CN111793706A - 一种豇豆InDel分子标记检测引物组及试剂盒 - Google Patents

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Abstract

本发明公开了一组豇豆InDel分子标记及引物组，所述InDel分子标记均匀分布于11条染色体上，具有数量丰富、遗传稳定、重复性好、多态性高的特点，序列如SEQ ID NO.1～170所示。本发明还提供了上述InDel分子标记的试剂盒与检测方法，该方法简捷，成功率高，且能避免了由于特异性和复杂性导致的后续分析模糊的问题，拥有广泛的应用前景。

Description

一种豇豆InDel分子标记检测引物组及试剂盒
技术领域
本发明属于植物分子标记技术领域，具体涉及一种豇豆InDel分子标记检测试剂盒及引物组。
背景技术
豇豆(Vigna unguiculata.)又名豆角、饭豆、泼豇豆等，属豆科(Leguminosae)蝶形花亚科(papilionoideae)豇豆属植物，起源于非洲，是全球范围内最重要的豆类作物之一。
分子标记RAPD、SSR、SNP等广泛地应用于豇豆种质资源遗传多样性评价、遗传图谱的构建与基因定位、分子标记辅助育种等方面。随着现代生物学理论与技术的不断发展进步，特别是18年首次发布了豇豆基因组信息，近年来豇豆DNA分子水平上的研究愈来愈成为学者们关注的焦点和热点。
目前豇豆DNA分子标记仍需要大量的开发并应用，尤其是在高密度分子遗传连锁图谱的构建，与生物逆境(虫害、病害等)、非生物逆境(高温、干旱、盐碱、湿涝等)以及与正常发育相关的功能基因鉴定与发掘。为有效拓宽豇豆的遗传基础、加快不同育种目标下的豇豆新品种选育及遗传改良进程，分子标记辅助选择育种方法是有效可行的。
插入/缺失(insertion-deletion，InDel)是指在近缘种或同一物种不同个体之间基因组同一位点的序列发生了不同大小核苷酸片段的插入或缺失，即一个序列上某一位点相比同源的另一个序列插入或缺失了一个或多个碱基。InDel标记属于共显性标记，具有较好的稳定性和较为丰富的多态性，已广泛应用于玉米，水稻，茄子，黄瓜等作物分子标记辅助育种中，并且取得了较大的进展，然而在豇豆遗传育种研究方面却没有相关的报道。
通过设计开发一批高质量的豇豆InDel标记，可为豇豆种质资源的合理开发利用以及进一步开展豇豆育种研究、指导亲本选配提供依据；同时可为豇豆种质的分类、核心种质库的构建，最终为豇豆种质资源的进一步收集保存、利用提供分子水平上的依据，缩短育种年限，提高育种效率。因此，开发出一组高质量的豇豆InDel标记，无论在遗传学基础理论研究还是在实际育种应用上都具有较大的科学意义与应用前景。
发明内容
本发明第一个方面的目的，在于提供一组高质量的豇豆InDel分子标记检测引物组。
本发明第二个方面的目的，在于提供一种豇豆InDel分子标记检测试剂盒。
本发明第三个方面的目的，在于提供一种豇豆InDel分子标记的检测方法。
本发明第四个方面的目的，在于提供上述引物组或上述试剂盒在基因分型、遗传图谱构建中的应用。
本发明第五个方面的目的，在于提供上述引物组或上述试剂盒在基因定位中的应用。
本发明第六个方面的目的，在于提供上述引物组或上述试剂盒在分子辅助育种中的应用。
本发明第七个方面的目的，在于提供上述引物组或上述试剂盒在种质资源鉴定评、遗传多样性分析中的应用。
本发明第八个方面的目的，在于提供上述引物组或上述试剂盒在种子纯度、杂交种鉴定中的应用。
本发明所采取的技术方案是：
本发明的第一个方面，提供一组豇豆InDel分子标记检测引物组，包括检测表3所示InDel分子标记位点的特异性引物。
根据本发明第一个方面所述的引物组，所述引物组包括SEQ ID NO.1～170所示的特异性引物。
根据本发明第一个方面所述的引物组，所述通用序列选自公共引物、接头、特异性标签。
本发明的第二个方面，提供一组豇豆InDel分子标记检测试剂盒，包括本发明第一个方面所述引物组。
根据本发明第二个方面所述的试剂盒，所述试剂盒中还包括缓冲液、PCR扩增试剂、PCR产物纯化试剂、测序接头。
根据本发明第二个方面所述的试剂盒，所述测序接头包括：测序通用接头、测序标签接头。
本发明的第三个方面，提供一种豇豆InDel分子标记的检测方法，包括以下步骤：
S1.利用本发明第一个方面所述的引物组或第二个方面所述的试剂盒，对DNA样品模板DNA进行第一轮PCR扩增，纯化后得PCR扩增文库；
S2.对纯化后的扩增文库进行加测序接头的第二轮PCR扩增，纯化后得测序文库；
S3.对加了测序接头的PCR产物进行测序。
