CN114921581A - 一种水稻抗稻瘟病基因Pi-d2的显性功能分子标记及其应用 - Google Patents

Abstract

本发明于分子鉴别和水稻育种领域，公开了一种水稻抗稻瘟病Pi‑d2基因的显性功能分子标记Pi‑d2SNP，所述标记由如SEQ ID NO.3和SEQ ID NO.4所示的引物对组成。Pi‑d2基因第1383位核苷酸是A还是G，是区分Pi‑d2抗病还是感病等位基因的标记位点。对18个水稻育成品种进行验证，结果该显性功能分子标记能够精准区分携带Pi‑d2抗、感病等位基因的水稻品种。本发明以PCR技术为基础，操作简单、稳定可靠，不仅能快速区分水稻品种的基因型，而且能够直接地实现Pi‑d2基因在水稻种植资源以及育种后代中的鉴定，为定向育种提供快速有效的辅助分子鉴定技术，加速传统育种进程。

Description

一种水稻抗稻瘟病基因Pi-d2的显性功能分子标记及其应用

技术领域

本发明属于分子鉴别和水稻育种领域，涉及水稻抗稻瘟病基因Pi-d2的显性功能分子标记及其应用。

背景技术

稻瘟病是由稻瘟病菌(Magnaporthe grisea)引起的一种极具破坏性的水稻病害，全球每年因稻瘟病害可减产10％～30％。从环境保护与农业可持续发展考虑，利用寄主抗性，选育和种植稻瘟病抗性品种是防治稻瘟病最安全有效的方法。传统抗性品种选育一般依靠表型鉴定，且需要加大群体规模和增加鉴定批次以减少环境和人为因素的影响，这极大地增加了抗性育种的工作量与成本。利用已克隆的稻瘟病抗性基因的连锁标记或功能基因标记，从分子水平跟踪目标基因，选择含有目标抗性基因的单株进行杂交或回交，不仅能精准指导抗病性状的定向改良，并且能减少杂交或回交群体的大小，节省成本。

目前针对Pi-d2基因的分子标记辅助育种所开发的分子标记主要为：一是与Pi-d2紧密连锁标记(CN1306041C)，但这类标记存在鉴定步骤复杂、特异性较差等缺陷，且需要依赖构建相应F2群体才能使用，影响标记利用效率。二是针对Pi-d2基因开发的功能型分子标记(CN103409417B)，但使用该标记引物扩增片段后需经酶切反应确定其基因型，增加鉴定成本。为了加快Pi-d2基因在抗稻瘟病育种中的应用，迫切需要开发Pi-d2更加高效的显性功能分子标记并应用于分子育种中。

发明内容

为了解决现有技术中存在的问题，本发明提供一种基于水稻抗稻瘟病基因Pi-d2的显性功能分子标记及其引物序列，应用于水稻抗稻瘟病分子标记辅助育种，加快选育广谱高抗稻瘟病水稻新品种。

为达到上述目的，本发明采用的技术方案如下：

本发明针对Pi-d2基因第1383位碱基(抗病A/感病G)，开发了一种新的水稻抗稻瘟病基因Pi-d2的显性功能分子标记，在分子标记辅助育种中准确鉴定目标个体的基因型，大幅提高选育效率。Pi-d2基因在第6号染色体着丝点附近，以单拷贝形式存在，隶属于凝集素类受体激酶家族，Pi-d2基因抗感差异是由于第1383位碱基突变而引起的氨基酸突变所决定的，具体来说，当该位点的A突变为G，其所编码的异亮氨酸(Ile)突变为甲硫氨酸(Met)，导致Pi-d2蛋白的跨膜结构域发生显著变异，不能将配体识别信息从细胞外空间传递到细胞内的激酶结构域，从而导致水稻感病。因此，461位的氨基酸是Ile还是Met，即对应的碱基是A还是G，成为区分Pi-d2抗病还是感病等位基因的标记。

