CN106978504A - 一种菠菜ssr标记的制备方法及应用 - Google Patents
一种菠菜ssr标记的制备方法及应用 Download PDFInfo
- Publication number
- CN106978504A CN106978504A CN201710305159.8A CN201710305159A CN106978504A CN 106978504 A CN106978504 A CN 106978504A CN 201710305159 A CN201710305159 A CN 201710305159A CN 106978504 A CN106978504 A CN 106978504A
- Authority
- CN
- China
- Prior art keywords
- spinach
- ssr
- preparation
- primer
- ssr marker
- Prior art date
- Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
- Granted
Links
- 235000009337 Spinacia oleracea Nutrition 0.000 title claims abstract description 77
- 239000003550 marker Substances 0.000 title claims abstract description 38
- 238000002360 preparation method Methods 0.000 title claims abstract description 22
- 241000219315 Spinacia Species 0.000 title claims abstract 21
- 239000000463 material Substances 0.000 claims abstract description 47
- 230000002068 genetic effect Effects 0.000 claims abstract description 9
- 108090000623 proteins and genes Proteins 0.000 claims abstract description 9
- 238000011160 research Methods 0.000 claims abstract description 9
- 238000005516 engineering process Methods 0.000 claims abstract description 8
- 230000000877 morphologic effect Effects 0.000 claims abstract description 8
- 238000009395 breeding Methods 0.000 claims abstract description 3
- 238000012163 sequencing technique Methods 0.000 claims abstract description 3
- 108020004414 DNA Proteins 0.000 claims description 48
- 239000002773 nucleotide Substances 0.000 claims description 46
- 125000003729 nucleotide group Chemical group 0.000 claims description 46
- 238000013461 design Methods 0.000 claims description 9
- 238000006467 substitution reaction Methods 0.000 claims description 3
- 238000011144 upstream manufacturing Methods 0.000 claims description 3
- 240000007594 Oryza sativa Species 0.000 claims description 2
- 235000007164 Oryza sativa Nutrition 0.000 claims description 2
- 210000000349 chromosome Anatomy 0.000 claims description 2
- 235000009566 rice Nutrition 0.000 claims description 2
- 238000004458 analytical method Methods 0.000 abstract description 7
- 239000000284 extract Substances 0.000 abstract description 2
- 239000003147 molecular marker Substances 0.000 abstract 1
- 244000300264 Spinacia oleracea Species 0.000 description 57
- 239000000203 mixture Substances 0.000 description 21
- 230000000692 anti-sense effect Effects 0.000 description 20
- 108091092878 Microsatellite Proteins 0.000 description 11
- 238000000034 method Methods 0.000 description 8
- HEDRZPFGACZZDS-UHFFFAOYSA-N Chloroform Chemical compound ClC(Cl)Cl HEDRZPFGACZZDS-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 4
- 241000196324 Embryophyta Species 0.000 description 4
- 230000003321 amplification Effects 0.000 description 4
- 238000002474 experimental method Methods 0.000 description 4
- 239000000499 gel Substances 0.000 description 4
- PHTQWCKDNZKARW-UHFFFAOYSA-N isoamylol Chemical compound CC(C)CCO PHTQWCKDNZKARW-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 4
- 238000003199 nucleic acid amplification method Methods 0.000 description 4
- 239000006228 supernatant Substances 0.000 description 4
- 230000015572 biosynthetic process Effects 0.000 description 3
- 238000005119 centrifugation Methods 0.000 description 3
- 238000001962 electrophoresis Methods 0.000 description 3
