CN108950054A - 一种与豇豆耐盐相关性状紧密连锁的InDel分子标记及其引物和应用 - Google Patents

一种与豇豆耐盐相关性状紧密连锁的InDel分子标记及其引物和应用 Download PDF

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Abstract

本发明公开了一种与豇豆耐盐相关性状紧密连锁的InDel分子标记及其引物和应用。一种与豇豆耐盐相关性状紧密连锁的InDel分子标记，该InDel分子标记为以SEQ ID NO.1所示的上游引物和SEQ ID NO.2所示的下游引物对耐盐豇豆品种苏紫41基因组DNA进行PCR扩增得到的SEQ ID NO.3所示的核苷酸序列。用于扩增本发明所述的InDel分子标记的引物对，上游引物如SEQ ID NO.1所示，下游引物如SEQ ID NO.2所示。利用该标记及其引物进行辅助选择，可以快速筛选豇豆耐盐株系用于豇豆耐盐性育种，提高育种的准确性和选择效率，节约成本。

Description

一种与豇豆耐盐相关性状紧密连锁的InDel分子标记及其引 物和应用
技术领域
本发明属于分子生物学及遗传育种技术领域,具体涉及一种与豇豆耐盐相关性状紧密连锁的InDel分子标记及其引物和应用。
背景技术
据联合国教科文组织(UNESCO)和联合国粮农组织(FAO)不完全统计，全世界盐渍土面积约10亿hm2(王遵亲,1993)。我国盐渍土面积约1亿hm2，这些盐渍土是我国重要的土地资源的一部分，尤其是在北方地区和南方沿海地区(时津霞等,2004；Stapies,1984)。
中国的豇豆种植面积常年维持在33万hm2以上，主要产区为河北、河南、江苏、浙江、安徽、四川、重庆、湖北、湖南、广西等省(自治区)(潘磊等，2014)。豇豆经济价值较高，其豆芽、幼苗、嫩荚都可作蔬菜食用，是解决夏秋淡季蔬菜供应的重要蔬菜作物之一。我国沿海地区是豇豆的重要产地，沿海地区海水中的盐分通过地上和地下途径进入土壤，而且处于较低的纬度，土壤的水分蒸发较多，也存在土壤盐碱问题(张舟等，2014)。
在豇豆的分子标记研究中，大多采用基于PCR(Polymerase chain reaction，聚合酶链式反应)的DNA分子标记。利用显性分子标记，如RAPD、ISSR等，已经筛选获得一批重复性好、稳定可靠的分子标记引物(陈禅友等，2008；Chen C Y,et al.,2010)。近年来，SSR和SNP等共显性分子标记的应用备受青睐。2009年首次报道了基于EST序列的1 375个SNP位点(Muchero W，et al.,2009)。Li等(2001)率先开发出27个SSR标记应用于豇豆研究。 Gupta等于2010年从NCBI数据库(http://archive-dtd.ncbi.nlm.nih.gov/)的豇豆 unigenes序列中设计筛选出102个SSR标记。Xu等于2010年则从豇豆基因组数据库 HarvEST(http://www.harvest-web.org/)和CGKB (http://cowpeagenomics.med.virginia.edu/CGKB)中发掘出172个多态性豇豆SSR分子标记(45个EST-SSR标记和127个gSSR标记)。InDe1标记是指由核苷酸水平上碱基的插入或缺失多态性，在植物基因组中有较高的分布频率，具有遗传稳定性高、分布广、多态性强等优点，并且InDel分布密度远高于SSR，理论上讲SSR标记包含在InDel标记范围内。标记辅助育种需要高密度遗传连锁图，但利用豇豆转录组数据开发InDel标记的研究还未见报道。
目前对豇豆耐盐相关的QTL定位研究较少，通常检测出的QTL数目较多，但效应值较小且重复性不好，较难在豇豆育种中应用。本研究通过QTL定位，旨在找到QTL区间内与豇豆耐盐相关性状紧密连锁的分子标记，同时将分子标记用于豇豆耐盐育种中。本研究通过QTL 定位，旨在筛选出与豇豆耐盐相关性状耐盐级别(STR)和叶绿素含量(SPAD)的QTLs位点和 InDel分子标记，用于豇豆耐盐育种的分子标记辅助选择。
发明内容
本发明所要解决的技术问题在于利用耐盐和盐敏感两个豇豆品种配置杂交组合，获得F1。以一株F1植株自交获得的143个F2单株为群体构建图谱。F2单株自交获得的143个F2:3家系用于耐盐性鉴定。这两个亲本材料进行转录组测序，将转录组组装序列进行BLAST比对，筛选有插入/缺失(InDel)的转录本，开发InDel标记。利用自主开发的InDel分子标记构建遗传图谱，并根据耐盐表型数据进行QTL定位。这为豇豆耐盐相关性状和农艺性状的基因定位、遗传多样性分析、指纹图谱构建、全基因组关联分析与高密度遗传连锁图谱的构建和分子标记辅助选择育种提供更多新的InDel标记，弥补目前豇豆InDel标记较为缺乏的不足。