本发明首先根据参考水稻品种日本晴基因组，设计Pi-d2基因全长引物，SEQ IDNO.1：GTTTGAGACCCCTCATAAGATTC和SEQ ID NO.2：AACCTAACTAGACAAGGCACTGTA，对不同遗传背景的水稻品种进行PCR扩增和测序。利用Clustal W序列比对程序，对所有检测水稻的Pi-d2基因核苷酸序列进行比对，结果如图1所示。与前人报道一致，与稻瘟病抗性相关的第1383位存在单碱基突变，当该位点为A时是Pi-d2抗病等位基因，为G时是Pi-d2感病等位基因。

本发明提供了一种水稻抗稻瘟病基因Pi-d2的显性功能分子标记，所述分子标记位于水稻Pi-d2基因第1383位核苷酸，该位点为A时，编码异亮氨酸(Ile)，为Pi-d2抗病等位基因；该位点为G时，编码甲硫氨酸(Met)，为Pi-d2感病等位基因。

进一步的，含有所述分子标记的核苷酸序列如SEQ ID NO.5所示，所述的分子标记位于第1383位。

本发明根据Pi-d2基因第1383位的单碱基突变，设计了Pi-d2基因特异性的显性分子标记，如图1所示。其中，正向引物序列位于Pi-d2基因1355bp至1383bp之间，3’端为A(抗病等位基因)，共28个碱基；反向引物序列位于1946bp至1971bp之间，共25个碱基。

该分子标记的正反向引物序列为：

正向引物Pi-d2SNP-F序列：5’-GCACAATACCATTATTATTGTCATTATA-3’，如SEQ IDNO.3；

反向引物Pi-d2SNP-R序列：5’-GTTGTCGTCAAGTAGAACATTCTCA-3’，如SEQ ID NO.4。

本发明还提供一种检测水稻抗稻瘟病Pi-d2基因的方法，利用上述的引物对水稻基因组DNA进行PCR扩增，根据扩增结果判断所含水稻抗稻瘟病Pi-d2基因的基因型。

进一步的，若扩增后得到长度为616bp的片段，则待测目标含Pi-d2抗病等位基因；若扩增无条带，则待测目标含Pi-d2感病等位基因。

进一步的，所述PCR扩增反应体系各组分及体积为：10×PCR缓冲液2.5μL，dNTPs2.0μL，DNA模板2.0μL，引物各1.0μL，Taq DNA聚合酶0.15μL，最后用去离子水补足至25μL。

进一步的，扩增程序为：95℃，3min预变性；95℃变性15s，58℃退火15s，72℃延伸3min，35个循环；最后72℃延伸5min。PCR扩增产物经1％琼脂糖凝胶电泳，电压120V，电泳0.5h后用凝胶成像系统观察、拍照，以DL2000为DNA marker。

进一步的，提取DNA的方法为：

(1)2×CTAB，60℃预热；异丙醇，-20℃预冷；

(2)水稻叶片放入液氮冷冻5min，经高速组织研磨机Tiss-48型将样品进行破碎；

(3)加入预热的2×CTAB抽提缓冲液，65℃水浴40～60min，每隔10min取出摇匀一次；

(4)冷却至室温，加入氯仿摇匀，5min后离心，抽提去除蛋白质；

(5)10000rpm室温离心12min，取上清液于离心管中；

(6)加入预冷的异丙醇，轻轻混匀，-20℃冰箱中放置2h以上；

(7)10000rpm室温离心12min，小心去上清液；

(8)用70％乙醇洗涤沉淀DNA2次，10000rpm室温离心1min，去上清；

(9)在通风橱或室温干燥；

(10)沉淀溶于50uL去离子水中，可加入RNAase，于-20℃保存备用。

本发明还提供含有上述引物的试剂或试剂盒。

本发明还提供上述水稻抗稻瘟病基因Pi-d2的显性功能分子标记或权利要求2所述引物在水稻种质资源的筛选和鉴定或分子标记辅助育种中的应用。

本发明进一步提供了所述分子标记在检测Pi-d2基因型方面的应用，如利用SEQID NO.3和SEQ ID NO.4所示引物对待测目标进行PCR扩增，若扩增后得到长度为616bp的片段，则待测目标含Pi-d2抗病等位基因；若扩增后无条带，则待测目标含Pi-d2感病等位基因。