- 238000003786 synthesis reaction Methods 0.000 description 3
- LFQSCWFLJHTTHZ-UHFFFAOYSA-N Ethanol Chemical compound CCO LFQSCWFLJHTTHZ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- XEEYBQQBJWHFJM-UHFFFAOYSA-N Iron Chemical compound [Fe] XEEYBQQBJWHFJM-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- KFZMGEQAYNKOFK-UHFFFAOYSA-N Isopropanol Chemical compound CC(C)O KFZMGEQAYNKOFK-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- TWRXJAOTZQYOKJ-UHFFFAOYSA-L Magnesium chloride Chemical compound [Mg+2].[Cl-].[Cl-] TWRXJAOTZQYOKJ-UHFFFAOYSA-L 0.000 description 2
- FAPWRFPIFSIZLT-UHFFFAOYSA-M Sodium chloride Chemical compound [Na+].[Cl-] FAPWRFPIFSIZLT-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 2
- 238000000137 annealing Methods 0.000 description 2
- 239000000872 buffer Substances 0.000 description 2
- 238000011161 development Methods 0.000 description 2
- 239000000539 dimer Substances 0.000 description 2
- 230000007613 environmental effect Effects 0.000 description 2
- 238000011156 evaluation Methods 0.000 description 2
- 238000012214 genetic breeding Methods 0.000 description 2
- 238000004519 manufacturing process Methods 0.000 description 2
- 238000004321 preservation Methods 0.000 description 2
- 239000000047 product Substances 0.000 description 2
- 239000005418 vegetable material Substances 0.000 description 2
- OYPRJOBELJOOCE-UHFFFAOYSA-N Calcium Chemical compound [Ca] OYPRJOBELJOOCE-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- LZZYPRNAOMGNLH-UHFFFAOYSA-M Cetrimonium bromide Chemical compound [Br-].CCCCCCCCCCCCCCCC[N+](C)(C)C LZZYPRNAOMGNLH-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 1
- 238000007400 DNA extraction Methods 0.000 description 1
- KCXVZYZYPLLWCC-UHFFFAOYSA-N EDTA Chemical compound OC(=O)CN(CC(O)=O)CCN(CC(O)=O)CC(O)=O KCXVZYZYPLLWCC-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 240000008415 Lactuca sativa Species 0.000 description 1
- 206010058467 Lung neoplasm malignant Diseases 0.000 description 1
- 108091028043 Nucleic acid sequence Proteins 0.000 description 1
- 108091081062 Repeated sequence (DNA) Proteins 0.000 description 1
- 102000006382 Ribonucleases Human genes 0.000 description 1
- 108010083644 Ribonucleases Proteins 0.000 description 1
- 108010006785 Taq Polymerase Proteins 0.000 description 1
- 208000002495 Uterine Neoplasms Diseases 0.000 description 1
- 238000000246 agarose gel electrophoresis Methods 0.000 description 1
- 230000009418 agronomic effect Effects 0.000 description 1
- 150000001413 amino acids Chemical class 0.000 description 1
- 230000009286 beneficial effect Effects 0.000 description 1
- 239000007853 buffer solution Substances 0.000 description 1
- 229910052791 calcium Inorganic materials 0.000 description 1
- 239000011575 calcium Substances 0.000 description 1
- 229920002678 cellulose Polymers 0.000 description 1
- 239000001913 cellulose Substances 0.000 description 1
- 238000006243 chemical reaction Methods 0.000 description 1
- 230000004087 circulation Effects 0.000 description 1
- 239000012141 concentrate Substances 0.000 description 1
- 108091036078 conserved sequence Proteins 0.000 description 1
- 238000010411 cooking Methods 0.000 description 1
- 230000001186 cumulative effect Effects 0.000 description 1
- 230000007812 deficiency Effects 0.000 description 1