一种与豇豆耐盐相关性状紧密连锁的InDel分子标记，该InDel分子标记为以SEQID NO.1 所示的上游引物和SEQ ID NO.2所示的下游引物对耐盐豇豆品种苏紫41基因组DNA进行PCR 扩增得到。
所述的与豇豆耐盐相关性状紧密连锁的InDel分子标记优选如SEQ ID NO.3所示的核苷酸序列。
用于扩增本发明所述的InDel分子标记的引物对。
所述的引物对优选上游引物如SEQ ID NO.1所示，下游引物如SEQ ID NO.2所示。
本发明所述的与豇豆耐盐相关性状紧密连锁的InDel分子标记在豇豆遗传图谱构建、QTL 定位、分子辅助育种及遗传多样性分析中的应用。
本发明所述的与豇豆耐盐相关性状紧密连锁的InDel分子标记在分子育种筛选耐盐和/或高叶绿素含量豇豆品种中的应用。
所述的引物对在豇豆遗传图谱构建、QTL定位、分子辅助育种及遗传多样性分析中的应用。
所述的引物对在分子育种筛选耐盐和/或高叶绿素含量豇豆品种中的应用。
本发明所述的一种与豇豆耐盐相关性状紧密连锁的InDel分子标记的开发方法，包括以下步骤：
1)利用耐盐豇豆品种苏紫41为母本和盐敏感苏豇1419为父本进行杂交，获得F1,以一株F1植株自交获得的143个F2单株为群体构建图谱，F2单株自交获得的143个F2:3家系用于耐盐性鉴定；
2)采用十六烷基三甲基溴化铵法提取苏紫41、苏豇1419、F1代和F2代单株的叶片DNA；
3)利用lllumina Hiseq2000平台对苏紫41和苏豇1419进行转录组测序；
4)将转录组组装序列进行BLAST比对，筛选有插入/缺失的转录本；
5)挑选插入/缺失的序列长度差异相对较大的序列，结合引物设计软件开发InDel标记引物；
6)利用自主开发的InDel引物，对两亲本和F1代进行PCR扩增，产物在8％聚丙烯凝胶中电泳、显影、染色和带型识别，筛选亲本具有多态性及F1代具有共显性的InDel标记；
7)利用5)的InDel标记对F2分离群体进行分子标记基因型分析，利用Joinmap3.0软件进行F2代群体遗传图谱的构建，作图参数设为重组率<0.4，LOD>1.0；并用WinQTLCartographer 2.5软件对F2:3群体进行数量性状位点定位，LOD阈值用1000次的置换测验确定，概率水平 P＝0.05，在第11连锁群上检测到主效QTL位点qSTR-11和qSPAD-11的存在，分别解释耐盐级别STR和叶绿素含量SPAD的7.0％和7.1％表现变异，距主效QTL位点qSTR-11和qSPAD-11 距离最近的Indel标记为VUIn282，其距离为13.7和9.23；该分子标记的引物序列为 VUIn282_F:SEQ ID NO.1，VUIn282_R:SEQ ID NO.2；此InDel标记在苏紫41的扩增片段为131个 bp:AGCCTGGATATAATCCAAACACTTTTTTTCCGAAGGCGATTGACAACACTTTCTTTTTGCACTAGATAATATGCTTCT AGTAATTTGATAAAAATCATTGAAAATTCTTGTTCTTTGCTTTGGTTGCTTTC(SEQ IDNO.3)。
有益效果：
利用耐盐和盐敏感两个豇豆品种配置杂交组合，获得F1。以一株F1植株自交获得的143 个F2单株为群体构建图谱。F2单株自交获得的143个F2:3家系用于耐盐性鉴定。这两个亲本材料进行转录组测序，将转录组组装序列进行BLAST比对，筛选有插入/缺失(InDel)的转录本，开发InDel标记。本发明通过开发的InDel标记及其引物对获得一个与豇豆耐盐相关性状耐盐级别(STR)和叶绿素含量(SPAD)的QTL。因此，利用该标记及其引物进行辅助选择，可以快速筛选豇豆耐盐株系用于豇豆耐盐性育种，提高育种的准确性和选择效率，节约成本。
附图说明
图1一种豇豆第11连锁群示意图。左半部分指示每个标记对应的遗传图距，右半部分指示该连锁群上的标记名称。
图2一种QTLCar2.0软件扫描的在豇豆第11连锁群上耐盐相关性状STR和SPAD主效基因位点(QTL)扫描的LOD曲线图。
图3为利用分子标记VUIn282(共显性)对两亲本苏紫41和苏豇1419及其F2代单株进行基因型分析和筛选图。图中前两个P1和P2分别代表亲本苏紫41和苏豇1419；1-45为F2单株编号；A、B、H分别代表P1、P2和杂合的分子标记带型。
具体实施方式