本发明利用Pi-d2SNP分子标记检测不同遗传背景水稻材料中所携带的Pi-d2基因型。通过对不同水稻材料DNA进行PCR扩增后，利用琼脂糖凝胶电泳对PCR产物进行检测，含Pi-d2抗病等位基因的水稻材料应得到一条616bp的目的条带，如图2样本3、4、7-11和13-16泳道条带所示；而含有Pi-d2感病等位基因的水稻材料无条带，如图2样本1、2、5、6、12、17和18泳道条带所示。

上述不同水稻材料选取了18个江苏大面积种植、多点示范的栽培稻品种(常软19-3、常农粳11号、CR-850、常农粳12号、常优粳8号、常优粳6号、常糯1号、常粳17-3、CR-954、常优粳7号、常农粳8号、CR-998、常香粳18-13、常农粳151、常优5号、常农粳10号、常粳18-10、常优998)作为鉴定材料，使用Pi-d2SNP分子标记进行PCR扩增，琼脂糖凝胶电泳显示为有条带(Pi-d2抗病等位基因)和无条带(Pi-d2感病等位基因)。

本发明还提供了所述分子标记在检测Pi-d2基因型时个体之间的稳定性和准确性方面的应用，对上述水稻品种所有单株进行验证，结果发现，携带Pi-d2抗病等位基因的水稻品种的8个个体中均扩增出1条清晰的、片段长度为616bp的目的条带，而携带Pi-d2感病等位基因的水稻品种的8个个体中均未扩增出条带。

进一步地，由SEQ ID NO.3和SEQ ID NO.4所示的引物组合，以及含有所述引物组合的试剂或试剂盒、PCR反应体系及热循环参数也属于本发明的保护范围。

本发明进一步地对前述PCR扩增反应体系及反应条件进行了优化。

优化后的PCR扩增反应体系如下：

优化后的PCR扩增程序为：95℃预变性3min；95℃变性15s，60℃退火15s，72℃延伸1min，35个循环；最后72℃延伸5min。

本发明涉及到的原料或试剂均为普通市售产品，涉及到的操作如无特殊说明均为本领域常规操作。

在符合本领域常识的基础上，上述各优选条件，可以项目组合，得到具体实施方式。

有益效果

根据水稻抗稻瘟病基因Pi-d2单个核苷酸决定抗感性的特征，本发明开发了一种Pi-d2基因显性功能分子标记及其应用。还公开了所述稻瘟病抗性基因Pi-d2显性功能分子标记的检测方法及其应用，对不同遗传背景水稻品种的基因组DNA进行PCR扩增和琼脂糖凝胶电泳检测，可在携带Pi-d2抗病等位基因的水稻样品中扩增到特异性条带，而在携带Pi-d2感病等位基因的水稻样品中无条带。

本发明基于Pi-d2基因第1383位碱基变异，据此开发抗病等位基因的显性分子标记Pi-d2SNP及应用方法，具体步骤如下：利用Pi-d2SNP标记引物，对不同遗传背景水稻基因组DNA进行PCR扩增和琼脂糖凝胶电泳检测，确定不同水稻品种所携带Pi-d2的基因型，并对各品种水稻的不同单株进行验证，携带Pi-d2抗病等位基因的品种条带清晰明亮，携带感病等位基因的品种无条带，本发明方法首次采用该分子标记进行水稻抗稻瘟病基因Pi-d2基因型的检测，为定向育种提供快速有效的辅助分子鉴定技术，加速传统育种进程。

本发明所提供的抗稻瘟病基因Pi-d2的显性功能分子标记，相较现有Pi-d2紧密连锁标记(CN1306041C)和功能型分子标记(CN103409417B)，具有特异性强、不依赖F2群体、不需要酶切反应、鉴定步骤简单等优势，仅通过一轮PCR反应和电泳检测，可直接用于稻瘟病抗性基因Pi-d2等位基因的鉴别，有效降低鉴定成本，提高标记利用效率。

附图说明

图1为本发明不同水稻品种Pi-d2基因序列比对图及Pi-d2SNP标记位置。

图2为显性功能分子标记Pi-d2SNP扩增产物的检测结果。

其中泳道M为DNA Marker，泳道1-18依次为：常软19-3、常农粳11号、CR-850、常农粳12号、常优粳8号、常优粳6号、常糯1号、常粳17-3、CR-954、常优粳7号、常农粳8号、CR-998、常香粳18-13、常农粳151、常优5号、常农粳10号、常粳18-10、常优998。