- 230000007850 degeneration Effects 0.000 description 1
- 238000004925 denaturation Methods 0.000 description 1
- 230000036425 denaturation Effects 0.000 description 1
- 230000000694 effects Effects 0.000 description 1
- 239000011536 extraction buffer Substances 0.000 description 1
- 235000013305 food Nutrition 0.000 description 1
- 235000021384 green leafy vegetables Nutrition 0.000 description 1
- 238000000227 grinding Methods 0.000 description 1
- 238000003384 imaging method Methods 0.000 description 1
- 238000011835 investigation Methods 0.000 description 1
- 229910052742 iron Inorganic materials 0.000 description 1
- 238000002372 labelling Methods 0.000 description 1
- 201000005202 lung cancer Diseases 0.000 description 1
- 208000020816 lung neoplasm Diseases 0.000 description 1
- 229910001629 magnesium chloride Inorganic materials 0.000 description 1
- 239000011159 matrix material Substances 0.000 description 1
- 238000012986 modification Methods 0.000 description 1
- 230000004048 modification Effects 0.000 description 1
- 238000009336 multiple cropping Methods 0.000 description 1
- 230000007935 neutral effect Effects 0.000 description 1
- 235000008935 nutritious Nutrition 0.000 description 1
- 238000001556 precipitation Methods 0.000 description 1
- 230000002265 prevention Effects 0.000 description 1
- 238000012545 processing Methods 0.000 description 1
- 238000004153 renaturation Methods 0.000 description 1
- 230000003252 repetitive effect Effects 0.000 description 1
- 235000012045 salad Nutrition 0.000 description 1
- 238000012772 sequence design Methods 0.000 description 1
- 239000011780 sodium chloride Substances 0.000 description 1
- 235000014347 soups Nutrition 0.000 description 1
- 241000894007 species Species 0.000 description 1
- 238000012916 structural analysis Methods 0.000 description 1
- 238000012549 training Methods 0.000 description 1
- 206010046766 uterine cancer Diseases 0.000 description 1
- 239000011782 vitamin Substances 0.000 description 1
- 229940088594 vitamin Drugs 0.000 description 1
- 229930003231 vitamin Natural products 0.000 description 1
- 235000013343 vitamin Nutrition 0.000 description 1
- 150000003722 vitamin derivatives Chemical class 0.000 description 1
- DGVVWUTYPXICAM-UHFFFAOYSA-N β‐Mercaptoethanol Chemical compound OCCS DGVVWUTYPXICAM-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
Classifications
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
- C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
- C12Q1/68—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving nucleic acids
- C12Q1/6876—Nucleic acid products used in the analysis of nucleic acids, e.g. primers or probes
- C12Q1/6888—Nucleic acid products used in the analysis of nucleic acids, e.g. primers or probes for detection or identification of organisms
- C12Q1/6895—Nucleic acid products used in the analysis of nucleic acids, e.g. primers or probes for detection or identification of organisms for plants, fungi or algae
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
- C12Q2600/00—Oligonucleotides characterized by their use
- C12Q2600/156—Polymorphic or mutational markers
Landscapes
- Chemical & Material Sciences (AREA)
- Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
- Analytical Chemistry (AREA)
- Engineering & Computer Science (AREA)
