确性和信息化程度高，可以通过序列分析软件一次性对成百上千个样品进行序列比对分析，快速统计待测样本中目标性状基因的序列，易于鉴别多等位基因型和新型等位基因，且准确率高重现率高。
Description
技术领域
本发明涉及生物技术领域，特别涉及一种鉴定水稻功能基因的引物组、试剂盒及应用。
背景技术
水稻是人类最主要的粮食作物之一，全世界有50％以上的人口以水稻作为主食。随着人们生活水平的提高，消费者对水稻品质的要求也越来越高，而稻瘟病和白叶枯病严重影响水稻的产量和品质。培育优质抗病水稻品种是目前水稻育种的主流趋势。通过分子标记辅助育种聚合优质、抗病基因的方式是培育优质抗病水稻品种最经济有效的方法。
目前，荧光PCR(Polymerase Chain Reaction，聚合酶链式反应)技术联合PCR扩增后凝胶电泳是分子标记辅助育种中较常用的检测手段，也是现行植物品种鉴定领域中常用的技术之一。该技术检测的靶标数目有限，通常仅检测1个目标基因，且不能获得基因序列碱基的变异情况，这并不利于水稻的品种鉴定。
发明内容
为了解决现有技术的问题，本发明实施例提供了一种鉴定水稻功能基因的引物组、试剂盒及应用。所述技术方案如下：
一方面，本发明提供了一种鉴定水稻功能基因的引物组，所述引物组包括：第1引物对至第30引物对，每个所述引物对均包括正向引物和反向引物，所述第1引物对的正向引物、所述第1引物对的反向引物至所述第30引物对的正向引物和第30引物对的反向引物依次如序列表中SEQ ID NO：1至SEQ ID NO：60所示。
另一方面，本发明实施例提供了一种鉴定水稻功能基因的试剂盒，所述试剂盒包括上述的引物组。
又一方面，本发明实施例提供了一种鉴定水稻功能基因的引物组的应用，所述应用包括：将上述引物组用于鉴定水稻性状和选育水稻新品种。
具体地，所述水稻性状包括水稻的抗病、品质、育性和株型。
进一步地，所述抗病包括：抗水稻白叶枯病和抗稻瘟病。
进一步地，所述品质包括：粒型、直链淀粉含量和香味。
进一步地，所述育性包括：高温敏感雄性不育性和广亲和性。
进一步地，所述株型包括：半矮杆和分裂角度。
本发明实施例提供的技术方案带来的有益效果是：本发明实施例提供的引物组及试剂盒，通过多重扩增和高通量测序获得待测样本中目标基因的数据是一条条的碱基序列，分辨率达到单碱基水平，数据准确性和信息化程度高，可以通过序列分析软件一次性对成百上千个样品进行序列比对分析，快速统计待测样本中20个目标性状基因的序列，易于鉴别多等位基因型和新型等位基因，且准确率高重现率高。同时基于基因特征序列开发的位于基因内的检测标记，不仅扩增效率高，还具有靶标多、通量高、准确性高、共享性强的特点，且与基因共分离，可以大大提高分子标记辅助选择的效率，为优质高抗水稻品种的选育提供了技术手段。该应用利用MNP标记法鉴定水稻抗病、品质、育性和株型的重要性状功能基因，在水稻新品种培育中将具有较好的应用前景。
附图说明
为了更清楚地说明本发明实施例中的技术方案，下面将对实施例描述中所需要使用的附图作简单地介绍，显而易见地，下面描述中的附图仅仅是本发明的一些实施例，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据这些附图获得其他的附图。
图1是本发明实施例一提供的琼脂糖凝胶电泳图，图中1～5分别代表水稻珍汕97S、明恢63、蜀恢498、D0411和香D0412材料。
具体实施方式
为使本发明的目的、技术方案和优点更加清楚，下面将结合附图对本发明实施方式作进一步地详细描述。
一方面，本发明提供了一种鉴定水稻功能基因的引物组，该引物组包括：第1引物对至第30引物对，每个引物对均包括正向引物和反向引物，第1引物对的正向引物、第1引物对的反向引物至第30引物对的正向引物和第30引物对的反向引物依次如序列表中SEQ IDNO：1至SEQ ID NO：60所示。
本发明实施例提供的引物组可扩增20个水稻功能性状基因的特征序列，这20个水稻功能性状基因包括已公开发布的水稻白叶枯抗性Xa5基因、Xa23基因和Xa7基因，稻瘟病抗性Pia基因、Pid3基因、Pid2基因、Pi1基因、Pi5基因和Pi5-2基因，粒型GW2基因、qGL3基因、GS3基因和GW5基因，控制直链淀粉含量Chalk5基因和Waxy基因，香味BADH2(fgr)基因，高温敏感雄性不育性TMS5基因，广亲和性S5基因，半矮杆Sd1基因和控制分裂角度TAC1基因，其中部分基因包含多个特征序列，最终可获得30个包括控制不同性状的候选特征序列。本发明实施例提供的引物组对应的检测基因及引物组信息如表1所示。
表1为本实施例提供的引物组对应的检测基因及引物组信息
本发明实施例提供的引物组扩增的长度小于300bp，且引物对间互不干扰，保证每个引物对均能够在同一个扩增反应中正常反应，并特异扩增目标基因序列。
