CN105349671B - 适于清溪乌鳖群体分析的微卫星序列及筛选方法 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种的适于清溪乌鳖群体分析的微卫星序列，包括3个清溪乌鳖的微卫星位点，其核苷酸序列依次为：SEQ ID No.1~SEQ ID No.3，同时提供了扩增上述3个微卫星位点的引物序列，可应用于乌鳖的群体分析，也为乌鳖的分子标记育种、种质资源保护等提供了一定的理论依据。其中，PS‑3引物对可作为乌鳖的特异性分子标记，用于区别于日本鳖和姚江鳖。上述开发的3个微卫星位点的等位基因数目大于5个，群体分析结果表明具有较高的遗传多样性，是用于清溪乌鳖群体分析或个体选育的理想工具。

Description

适于清溪乌鳖群体分析的微卫星序列及筛选方法

技术领域

本发明涉及一种微卫星序列，特别是适于清溪乌鳖群体分析的微卫星序列及筛选方法。

背景技术

中华鳖，又名水鱼、甲鱼、团鱼等，隶属于爬行纲、龟鳖目、鳖科、鳖属，其主要有北鳖、黄河鳖、花鳖、湖南鳖、日本鳖以及乌鳖等种类，其中尤以乌鳖最为具有营养和药物的价值，并在我国水产养殖产业中占有重要的地位。

但是近几十年来，由于乌鳖养殖泛滥及各个养殖场相互引种，导致乌鳖种质退化严重，生长缓慢、抗病能力及健康程度下降，最终下降了乌鳖的种群资源。因此开展乌鳖的种质保护和良种选育工作势在必行。

发明内容

本发明的目的是为了解决上述现有技术的不足而提供一种适于清溪乌鳖群体分析的微卫星序列及筛选方法，从而为不同养殖群体间的遗传结构以及种质资源数据库提供相关基础数据。

为了实现上述目的，本发明所设计的适于清溪乌鳖群体分析的微卫星序列，包括3个清溪乌鳖的微卫星位点，其核苷酸序列依次为：SEQ ID No.1～SEQ ID No.3。

其中扩增上述3个微卫星位点的引物序列选自如下引物对：

序列为SEQ ID NO:1的微卫星位点设计的引物对PS-1，其序列为：

PS-1F:CGATCACCCTCACTGCCTTT，

PS-1R:TGGCTAAGCTGTGGCATGAA；

序列为SEQ ID NO:2的微卫星位点设计的引物对PS-2，其序列为：

PS-2F:GCAAAGCTATTCGTGGGCTG，

PS-2R:GTGTCATCCATGTCTCCCCG；

序列为SEQ ID NO:3的微卫星位点设计的引物对PS-3，其序列为：

PS-3F:GTTGTGGGTCTCCTCTTCGG，

PS-3R:ATTCGCCTCCCTGGAGTACT。

上述开发的3个SSR位点的等位基因数目大于5个，群体分析结果表明具有较高的遗传多样性，是用于清溪乌鳖群体分析或个体选育的理想工具。

其中微卫星(SSR)分子标记，是指以1-6个核苷酸组成的核心序列为基本重复单位所构建的简单串联重复序列，最常见的两核苷酸重复是(AC/TG)n和(AG/TC)n。这类序列广泛存在于真核生物基因组的不同座位上，其重复次数在同一物种不同个体的遗传型间呈现出高度多态性。研究表明，这种重复序列数量间的差异，可能与DNA复制过程中的“链滑”现象相关。微卫星侧翼序列为相对保守的单拷贝序列，这为开发特异性引物，进而通过PCR技术分析检测重复序列在不同物种或同一物种不同个体间的多态性提供了有利途径。微卫星分子标记具有以下特点：在真核生物基因组中分布广泛、数量多、多态性丰富、共显性、孟德尔式遗传、选择中性等。作为一种优良分子标记，目前微卫星标记已在遗传图谱的构建、群体遗传变异分析和物种进化、基因定位、品种鉴定、遗传辅助育种等方面得到广泛应用。