- Organic Chemistry (AREA)
- Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
- Health & Medical Sciences (AREA)
- Biotechnology (AREA)
- Zoology (AREA)
- Wood Science & Technology (AREA)
- Immunology (AREA)
- Mycology (AREA)
- Microbiology (AREA)
- Molecular Biology (AREA)
- Botany (AREA)
- Biophysics (AREA)
- Physics & Mathematics (AREA)
- Biochemistry (AREA)
- Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
- General Engineering & Computer Science (AREA)
- General Health & Medical Sciences (AREA)
- Genetics & Genomics (AREA)
- Measuring Or Testing Involving Enzymes Or Micro-Organisms (AREA)
Abstract
本发明公开了一种菠菜SSR标记的制备方法，包括以下步骤：获取菠菜基因组或转录组测序数据；利用SSR检索程序进行SSR位点搜索；采用引物设计软件设计含有SSR位点的引物序列；提取菠菜材料的总DNA；利用形态特征差异明显的菠菜材料的DNA筛选出差异SSR标记。本发明还公开了上述菠菜SSR标记的应用，其应用步骤包括：用差异SSR标记扩增目标菠菜材料和F2群体；计算每对引物的多态性信息含量；对目标菠菜材料进行遗传多样性聚类及群体结构分析。本发明开发了大批量的SSR引物，为利用SSR分子标记进行菠菜种质资源多样性、连锁图谱构建、亲缘关系研究及分子辅助选育技术奠定了基础。
Description
技术领域
本发明涉及生物技术领域，具体涉及一种菠菜SSR标记的制备方法及应用。
背景技术
菠菜(Spinacia oleracea L.)是重要的叶菜类经济作物之一，生长周期短，复种指数高，在我国南北方普遍种植。我国是最大的菠菜生产和消费国家，年产量1200多万吨，约占世界总产量的90％。菠菜即可生食(拌沙拉)，也可熟食(炒、拌、做汤)，还可加工出口。菠菜营养丰富，富含纤维素、维生素以及铁、钙等，其含有的胡萝卜素和多种维生素、氨基酸，对预防肺癌和子宫癌有益处。
菠菜起源于波斯地区(今伊朗及周边)，于公元647年传入中国，已在世界上广泛栽培，包含2个野生种和1个栽培种，具有十分丰富的种质资源。目前菠菜种质资源的研究主要集中于对植物学性状的描述和品质性状测定上，虽然表型和品质性状的调查及测定快捷简便，可以对植物材料做出快速且较直观的比较和分类，但易受环境因素和植物生长发育时期的影响，而利用分子标记研究菠菜种质资源遗传，则不受样品形态和环境因素的影响，并且分子标记试验所需样品用量少，标记数目多，重复性高，结果可靠，能检测整个基因组及提供中立、客观的遗传多样性评价。目前对于菠菜的遗传多样性研究主要局限于TRAP等通用的分子标记技术，虽然已经开发出部分SSR标记，但标记的数量小，应用局限，不利于后期的研究。
简单重复序列(Simple sequence repeat，SSR)，又叫微卫星(microsatellite)，主要是以1-6核苷酸为核心序列的简单串联重复序列，其长度大多在100-300bp。微卫星包括重复基本基序所构成的核心序列与其两侧的侧翼序列。SSR标记利用简单序列重复的侧翼保守序列设计引物，经过PCR扩增，根据条带的大小来反映DNA序列的多态性。与其它分子标记相比，SSR标记具有多态性高、共显性遗传、重复性好、特异性强等特点，然而传统SSR标记的开发费时费力、开发成本高，阻碍了该技术在分子遗传育种等领域的应用。
发明内容
本发明针对目前菠菜分子生物学研究基础及分子遗传育种技术薄弱的不足，开发菠菜SSR标记的引物序列，并将其应用于菠菜种质资源遗传多样性评价、遗传连锁图谱构建及QTL定位的研究。本发明的具体技术方案如下：
本发明一方面提供了一种菠菜SSR标记的制备方法，包括以下步骤：
步骤1、获取菠菜基因组或转录组测序数据；
步骤2、利用SSR检索程序进行SSR位点搜索；
步骤3、采用引物设计软件设计含有上述SSR位点的引物序列；
步骤4、提取菠菜材料的总DNA；
步骤5、利用形态特征差异明显的菠菜材料的DNA筛选出差异SSR标记。
优选地，在上述步骤1中，获取菠菜转录组数据的27376条Unigene序列。
优选地，在上述步骤2中，利用MicroSAtellite(MISA)程序进行SSR位点搜索，搜索条件为：二核苷酸、三核苷酸、四核苷酸、五核苷酸、六核苷酸和七核苷酸最少重复次数分别为10、6、5、5、5和5次。
优选地，在上述步骤3中，采用Primer 3.0软件对含有SSR位点的Unigene序列批量设计引物。
更优选地，设计上述引物的主要参数为：(1)退火温度在55～65℃之间，上、下游引物的Tm相差≤2℃；(2)PCR产物大小在100～300bp；(3)引物长度在18～24bp之间；(4)GC含量在40％～60％之间。
优选地，在上述步骤5中，差异SSR标记为筛选出的在形态特征差异明显的12个菠菜材料的DNA中存在多态性的标记。
优选地，上述差异SSR标记至少包括如表2所示的20对具有多态性的SSR标记。
优选地，上述菠菜材料至少包括自然群体、F2群体、回交群体、重组自交系、双单倍体群体、近等基因系、残留异质系、QTL等基因系、导入系、单片段代换系和染色体片段代换系中的一种或几种。
更优选地，上述植物材料为菠菜自然群体。
本发明在另一方面提供了根据上述制备方法得到的菠菜SSR标记在菠菜种质资源多样性、连锁图谱构建、亲缘关系研究及分子辅助选育技术中的应用。
根据上述制备方法得到的菠菜SSR标记的应用，包括以下步骤：
步骤1、用上述差异SSR标记扩增目标菠菜材料和F2群体；
步骤2、计算每对引物的多态性信息含量；
步骤3、对目标菠菜材料进行遗传多样性聚类及群体结构分析。
本发明的有益效果在于，共开发菠菜转录组SSR位点7410个，设计SSR特异引物5932对，随机合成60对SSR引物，其中20对能成功地在84份菠菜种质资源中扩增出多态性，20对引物共获得64个多态性位点，最多一对引物检测到了5个多态位点，平均每对引物能检测到3.1个多态性位点。20对SSR引物在84份材料中检测到的多态性信息含量(PIC值)范围为0.137-0.668，平均PIC值为0.41；基因多样性范围为0.144-0.720，平均0.475；期望杂合度为0.012-0.988，平均值0.413。84份材料的相似系数范围是0.64-0.98，被这些引物分成不同的组别，且基本与其形态特征相吻合。此外群体结构分析表明在Q值＝0.612时，可以将84份菠菜材料分为2个组，分别为Q1和Q2。
以下将结合附图对本发明作进一步说明，以充分说明本发明的目的、技术特征和技术效果。
附图说明
图1为本发明较优实施例中的SSR标记对菠菜材料的扩增电泳图；
图2为本发明较优实施例中的SSR标记分析的84份菠菜材料的聚类图；
图3为本发明较优实施例中的SSR标记分析的84份菠菜材料的群体结构图。
具体实施方式
在描述本发明之前，应当理解本发明不限于所述的具体方法和实验条件，因为这类方法和条件可以变动。还应当理解本文所用的术语其目的仅在于描述具体实施方案，并且不意图是限制性的，本发明的范围将仅由所附的权利要求书限制。