本发明所述的一种与豇豆耐盐相关性状紧密连锁的InDel分子标记的开发方法，包括以下步骤：
(1)利用在耐盐和盐敏感的两个豇豆品种苏紫41和苏豇1419进行杂交，获得F1。以一株F1植株自交获得的143个F2单株为群体构建图谱。F2单株自交获得的143个F2:3家系用于耐盐性鉴定；
(2)使用改进的CTAB法提取DNA。
(3)采集父母本、F1和F2植株的嫩叶，采用十六烷基三甲基溴化铵法(CTAB法)提取叶片总DNA，过程中所用到的试剂包括提取液(1.4M NaCl，100mM Tris，pH 8.0，20 mMEDTA，pH 8.0，2％CTAB)、苯盼：氯仿：异戊醇(25：24：1)、氯仿：异戊醇(24： 1)、无水乙醇、75％乙醇；利用核酸蛋白仪检测其浓度并稀释至10ng﹒μL-1用于PCR 扩增；
(4)将亲本、F2家系各10粒种子播于盛有蛭石的塑料杯(下口直径7cm，上口直径9cm，高15cm)中，再覆盖2cm蛭石；
(5)待真叶完全展开后间苗，每杯留4株。以100mmol L-1NaCL处理2天，盐浓度每隔1天以100mmol L-1递增，直至最终浓度达到300mmol L-1，之后每隔3天更换盐溶液，以保持NaCl的浓度恒定，连续处理至实验结束为止。盐处理PH为6.0-6.5，电导率为1.08S/m。气泵每天24h通气；
(6)直到盐敏感材料死亡(处理后约5周)，目测耐盐级别STR(1-5)(1，植物叶片健康；5，植株完全死亡)。并用叶绿素仪(Konica Minolta SPAD-502)测定植株叶片叶绿素含量(SPAD值)；
(7)利用lllumina Hiseq 2000平台对亲本品种苏紫41和苏豇1419进行转录组测序；
(8)利用生物信息学软件进行数据分析，将转录组组装序列进行BLAST比对，筛选有插入/缺失(InDel)的转录本；
(9)在InDel序列两侧设计PCR引物，并对亲本进行多态筛选和F1共显性筛选；
(10)利用共显性引物对F2群体进行基因型分析，利用Joinmap 4.0软件构建F2群体遗传连锁图谱，作图参数设为重组率<0.4，LOD>1.0，结合耐盐表型数据，利用WinQTLCartographer 2.0软件对F2:3群体进行豇豆耐盐相关性状耐盐级别(STR)和叶绿素含量(SPAD)的QTL定位，LOD阔值用1000次的置换测验确定，概率水平P＝0.05；
(11)在第11连锁群上检测到主效QTL的存在，分别解释耐盐级别(STR)和叶绿素含量 (SPAD)的7.0％和7.1％表现变异。距主效QTL位点qSTR-11和qSPAD-11距离最近的InDel标记为VUIn282(自主开发的分子标记命名)，其距离为13.7和9.23。
实施例1.豇豆耐盐分离群体的构建及性状；
本实施例中使用的群体为耐盐和盐敏感亲本(耐盐级别STR分别为1级的苏紫41和5级的苏豇1419)杂交后代F2：3群体。STR和SPAD数据分布结果表明:这两个性状均呈连续性分布，峰度、偏斜度的绝对值大部分都小于或接近1.0，属多基因控制的数量性状，适合进行QTL定位。(表1)。结果表明STR和SPAD性状均呈连续性分布，峰度、偏斜度的绝对值都小于或接近1.0，属多基因控制的数量性状，适合进行QTL定位。
表1 F2:3群体NJSS在盐胁迫下STR和SPAD性状的描述性统计分析
实施例2.亲本苏紫41、苏豇1419、F1和F2分离群体叶片总DNA的提取；
利用CTAB法提取叶片总DNA，具体步骤如下：
A.取0.1克叶片鲜样放入研磨，加650微升提取液研磨，随即装入1.5毫升离心管中置于65℃恒温水浴60分钟，其间混合2-3次；
B.加等体积的苯酚:氯仿:异戊醇(25:24:1，体积比)，轻轻颠倒使其充分混匀；12000 rpm离心10分钟使其分层，轻轻吸取上清液转入另一1.5毫升离心管,加等体积的氯仿:异戊醇(24:1，体积比)重新抽提一次；
C.加入1毫升的-20℃预冷无水乙醇，置于4℃冷冻不超过30分钟让DNA析出，12000rpm离心10分钟，倒掉离心管中乙醇溶液；用75％乙醇(体积比)清洗2-3次；倒掉浸泡液，打开离心管盖置于通风橱内吹干；
D.干燥后加入TE(10mM Tris，pH8.0；lmM EDTA，pH8.0)溶解DNA；紫外分光光度计测定DNA的浓度，于4℃冰箱中保存备用。
实施例3.InDel分子标记引物的开发及多态性的筛选：
根据苏紫41和苏豇1419转录组组装序列，进行BLAST比对，筛选有插入/缺失(InDel) 的转录本；
挑选插入/缺失(InDel)的序列长度差异相对较大的序列，然后用Primer5.0软件设计 InDel标记引物。