另一方面，本发明实施例提供了一种鉴定水稻功能基因的试剂盒，该试剂盒包括上述引物组。
又一方面，本发明实施例提供了一种鉴定水稻功能基因的引物组的应用，该应用包括：将上述引物组用于鉴定水稻性状和选育水稻新品种。
具体地，水稻性状包括水稻的抗病、品质、育性和株型。
进一步地，抗病包括：抗水稻白叶枯病和抗稻瘟病。
进一步地，品质包括：粒型、直链淀粉含量和香味。
进一步地，育性包括：高温敏感雄性不育性和广亲和性。
进一步地，株型包括：半矮杆和分裂角度。
实施例一
本实施例中待测样本为常用水稻品种珍汕97S(不育系)、明恢63、蜀恢498、D0411和香D0412，其中，D0411和香D0412除了在稻米香味的表现上不同外，株型、抽穗期和抗性等性状无明显差异，即D0411不具有香味，D0412具有香味。上述水稻材料均由湖北省农业科学院粮食作物研究所提供。
DNA提取，获得待测样本的DNA。
具体地，采用天根生化科技(北京)有限公司生产的新型植物基因组DNA提取试剂盒(货号：DP320)分别提取待测样本珍汕97S、明恢63、蜀恢498、D0411和香D0412的叶片DNA，提取操作步骤详细见该试剂盒的说明书，分别得到待测样本的DNA。分别取1μL待测样本的DNA用Qubit荧光定量仪测定待测样本的DNA浓度，测得待测样本的DNA浓度分别为40.4ng/μL、45.7ng/μL、50.4ng/μL、39.8ng/μL和51.2ng/μL。
多重PCR扩增，得到多重PCR扩增产物。
具体地，针对两份待测样本的DNA，取五个PCR管，分别向每个PCR管中加入4μL本发明实施例提供的引物组、4μL待测样本的DNA(每个待测样本的DNA分别加入不同的PCR管中)、10μL GenoPlexs 3×T MasterMix(生产商：石家庄博瑞迪生物技术有限公司)和12μL水，并振荡混匀，得到混合物，将该混合物用于多重PCR扩增。多重PCR扩增程序：95℃3min；(95℃20sec，60℃4min)×17个循环；72℃4min。
反应结束后，得到30μL多重PCR扩增产物，然后使用磁珠(VAHTS DNA CleanBeads)对多重PCR扩增产物进行纯化，得到纯化后的多重PCR扩增产物，磁珠由南京诺唯赞生物科技股份有限公司提供，方法参照产品说明书。
构建高通量文库
具体地，向纯化后的多重PCR扩增产物中加入10μL GenoPlexs 3×T Master Mix、2μL浓度为5μM的P5 primer和P7 barcode primer(illumina测序接头引物，P7引物中包含样品条形码)和16μL水，将配制好反应体系震荡混匀并短暂离心，按如下程序进行PCR反应：95℃3min；(95℃15s，58℃15s，70℃30s)×8个循环；72℃最后延伸5min，于16℃结束反应。
反应结束后，分别获得构建好的待测样本的高通量文库。然后使用磁珠(VAHTSDNA Clean Beads)对高通量文库进行纯化，得到纯化后的高通量文库，纯化方法参照该产品的说明书。
对获得的高通量文库质检
取1μL纯化后的高通量文库采用Qubit进行定量检测，测得待测样品的浓度分别为38.2ng/μL、35.9ng/μL、36.4ng/μL、37.8ng/μL和36.5ng/μL，取4μL纯化后的高通量文库进行琼脂糖凝胶电泳，电泳结果如图1所示，由图1可知，五个高通量文库的条带集中，且无明显非特异扩增条带和引物二聚体残留，判定该高通量文库的质量合格。
文库测序
将质检合格的五个高通量文库共同采用illumina NextSeq550测序仪进行测序，得到待测样本的测序数据，测序详细步骤参见该测序仪的说明书，测序结束后获得测序数据，将测序数据拷贝至移动硬盘。
测序数据分析
高通量测序仪根据样本条形码的序列，自动将待测样本的测序数据进行拆分。利用数据比对软件Bowtie2(版本号2.1.0)，将测序数据比对到水稻参考基因组上，该水稻参考基因组的版本为IRGSP-1.0，获得每个待测样本的目标基因序列。比对结果采用SAM(TheSequence Alignment/Map format，序列比对格式)格式保存。
本实施例同时对5个待测样本的20个关于水稻抗病、品质、育性和株型的性状功能基因的30个性状调控区域进行了检测，测序分析目标基因平均覆盖倍数达2958倍，其中珍汕97S检出26个目标区域，明恢63检出26个目标区域，蜀恢498检出24对目标区域，D0411和香D0412共检出27个目标区域。采用日本晴水稻品种作为对照，珍汕97S、明恢63和蜀恢498共同检出的24个目标区域中，至少两个品种在控制品质、育性和株型等基因的8个目标区域中序列不同，具体见表1，例如明恢63为常规稻，而珍汕97S是不育系，在育性控制基因S5上有两个区域不同。D0411和香D0412两个待测样本共同检出的27目标区域中，除了在BADH2基因处存在8碱基的缺失和3碱基序列突变外，其它功能基因目标区域序列相同，具体见表2。对控制香味的基因BADH2进行了分析，BADH2基因的差异会影响稻米的香味，结果显示待测样本D0411的序列特征证明其稻米不具备香味特性，而待测样本香D0412的序列特征与其稻米具备香味特性一致，这与待测样本的实际性状一致。
