CN104651497B - 与白菜黄色种皮基因Brsc‑ye连锁的SSR分子标记引物及应用 - Google Patents

与白菜黄色种皮基因Brsc‑ye连锁的SSR分子标记引物及应用 Download PDF

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Abstract

本发明公开了与白菜黄色种皮基因Brsc‑ye连锁的SSR分子标记引物及应用。该标记引物的获得是以黄籽白菜和普通棕籽白菜及其F2分离群体的基因组DNA为模板，通过520对SSR引物对黄籽白菜亲本和棕籽白菜亲本进行多态性引物筛选，然后通过对F2群体的单株进行分析，筛选与白菜黄色种皮基因Brsc‑ye连锁的分子标记，成功获得了与Brsc‑ye基因连锁的7对SSR标记引物，构建了白菜黄色种皮基因Brsc‑ye的分子遗传图谱。连锁分析发现Brsc‑ye基因两侧连锁紧密的两个SSR标记的遗传距离分别为0.17cM和0.29cM，该分子标记具有检测方便，扩增稳定，重复性和准确率高等优点，为白菜、油菜黄色种皮性状的分子辅助选择育种提供依据，加快育种进程。

Description

与白菜黄色种皮基因Brsc-ye连锁的SSR分子标记引物及应用
技术领域
本发明属于蔬菜育种及分子遗传学领域，具体涉及与白菜黄色种皮基因Brsc-ye连锁的SSR分子标记引物的开发及应用。
背景技术
白菜(Brassica rapa L.)属十字花科芸薹属芸薹种白菜亚种，是起源于我国的主要蔬菜作物之一，也是世界三大油菜之一，与人们的日常生活密切相关，近年来，随着人们生活水平的提高，人们对油料品质的要求日益高涨。因此，黄色种皮白菜育种受到越来越多国内外学者，育种家的重视。
研究表明黄色种皮的油菜籽种皮薄，所以含油量高，不仅如此，黄色种皮油菜籽生产的油粗纤维含量较低，蛋白质含量较高，受到国内外的广泛关注。但是，白菜种皮颜色需要开花结实且种子成熟后才能表现出，而且需要在田间逐株观察，操作起来费时费力，极大的延缓了育种进程。因此为了加快黄籽白菜的育种速度，利用现代的分子生物技术，进行分子标记辅助育种十分必要。
随着分子生物学技术的快速发展，多种基于DNA多态性的分子技术应运而生，并广泛应用于遗传育种研究的各个领域。简单序列重复(simple sequence repeats，SSR)，又称为微卫星DNA(microsatellite，DNA)，是一类由1-6个核苷酸串联重复组成的DNA序列如(CA)n，(ATG)n，(TAGG)n等重复，其长度一般较短，广泛分布于基因组的不同位置，由于重复次数的不同和重复程度的不完全造成了每个位点的多态性，包括SSR标记和EST-SSR标记两种类型。其中，SSR标记具有共显性、重复性好、多态性丰富、易于检测等优点，已广泛应用于植物遗传多样性分析、遗传图谱构建、基因定位和分子标记辅助育种等研究领域(Tautzand 1994；Powell et al.，1996)。
因此，基于以上SSR标记的优点，申请人利用白菜的测序结果，开发并成功筛选出与白菜种皮颜色基因Brsc-ye紧密连锁的分子标记，并构建了Brsc-ye基因的分子遗传图谱，为克隆该基因及利用该分子标记进行黄籽油菜、白菜分子辅助育种，加快育种进程奠定了基础。
发明内容
本发明的目的在于，提供一种与白菜种皮颜色基因Brsc-ye紧密连锁的SSR分子标记引物，应用该SSR分子标记引物，通过PCR方法，在苗期即可鉴定区分黄籽白菜和棕籽白菜，从而淘汰非目标植株，大大提高选择的效率。
为了实现上述任务，本发明采用如下的技术解决方案：
与白菜种皮颜色基因Brsc-ye连锁的SSR分子标记引物，包括已鉴定出的7对SSR引物对中的一对，即可将黄色种皮与棕色种皮白菜区分开，同时使用两个标记能提高选择的准确性。7对SSR引物对的脱氧核糖核苷酸引物序列如下：
引物对SSR309：
上游引物(F)：5＇－ACACTTTCTTCCTCCTCCCTCTCT－3＇；
下游引物(R)：5＇－CTCTCAACACTCCTCTCGTTTTCC－3＇；
引物对SSR328：
上游引物(F)：5＇－GAAGCCTGTTTGAACATTAC－3＇；