通过生物公司合成了InDel引物845对。筛选结果表明，有93％引物的扩增产物在双亲间存在长度多态性差异，31％引物的扩增产物在F1存在共显性。多态性筛选程序如下：
(1)从亲本中各随机选择4株DNA等量混合，作为筛选引物的模板。
(2)PCR反应体系：
(3)PCR反应程序：
(4)凝胶电泳
试剂配制：
用超纯水定容至1升。
(5)8％变性聚丙烯酰胺(PAGE)的配制
10％过硫酸铵配制：
称取过硫酸铵10g，加水溶解后，用超纯水定容至100ml；
(6)6×loading Buffer(加入到扩增产物中)
加入少量的超纯水溶解，再加入180毫升的甘油，调节PH至7.0，定容至500毫升；
(7)1×TBE(电泳缓冲液)：100毫升的10×TBE，用900毫升的超纯水定容至1升；
(8)染色液：硝酸银1g，用超纯水溶解并定容至1升；
(9)显色液：氢氧化钠15g，用超纯水溶解并定容至1升，加入3毫升的甲醛；
(10)聚丙烯酰胺凝胶胶制备
①电泳槽的各部件在使用前均需清洗干净。尤其是凝胶玻璃板，必须用泡沫海绵沾少许肥皂或者洗涤剂清洗，清洗后用自来水将洗涤剂冲洗干净，在用超纯水冲洗2遍，晾干备用。
②选择水平操作台面，将上玻璃板和下玻璃板合起，在玻璃板边二分之一处用一至两个夹子固定好；
(11)电泳
①在烧杯中倒入70毫升的8％非变形聚丙烯酰胺，再分别加入1毫升的10％过硫酸铵以及25微升TEMED，快速搅拌均匀；
②将配置好的8％非变形聚丙烯酰胺凝胶溶液沿着玻璃板上沿缓慢注入(防止有气泡) ，注入高度距下沿齐平；向凝胶内插入相应的加样梳；
③待胶凝固后，拆下长尾夹，将凝胶板安装到电泳槽上，然后再用夹子加紧防止渗漏；在上下电极槽中加注电泳缓冲液即1倍TBE，下槽液面不得高于凹型玻璃板凹口底边5-10毫米。下槽液面不得高于最高水位线“MAX”。双手轻轻取出梳子，即可看到界限清楚的加样孔，用移液枪吸取一定的样品溶液，加入凹型凝胶样品孔内；
④正确连接电泳槽的正负极，接通电泳仪，根据胶面大小和其他要求，选择合适的电压或电流进行电泳。
(12)染色和显色
①将电泳好的凝胶取出，转移至染色器皿中。加入配置好的硝酸银溶液，在小型摇床上染色10分钟。将硝酸银溶液倒出，再加入清水冲洗一遍。加入氢氧化钠和甲醛溶液显色5分钟。倒掉显色液，用清水冲洗两遍。
②将保鲜膜平铺在桌面上，然后再将胶整齐的平铺在保鲜膜上并包好，室温晾干，拍照后留用。
实施例4.多态性引物在F2群体中的分布及连锁性分析
挑选出在F1中显示出共显性的引物对F2分离群体143个单株进行分子标记基因型分析，获得分子标记基因型数据。如图3，利用共显性标记VUIn282对F2群体中45个单株进行基因型分析的结果。利用Joinmap4.0软件对F2群体的分子标记基因型数据进行连锁分析以构建分子标记遗传连锁图谱，获得9个连锁群(含106个分子标记)。基于该遗传图谱、F2：3群体STR与SPAD 性状表型数据，利用WinQTL Cartographer 2.0软件进行QTL定位，在豇豆第11连锁群(图 1)上分子标记VUIn282附近(表2)，分别检测到了1个控制STR和SPAD的QTL(图2)，其贡献率为7.0％和7.1％(表3)。表2第11连锁群上与STR和SPAD性状紧密连锁的分子标记的引物序列
表3 第11连锁群上控制STR和SPAD性状的主效基因位点(QTL)的基本信息
序列表
<110> 江苏省农业科学院
<120> 一种与豇豆耐盐相关性状紧密连锁的InDel分子标记及其引物和应用
<160> 3
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 22
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 1
agcctggata taatccaaac ac 22
<210> 2
<211> 22
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 2
gaaagcaacc aaagcaaaga ac 22
<210> 3
<211> 131
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 3
agcctggata taatccaaac actttttttc cgaaggcgat tgacaacact ttctttttgc 60
actagataat atgcttctag taatttgata aaaatcattg aaaattcttg ttctttgctt 120
tggttgcttt c 131