一种适于清溪乌鳖群体分析的微卫星序列的应用，所述PS-3引物对可作为乌鳖的特异性分子标记，用于区别日本鳖和姚江鳖。

一种适于清溪乌鳖群体分析的微卫星序列的筛选方法，具体包括以下步骤：

步骤A、样品采集以及DNA提取

选取健康中华鳖的后腿肌肉，采用酚-氯仿法提取基因组DNA，并用1％琼脂糖凝胶电泳检测DNA的完整性，最终用无菌水稀释并在-20℃分装储存备用；

步骤B、SSR序列获得与引物设计

对上述中华鳖进行高通量转录组测序，并进行微卫星序列搜索，然后针对每一个微卫星位点利用引物设计软件来设计SSR引物；其中采用低成本高效率的转录组测序来批量开发乌鳖的微卫星分子标记，研究中华鳖不同养殖群体间的遗传多样性。高度多态性的微卫星位点将提供一个研究遗传多样性分析的强大工具，为中华鳖不同养殖群体间的遗传结构和亲缘进化关系、乌鳖的种质资源数据库提供相关基础数据。

步骤C、微卫星引物的筛选与优化

对上述获得的SSR引物进行预扩增及多态性引物筛选，其中筛选条件是微卫星序列长度最短为15bp，产物大小介于150bp到350bp之间，预扩增模板DNA来自于健康中华鳖样品的基因组DNA，然后进行PCR扩增，并通过温度梯度来确定引物的最佳退火温度，接着在8％非变性聚丙烯酰胺凝胶电泳后进行EB染色(溴化乙锭染色法)，凝胶成像系统拍摄电泳图后读带；

步骤D、多态性微卫星引物在中华鳖群体中的遗传多样性检测

根据上述实验获得的多态性标记引物，对乌鳖群体通过PCR扩增进行种群遗传结构分析和多样性检测，最后根据电泳图获取每只中华鳖的基因型数据，利用遗传多样性软件来统计各个微卫星标记基因座上所标记的特征，从而筛选出适于清溪乌鳖群体分析的微卫星序列。

在步骤B中微卫星搜索的标准是6次以上双碱基重复序列，5次以上3碱基重复序列或4次以上四碱基重复序列。

所述PCR反应体系为20微升，包括10μL的2×ES Taq酶，10μmol/L的上下游引物以及100ng的模板DNA；PCR扩增的步骤为先在94℃预变性5min，接着进行35个循环变性，其中每个循环变性由94℃变性30s、50℃～60℃复性30s和72℃延伸30s组成，最后在72℃延伸10min。

上述筛选方法中是主要的特点是采用高通量测序，从而可在短时间内获得大量的SSR(微卫星)和SNP(单核苷酸多态性)标记位点。新一代高通量测序最大特点在于单次运行产出序列数据量大，可实现同时对几百万条DNA分子进行序列的测定，同时还具有自动化程度高和成本低等优势。将高通量测序用于分子标记的筛选，将大大推动水产动物遗传育种的进展。这些分子遗传标记将为种质资源保护、遗传多样性评价、系统进化分析以及比较基因组学等研究提供有力的分析工具，在构建高密度遗传连锁图谱、关联分析、群体遗传结构及系统发育分析、品种鉴定等方面表现出良好的应用前景。

本发明得到的适于清溪乌鳖群体分析的微卫星序列，其提供了3个清溪乌鳖的微卫星位点及扩增3个微卫星位点的引物序列，可应用于乌鳖的群体分析，也为乌鳖的分子标记育种、种质资源保护等提供了一定的理论依据。同时将高通量测序用于分子标记的开发，将大大推动水产动物遗传育种的进展。这些分子遗传标记将为种质资源保护、遗传多样性评价、系统进化分析以及比较基因组学等研究提供有力的分析工具，在构建高密度遗传连锁图谱、关联分析、群体遗传结构及系统发育分析、品种鉴定等方面表现出良好的应用前景。

附图说明

图1是适于清溪乌鳖群体分析的微卫星序列中引物1在群体中扩增的电泳图谱；

图2是适于清溪乌鳖群体分析的微卫星序列中引物2在群体中扩增的电泳图谱；

图3是适于清溪乌鳖群体分析的微卫星序列中引物3在群体中扩增的电泳图谱。

图中：1-15是清溪乌鳖；16-30是日本鳖；31-45是姚江鳖；M是20bp DNA laddermarker。

具体实施方式

下面结合实施例对本发明进一步说明。

实施例：

本实施例提供的适于清溪乌鳖群体分析的微卫星序列，包括3个清溪乌鳖的微卫星位点，其核苷酸序列依次为：SEQ ID No.1～SEQ ID No.3，同时提供了扩增上述3个微卫星位点的引物序列。