根据本发明第三个方面所述的方法，步骤S1所述第一轮PCR扩增的反应条件为：94℃预变性3min；94℃变性40s，60℃退火30s，72℃延伸45s，35个循环；72℃延伸7min，16℃保存待用。
根据本发明第三个方面所述的方法，步骤S1所述第一轮PCR扩增反应体系采用10μL PCR扩增体系,其中，DNA模板(50ng/μL)2μL，10×Taq Buffer 1.0μL，dNTP(10mmol/L)0.2μL，上游引物(10μmol/L)0.2μL，下游引物(10μmol/L)0.2μL，Taq DNA聚合酶(2U/μL)0.2μL，dd H2O 6.2μL。
本发明的第四个方面，提供本发明第一个方面所述的引物组或本发明第二个方面所述的试剂盒在基因分型、遗传图谱构建中的应用。
本发明的第五个方面，提供本发明第一个方面所述的引物组或本发明第二个方面所述的试剂盒在基因定位中的应用。
本发明的第六个方面，提供本发明第一个方面所述的引物组或本发明第二个方面所述的试剂盒在分子辅助育种中的应用。
本发明的第七个方面，提供本发明第一个方面所述的引物组或本发明第二个方面所述的试剂盒在种质资源鉴定评、遗传多样性分析中的应用。
本发明的第八个方面，提供本发明第一个方面所述的引物组或本发明第二个方面所述的试剂盒在种子纯度、杂交种鉴定中的应用。
本发明的有益效果是：
本发明提供的InDel分子标记及其引物具有多态性高，重演性好，变异稳定，检测方法简捷，成功率高的优点，且避免了由于特异性和复杂性导致的后续分析模糊，拥有广泛的应用前景。在豇豆种质资源研究中是首次报道，基于豇豆重测序的InDel标记的开发及遗传多样性分析都是首创性的。本发明提供了一批高质量的豇豆InDel标记，对国内外收集到的豇豆种质进行遗传多样性分析，可为豇豆种质资源的合理开发利用以及进一步开展豇豆育种研究、指导亲本选配提供依据；同时可为豇豆种质的分类、核心种质库的构建，最终为豇豆种质资源的进一步收集保存、创新利用提供分子水平上的依据，缩短育种年限，提高育种效率。
国内外许多研究报道采用形态学、同工酶、AFLP等方法对豇豆栽培资源进行聚类分析,本研究开发具有高质量的豇豆InDel标记并对国内外豇豆种质资源做出了遗传多样性评价，为豇豆遗传图谱构建，功能基因挖掘、分子标记辅助育种、遗传多样性分析及品质纯度鉴定等研究工作提供了工作基础。
附图说明
图1 15对Indel引物(编号Vu147至Vu161的引物对)在6份豇豆材料的扩增结果。注：M对应Marker代表100-600bp的DNA长度参照，点样顺序从左至右依次为1-8、1-17、2-22、2-8、2-10、5-12的豇豆材料，条带下方数字为引物名称的数字后缀。
图2引物Vu 6-94在豇豆自然群体的扩增图。注：Marker代表100-600bp的DNA长度参照，箭头指示材料2-30。
图3引物Vu 9-125在豇豆自然群体扩增图。注：Marker代表100-600bp的DNA长度参照。“↑”和“↓”分别指示长度>600bp和介于100-600bp间能区别不同种质的特异性条带。
图4基于遗传距离的环状聚类图。
具体实施方式
为了能够更清楚地理解本发明的技术内容，特举以下实施例结合附图详细说明。应理解，这些实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围。下列实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条件，以Sambrook等人编写的，分子克隆：实验室手册(New York:Cold Spring Harbor Laboratory Press，1989)中所述的条件，或按照制造厂商所建议的条件。实施例中所用到的各种常用化学试剂，均为市售产品。
实施例1 InDel标记开发
发明人团队从国内外收集到173份豇豆材料(包含商品种和地方农家种)组成豇豆自然群体，依据商品期果荚颜色及豇豆特征特性将其分为8个组群，即油白类豇豆、油青类豇豆、紫豇豆、特青类豇豆、纯白豇豆、灰青类豇豆、无架豆、密豆组。各材料以所在组群编号为“前缀+数字”命名，如下表1所示。
表1 173份豇豆种质资源的分类编号及数量
Figure BDA0002541169580000041
发明人团队从自然群体中挑选出3份(Fc_2、Fc_6、WS2)具有典型性状，表型差异较大的豇豆品系进行全基因组序列重测序分析，检测InDel位点，并据此开发设计InDel标记引物。
重测序和测序质量分析
提取豇豆自然群体基因组DNA后，将Fc_2、Fc_6、WS2 DNA进行重测序。首先对序列进行质控，三个样本接头含量均为0.01％，序列质量Q30在91.81-92.27％，重复reads比例在13.92-17.24％，重测序结果统计如表2所示。
表2重测序数据分析汇总