Claims (9)

1.一种与豇豆耐盐相关性状紧密连锁的InDel分子标记，其特征在于该InDel分子标记为以SEQ ID NO.1所示的上游引物和SEQ ID NO.2所示的下游引物对耐盐豇豆品种苏紫41基因组DNA进行PCR扩增得到。
2.根据权利要求1所述的InDel分子标记,其特征在于如SEQ ID NO.3所示。
3.用于扩增权利要求1所述的InDel分子标记的引物对。
4.根据权利要求1所述的引物对，其特征在于上游引物如SEQ ID NO.1所示，下游引物如SEQ ID NO.2所示。
5.权利要求1所述的InDel分子标记在豇豆遗传图谱构建、QTL定位、分子辅助育种或遗传多样性分析中的应用。
6.根据权利要求5所述的应用，其特征在于所述的与豇豆耐盐相关性状紧密连锁的InDel分子标记在分子辅助育种筛选耐盐和/或高叶绿素含量豇豆品种中的应用。
7.权利要求2或3所述的引物对在豇豆遗传图谱构建、QTL定位、分子辅助育种及遗传多样性分析中的应用。
8.根据权利要求7所述的应用，其特征在于权利要求2或3所述的引物对在分子育种筛选耐盐和/或高叶绿素含量豇豆品种中的应用。
9.权利要求1所述的一种与豇豆耐盐相关性状紧密连锁的InDel分子标记的开发方法，其特征在于包括以下步骤：
1)利用耐盐豇豆品种苏紫41为母本和盐敏感苏豇1419为父本进行杂交，获得F1。以一株F1植株自交获得的143个F2单株为群体构建图谱，F2单株自交获得的143个F2:3家系用于耐盐性鉴定；
2)采用十六烷基三甲基溴化铵法提取苏紫41、苏豇1419、F1代和F2代群体的叶片总DNA；
3)利用lllumina Hiseq2000平台对苏紫41和苏豇1419进行转录组测序；
4)将转录组组装序列进行BLAST比对，筛选有插入/缺失的转录本；
5)挑选插入/缺失的序列长度差异相对较大的序列，结合引物设计软件开发InDel标记引物；
6)利用自主开发的InDel引物，对两亲本和F1代进行PCR扩增，产物在8％聚丙烯凝胶中电泳、显影、染色和带型识别，筛选亲本具有多态性及F1代具有共显性的InDel标记；
7)利用5)的InDel标记对F2单株进行分子标记基因型分析，利用Joinmap3.0软件进行F2代群体遗传图谱的构建，作图参数设为重组率<0.4，LOD>1.0；并用WinQTL Cartographer2.5软件对F2:3群体进行数量性状位点定位，LOD阈值用1000次的置换测验确定，概率水平P＝0.05，在第11连锁群上检测到主效QTL位点qSTR-11和qSPAD-11的存在，分别解释耐盐级别STR和叶绿素含量SPAD的7.0％和7.1％表现变异，距主效QTL位点qSTR-11和qSPAD-11距离最近的Indel标记为VUIn282，其距离为13.7和9.23；该分子标记的引物序列为VUIn282_F:SEQ ID NO.1，VUIn282_R:SEQ ID NO.2；此InDel标记在苏紫41的扩增片段为131个bp，其核苷酸序列为SEQ ID NO.3。
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Cited By (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN110484599A (zh) * 2019-09-20 2019-11-22 南通大学 旱柳耐盐基因的发掘方法
CN111793706A (zh) * 2020-06-16 2020-10-20 广东省农业科学院蔬菜研究所 一种豇豆InDel分子标记检测引物组及试剂盒
CN114381547A (zh) * 2022-01-24 2022-04-22 青岛农业大学 一种与花生乙烯不敏感以及耐盐相关性状紧密连锁的分子标记及应用