下游引物(R)：5＇－ATCTCCATTAGTTACTACGC－3＇；
引物对SSR282：
上游引物(F)：5＇－ATAACAACACTAGGCGACAG－3＇
下游引物(R)：5＇－CTCTGCTAACACTTCCCTCT－3＇
引物对SSR289：
上游引物(F)：5＇－GCTGGTTAGGTGGTGTTGGT－3＇
下游引物(R)：5＇－GTGGTGCTTTGTCTTCGTCA－3＇
引物对SSR298：
上游引物(F)：5＇－GCTCCAGGTGTTACCATATT－3＇
下游引物(R)：5＇－TATCACCCAAAGCAAAGGAC－3＇
引物对SSR340：
上游引物(F)：5＇－AACCTAATTTCGTGTTCATG－3＇
下游引物(R)：5＇－AAAGACAGTACGCACAGACA－3＇
引物对SSR344：
上游引物(F)：5＇－TGTTGTGGTTCTGAAATGGA－3＇
下游引物(R)：5＇－TGAAGATGGTGAATGAAGCC－3＇
采用上述与白菜黄色种皮基因Brsc-ye紧密连锁的SSR分子标记引物，通过DNA扩增，在苗期即可鉴定区分黄色种皮和棕色种皮白菜，从而淘汰非目标植株，大大提高选择的效率。同时白菜黄色种皮基因Brsc-ye分子遗传图谱的构建可加快克隆该基因。
所述的白菜黄色性状辅助选择的方法是：PCR扩增黄籽白菜基因组DNA的多态性片段，引物SSR309和SSR328分别产生大小约为252bp和109bp的产物，这两个SSR标记分别位于Brsc-ye的两侧，与Brsc-ye的遗传距离分别为0.17cM和0.29cM。
本发明首次获得了与白菜黄色种皮基因Brsc-ye最为紧密连锁的分子标记引物，具有检测方便，扩增稳定，重复性和准确率高等优点。其具体有益效果表现在：
(1)获得了在第6连锁群(A 06)上白菜黄色种皮基因Brsc-ye的分子遗传图谱，且首次获得与Brsc-ye基因紧密连锁的分子标记SSR309和SSR328，可在黄籽白菜分子标记辅助育种及Brsc-ye基因克隆中发挥重要的作用。
(2)获得了与Brsc-ye紧密连锁的分子标记，并构建了其高密度遗传图谱。其中SSR328与Brsc-ye连锁紧密，其遗传距离为0.29cM，SSR309与Brsc-ye连锁最为紧密，其遗传距离为0.17cM，这两个标记能够帮助该基因向推广品种中转移以及与其他抗病、抗逆基因的聚合。
(3)鉴定方便。这2个标记均为共显性标记，具有扩增稳定、检测方便、快速等优点。用这2个分子标记检测Brsc-ye基因，可以确定Brsc-ye的存在与否及存在的状态，进而快速筛选携有Brsc-ye基因的植株，并用于黄籽白菜品种的选育。同时利用分子标记进行检测时还可以避免环境对品种的影响，提高选择的准确性。
(4)提高黄籽白菜的选择效率。在传统的黄籽白菜鉴定过程中，必须等到白菜开花结实且种子成熟后才能对种皮颜色性状进行观察统计，因此黄籽白菜的选育不仅费时，而且难度大，成本高。用本发明的分子标记引物，通过检查与白菜黄色种皮基因Brsc-ye紧密连锁的分子标记，可将表型鉴定的工作大大减少，在苗期即可区分黄籽和棕籽白菜，从而淘汰非目标植株，因此，利用本发明的与Brsc-ye基因紧密连锁的分子标记，不仅节约成本，而且大大的提高了育种效率，加快了育种进程。
(5)可用于克隆白菜黄籽基因的研究。图位克隆白菜黄籽基因Brsc-ye的前提在于获得与Brsc-ye紧密连锁的分子标记。SSR309和SSR328在所有已知的分子标记中与Brsc-ye连锁最为紧密，为克隆该基因提供基础。
附图说明
图1是白菜黄籽基因Brsc-ye的遗传连锁图，右侧为遗传连锁图的标记，左侧数据为标记间的遗传距离(cM)。
图2是SSR309在黄籽和棕籽亲本及F2代单株中的扩增结果；泳道信息：(从左到右)M，50bp DNA ladder；BP是棕籽亲本；YP是黄籽亲本，7个纯合棕籽单株；7个杂合棕籽单株；7个纯合黄籽单株。
图3(a)棕籽材料92S105和(b)黄籽材料09Q5的种子。
以下结合附图和实施例对本发明作进一步的详细说明。
具体实施方式
以下实施例中的实验方法均为常规方法，所涉及的实验试剂均为常规生化试剂。