Figure BDA0002541169580000051
注：Q30值是指的测序过程碱基识别(Base Calling)过程中，对所识别的碱基给出的错误概率是0.1％。
从表2中数据可知，三个材料的重测序接头含量低，Q30比率均大于90％，重复reads比例低于20％，说明重测序质量高，适合用于后续分析。
InDel位点分析
以已公布的豇豆基因组(Stefano Lonardi et al 2019)为参考，进行序列比对。Fc-2、Fc-6、WS2全基因组范围内共检测到的InDel位点数分别为274647、270096、265355个，其中纯合位点数为257219个(93.65％)、254479个(94.22％)、249698个(94.10％)。
InDel引物设计
将三份材料的重测序数据与已公布的豇豆基因组做比对，筛选各个材料与参考基因组不一致的有插入缺失的纯合位点，提取三个材料两两之间基因型不一致及和三个材料均不一致的位点，从中筛选每个样本测序深度大于10×，且Indel大于30bp的位点，共筛选到符合上述标准的Indel位点981个位点。从981个位点挑选了165个均匀分布于11条染色体上的位点，提取该位点上下游各250bp碱基序列，利用Primer 3.0软件设计引物，设置引物长度为20-23bp，Tm值为52～60℃。设计的165对引物送擎科生物技术有限公司合成，引物命名方式为“所在染色体编号+引物序号”。
165对引物在染色体上的分布为:1号染色体17对，2号染色体13对，3号染色体22对，4号染色体19对，5号染色体14对，6号染色体17对，7号染色体9条，8号染色体11对，9号染色体16条，10号染色体16对，11号染色体11对。
InDel引物筛选
有效性验证和多态性筛选：
从豇豆自然群体中挑选6份代表性样品1-8、1-17、2-22、2-8、2-10、5-12，利用PCR技术对合成的InDel标记进行多种质间多态性鉴定。以上述6份材料的基因组DNA为模板进行PCR扩增。
(1)PCR扩增反应体系：采用10μL PCR扩增体系,其中DNA模板(50ng/μL)2μL，10×Taq Buffer 1.0μL，dNTP(10mmol/L)0.2μL，上游引物(10μmol/L)0.2μL，下游引物(10μmol/L)0.2μL，Taq DNA聚合酶(2U/μL)0.2μL，dd H2O 6.2μL。
(2)PCR扩增程序：94℃预变性3min；94℃变性40s，60℃退火30s，72℃延伸45s，35个循环；72℃延伸7min，16℃保存；待反应完成后，在PCR扩增产物中加入5ul Formamidedeionized(去离子甲酰胺)，沉淀DNA，离心1min，微震混匀，4℃保存备用。
(3)PCR产物分离：利用8％的聚丙烯酰胺电泳后银染显色；通过将PCR产物纯化、建库、测序，通过分析测序结果检测引物的有效性及位点的多态性。
以人工读带，同一位置上清晰且重复性好的条带记为“1”，无带记为“0”，缺失数据记为“–”。
发现165对引物，有效扩增引物为162对，占比为98.18％。筛选出其中能稳定扩增、可读性强且具良好多态性的引物85对，如表3所示，每条染色体上至少有3个标记，平均有7.73个。其中15对Indel引物Vu10-147、Vu10-148、Vu10-149、Vu10-150、Vu10-151、Vu10-152、Vu10-153、Vu10-154、Vu10-155、Vu10-156、Vu11-157、Vu11-158、Vu11-159、Vu11-160、Vu11-161在6份豇豆材料的电泳结果如附图1所示。根据图1可知，其中6对引物(Vu10-147、Vu10-149、Vu10-150、Vu10-151、Vu10-152、Vu10-153、Vu10-154、Vu11-157)扩增出清晰的多态性条带，具有多态性。
上述85对引物即为本发明的豇豆In Del分子标记检测引物组，各引物名称、物理位置和核苷酸序列如表3所示，亦如序列表中SEQ ID NO.1～170所示。
表3可用豇豆序列位置信息及对应引物
Figure BDA0002541169580000061
Figure BDA0002541169580000071
Figure BDA0002541169580000081
Figure BDA0002541169580000091
Figure BDA0002541169580000101
实施例2 InDel引物用于豇豆自然群体基因分型试验
实施例1中的85对InDel标记引物，采用同样的PCR技术对173份豇豆自然群体进行基因分型，同时检测InDel标记在豇豆群体中的特异性情况。按照实施例1中的聚丙烯酰胺凝胶电泳分离扩增产物电泳图谱读带规则，电泳图谱中的每一条带均作为1个位点，读带，整理形成豇豆自然群体基因型“0-1”矩阵。