本实施例提供的适于清溪乌鳖群体分析的微卫星序列的筛选方法，具体包括以下步骤：

步骤A、样品采集以及DNA提取

养殖群体多样性分析的材料取自于该场的清溪乌鳖养殖群体，养殖群体随机取样30只，以上材料均于无菌水冲洗干净后，活体运回实验室。

选取健康黄河鳖后腿肌肉0.1g，采用酚-氯仿法提取基因组DNA，并用1％琼脂糖凝胶电泳检测DNA的完整性，紫外分光光度计测定浓度和纯度，最终用无菌水稀释至约100ng/μL，-20℃分装储存备用。

步骤B、SSR序列获得与引物设计

采用高通量转录组测序，随后进行微卫星序列搜索，微卫星搜索的标准是：6次以上双碱基重复序列，5次以上3碱基重复序列或4次以上四碱基重复序列。然后针对每一个位点利用Primer5引物设计软件设计SSR引物。用Prime5.0软件设计引物，按照引物设计原则共设计出117对SSR引物可用于实验，设计的引物由上海生工合成。

步骤C、微卫星引物的筛选与优化

从上述四碱基重复的所有引物中，选取了117对引物进行预扩增及多态性引物筛选，筛选条件如下：微卫星序列长度最短为15bp；产物大小介于150bp到350bp之间，预扩增模板DNA来自于8只黄河鳖个体基因组DNA，PCR反应体系为20微升，包括10μL的2×ES Taq酶，10μmol/L的上下游引物以及100ng的模板DNA；然后进行PCR扩增，扩增程序为先在94℃预变性5min，接着进行35个循环变性，其中每个循环变性由94℃变性30s、50℃～60℃复性30s和72℃延伸30s组成，最后在72℃延伸10min，通过温度梯度来确定引物的最佳退火温度，接着在8％非变性聚丙烯酰胺凝胶电泳后进行EB染色，凝胶成像系统拍摄电泳图后读带。以扩增效率高、条带清晰、多态性丰富、重复性好为原则进行引物筛选。

步骤D、多态性微卫星引物在中华鳖群体中的遗传多样性检测

将上述实验获得的多态性标记引物，从中筛选稳定性较好的引物。对清溪乌鳖群体，通过PCR扩增进行种群遗传结构分析和多样性检测。其中扩增的体系、程序和退火温度参照预扩增的过程，聚丙烯酰胺凝胶电泳、EB染色后进行拍照，如图1-图3所示，根据电泳图获取每只中华鳖的基因型数据。利用PopGen32软件统计各个微卫星标记基因座上所标记的特征，从而筛选出适于清溪乌鳖群体分析的微卫星序列。利用PopGen32软件统计各个微卫星标记基因座的等位基因频率(P)、等位基因数(Na)、有效等位基因数(Ne)、观测杂合度(Ho)、期望杂合度(He)、哈德温伯格平衡PHWE。通过多样化检测，本发明共筛选出3个清溪乌鳖的微卫星位点，其中扩增上述3个微卫星位点的引物序列信息如表1所示。

表1：微卫星位点的3对引物序列信息

3个多态性位点在乌鳖的90个个体中共获得20个等位基因，多态位点的等位基因数为5-8个，平均等位基因数为6.7个，平均有效等位基因数4.5个，说明这3个引物的遗传信息丰富。PIC值分别为0.6518、0.7292、0.8170，全部为高度多态位点(PIC＞0.5)，PIC平均值为0.7426。观测杂合度、期望杂合度分别为0.2000～0.7778、0.7026～0.8464，杂合度都较高。各多态位点经哈迪-温伯格平衡检测，各位点的P值分别为0.0276、0.3001、0.0000，其中位点3显著偏离Hardy-Weinberg平衡(P＜0.05)。上述开发的3个多态性位点的等位基因数目、杂合度、PIC均较高，具有较高的遗传多样性，具有较好的开发价值。

表2：引物1群体等位基因频率分布

表3：引物2群体等位基因频率分布

表4：引物3群体等位基因频率分布

根据3个群体的等位基因频率差异分析，其中引物136bp处，乌鳖群体出现的频率0.3333大于日本群体的0.1667，而姚江群体并没有扩增。引物2在157bp处在3个群体的等位基因频率分别为0.2000、0.0667、0.0667。引物3在187处在3个群体的等位基因频率分别为0.3667、0.1000、0.1000；在199bp、203bp处乌鳖群体的等位基因频率分别为0.3667、0.1000，在日本、姚江水系鳖群体中没有扩增。因此所述PS-3引物对可作为乌鳖的特异性分子标记，用于区别日本鳖和姚江鳖。引物在群体的等位基因频率分布见表2、3、4所示。