图3为显性功能分子标记Pi-d2SNP对不同水稻品种单株验证的检测结果。

其中，A：泳道2-9为常软19-3；泳道10-17为常农粳11号；泳道18-25为CR-850；泳道27-34为常农粳12号；泳道35-42为常优粳8号；泳道43-50为常优粳6号；泳道M为DNAMarker。

B：泳道2-9为常糯1号；泳道10-17为常粳17-3；泳道18-25为CR-954；泳道27-34为常优粳7号；泳道35-42为常农粳8号；泳道43-50为CR-998；泳道M为DNA Marker。

C：泳道2-9为常香粳18-13；泳道10-17为常农粳151；泳道18-25为常优5号；泳道27-34为常农粳10号；泳道35-42为常粳18-10；泳道43-50为常优998；泳道M为DNA Marker。1-18分别为：常软19-3、常农粳11号、CR-850、常农粳12号、常优粳8号、常优粳6号、常糯1号、常粳17-3、CR-954、常优粳7号、常农粳8号、CR-998、常香粳18-13、常农粳151、常优5号、常农粳10号、常粳18-10、常优998。

具体实施方式

下述实施例中所用方法如无特别说明，均为常规方法。引物由北京擎科生物技术有限公司合成；DL2000 DNA marker购自北京擎科生物科技有限公司；核酸染料为北京兰杰柯科技有限公司的SuperRed/GelRed；Taq酶购自南京诺唯赞生物科技股份有限公司；高速组织研磨机为上海净信实业发展有限公司Tiss-48型；PCR仪为杭州朗基科学仪器有限公司T20型。下面结合附图对本发明的实施例进行详细说明。

实施例1

一种稻瘟病抗性基因Pi-d2的显性功能分子标记Pi-d2SNP及其引物设计，包括如下步骤：

(1)根据水稻品种日本晴基因组中Pi-d2基因序列设计Pi-d2全长基因扩增引物，上游引物为Pi-d2-F，如SEQ ID NO.1所示，下游引物为Pi-d2-R，如SEQ ID NO.2所示。分别对江苏大面积种植、多点示范的18个稻种资源(如表1)的基因组DNA为模板，进行PCR扩增并测序，序列比对结果为图1；

上述PCR扩增体系为25μl，其组分及终浓度为：DNA模板(20ng/μl)2.0μl，引物(10μmol/L)各1.0μl，Taq DNA聚合酶(2.5U/μL)0.25μl，最后用去离子水补足至25μl。扩增程序为：95℃预变性3min；95℃变性15s，58℃退火15s，72℃延伸3min，35个循环；最后72℃延伸5min。PCR扩增产物经1％琼脂糖凝胶(提前加入核酸染料)电泳，电压120V，电泳0.5h后用凝胶成像系统观察、拍照，以DL2000为DNA marker。

表1实验材料表

(2)根据序列比对结果，水稻Pi-d2基因第1383位核苷酸是区分抗、感病等位基因的关键碱基(抗病为A，感病为G)，水稻Pi-d2基因符合“基因对基因”抗病形式，对含有Avr-Pid2的稻瘟病生理小种具有完全抗性，但当其第1383位碱基由A突变为G后，则抗性丧失，导致水稻感病。将抗病等位碱基设计在上游引物Pi-d2SNP-F的3’端，如SEQ ID NO.3所示，在该位点下游600bp处设计下游引物Pi-d2SNP-R的3’端，如SEQ ID NO.4所示。通过这组引物对上述水稻种质DNA进行PCR扩增和电泳检测，结果如图2，第1383位核苷酸为A的11个水稻品种可扩增出616bp的条带，而第1383位核苷酸为G的7个水稻品种无法扩增出条带。