本发明的与白菜黄籽基因Brsc-ye紧密连锁的SSR分子标记引物是通过以下步骤获得的：
(1)群体材料准备
以棕籽白菜“92S105”(西北农林科技大学学报(自然科学版)2011(3)11：146-151)为母本，黄籽白菜“09Q5”(秦白6号大白菜的亲本之一，陕西农业科学，1999(3)，5-6)为父本杂交产生的F1群体，然后通过单株自交获得其F2群体。
(2)白菜单株基因组总DNA的提取
A、取0.2g去掉主脉的新鲜嫩叶片，塞入装有钢珠(钢珠需要由质量分数为75％的酒精清洗过)的2mL的离心管中，放入液氮中速冻，利用组织研磨仪磨成粉末；
B、向离心管中加700μl经65℃预热的CTAB提取液(CTAB：2％，Tris-HCl(pH＝8.0)：100mmol/L，EDTA：20mmol/L，NaCl：1.4mol/L)，再加入10μL的β-巯基乙醇，迅速混匀；
C、随后将离心管放入65℃烘箱中，中间每间隔5-10min分钟摇一次，温浴45min；
D、取出离心管，加入等体积的酚：氯仿：异戊醇(25:24:1)的混合物，摇匀15min后，常温下10000r/min离心10min；
E、将上层液相(约700μl)转移到另一离心管中，加入等体积的氯仿和异戊醇混合溶液(氯仿：异戊醇＝24：1)，轻轻摇匀10min，常温下10000r/min离心10min；
F、取上清(约500μl)，加入2倍体积经预冷的无水乙醇，轻轻混匀使DNA抱团，-20℃条件下沉淀30min，4℃条件下8000r/min离心5min；
G、弃上清，加入500μl质量百分数为75％的乙醇洗涤沉淀2次后，沉淀物室温晾干；
H、加入500μl的无菌蒸馏水溶解DNA，加入0.29μl的RNase A(10μg/μl)，混匀后稍离心，37℃保温30min；
I、加入3mol/L的NaAc溶液50μL和2倍体积经预冷的无水乙醇，轻轻混匀使DNA抱团，-20℃条件下沉淀30min；
J、在4℃条件下，8000r/min离心5min，弃上清，加入质量百分数为75％的乙醇清洗沉淀1～2次后，沉淀物室温晾干，加入400μl～500μl的灭菌ddH2O溶解使用，或加入质量百分数为75％的乙醇-20℃保存备用；
(3)SSR序列的获得
根据http://brassicadb.org/brad/index中公布的已知引物，共选取白菜10对染色体上已知的引物120对，利用亲本材料对120对引物进行筛选，共筛选出30对差异引物，然后随机选择棕籽材料和黄籽材料各7株，对这30对引物进行再次筛选，发现1对差异引物A67，随后继续选取A67引物两侧已知引物，发现了另一对差异引物A0611。进一步沿A0611到Brsc-ye方向设计SSR引物。利用SSRHunter软件对该区间序列内的SSR位点进行检索，检索标准为：含二、三、四、五和六核苷酸类型的SSR基序(motif)的最小重复数分别为5，4，3，3和3次。将检索得到的含SSR位点的序列在芸薹属基因组网站(http://www.brassica.bbsrc.ac.uk/)进行同源性比对，SSR序列选取条件为比对相似性85％以上，同时有3条以上的同源序列与该序列存在SSR位点差异。
(4)SSR分子标记引物设计
根据SSR差异位点两端的序列，采用Primer 5.0软件对符合条件的目标序列设计引物。设计引物参数原则：退火温度为50℃～70℃，最佳温度为57℃；引物长度18bp～24bp；产物大小为100bp～300bp；引物(G+C)含量为40％～60％，引物不出现二级结构、发夹结构和二聚体。引物由生工生物工程(上海)股份有限公司合成，设计合成了SSR引物400对。
(5)多态性引物筛选和SSR分子标记分析
选用所设计的400对引物，将黄籽亲本与棕籽亲本间表现出相同多态性的引物重复分析3次，然后选择F2群体中30株极端个体间进行多态性验证，如果扩增结果与在两亲本间扩增结果一致，则将确实存在多态性的引物用于F2代单株的SSR分析。最后根据连锁交换规律，结合单株基因型资料与田间对种皮颜色调查统计的结果，利用JoinMap4.0软件构建了白菜黄色种皮基因Brsc-ye的分子遗传连锁图，获得了与Brsc-ye紧密连锁的7个SSR标记标记。