表1为待测样本珍汕97S、明恢63和蜀恢498在30个目标区域上的分型差异结果统计
注：在表2中，用字母A、B和C表示每个引物对扩增出的基因目标区域的基因型；“/”表示该目标区域未检出。在表2中字母相同，则表示对应的两个或三个品种中目标区域测序序列相同；字母不同，则表示对应的两个或三个品种中目标区域测序序列不同，表1中的检测结果与待测样本的实际性状一致。
表2为待测样本D0411和香D0412在BADH2基因位置的检测序列
注：在表1中，与日本晴水稻材料相比，待测样本D0411和待测样本香D0412的差异碱基用下划线“_”和阴影标记，“-”代表缺失的碱基序列。
采用本发明实施例提供的引物组及试剂盒，对标准DNA进行高通量文库构建，其中，标准DNA由含有目标基因的水稻品种IRBB5、CBB23、IRBB7、5173、泰国小香占、黄花占、日本晴和9311水稻材料的基因组DNA等物质的量混合构成，检测体系和高通量文库构建过程参照前文进行。基于两次重复中，检出的目标基因的基因型是否可重现，评估本发明实施例提供的引物组及试剂盒的重现性和准确性。构建的高通量文库的测序数据分别进行两两比较，结果如表3所示。
表3为引物组及试剂盒检测准确性的评估
由表2可知，目标基因的基因型差异的数目都为0；依据2次重复实验间可重现的基因型是准确的原则，准确率a＝1-(1-r)/2＝0.5+0.5r，r代表重现率，即可重现的基因数占共同检出基因数目的比率。本实施例中不同文库间目标基因的基因型差异对数为0，重现率r＝100％，准确率a＝100％。
由此可见，本发明实施例提供的引物组和试剂盒能够准确地检测待测水稻的重要性状功能基因。
此外，在水稻新品种培育时，可采用本发明实施例提供的引物组和试剂盒进行分子标记辅助选择，在水稻苗期时高效检测育种群体中的20个功能基因的序列，从而筛选携带目标功能基因的后代材料，相比较在水稻成熟期时通过性状鉴定和单基因的检测方法，提高了基因的检测效率，缩短了培育周期。
本发明实施例提供的引物组及试剂盒，通过多重扩增和高通量测序获得待测样本中目标基因的数据是一条条的碱基序列，分辨率达到单碱基水平，数据准确性和信息化程度高，可以通过序列分析软件一次性对成百上千个样品进行序列比对分析，快速统计待测样本中20个目标性状基因的序列，易于鉴别多等位基因型和新型等位基因，且准确率高重现率高。同时基于基因特征序列开发的位于基因内的检测标记，不仅扩增效率高，还具有靶标多、通量高、准确性高、共享性强的特点，且与基因共分离，可以大大提高分子标记辅助选择的效率，为优质高抗水稻品种的选育提供了技术手段。该应用利用MNP标记法鉴定水稻抗病、品质、育性和株型的重要性状功能基因，在水稻新品种培育中将具有较好的应用前景。
以上所述仅为本发明的可选实施例，并不用以限制本发明，凡在本发明的精神和原则之内，所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。
Claims (8)
1.一种鉴定水稻功能基因的引物组，其特征在于，所述引物组包括：第1引物对至第30引物对，每个所述引物对均包括正向引物和反向引物，所述第1引物对的正向引物、所述第1引物对的反向引物至所述第30引物对的正向引物和第30引物对的反向引物依次如序列表中SEQ ID NO：1至SEQ ID NO：60所示。
2.一种鉴定水稻功能基因的试剂盒，其特征在于，所述试剂盒包括如权利要求1所述的引物组。
3.一种鉴定水稻功能基因的引物组的应用，其特征在于，所述应用包括：将如权利要求1所述的引物组用于鉴定水稻性状和选育水稻新品种。
4.根据权利要求3所述的应用，其特征在于，所述水稻性状包括所述水稻的抗病、品质、育性和株型。
5.根据权利要求4所述的应用，其特征在于，所述抗病包括：抗水稻白叶枯病和抗稻瘟病。
6.根据权利要求4所述的应用，其特征在于，所述品质包括：粒型、直链淀粉含量和香味。
7.根据权利要求4所述的应用，其特征在于，所述育性包括：高温敏感雄性不育性和广亲和性。
8.根据权利要求4所述的应用，其特征在于，所述株型包括：半矮杆和分裂角度。
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