根据引物扩增产物片段长度，部分InDel引物能够鉴定出特定豇豆品系，如引物Vu6-94可直接鉴定出豇豆品系2-30(如附图2所示)；部分InDel引物可对个别豇豆品系进行特异性区分，以引物Vu 9-125为例(附图3)，图中箭头所示材料特异性片段，结合多个InDel标记可将相应豇豆种质特异性分离。说明筛选得到的InDel标记及对应的引物能有效检测出不同豇豆材料之间的遗传变异，可以应用于豇豆基因分型、构建豇豆分子身份证，为进一步开展豇豆种质资源的鉴定提供有效工具。
实施例3一组豇豆InDel分子标记在豇豆遗传多样性分析中的应用
实施例2中85对引物的豇豆自然群体基因分型条带数据形成0-1矩阵，利用POWERMARKER V3.25软件计算各种质材料间Nei’s遗传距离，173份材料的Nei’s遗传距离变化范围为0.015～0.811，平均值为0.367，依据距离矩阵构建系统发生树，进行Neighbor-Joining聚类分析，生成结果如附图4所示，173份豇豆材料可以划分两大类群。
根据发掘的InDel位点的插入/缺失信息，发明人团队筛选出有效多态性引物85对，占总数的51.52％。用这85对引物对173份豇豆材料进行基因分型和聚类分析，其聚类结果与以表型特征分组结果基本吻合，同一类型豇豆品系之间普遍存在遗传差异狭窄的问题，这与前人研究结果一致。分析结果表明，85对引物适用于豇豆遗传多样性分析。
以上所述的实施例仅为阐述性例子，其描述较为具体和详细，但并不能因此而理解为对本发明专利范围的限制。应当指出的是，对于本领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明构思的前提下，还可以做出若干变形和改进、修饰、替代、组合、简化，均应为等同的置换方式，这些都属于本发明的保护范围。
SEQUENCELISTING
<110>广东省农业科学院蔬菜研究所
<120>一种豇豆InDel分子标记检测引物组及试剂盒<130>
<160>170
<170>PatentInversion3.5
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<210>41<211>22<212>DNA<213>人工序列<400>41agttattggagaacatgcctct22
<210>42<211>22<212>DNA<213>人工序列<400>42cggacaaaagaaataacctgca22
<210>43<211>22<212>DNA<213>人工序列<400>43actttcaccacttactctcact22
<210>44<211>22<212>DNA<213>人工序列<400>44cctacccagccaattttgtcta22
<210>45<211>22<212>DNA<213>人工序列<400>45ctgtaccaatccacatgaacct22
<210>46<211>22<212>DNA<213>人工序列<400>46gcttcctaagattgcaaccttg22
<210>47<211>22<212>DNA<213>人工序列<400>47aaggtttagtttaggctgtccc22
<210>48<211>22<212>DNA<213>人工序列<400>48ttgtgtattgggtaagtgccaa22
<210>49<211>22<212>DNA<213>人工序列<400>49attttcttcttggctgctgttc22
<210>50<211>22<212>DNA<213>人工序列<400>50cactcccaaggaagatgagatc22
<210>51<211>22<212>DNA<213>人工序列<400>51acatctatcgccaatctcacag22
<210>52<211>22<212>DNA<213>人工序列<400>52cacttgaagacgctaagaacac22
<210>53<211>22<212>DNA<213>人工序列<400>53tattggagaaagggcatagcag22
<210>54<211>22<212>DNA<213>人工序列<400>54tcctctacctttcaccaagcta22
<210>55<211>22<212>DNA<213>人工序列<400>55gatagctcacaacacagacact22
<210>56<211>22<212>DNA<213>人工序列<400>56cacttagcatctgatggcctta22
<210>57<211>22<212>DNA<213>人工序列<400>57aaaggggtcactcatacacatg22