7对SSR引物对的脱氧核糖核苷酸引物序列如下：
引物对SSR309：
上游引物(F)：5＇－ACACTTTCTTCCTCCTCCCTCTCT－3＇；
下游引物(R)：5＇－CTCTCAACACTCCTCTCGTTTTCC－3＇；
引物对SSR328：
上游引物(F)：5＇－GAAGCCTGTTTGAACATTAC－3＇；
下游引物(R)：5＇－ATCTCCATTAGTTACTACGC－3＇；
引物对SSR282：
上游引物(F)：5＇－ATAACAACACTAGGCGACAG－3＇
下游引物(R)：5＇－CTCTGCTAACACTTCCCTCT－3＇
引物对SSR289：
上游引物(F)：5＇－GCTGGTTAGGTGGTGTTGGT－3＇
下游引物(R)：5＇－GTGGTGCTTTGTCTTCGTCA－3＇
引物对SSR298：
上游引物(F)：5＇－GCTCCAGGTGTTACCATATT－3＇
下游引物(R)：5＇－TATCACCCAAAGCAAAGGAC－3＇
引物对SSR340：
上游引物(F)：5＇－AACCTAATTTCGTGTTCATG－3＇
下游引物(R)：5＇－AAAGACAGTACGCACAGACA－3＇
引物对SSR344：
上游引物(F)：5＇－TGTTGTGGTTCTGAAATGGA－3＇
下游引物(R)：5＇－TGAAGATGGTGAATGAAGCC－3＇
所述的PCR扩增包括：20μl PCR反应体系为：50ng/μl的模板DNA为2μl，2×TaqMaster Mix 10μl，10μM的上、下游引物各1μl，用无菌蒸馏水补充反应体系至20μl；
PCR反应程序为：
SSR309引物扩增程序：先94℃预变性5min；然后94℃变性30s，63℃退火30s，72℃延伸30s，共30个循环；最后72℃再延伸10min，4℃保存。
SSR328引物：先94℃预变性5min；然后94℃变性30s，59℃退火30s，72℃延伸30s，共30个循环；最后72℃再延伸10min，4℃保存。
以下是发明人给出的具体实施例。
实施例：SSR309引物的应用
(一)采用CTAB法提取白菜基因组DNA，提取步骤如下所示：
A.取0.2g去掉主脉的新鲜嫩叶片，塞入装有钢珠(钢珠需要由质量分数为75％的酒精清洗过)的2mL的离心管中，放入液氮中速冻，利用组织研磨仪磨成粉末；
B.向离心管中加700μl经65℃预热的CTAB提取液(CTAB：2％，Tris-HCl(pH8.0)：100mmol/L，EDTA：20mmol/L，NaCl：1.4mol/L)，再加入8μl的β-巯基乙醇，迅速混匀；
C.随后将离心管放入65℃水浴中，中间每间隔5-10min分钟摇一次，水浴45min；
D.取出离心管，加入等体积的酚、氯仿和异戊醇的混合物(酚：氯仿：异戊醇＝25：24：1)，摇匀15min后，常温下10000r/min离心10min；
E.将上层液相(约700μl)转移到另一离心管中，加入等体积的氯仿和异戊醇的混合物(氯仿：异戊醇＝24：1)，轻轻摇匀10min，常温下10000r/min离心10min；
F.取上清(约500μl)，加入2倍体积预冷的无水乙醇，轻轻混匀使DNA抱团，-20℃条件下沉淀30min，4℃条件下8000r/min离心5min；
G.弃上清，加入500μl质量分数为75％的乙醇洗涤沉淀2次后，沉淀物室温晾干；
H.加入500μl的无菌蒸馏水溶解DNA，加入0.29μl的RNaseA(10μg/μL)，混匀后离心，37℃保温30min；
I.加入3mol/L NaAc溶液50μL和2倍体积经预冷的无水乙醇，轻轻混匀使DNA抱团，-20℃条件下沉淀30min；
J.在4℃条件下，8000r/min离心5min，弃上清，加入质量分数为75％的乙醇清洗沉淀1～2次后，沉淀物室温晾干，加入400μl-500μl灭菌的ddH2O溶解使用，或加入质量百分数为75％乙醇-20℃保存备用；
(二)PCR扩增
用黄籽亲本和棕籽亲本作模板，按照下述PCR扩增条件和程序进行分析
①PCR扩增条件：