PCR验证体系为25μl，其组分及终浓度为：DNA模板(20ng/μl)2.0μl，引物(10μmol/L)各1.0μl，Taq DNA聚合酶(5U/μl)0.15μl，最后用去离子水补足至25μl。扩增程序为：95℃，3min预变性；95℃变性15s，60℃退火15s，72℃延伸1min，35个循环；最后72℃延伸5min。PCR扩增产物经1％琼脂糖凝胶(提前加入核酸染料)电泳，电压120V，电泳0.5h后用凝胶成像系统观察、拍照，以DL2000为DNA marker。

实施例2

一种稻瘟病抗性基因Pi-d2的显性功能分子标记的稳定性验证，包括如下步骤：

随机选取上述18个水稻品种各8个个体，分别提取基因组DNA，具体为：待植株苗高10～15cm时剪取新鲜叶片100mg，经高速组织研磨机Tiss-48型将样品进行破碎，利用CTAB法提取样品总DNA，具体步骤如下。DNA样品的浓度及纯度用核酸蛋白检测仪进行检测，调整每个样品的DNA浓度至20ng/μL，于-20℃保存备用。

(1)2×CTAB，60℃预热；异丙醇，-20℃预冷。

(2)水稻叶片(约100mg)加入2mL离心管中，放入液氮冷冻5min，经高速组织研磨机Tiss-48型将样品进行破碎。

(3)加入750μL预热的2×CTAB抽提缓冲液，65℃水浴40～60min，每隔10min取出摇匀一次。

(4)冷却至室温，加入750μL的氯仿，摇匀，静置5min，抽提去除蛋白质。

(5)10000rpm室温离心12min，取上清液600μL于1.5mL离心管中。

(6)加入500μL预冷的异丙醇，轻轻混匀，-20℃冰箱中放置2h以上，可过夜。

(7)10000rpm室温离心12min，小心去上清液。

(8)用70％乙醇洗涤(500μL)沉淀DNA2次，10000rpm室温离心1min，去上清。

(9)在通风橱或室温干燥。

(10)沉淀溶于50uL去离子水中，可加入RNAase，于-20℃保存备用。

利用上述开发的Pi-d2基因显性功能分子标记Pi-d2SNP，对144个样品进行单株PCR扩增和电泳检测，结果如图3所示，第1383位核苷酸为A的11个水稻品种的所有单株均可扩增出616bp的条带，而第1383位核苷酸为G的7个水稻品种的各个单株均无法扩增出条带。