以84份菠菜种质资源为例进行说明。本发明提供的菠菜SSR标记的制备方法以及应用，具体按照以下步骤完成：
(1)、从Spinachbase(http://www.spinachbase.org)获取菠菜基因组或转录组测序数据；
(2)、利用MicroSAtellite(MISA)程序进行SSR位点搜索；
(3)、用Primer 3.0软件批量设计含有SSR位点的引物序列；
(4)、获取菠菜材料植株嫩绿叶片，提取总DNA；
(5)、用步骤(3)所设计合成的SSR标记的引物序列扩增步骤(4)中如表1所示的形态特征差异明显的12份菠菜材料；
(6)、获得在步骤(5)中12份菠菜材料中有差异的EST-SSR标记，其序列如序列表2所示；并用所获差异SSR标记扩增所有菠菜材料；
表1示出了本发明较优实施例中所用的84份菠菜植物材料
(7)、计算每对引物的多态性信息含量；
(8)、对所有菠菜材料进行遗传多样性聚类及群体结构分析。
以下通过实施例对本发明作进一步描述。
实施例1：
1、供试材料(如表1所示)：选择形态特征差异的菠菜材料12份(编号分别为1、2、3、4、6、16、24、69、77、88、98和106，剩余菠菜材料72份，其中3份为野生型种质，种植于实验大棚中。
2、SSR标记的制备及引物设计：使用MicroSAtellite(MISA)程序进行SSR位点搜索，搜索标准为：二核苷酸、三核苷酸、四核苷酸、五核苷酸、六核苷酸和七核苷酸最少重复次数分别为10、6、5、5、5和5次。结果表明：通过对菠菜转录组的27376条Unigene序列(序列总长约42968kb)进行搜索，发现其中5454条Unigene序列中含有7410个SSR位点，其中1351条Unigene序列中含有两个或两个以上SSR位点。总体上，SSR发生频率为19.9％，平均每5.8kb出现1个SSR。SSR的类型丰富，二核苷酸至七核苷酸重复类型均存在。其中二核苷酸和四核苷酸重复出现频率占优势，分别占总SSR的40.3％和41.3％；六核苷酸和七核苷酸重复类型数量较少，分别占总数的0.8％和5.3％。
用Primer 3.0引物批量设计程序对含有SSR位点的Unigene序列设计引物，并且SSR位点侧翼序列长度≥50bp。引物设计的主要参数为：(1)、退火温度(Tm)在55～65℃之间，上、下游引物的Tm相差≤2℃；(2)、PCR产物大小在100～300bp；(3)、引物长度在18～24bp之间；(4)、GC含量在40％～60％之间；尽量避免引物二级结构如发卡结构、二聚体、错配、引物二聚体的出现。对批量设计的SSRs引物对在Unigene库中进行SSR引物的Blast验证，共设计了5932对SSR位点特异引物。为了验证其引物的有效性，随机挑选合成了60对SSR引物。
3、菠菜总DNA提取方法：田间取所述供试材料的嫩绿叶片，提取其总DNA，具体方法步骤如下：
(1)取菠菜的幼嫩叶片50-100mg于2.0ml离心管中，加入750μL新鲜提取缓冲液于植物DNA磨样机中充分研磨，65℃条件下水浴30min，12000rpm离心10min，上清液转移至1.5ml离心管；所述提取缓冲液为2％CTAB，100MmTris-HCl(pH8.0)，20mM EDTA，1.4M NaCl，1％PVP和2％β-巯基乙醇。
(2)加入等体积(750μL)的氯仿：异戊醇为24：1的混合液，上下剧烈颠倒100次，静置2min；12000rpm离心10min，将上清液转移至新的1.5ml离心管中。
(3)加入等体积(750μL)的氯仿：异戊醇为24：1的混合液，上下剧烈颠倒100次，静置2min；12000rpm离心10min，将上清液转移至新的2.0ml离心管中。
(4)加入0.1倍体积3M NaAc，轻轻充分混匀，静置1min；加等体积的异丙醇后翻转50次，于-20℃冰箱保存10min，12000r/min离心5min。
(5)倒掉上清液，用1000μL 75％的酒精清洗，同时震荡离心，再次倒掉酒精，自然干燥。
(6)加入适量含有RNase的ddH2O(50μL)溶解沉淀，37℃水浴30min。最后测定DNA浓度，调至300-500ng/μL置于-20℃备用。
4、利用开发的引物进行分析：具体步骤如下：
4.1、将所有的引物对所选取的差异明显的菠菜材料进行预筛选：
SSR的PCR反应体系为：体系总体积为15μL，模板DNA约为20ng，前引物与后引物分别为0.2μM，2.5mM MgCl2，0.4mM dNTPs，1×Taq buffer和1U Taq DNA Taq聚合酶。PCR反应在96孔PCR仪(ETC-811Dongsheng ThermalCycler)上进行。反应程序为：94℃预变性5min；94℃变性0.5min，55℃复性1min，72℃延伸1min，35个循环；72℃延伸5min后4℃保存。扩增产物经琼脂糖凝胶电泳，凝胶浓度1-2％，凝胶大小140×120×2mm，电泳缓冲液为1×TAE，恒压100v，电泳0.5h左右。电泳结束后，凝胶用凝胶成像系统拍照保存(Tanon2500gelimage System)。
4.2、按照步骤4所示用差异SSR标记对剩余的72份菠菜材料进行标记分析。
4.3、数据整理及分析：
在相同迁移率位置上，条带有记为“1”，无则记为“0”构成1、0数据矩阵，建立Excel表格的数据库。应用PowerMarker 3.25软件计算基因多样性，杂合性和多态性信息含量(PIC，polymorphism information content)等参数值。利用NTSYS-PC2.10软件，采用非加权平均法(UPGMA)对材料进行聚类分析并绘制系统树图(Rohlf，2000)。利用STUCTURE2.3.4软件分析菠菜群体结构。
4.4、引物扩增情况：
随机开发合成的60对SSR引物，其中32对能够在12份菠菜材料中扩增出目的条带，占总引物的53.3％，并且其中20引物在12份菠菜材料中具有多态性(表2)，占总引物的33.3％。利用这20对引物对所有的84份菠菜材料进行标记分析，20对SSR引物共获得64个多态性位点，最多一对引物检测到了5个多态位点。平均每对引物能检测到3.1个多态性位点(见图1)。
表2示出了本发明较优实施例中筛选出的20对具有多态性的SSR标记
其中标记物SSR7由核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示的上游引物和核苷酸序列如SEQ ID NO.2所示的下游引物组成；
标记物SSR13由核苷酸序列如SEQ ID NO.3所示的上游引物和核苷酸序列如SEQID NO.4所示的下游引物组成；
标记物SSR17由核苷酸序列如SEQ ID NO.5所示的上游引物和核苷酸序列如SEQID NO.6所示的下游引物组成；
标记物SSR19由核苷酸序列如SEQ ID NO.7所示的上游引物和核苷酸序列如SEQID NO.8所示的下游引物组成；
标记物SSR20由核苷酸序列如SEQ ID NO.9所示的上游引物和核苷酸序列如SEQID NO.10所示的下游引物组成；
标记物SSR21由核苷酸序列如SEQ ID NO.11所示的上游引物和核苷酸序列如SEQID NO.12所示的下游引物组成；
标记物SSR22由核苷酸序列如SEQ ID NO.13所示的上游引物和核苷酸序列如SEQID NO.14所示的下游引物组成；
标记物SSR23由核苷酸序列如SEQ ID NO.15所示的上游引物和核苷酸序列如SEQID NO.16所示的下游引物组成；
标记物SSR28由核苷酸序列如SEQ ID NO.17所示的上游引物和核苷酸序列如SEQID NO.18所示的下游引物组成；
标记物SSR30由核苷酸序列如SEQ ID NO.19所示的上游引物和核苷酸序列如SEQID NO.20所示的下游引物组成；