20μl PCR反应体系为：50ng/μl的模板DNA为2μl，2×Taq Master Mix 10μl，10μM的上、下游引物各1μl，用无菌蒸馏水补充反应体系至20μl；
②PCR反应程序为：先94℃预变性5min；然后94℃变性30s，63℃退火30s，72℃延伸30s，共30个循环；最后72℃再延伸10min，4℃保存。PCR反应在Bio-Rad S100096型PCR仪中进行。
(三)9％非变性聚丙烯酰胺凝胶电泳
(1)9％非变性聚丙烯酰胺凝胶的制备方法如下：
①玻璃板的清洗：用清水将玻璃板冲洗干净，再用无水乙醇冲洗并空置晾干，洗板时应将带有磨砂条的玻璃板和光滑玻璃板分开。
②装板：将带有磨砂条的玻璃板和光滑玻璃板两侧对齐，光滑玻璃板下侧突出插入到带有凹槽的橡皮封条中，利用1％的琼脂糖凝胶将磨砂玻璃板与橡皮封条之间的间隙封住，琼脂糖凝胶凝固后待用。
③灌胶：封底之后，取25ml，9％的非变性聚丙烯酰胺凝胶溶液，加250μl浓度为10％的过硫酸氨(APS)和25μl的TEMED，轻轻混匀，灌完后，将梳子插入适当位置，再将板调至水平，室温下胶板凝固30min。
(2)电泳：
①点样：从胶板中将梳子小心拔出，往胶槽内倒入适量1×TBE电泳缓冲液(中间槽的电泳液需要高于光滑玻璃板的高度，两侧液体高度10cm以上)，用移液器将梳孔中残余的凝胶和气泡清除出去，加入2μl由SSR309引物扩增出的PCR扩增产物。
②电泳检测：接通电源，恒压180V电泳检测，时间约为90min，待二甲苯氰跑出胶底部，停止电泳。
③卸板：将电泳完毕的凝胶从玻璃板上剥离下来，该过程在水中进行，可以减少凝胶的损坏。
(3)银染步骤：
①冲洗：将电泳完毕的凝胶从玻璃板上剥离下来后，放入盛有蒸馏水的盘子里，轻晃5-6s，倒掉，以洗去凝胶表面的残余电泳液；
②染色：将胶转入0.1％的硝酸银溶液中震荡染色8-10min；
③水洗：将染完色的凝胶转入蒸馏水中漂洗2-3次，洗去凝胶表面的硝酸银残余；
④显色：将冲洗完毕的凝胶转入显色液(1.5％NaOH，0.4％甲醛)中显色至条带清楚显示；
⑤冲洗：将显色液倒掉，用自来水冲洗胶片2-3次；
⑥保存：将冲洗后的凝胶放在胶片观察灯上统计分析、照相，然后用保鲜膜封存，4℃可保存数月。
(四)结果判断
纯合黄色种子材料扩增出252bp的产物、纯合褐色种子扩增出大约300bp的产物，杂合褐色种子扩增出共显性的产物(附图2)。

Claims (1)

1.一种白菜黄籽种皮基因克隆和白菜黄色种皮性状辅助育种的方法，其特征在于，所述方法包括：
与白菜黄色种皮基因Brsc-ye连锁的分子标记引物SSR309和SSR328分别PCR扩增白菜基因组DNA，PCR扩增产物的的多态性片段大小分别为252bp和109bp，这两个SSR标记分别位于Brsc-ye的两侧，与Brsc-ye的遗传距离分别为0.17cM和0.29cM；
所述引物SSR309脱氧核糖核苷酸引物序列为：
上游引物(F)：5＇－ACACTTTCTTCCTCCTCCCTCTCT－3＇；
下游引物(R)：5＇－CTCTCAACACTCCTCTCGTTTTCC－3＇；
所述引物SSR328脱氧核糖核苷酸引物序列为：
上游引物(F)：5＇－GAAGCCTGTTTGAACATTAC－3＇；
下游引物(R)：5＇－ATCTCCATTAGTTACTACGC－3＇；
所述的PCR扩增体系包括：
20μl PCR反应体系为：50ng/μl的模板DNA为2μl，2×TaqMaster Mix 10μl，10μM的上、下游引物各1μl，用无菌蒸馏水补充反应体系至20μl；
PCR反应程序为：
SSR309引物：先94℃预变性5min；然后94℃变性30s，63℃退火30s，72℃延伸30s，共30个循环；最后72℃再延伸10min，4℃保存；
SSR328引物：先94℃预变性5min；然后94℃变性30s，59℃退火30s，72℃延伸30s，共30个循环；最后72℃再延伸10min，4℃保存；
所述的PCR扩增产物的检测方法是，将PCR扩增产物在质量百分比浓度为9％～12％的非变性聚丙烯酰胺凝胶电泳分离，然后银染显色。
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