SEQ ID NO.5

ATGCAAATGTGTGGATGGTTACTGAAGGTTGTTCGTTGGGAAAACTTAAATTGTGTGCACATGGAAGCTCATGGCAATCGTCGCAGCAGTCCAACATACCTTGTTATGCTGTGGATGATTTCGGTAGCTAGCCTATTGATAACATGTCGTGGCAGTATCCAGAAGCAAGTTCTCTTTCCAGGGTTCACTGCCGCGCAAATGGATTACATTGATAACGATGGGATATTTCTGCTTTCTAATGGCTCTGTCTTTGGCTTTGGTTTTGTCACGAGCAATGTCTCAGACAACACGTTCTACATTCTTGCAGTGGTTCACATGGCCACTACTACCACAGTCTGGTCTGCCAATCCTAACTCTCCTGTCACCCATTCAGATGACTTTTTTTTCGACAAGGATGGCAATGCCTTCCTGCAGTCAGGAGGAGGCTCCAATGTATGGGCTGCCAATATCTCCGGGAAAGGGACTGCCACCTCTATGCAACTACTGGACTCTGGCAATCTTGTAGTGCTTGGGAAAGATGCCTCTTCTCCTCTCTGGCAAAGTTTCAGCCATCCGACAGACACTCTTCTGTCTGGTCAGAATTTCATCGAAGGGATGACGCTGATGAGCAAGTCCAACACAGTACAGAACATGACCTATACACTTCAGATCAAATCTGGGAACATGATGTTATACGCCGGCTTCGAGACACCTCAACCATACTGGTCTGCACAGCAGGATAGCAGGATAATTGTCAACAAGAACGGTGACAGCATCTACTCTGCAAACCTCAGTTCAGCTTCTTGGTCCTTCTATGATCAATCAGGGTCCCTTCTATCACAACTTGTCATCGCGCAAGAAAATGCCAATGCCACATTGTCTGCTGTCCTTGGTAGTGATGGATTGATAGCTTTCTATATGCTGCAGGGTGGAAATGGCAAGAGTAAATTCTCGATCACAGTTCCGGCAGACTCTTGTGACATGCCAGCCTACTGCAGTCCTTACACCATTTGCAGTAGTGGGACAGGTTGCCAATGCCCTTTGGCCCTCGGCTCGTTTGCAAACTGCAATCCTGGTGTTACATCAGCATGCAAATCGAACGAGGAGTTTCCGCTGGTTCAACTGGATAGTGGAGTTGGATATGTAGGCACTAACTTCTTCCCTCCTGCGGCTAAGACGAACCTTACGGGTTGTAAGAGTGCCTGTACAGGCAACTGCTCTTGTGTTGCTGTGTTCTTTGATCAATCTTCAGGCAATTGTTTCCTTTTCAACCAGATCGGAAGCTTGCAGCACAAAGGTGGGAATACAACTCGTTTCGCATCTTTTATCAAGGTATCAAGCAGAGGAAAAGGTGGGAGTGATAGTGGCAGTGGGAAGCACAATACCATTATTATTGTCATTATGCTCGGAACTTTGGCTATCATAGGCGTCCTTATTTATATTGGTTTCTGGATCTACAAGAGGAAGAGGCATCCTCCACCATCACAAGACGACGCTGGTTCATCGGAAGATGATGGATTTCTGCAAACAATATCCGGAGCACCAGTGCGGTTCACTTACAGGGAGCTCCAGGATGCGACAAGCAACTTCTGTAACAAGCTTGGTCAGGGAGGGTTTGGATCTGTGTATCTTGGTACACTCCCAGACGGCAGTCGTATTGCTGTGAAGAAGCTGGAGGGCATAGGCCAAGGAAAGAAAGAGTTCCGCTCTGAGGTAACGATCATTGGTAGTATCCACCACATCCATCTTGTCAAACTCCGAGGCTTTTGTACTGAGGGACCACACAGGCTTCTTGCCTACGAGTACATGGCGAATGGGTCGCTGGATAAGTGGATTTTCCATTCTAAAGAAGATGATCACCTGCTCGACTGGGATACAAGGTTTAACATTGCGCTTGGAACGGCAAAGGGATTGGCATACCTCCATCAGGACTGCGATTCGAAGATTGTACACTGTGACATTAAGCCTGAGAATGTTCTACTTGACGACAACTTCATCGCAAAGGTATCTGATTTTGGCCTTGCCAAGTTGATGACCAGGGAGCAGAGCCATGTTTTCACTACGCTCAGAGGCACGCGCGGGTACCTTGCACCTGAGTGGCTCACCAACTATGCCATCTCAGAGAAGAGTGATGTGTACAGCTACGGCATGGTTTTGCTTGAGATAATCGGTGGGAGGAAGAGCTACGATCCCTCGGAGATCTCCGAGAAGGCTCACTTCCCTTCCTTTGCATTCAAGAAGCTGGAGGAAGGCGATCTTCAGGACATCTTCGACGCCAAGCTGAAGTACAATGACAAGGATGGGCGGGTCGAGACCGCGATCAAGGTCGCGCTCTGGTGCATCCAGGATGATTTCTACCAGAGACCATCCATGTCAAAGGTTGTGCAGATGCTCGAAGGCGTCTGCGAGGTGCTCCAGCCACCGGTGTCGTCGCAGATCGGGTACAGGCTCTACGCAAACGCCTTCAAATCGAGCAGCGAGGAGGGGACTTCATCAGGGATGTCGGACTACAACAGTGATGCTCTGCTTTCAGCTGTGAGGCTTTCTGGTCCCAGATGA