标记物SSR36由核苷酸序列如SEQ ID NO.21所示的上游引物和核苷酸序列如SEQID NO.22所示的下游引物组成；
标记物SSR38由核苷酸序列如SEQ ID NO.23所示的上游引物和核苷酸序列如SEQID NO.24所示的下游引物组成；
标记物SSR39由核苷酸序列如SEQ ID NO.25所示的上游引物和核苷酸序列如SEQID NO.26所示的下游引物组成；
标记物SSR40由核苷酸序列如SEQ ID NO.27所示的上游引物和核苷酸序列如SEQID NO.28所示的下游引物组成；
标记物SSR42由核苷酸序列如SEQ ID NO.29所示的上游引物和核苷酸序列如SEQID NO.30所示的下游引物组成；
标记物SSR44由核苷酸序列如SEQ ID NO.31所示的上游引物和核苷酸序列如SEQID NO.32所示的下游引物组成；
标记物SSR45由核苷酸序列如SEQ ID NO.33所示的上游引物和核苷酸序列如SEQID NO.34所示的下游引物组成；
标记物SSR53由核苷酸序列如SEQ ID NO.35所示的上游引物和核苷酸序列如SEQID NO.36所示的下游引物组成；
标记物SSR55由核苷酸序列如SEQ ID NO.37所示的上游引物和核苷酸序列如SEQID NO.38所示的下游引物组成；
标记物SSR58由核苷酸序列如SEQ ID NO.39所示的上游引物和核苷酸序列如SEQID NO.40所示的下游引物组成。
4.5、SSR引物的特征：
20对SSR引物在84份材料中检测到的PIC值范围为0.137-0.668，平均PIC值为0.41；基因多样性范围为0.144-0.720，平均0.475；期望杂合度为0.012-0.988，平均值0.413(见表3)。
表3示出了本发明中筛选出的20对SSR标记遗传多样性
4.6、聚类及群体结构分析：
84份材料的相似系数范围是0.64-0.98(见图2)，从图2中可以看出，在相似系数为0.67，84份菠菜材料被分为2个亚组，分别为组A和组B。组A中有29份菠菜材料，包含2份野生型材料，13份来源于中国不同地区的材料；组B有55份材料，又可细分为4个亚组。此外群体结构分析表明在Q值＝0.612时，可以将84份菠菜材料分为2个组，分别为Q1和Q2。84份材料基本能被这些引物分成不同的组别，且基本与其形态特征相吻合。
以上详细描述了本发明的较佳具体实施例。应当理解，本领域的普通技术无需创造性劳动就可以根据本发明的构思做出诸多修改和变化。因此，凡本技术领域中技术人员依本发明的构思在现有技术的基础上通过逻辑分析、推理或者有限的实验可以得到的技术方案，皆应在由权利要求书所确定的保护范围内。
SEQUENCE LISTING
<110> 上海师范大学
<120> 一种菠菜SSR标记的制备方法及应用
<130> 2017
<160> 40
<170> PatentIn version 3.5
<210> 1
<211> 19
<212> DNA
<213> 人工合成
<400> 1
tcggtgggtt ccaaacacc 19
<210> 2
<211> 19
<212> DNA
<213> 人工合成
<400> 2
gctggtccgg tggaatacc 19
<210> 3
<211> 18
<212> DNA
<213> 人工合成
<400> 3
acgagccccc gttgaaat 18
<210> 4
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工合成
<400> 4
ttccaacact ctccattgca 20
<210> 5
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工合成
<400> 5
tggaaacacc tcctcttcca 20
<210> 6
<211> 18
<212> DNA
<213> 人工合成
<400> 6
tgagcaggac tgagggca 18
<210> 7
<211> 19
<212> DNA
<213> 人工合成
<400> 7
tgccacgtaa gcatcagca 19
<210> 8
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工合成
<400> 8
agaagaggtg aagtggagga 20
<210> 9
<211> 19
<212> DNA
<213> 人工合成
<400> 9
gctgacatgt cctcccaga 19
<210> 10
<211> 19
<212> DNA
<213> 人工合成
<400> 10
cggaaccgga actgtcagt 19
<210> 11
<211> 18
<212> DNA
<213> 人工合成
<400> 11
gaagcgttaa cagcggcg 18
<210> 12
<211> 18
<212> DNA
<213> 人工合成
<400> 12
atgccccacg ctgaaaca 18
<210> 13
<211> 18
<212> DNA
<213> 人工合成
<400> 13
ggaaggtggt gcgatgga 18
<210> 14
<211> 18
<212> DNA
<213> 人工合成
<400> 14
tggtgctggt ggtgctac 18
<210> 15
<211> 18
<212> DNA
<213> 人工合成
<400> 15
ggctggtttt gccggaat 18
<210> 16
<211> 18
<212> DNA
<213> 人工合成
<400> 16
ctccagcagc agcaccat 18
<210> 17
<211> 18
<212> DNA
<213> 人工合成
<400> 17
cgcggatttg gagggagg 18
<210> 18
<211> 19
<212> DNA
<213> 人工合成
<400> 18
ggcgtgaacc tgaacctga 19
<210> 19
<211> 19
<212> DNA
<213> 人工合成
<400> 19
gcagatactg ggagcgacc 19
<210> 20
<211> 18
<212> DNA
<213> 人工合成
<400> 20
ggacgccgac actttgtg 18
<210> 21
<211> 18
<212> DNA
<213> 人工合成
<400> 21
gaaacacgag gtggccga 18
<210> 22
<211> 18
<212> DNA
<213> 人工合成
<400> 22
aacgtaccgc ccatgcaa 18
<210> 23
<211> 18
<212> DNA
<213> 人工合成
<400> 23
ccggaccctc catctcca 18
<210> 24
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工合成
<400> 24
agggagaatg gaaactggcg 20
<210> 25
<211> 19
<212> DNA
<213> 人工合成
<400> 25
tcctcttcac acactccct 19
<210> 26
<211> 18
<212> DNA
<213> 人工合成
<400> 26
gtgaatttgg cacgggcg 18
<210> 27
<211> 18
<212> DNA
<213> 人工合成
<400> 27
tctttgcccc ctctcccc 18
<210> 28
<211> 18
<212> DNA
<213> 人工合成
<400> 28
tcagtgtcgc cgccaaat 18
<210> 29
<211> 18