<210>58<211>22<212>DNA<213>人工序列<400>58tgtggtagctcagtgttagttg22
<210>59<211>22<212>DNA<213>人工序列<400>59tgcgtgtaagtgtcagagaaat22
<210>60<211>22<212>DNA<213>人工序列<400>60ttgcttaacctgagatgaacgt22
<210>61<211>22<212>DNA<213>人工序列<400>61gacacaagatcgaatccaagga22
<210>62<211>22<212>DNA<213>人工序列<400>62cctggtacttggactcagattt22
<210>63<211>22<212>DNA<213>人工序列<400>63ttgtgttaaaggtggtgcattg22
<210>64<211>22<212>DNA<213>人工序列<400>64gtctctatggcggtcaagttta22
<210>65<211>22<212>DNA<213>人工序列<400>65gtatcggatgctgttatttggg22
<210>66<211>22<212>DNA<213>人工序列<400>66gatcattgaactcccttggtca22
<210>67<211>22<212>DNA<213>人工序列<400>67gcagtgacctctcaattcatct22
<210>68<211>22<212>DNA<213>人工序列<400>68acgattctactgcttagccatc22
<210>69<211>22<212>DNA<213>人工序列<400>69ccccgaataagtgttctaggtg22
<210>70<211>22<212>DNA<213>人工序列<400>70cactgcaacaattatacgcctt22
<210>71<211>22<212>DNA<213>人工序列<400>71aaagttgtaggctaaggtggac22
<210>72<211>22<212>DNA<213>人工序列<400>72aaacccactcatgtacaagact22
<210>73<211>22<212>DNA<213>人工序列<400>73gcgattgatttaaggcacagta22
<210>74<211>22<212>DNA<213>人工序列<400>74agtcacagtttcagtcaccaaa22
<210>75<211>22<212>DNA<213>人工序列<400>75agggcttcaattttctccttca22
<210>76<211>22<212>DNA<213>人工序列<400>76ccggaaaactcacaacatcatt22
<210>77<211>22<212>DNA<213>人工序列<400>77actggtcttcattttgtgctga22
<210>78<211>22<212>DNA<213>人工序列<400>78acttcatcaatgtccacctctt22
<210>79<211>22<212>DNA<213>人工序列<400>79tgtttcttgcgctgacatagta22
<210>80<211>22<212>DNA<213>人工序列<400>80agtaagcacagtcttagagcaa22
<210>81<211>22<212>DNA<213>人工序列<400>81gacagaagaggggttcagaatc22
<210>82<211>21<212>DNA<213>人工序列<400>82catttcgctccctgaagtttc21
<210>83<211>22<212>DNA<213>人工序列<400>83ccaacacgctttcatgattcaa22
<210>84<211>22<212>DNA<213>人工序列<400>84agtatccaacaaccaaccatca22
<210>85<211>23<212>DNA<213>人工序列<400>85ggtcacgtccagagataattact23
<210>86<211>22<212>DNA<213>人工序列<400>86agggtaacttgttttcagccat22
<210>87<211>22<212>DNA<213>人工序列<400>87tttagtcccctctcctctacac22
<210>88<211>23<212>DNA<213>人工序列<400>88ttgaagcgtgtttaaattactga23
<210>89<211>22<212>DNA<213>人工序列<400>89ccttcataaccagctaaaaggc22