序列表

<110> 江苏省中国科学院植物研究所

常熟市农业科学研究所

<120> 一种水稻抗稻瘟病基因Pi-d2的显性功能分子标记及其应用

<160> 5

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 23

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 1

gtttgagacc cctcataaga ttc 23

<210> 2

<211> 24

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 2

aacctaacta gacaaggcac tgta 24

<210> 3

<211> 28

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 3

gcacaatacc attattattg tcattata 28

<210> 4

<211> 25

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 4

gttgtcgtca agtagaacat tctca 25

<210> 5

<211> 2538

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 5

atgcaaatgt gtggatggtt actgaaggtt gttcgttggg aaaacttaaa ttgtgtgcac 60

atggaagctc atggcaatcg tcgcagcagt ccaacatacc ttgttatgct gtggatgatt 120

tcggtagcta gcctattgat aacatgtcgt ggcagtatcc agaagcaagt tctctttcca 180

gggttcactg ccgcgcaaat ggattacatt gataacgatg ggatatttct gctttctaat 240

ggctctgtct ttggctttgg ttttgtcacg agcaatgtct cagacaacac gttctacatt 300

cttgcagtgg ttcacatggc cactactacc acagtctggt ctgccaatcc taactctcct 360

gtcacccatt cagatgactt ttttttcgac aaggatggca atgccttcct gcagtcagga 420

ggaggctcca atgtatgggc tgccaatatc tccgggaaag ggactgccac ctctatgcaa 480

ctactggact ctggcaatct tgtagtgctt gggaaagatg cctcttctcc tctctggcaa 540

agtttcagcc atccgacaga cactcttctg tctggtcaga atttcatcga agggatgacg 600

ctgatgagca agtccaacac agtacagaac atgacctata cacttcagat caaatctggg 660

aacatgatgt tatacgccgg cttcgagaca cctcaaccat actggtctgc acagcaggat 720

agcaggataa ttgtcaacaa gaacggtgac agcatctact ctgcaaacct cagttcagct 780

tcttggtcct tctatgatca atcagggtcc cttctatcac aacttgtcat cgcgcaagaa 840

aatgccaatg ccacattgtc tgctgtcctt ggtagtgatg gattgatagc tttctatatg 900

ctgcagggtg gaaatggcaa gagtaaattc tcgatcacag ttccggcaga ctcttgtgac 960

atgccagcct actgcagtcc ttacaccatt tgcagtagtg ggacaggttg ccaatgccct 1020

ttggccctcg gctcgtttgc aaactgcaat cctggtgtta catcagcatg caaatcgaac 1080

gaggagtttc cgctggttca actggatagt ggagttggat atgtaggcac taacttcttc 1140

cctcctgcgg ctaagacgaa ccttacgggt tgtaagagtg cctgtacagg caactgctct 1200

tgtgttgctg tgttctttga tcaatcttca ggcaattgtt tccttttcaa ccagatcgga 1260

agcttgcagc acaaaggtgg gaatacaact cgtttcgcat cttttatcaa ggtatcaagc 1320

agaggaaaag gtgggagtga tagtggcagt gggaagcaca ataccattat tattgtcatt 1380

atgctcggaa ctttggctat cataggcgtc cttatttata ttggtttctg gatctacaag 1440

aggaagaggc atcctccacc atcacaagac gacgctggtt catcggaaga tgatggattt 1500

ctgcaaacaa tatccggagc accagtgcgg ttcacttaca gggagctcca ggatgcgaca 1560

agcaacttct gtaacaagct tggtcaggga gggtttggat ctgtgtatct tggtacactc 1620