<212> DNA
<213> 人工合成
<400> 29
cgcgcacaag caagactc 18
<210> 30
<211> 18
<212> DNA
<213> 人工合成
<400> 30
gcttgcagga gctcggaa 18
<210> 31
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工合成
<400> 31
ccttctcttg ggtggagtgt 20
<210> 32
<211> 19
<212> DNA
<213> 人工合成
<400> 32
aggagacgaa acgggaaca 19
<210> 33
<211> 18
<212> DNA
<213> 人工合成
<400> 33
tgcacagatc caggtcca 18
<210> 34
<211> 19
<212> DNA
<213> 人工合成
<400> 34
agcctctgcc ttgtttgga 19
<210> 35
<211> 18
<212> DNA
<213> 人工合成
<400> 35
gaacaacgcc ggcaatcc 18
<210> 36
<211> 19
<212> DNA
<213> 人工合成
<400> 36
tggaggtctg gttgggttg 19
<210> 37
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工合成
<400> 37
cggatccctc ccaagaaagt 20
<210> 38
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工合成
<400> 38
tgttgatgga agctggttgt 20
<210> 39
<211> 18
<212> DNA
<213> 人工合成
<400> 39
caaccgcccc tcactctg 18
<210> 40
<211> 18
<212> DNA
<213> 人工合成
<400> 40
gcatcagctg ccattgcc 18
Claims (10)
1.一种菠菜SSR标记的制备方法，其特征在于，所述制备方法包括以下步骤：
步骤1、获取菠菜基因组或转录组测序数据；
步骤2、利用SSR检索程序进行SSR位点搜索；
步骤3、采用引物设计软件设计含有所述SSR位点的引物序列；
步骤4、提取菠菜材料的总DNA；
步骤5、利用形态特征差异明显的菠菜材料的DNA筛选出差异SSR标记。
2.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于，在所述步骤1中，获取菠菜转录组数据的27376条Unigene序列。
3.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于，在所述步骤2中，利用MicroSAtellite程序进行SSR位点搜索，搜索条件为：二核苷酸、三核苷酸、四核苷酸、五核苷酸、六核苷酸和七核苷酸最少重复次数分别为10、6、5、5、5和5次。
4.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于，在所述步骤3中，采用Primer3.0软件对含有所述SSR位点的Unigene序列批量设计引物。
5.根据权利要求4所述的制备方法，其特征在于，设计所述引物的主要参数为：(1)退火温度在55～65℃之间，上、下游引物的Tm相差≤2℃；(2)PCR产物大小在100～300bp；(3)引物长度在18～24bp之间；(4)GC含量在40％～60％之间。
6.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于，在所述步骤5中，所述差异SSR标记为筛选出的在形态特征差异明显的12个菠菜材料的DNA中存在多态性的标记。
7.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于，所述差异SSR标记至少包括如表2所示的20对具有多态性的SSR标记。
8.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于，所述菠菜材料至少包括自然群体、F2群体、回交群体、重组自交系、双单倍体群体、近等基因系、残留异质系、QTL等基因系、导入系、单片段代换系和染色体片段代换系中的一种或几种。
9.根据权利要求1-8中任一项所述的制备方法得到的菠菜SSR标记在菠菜种质资源多样性、连锁图谱构建、亲缘关系研究及分子辅助选育技术中的应用。
10.根据权利要求1-8中任一项所述的制备方法得到的菠菜SSR标记的应用，其特征在于，所述应用包括以下步骤：
步骤1、用所述差异SSR标记扩增目标菠菜材料和F2群体；
步骤2、计算每对引物的多态性信息含量；
步骤3、对目标菠菜材料进行遗传多样性聚类及群体结构分析。
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| CN201710305159.8A CN106978504B (zh) | 2017-05-03 | 2017-05-03 | 一种菠菜ssr标记的制备方法及应用 |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| CN201710305159.8A CN106978504B (zh) | 2017-05-03 | 2017-05-03 | 一种菠菜ssr标记的制备方法及应用 |
Publications (2)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| CN106978504A true CN106978504A (zh) | 2017-07-25 |
| CN106978504B CN106978504B (zh) | 2020-12-01 |
Family
ID=59341580
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| CN201710305159.8A Expired - Fee Related CN106978504B (zh) | 2017-05-03 | 2017-05-03 | 一种菠菜ssr标记的制备方法及应用 |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| CN (1) | CN106978504B (zh) |
Cited By (4)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CN108165654A (zh) * | 2018-02-27 | 2018-06-15 | 河南师范大学 | 与菠菜雄性紧密连锁的ssr标记sp_ssr04及其应用 |
| CN108165655A (zh) * | 2018-02-27 | 2018-06-15 | 河南师范大学 | 一种与菠菜雄性紧密连锁的ssr标记sp_ssr19及其在菠菜性别鉴定中的应用 |
| CN110172525A (zh) * | 2019-06-26 | 2019-08-27 | 广西壮族自治区林业科学研究院 | 林木差异表达基因ssr引物组及多态性ssr标记开发方法 |
| CN115198029A (zh) * | 2022-06-07 | 2022-10-18 | 上海市农业科学院 | 小菠菜指纹图谱、构建方法及其应用 |