<210>90<211>22<212>DNA<213>人工序列<400>90gaggtttctaagcacatgaggt22
<210>91<211>22<212>DNA<213>人工序列<400>91tcacgacgagaaccatatttga22
<210>92<211>22<212>DNA<213>人工序列<400>92gacgatgatggtgatgatgaca22
<210>93<211>22<212>DNA<213>人工序列<400>93ttatccagaactccttcaagcc22
<210>94<211>22<212>DNA<213>人工序列<400>94ttgggttgatcttgtatgccaa22
<210>95<211>22<212>DNA<213>人工序列<400>95tccaatccatcattcattacgc22
<210>96<211>22<212>DNA<213>人工序列<400>96tgaagagcttgaacgtgagaat22
<210>97<211>22<212>DNA<213>人工序列<400>97tgtcaccagaaaaggccataat22
<210>98<211>21<212>DNA<213>人工序列<400>98tgatgctgtttggattgtggg21
<210>99<211>22<212>DNA<213>人工序列<400>99ctgtctacctgcagtcgattag22
<210>100<211>22<212>DNA<213>人工序列<400>100agaaaagcaatacaaacgtggc22
<210>101<211>22<212>DNA<213>人工序列<400>101ctcttgcagtccctattgtcaa22
<210>102<211>22<212>DNA<213>人工序列<400>102cacaaagtggcatatctggttt22
<210>103<211>22<212>DNA<213>人工序列<400>103agaactggcgagaagaaatgat22
<210>104<211>22<212>DNA<213>人工序列<400>104aagaaagagacctgaagtgctc22
<210>105<211>20<212>DNA<213>人工序列<400>105aacctaatcgcactgaaccg20
<210>106<211>22<212>DNA<213>人工序列<400>106gtgcaagaatatgtgttccagc22
<210>107<211>22<212>DNA<213>人工序列<400>107aattccattcccgtgttctgaa22
<210>108<211>22<212>DNA<213>人工序列<400>108caaactgtggtggtgaatatga22
<210>109<211>22<212>DNA<213>人工序列<400>109tctaaagggcacgatcaacatt22
<210>110<211>22<212>DNA<213>人工序列<400>110tgggaccttcaagtgcaattaa22
<210>111<211>22<212>DNA<213>人工序列<400>111gcactgttttggttcttagcat22
<210>112<211>22<212>DNA<213>人工序列<400>112gaaaagggtatgcatgaacaac22
<210>113<211>22<212>DNA<213>人工序列<400>113actgaaaatcgcactggaaaac22
<210>114<211>22<212>DNA<213>人工序列<400>114tcctgaaactgtctttcccatc22
<210>115<211>22<212>DNA<213>人工序列<400>115caaaatttgggttgtagtcagc22
<210>116<211>22<212>DNA<213>人工序列<400>116gatatggttctgttggtgggag22
<210>117<211>22<212>DNA<213>人工序列<400>117gggtttgattcacttttgtccc22
<210>118<211>22<212>DNA<213>人工序列<400>118gcatgccaccataatcacaaat22
<210>119<211>22<212>DNA<213>人工序列<400>119agttttggctagcaggtattgt22
<210>120<211>22<212>DNA<213>人工序列<400>120gctcaaacaagtgcaagatcat22