Citations (4)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN102766627A (zh) * 2012-08-08 2012-11-07 中国农业科学院油料作物研究所 一种与油菜含油量性状紧密连锁的分子标记及应用
CN105296475A (zh) * 2015-11-06 2016-02-03 江苏省农业科学院 与辣椒抗黄瓜花叶病毒病基因qcmv-2-1连锁的分子标记及其应用
CN105325192A (zh) * 2015-11-16 2016-02-17 江苏省农业科学院 一种豇豆苗期耐盐资源鉴定方法
CN108315465A (zh) * 2018-03-27 2018-07-24 江苏省农业科学院 一种与豇豆耐盐相关性状紧密连锁的InDel分子标记及其引物和应用

Patent Citations (4)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN102766627A (zh) * 2012-08-08 2012-11-07 中国农业科学院油料作物研究所 一种与油菜含油量性状紧密连锁的分子标记及应用
CN105296475A (zh) * 2015-11-06 2016-02-03 江苏省农业科学院 与辣椒抗黄瓜花叶病毒病基因qcmv-2-1连锁的分子标记及其应用
CN105325192A (zh) * 2015-11-16 2016-02-17 江苏省农业科学院 一种豇豆苗期耐盐资源鉴定方法
CN108315465A (zh) * 2018-03-27 2018-07-24 江苏省农业科学院 一种与豇豆耐盐相关性状紧密连锁的InDel分子标记及其引物和应用

Non-Patent Citations (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
WALTRAM RAVELOMBOLA等: ""Association analysis of salt tolerance in cowpea (Vigna unguiculata (L.) Walp) at germination and seedling stages"", 《THEOR APPL GENET》 *

Cited By (5)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN110484599A (zh) * 2019-09-20 2019-11-22 南通大学 旱柳耐盐基因的发掘方法
CN111793706A (zh) * 2020-06-16 2020-10-20 广东省农业科学院蔬菜研究所 一种豇豆InDel分子标记检测引物组及试剂盒
CN111793706B (zh) * 2020-06-16 2021-06-29 广东省农业科学院蔬菜研究所 一种豇豆InDel分子标记检测引物组及试剂盒
CN114381547A (zh) * 2022-01-24 2022-04-22 青岛农业大学 一种与花生乙烯不敏感以及耐盐相关性状紧密连锁的分子标记及应用
CN114381547B (zh) * 2022-01-24 2023-05-02 青岛农业大学 一种与花生乙烯不敏感以及耐盐相关性状紧密连锁的分子标记及应用

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