<110> 浙江万里学院

<120> 适于清溪乌鳖群体分析的微卫星序列及筛选方法

<130> 1

<160> 3

<170> PatentIn version 3.3

<210> 1

<211> 152

<212> DNA

<213> 清溪乌鳖

<400> 1

ttggctaagc tgtggcatga acggctccca gagctgtcac cggggggacg gcggcaggca 60

ggcaggcagg cagcctcgcg gccaagcgcc ccatgccctg gtatatttat acccctggga 120

tcagcctgca aaaggcagtg agggtgatcg aa 152

<210> 2

<211> 151

<212> DNA

<213> 清溪乌鳖

<400> 2

tgcaaagcta ttcgtgggct gtattattga tgcattgtgg taccattctg cagggtgact 60

gtgactatgt tgcttcatct agatggatgt tataaggttc atcttctcct aaccctaacc 120

ctaacccttc ggggagacat ggatgacaca a 151

<210> 3

<211> 179

<212> DNA

<213> 清溪乌鳖

<400> 3

tgttgtgggt ctcctcttcg ggccggccgc ttgttggggc gactctgcag cagcagcagc 60

agcagcagca gcacggacgg gctgggcgat gtccgccgtt tgggagctgc tggttctgag 120

cttctctctg ctgctggtgg tctggggcca ggggagtaag tactccaggg aggcgaata 179

Claims (5)

1.一种适于清溪乌鳖群体分析的微卫星序列，其特征是包括3个清溪乌鳖的微卫星位点，其核苷酸序列依次为：SEQIDNo.1~SEQIDNo.3。

2.根据权利要求1所述的适于清溪乌鳖群体分析的微卫星序列，其特征是扩增上述3个微卫星位点的引物对分别为如下引物对序列：

PS-1F:CGATCACCCTCACTGCCTTT，

PS-1R:TGGCTAAGCTGTGGCATGAA；

PS-2F:GCAAAGCTATTCGTGGGCTG，

PS-2R:GTGTCATCCATGTCTCCCCG；

PS-3F:GTTGTGGGTCTCCTCTTCGG，

PS-3R:ATTCGCCTCCCTGGAGTACT。

3.一种适于清溪乌鳖群体分析的微卫星序列的应用，其特征是以PS-3引物对作为乌鳖的特异性分子标记，用于将清溪乌鳖群区别开日本鳖和姚江鳖，

其PS-3引物对的结构为：

PS-3F:GTTGTGGGTCTCCTCTTCGG，

PS-3R:ATTCGCCTCCCTGGAGTACT。

4.一种适于清溪乌鳖群体分析的微卫星序列的筛选方法，其特征是包括以下步骤：

步骤A、样品采集以及DNA提取

选取健康中华鳖的后腿肌肉，采用酚-氯仿法提取基因组DNA，并用1%琼脂糖凝胶电泳检测DNA的完整性，最终用无菌水稀释并在-20℃分装储存备用；

步骤B、SSR序列获得与引物设计

对上述中华鳖进行高通量转录组测序，并进行微卫星序列搜索，然后针对每一个微卫星位点利用引物设计软件来设计微卫星引物；

步骤C、微卫星引物的筛选与优化

对上述获得的微卫星引物进行预扩增及多态性引物筛选，其中筛选条件是微卫星序列长度最短为15bp，产物大小介于150bp到350bp之间，预扩增模板DNA来自于健康中华鳖样品的基因组DNA，然后进行PCR扩增，并通过温度梯度来确定引物的最佳退火温度，接着在8%非变性聚丙烯酰胺凝胶电泳后进行EB染色，凝胶成像系统拍摄电泳图后读带；

步骤D、多态性微卫星引物在中华鳖群体中的遗传多样性检测

根据上述实验获得的多态性标记引物，对乌鳖群体通过PCR扩增进行种群遗传结构分析和多样性检测，最后根据电泳图获取每只中华鳖的基因型数据，利用遗传多样性软件来统计各个微卫星标记基因座上所标记的特征，从而筛选出适于清溪乌鳖群体分析的微卫星序列；

所述筛选出的适于清溪乌鳖群体分析的微卫星序列依次为：SEQ ID No.1 ~ SEQ IDNo.3。

5.根据权利要求4所述的一种适于清溪乌鳖群体分析的微卫星序列的筛选方法，其特征在于：在步骤B中微卫星搜索的标准是6次以上双碱基重复序列，5次以上3碱基重复序列或4次以上四碱基重复序列。