<210>121<211>22<212>DNA<213>人工序列<400>121ctgttgatagagtgtgagtccc22
<210>122<211>22<212>DNA<213>人工序列<400>122cttgaagttgtgagtggacaga22
<210>123<211>22<212>DNA<213>人工序列<400>123gtcattcggtccatttcacaag22
<210>124<211>22<212>DNA<213>人工序列<400>124gggaccacagtaaaatcatgac22
<210>125<211>22<212>DNA<213>人工序列<400>125tgactggaaaccttctaactgg22
<210>126<211>22<212>DNA<213>人工序列<400>126ggcgtttaagatttagtcgaca22
<210>127<211>22<212>DNA<213>人工序列<400>127tgttctccaatagttcctcacg22
<210>128<211>24<212>DNA<213>人工序列<400>128cacatgtaaacaagtagtagacgc24
<210>129<211>22<212>DNA<213>人工序列<400>129ctgaattctccaggactgattc22
<210>130<211>22<212>DNA<213>人工序列<400>130ctgaattgaacgaagaagtgcg22
<210>131<211>22<212>DNA<213>人工序列<400>131aaactctaagacccaacctgtc22
<210>132<211>22<212>DNA<213>人工序列<400>132tggaaaatgtgcacaactagga22
<210>133<211>22<212>DNA<213>人工序列<400>133tcttcctcagtcccaatactca22
<210>134<211>22<212>DNA<213>人工序列<400>134ctctctcccactcctttcaatg22
<210>135<211>22<212>DNA<213>人工序列<400>135gttctcaggggaaaaggtgatt22
<210>136<211>22<212>DNA<213>人工序列<400>136caaatgaagtggggaggaagaa22
<210>137<211>22<212>DNA<213>人工序列<400>137acctccaacaagttcatgatca22
<210>138<211>22<212>DNA<213>人工序列<400>138cttttcaccggtatcccttctt22
<210>139<211>22<212>DNA<213>人工序列<400>139atggtatgtcttgtgatggcaa22
<210>140<211>22<212>DNA<213>人工序列<400>140tgtatcggtactcacatgcttc22
<210>141<211>22<212>DNA<213>人工序列<400>141actggggtatttcaaagtgagg22
<210>142<211>22<212>DNA<213>人工序列<400>142gacaccactttaacccaaaacc22
<210>143<211>22<212>DNA<213>人工序列<400>143aatataacataggccggctgac22
<210>144<211>22<212>DNA<213>人工序列<400>144aagtgtggtgaggaaaggtatg22
<210>145<211>22<212>DNA<213>人工序列<400>145acgggaggttataggctatttg22
<210>146<211>22<212>DNA<213>人工序列<400>146gcactgcatctttcactttcat22
<210>147<211>22<212>DNA<213>人工序列<400>147cagctgttgatgttgaaccaaa22
<210>148<211>22<212>DNA<213>人工序列<400>148aggggtaaagcaagcaacatat22
<210>149<211>22<212>DNA<213>人工序列<400>149cttcatgatctatctgccccag22
<210>150<211>22<212>DNA<213>人工序列<400>150gtggaatttctattttgcctgc22
<210>151<211>22<212>DNA<213>人工序列<400>151gttagcaacagcaaccgataag22