ccagacggca gtcgtattgc tgtgaagaag ctggagggca taggccaagg aaagaaagag 1680

ttccgctctg aggtaacgat cattggtagt atccaccaca tccatcttgt caaactccga 1740

ggcttttgta ctgagggacc acacaggctt cttgcctacg agtacatggc gaatgggtcg 1800

ctggataagt ggattttcca ttctaaagaa gatgatcacc tgctcgactg ggatacaagg 1860

tttaacattg cgcttggaac ggcaaaggga ttggcatacc tccatcagga ctgcgattcg 1920

aagattgtac actgtgacat taagcctgag aatgttctac ttgacgacaa cttcatcgca 1980

aaggtatctg attttggcct tgccaagttg atgaccaggg agcagagcca tgttttcact 2040

acgctcagag gcacgcgcgg gtaccttgca cctgagtggc tcaccaacta tgccatctca 2100

gagaagagtg atgtgtacag ctacggcatg gttttgcttg agataatcgg tgggaggaag 2160

agctacgatc cctcggagat ctccgagaag gctcacttcc cttcctttgc attcaagaag 2220

ctggaggaag gcgatcttca ggacatcttc gacgccaagc tgaagtacaa tgacaaggat 2280

gggcgggtcg agaccgcgat caaggtcgcg ctctggtgca tccaggatga tttctaccag 2340

agaccatcca tgtcaaaggt tgtgcagatg ctcgaaggcg tctgcgaggt gctccagcca 2400

ccggtgtcgt cgcagatcgg gtacaggctc tacgcaaacg ccttcaaatc gagcagcgag 2460

gaggggactt catcagggat gtcggactac aacagtgatg ctctgctttc agctgtgagg 2520

ctttctggtc ccagatga 2538

Claims (10)

1.一种水稻抗稻瘟病基因Pi-d2的显性功能分子标记，其特征在于，所述分子标记位于水稻Pi-d2基因第1383位核苷酸，该位点为A时，编码异亮氨酸，为Pi-d2抗病等位基因；该位点为G时，编码甲硫氨酸，为Pi-d2感病等位基因。

2.根据权利要求1所述的分子水稻抗稻瘟病基因Pi-d2的显性功能分子标记，含有所述分子标记的核苷酸序列如SEQ ID NO.5所示，所述的分子标记位于第1383位。

3.根据权利要求1所述的水稻抗稻瘟病基因Pi-d2的显性功能分子标记的引物，其特征在于，所述引物序列如下：

SEQ ID NO.3：5’-GCACAATACCATTATTATTGTCATTATA-3’；

SEQ ID NO.4：5’-GTTGTCGTCAAGTAGAACATTCTCA-3’。

4.一种检测水稻抗稻瘟病Pi-d2基因的方法，其特征在于，利用权利要求2所述的引物对水稻基因组DNA进行PCR扩增，根据扩增结果判断所含水稻抗稻瘟病Pi-d2基因的基因型。

5.根据权利要求4所述的检测水稻抗稻瘟病Pi-d2基因的方法，其特征在于，若扩增后得到长度为616bp的片段，则待测目标含Pi-d2抗病等位基因；若扩增无条带，则待测目标含Pi-d2感病等位基因。

6.根据权利要求4所述的检测水稻抗稻瘟病Pi-d2基因方法，其特征在于，所述PCR扩增反应体系各组分及体积为：10×PCR缓冲液2.5μL，dNTPs 2.0μL，DNA模板2.0μL，引物各1.0μL，Taq DNA聚合酶0.15μL，最后用去离子水补足至25μL。

7.根据权利要求4所述的检测水稻抗稻瘟病Pi-d2基因方法，其特征在于，扩增程序为：95℃，3min预变性；95℃变性15s，58℃退火15s，72℃延伸3min，35个循环；最后72℃延伸5min。PCR扩增产物经1％琼脂糖凝胶电泳，电压120V，电泳0.5h后用凝胶成像系统观察、拍照，以DL2000为DNA marker。

8.根据权利要求4所述的检测水稻抗稻瘟病Pi-d2基因方法，其特征在于，提取DNA的方法为：

(1)2×CTAB，60℃预热；异丙醇，-20℃预冷；

(2)水稻叶片放入液氮冷冻5min，经高速组织研磨机Tiss-48型将样品进行破碎；

(3)加入预热的2×CTAB抽提缓冲液，65℃水浴40～60min，每隔10min取出摇匀一次；

(4)冷却至室温，加入氯仿摇匀，5min后离心，抽提去除蛋白质；

(5)10000rpm室温离心12min，取上清液于离心管中；

(6)加入预冷的异丙醇，轻轻混匀，-20℃冰箱中放置2h以上；

(7)10000rpm室温离心12min，小心去上清液；

(8)用70％乙醇洗涤沉淀DNA2次，10000rpm室温离心1min，去上清；

(9)在通风橱或室温干燥；

(10)沉淀溶于50uL去离子水中，可加入RNAase，于-20℃保存备用。

9.含有权利要求3所述引物的试剂或试剂盒。

10.权利要求1所述水稻抗稻瘟病基因Pi-d2的显性功能分子标记或权利要求3所述引物在水稻种质资源的筛选和鉴定或分子标记辅助育种中的应用。

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