Citations (2)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CN101821409A (zh) * | 2007-08-29 | 2010-09-01 | 孟山都技术公司 | 用于优选性状育种的方法和组合物 |
| WO2012075125A1 (en) * | 2010-11-30 | 2012-06-07 | Syngenta Participations Ag | Methods for increasing genetic gain in a breeding population |
-
2017
- 2017-05-03 CN CN201710305159.8A patent/CN106978504B/zh not_active Expired - Fee Related
Patent Citations (2)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CN101821409A (zh) * | 2007-08-29 | 2010-09-01 | 孟山都技术公司 | 用于优选性状育种的方法和组合物 |
| WO2012075125A1 (en) * | 2010-11-30 | 2012-06-07 | Syngenta Participations Ag | Methods for increasing genetic gain in a breeding population |
Non-Patent Citations (4)
| Title |
|---|
| XUE-DONG YANG ET AL.: ""SpinachDB: A Well-Characterized Genomic Database for Gene Family Classification and SNP Information of Spinach"", 《PLOS ONE》 * |
| 林力浩等: "紫色蔬菜成色分子机制研究进展", 《上海师范大学学报(自然科学版)》 * |
| 潜宗伟等: "菠菜转录组SSR位点分析及其分子标记的开发", 《农业生物技术学报》 * |
| 阎君 等: ""基于转录组测序的菠菜标记开发"", 《园艺学报》 * |
Cited By (5)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CN108165654A (zh) * | 2018-02-27 | 2018-06-15 | 河南师范大学 | 与菠菜雄性紧密连锁的ssr标记sp_ssr04及其应用 |
| CN108165655A (zh) * | 2018-02-27 | 2018-06-15 | 河南师范大学 | 一种与菠菜雄性紧密连锁的ssr标记sp_ssr19及其在菠菜性别鉴定中的应用 |
| CN110172525A (zh) * | 2019-06-26 | 2019-08-27 | 广西壮族自治区林业科学研究院 | 林木差异表达基因ssr引物组及多态性ssr标记开发方法 |
| CN115198029A (zh) * | 2022-06-07 | 2022-10-18 | 上海市农业科学院 | 小菠菜指纹图谱、构建方法及其应用 |
| CN115198029B (zh) * | 2022-06-07 | 2023-08-08 | 上海市农业科学院 | 小菠菜指纹图谱、构建方法及其应用 |
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| CN106978504B (zh) | 2020-12-01 |
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| CN106978504A (zh) | 一种菠菜ssr标记的制备方法及应用 | |
| CN105349671B (zh) | 适于清溪乌鳖群体分析的微卫星序列及筛选方法 | |
| CN105802960B (zh) | 分子标记及其应用 | |
| CN113430300A (zh) | 一种果桑品种‘粤椹123’的ssr分子标记及其核心引物组、试剂盒和应用 | |
| CN105219880A (zh) | 文心兰属est-ssr标记引物及其应用 | |
| CN105803094B (zh) | 一种鉴定或辅助鉴定马铃薯熟性的scar标记及其应用 | |
| CN116287399A (zh) | 带叶兜兰和同色兜兰est-ssr分子标记及其使用方法与应用 | |
| CN105925680A (zh) | 一种四倍体马铃薯高通量测序开发标记的方法及其应用 | |
| CN112159858A (zh) | 与花椰菜紫色基因紧密连锁的分子标记及应用 | |
| CN103215289B (zh) | 导致西瓜两性花发育的基因a序列及其获得方法 | |
| CN105838809B (zh) | 一种与橡胶树乳管数量相关的snp标记及其应用 | |
| CN105861498B (zh) | 一种与橡胶树干胶产量相关的snp标记及其应用 | |
| CN105112557B (zh) | 快速鉴定兰属植物的方法 | |
| CN104651497B (zh) | 与白菜黄色种皮基因Brsc‑ye连锁的SSR分子标记引物及应用 | |
| CN108239675B (zh) | 一种用于鉴定甜瓜单性花的分子标记物TJcM02及其应用 | |
| CN108531636B (zh) | 一种用于鉴定甜瓜单性花的分子标记物TJcM01及其应用 | |
| CN112725521B (zh) | 一种鼓槌石斛ssr分子标记引物组合物及其应用 | |
| CN113025724B (zh) | 一种鉴定小圆胸小蠹昆虫的双重pcr引物、方法及试剂盒 | |
| CN112680542B (zh) | 一种兰科植物通用型ssr分子标记引物组合物及其应用 | |
| CN104789650B (zh) | 芸薹属栽培种细胞质的分子检测方法 | |
| CN110106270B (zh) | 一种与甜瓜黄色种皮共分离的分子标记及其应用 | |
| CN106048032A (zh) | 一种香蕉b基因组鉴定的scar分子标记及其鉴定方法 | |
| CN110066879A (zh) | 一种co i基因序列的dna条形码及其鉴定拟水龟属物种的方法 | |
| CN106244683B (zh) | 用于检测“琼丽”小型西瓜杂交种纯度的引物组合及其方法和应用 | |
| CN110484644A (zh) | 一种日本落叶松种质的指纹图谱构建方法及应用 |
Legal Events
| Date | Code | Title | Description |
|---|---|---|---|
| PB01 | Publication | ||
| PB01 | Publication | ||
| SE01 | Entry into force of request for substantive examination | ||
| SE01 | Entry into force of request for substantive examination | ||
| GR01 | Patent grant | ||
| GR01 | Patent grant | ||
| CF01 | Termination of patent right due to non-payment of annual fee | ||
| CF01 | Termination of patent right due to non-payment of annual fee |
Granted publication date: 20201201 |