<210>152<211>22<212>DNA<213>人工序列<400>152ccctgcatctccattttgattt22
<210>153<211>22<212>DNA<213>人工序列<400>153gcgagaattaaaggaaacgtca22
<210>154<211>22<212>DNA<213>人工序列<400>154caaaacatggccatacatctcg22
<210>155<211>22<212>DNA<213>人工序列<400>155tgtcacagctccaaagaatgat22
<210>156<211>22<212>DNA<213>人工序列<400>156cacagataacgaggagataggc22
<210>157<211>22<212>DNA<213>人工序列<400>157tggtgttcatcaagatttcacg22
<210>158<211>22<212>DNA<213>人工序列<400>158aagtcaggggttttgatcaagt22
<210>159<211>22<212>DNA<213>人工序列<400>159acggagatcagtcactataacc22
<210>160<211>22<212>DNA<213>人工序列<400>160gaatttggaaggctgttgttgt22
<210>161<211>22<212>DNA<213>人工序列<400>161ccaacttttgaatgcttgacca22
<210>162<211>22<212>DNA<213>人工序列<400>162aggcttcattgggtagtgttac22
<210>163<211>22<212>DNA<213>人工序列<400>163cgcaacggataggaaatggata22
<210>164<211>22<212>DNA<213>人工序列<400>164ttagcagttgtcgagtctcttc22
<210>165<211>22<212>DNA<213>人工序列<400>165taggcaattcacagtctcttgg22
<210>166<211>22<212>DNA<213>人工序列<400>166agttcaagtacatgctccaaca22
<210>167<211>22<212>DNA<213>人工序列<400>167tggtttagaaagaggttacgtg22
<210>168<211>22<212>DNA<213>人工序列<400>168ggtctcgtgcaaaagtaatgtc22
<210>169<211>22<212>DNA<213>人工序列<400>169gcgtggaaatatgtatcgatcg22
<210>170<211>21<212>DNA<213>人工序列<400>170cacttgccaatattcacagca21

Claims (10)

1.一组豇豆InDel分子标记检测引物组，包括检测以下85个InDel分子标记位点的特异性引物，所述特异性引物的序列如SEQ ID NO.1～170所示：
Figure FDA0002541169570000011
Figure FDA0002541169570000021
Figure FDA0002541169570000031
Figure FDA0002541169570000041
。
2.根据权利要求1所述的引物组，其特征在于，所述引物组中的每条特异性引物5’端还连接有建库测序所需的通用序列。
3.根据权利要求2所述的引物组，其特征在于，所述通用序列选自公共引物、接头、特异性标签。
4.一种豇豆InDel分子标记检测试剂盒，其特征在于，包括权利要求1～3任一项所述的引物组。
5.一种豇豆InDel分子标记的检测方法，其特征在于，包括以下步骤：
S1.利用权利要求1～3任一项所述的引物组或权利要求4所述的试剂盒，对DNA样品模板DNA进行PCR扩增，获得PCR扩增产物；
S2.对PCR扩增产物进行凝胶电泳检测或将PCR扩增产物纯化后进行建库、测序。
6.权利要求1～3任一项所述的引物组或权利要求4所述的试剂盒在基因分型、遗传图谱构建中的应用。
7.权利要求1～3任一项所述的引物组或权利要求4所述的试剂盒在基因定位中的应用。
8.权利要求1～3任一项所述的引物组或权利要求4所述的试剂盒在分子辅助育种中的应用。
9.权利要求1～3任一项所述的引物组或权利要求4所述的试剂盒在种质资源鉴定评、遗传多样性分析中的应用。
10.权利要求1～3任一项所述的引物组或权利要求4所述的试剂盒在种子纯度、杂交种鉴定中的应用。
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