CN116287399A - 带叶兜兰和同色兜兰est-ssr分子标记及其使用方法与应用 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了带叶兜兰和同色兜兰EST‑SSR分子标记及其使用方法与应用，其对应的引物组的核苷酸序列如SEQ ID NO:2～3、SEQ ID NO:5～6、SEQ ID NO:8～9、SEQ ID NO:11～12、SEQ ID NO:14～15和SEQ ID NO:16～65所示。本发明中的引物组可以广泛用于任意兜兰属植物分型鉴定，克服了现有技术中的引物通用性较差的缺陷，实现了兜兰属植物的批量化、快速化分型。
Description
技术领域
本发明涉及植物分子鉴定技术领域，特别涉及带叶兜兰和同色兜兰EST-SSR分子标记及其使用方法与应用。
背景技术
兜兰(Paphiopedilum spp.)为兰科(Orchidaceae)兜兰属植物，花形奇特，具有极高的观赏价值。兜兰拥有丰富的表型性状，属于奇花异草。随着全球经济的发展，兜兰越来越受到各国兰花爱好者的喜爱，拥有广阔的市场前景。
兜兰属拥有80多个原种，均被列入国家重点保护濒危植物名录，广泛分布于东南亚、华南地区、北印度和新几内亚等地区。不同兜兰物种间的根、茎、叶片相似度较高，种间的差异主要靠花的形貌来鉴定，因此，在非开花时期，很难仅凭根茎叶对其进行物种鉴定。这给兜兰的种质资源收集和保护工作带来很大的困难。而且，目前的兜兰产业发展存在诸多问题，如兰花种质资源破坏严重，保存保育技术不成熟；兰花相关基础研究薄弱，种质创新手段单一，主要表现在系统发育关系不明，进化路线不清楚，传粉生物学研究不足等。而现有的兜兰SSR标记引物都是用某单一物种的兜兰转录组RNA开发，在兜兰属不同物种间的通用性较差(不能在兜兰属不同物种中PCR扩增)，致使其在兜兰属物种的鉴定、分类、保护及野外回归等应用方面具有很大的局限性。
因此，开发一种能在兜兰属不同物种中通用的引物，对兜兰属植物进行种质资源鉴定，对兜兰属植物的收集、保护及野外回归具有重要作用。
发明内容
本发明旨在至少解决现有技术中存在的上述技术问题之一。为此，本发明提供了一种兜兰EST-SSR分子标记及其使用方法与应用，本发明中的兜兰属SSR引物以亲缘关系较远的带叶兜兰和同色兜兰转录组中能共同表达的同源序列为模板，检测两者同源序列中的SSR位点，以SSR两端的保守序列设计得到，该SSR分子标记引物在兜兰属种具有很强的通用性，能够有效用于识别和鉴别现有的兜兰属植物。
本发明的第一个方面，提供兜兰属EST-SSR分子标记引物组，所述引物组包括如SEQ ID NO:2～61所示核苷酸序列中的至少20个。
在本发明的一些实施方式中，所述引物组包括如SEQ ID NO:2～61所示核苷酸序列中的至少13个。
在本发明的一些实施方式中，所述引物组中各核苷酸序列两两配对组成引物对(上游引物和下游引物)，其具体对应关系如表1所示。
在本发明的一些实施方式中，所述引物组包括SSR1、SSR6、SSR8、SSR10、SSR11、SSR12、SSR13、SSR16、SSR20、SSR23、SSR25、SSR29和SSR30的引物。
在本发明的一些实施方式中，所述引物组还包括：与SEQ ID NO:2～61所示核苷酸序列中任一条的序列同一性大于等于95％，且与原序列具有相同功能性的核酸分子。
在本发明的一些实施方式中，所述引物组中的各引物可由于一个或多个核苷酸的插入、缺失、替换或本领域技术人员已知的修饰手段进行修饰而发生变化，从而提高所述引物的特异性、用于同属或同种其他植物的分子生物学研究、或获得其它期望的性能。
在本发明的一些实施方式中，所述引物组中的核苷酸的插入、缺失、替换、修饰均发生于功能区序列中。在本发明中，所述功能区序列为引物中的非M13序列部分。
在本发明的一些实施方式中，所述同一性为95％、96％、97％、98％或99％。
在本发明中，所述引物组是基于亲缘关系较远的带叶兜兰和同色兜兰转录组中能共同表达的同源序列为模板得到的。
在本发明中，为了解决分子标记在兜兰属中通用性和多态性差的问题，发明人在传统的“单一物种转录组序列设计法”的基础上做了进一步改进，采用“多物种转录组同源序列设计法”。选取已发表的亲缘关系较远的带叶兜兰(P.hirsutissimum)和同色兜兰(P.concolor)转录组的同源序列为模板，检测两者同源序列中的SSR位点，以SSR两端的保守序列设计引物。因为两种兜兰的亲缘关系较远，并且引物的筛选经过了两种兜兰同源序列的多态性比较，因此，具有很强的多态性和通用性，能在所有兜兰属物种中稳定扩增。
在本发明的一些实施方式中，所述引物组中的上下游引物中的至少一条上具有能够被识别的标记。
在本发明的一些实施方式中，所述引物组中的上游引物上具有能够被识别的标记。
在本发明的一些实施方式中，所述标记包括荧光基团、特异性核酸分子、核素和配体。
在本发明的一些实施方式中，所述标记为特异性核酸分子，具体为M13序列(5’-GTAAAACGACGGCCAGT-3’)。
在本发明的一些实施方式中，所述兜兰属包括但不限于：迎春兜兰、巨瓣兜兰、海伦兜兰、苍叶兜兰、白花兜兰、紫毛兜兰、硬叶兜兰、粉国王兜兰、彩云兜兰、咸哥兜兰、红旗兜兰、报春兜兰、亨利兜兰、长瓣兜兰、国王兜兰、紫毛兜兰、红旗兜兰、带叶兜兰、同色兜兰、文山兜兰、魔魁兜兰或其中任意两种兜兰的杂交种。
在本发明中，发明人还验证了上述引物组在未命名的兜兰属未知种中的有效性，发现其也能产生扩增判断并出现分型峰，从而可以说明上述引物组能够广泛应用于任意的兜兰属植物的分型中。
本发明的第二个方面，提供一种兜兰种属检测试剂，所述检测试剂中包括本发明第一个方面所述的兜兰属EST-SSR分子标记引物组和M13引物。
在本发明的一些实施方式中，所述M13引物的核苷酸序列如SEQ ID NO：1所示。
在本发明中，M13引物的加入主要用于对于特定序列的标记，从而更加便于识别。当然，本领域技术人员也可以采用其他常规标记手段对其进行标记或识别，包括但不限于M13引物。
本发明的第三个方面，提供本发明第一个方面所述的兜兰属EST-SSR分子标记引物组在制备兜兰属植物物种鉴定检测产品中的应用。
在本发明的一些实施方式中，所述检测产品包括检测试剂盒和检测芯片。
在本发明的一些实施方式中，所述兜兰属植物物种鉴定检测产品的使用方法为：
提取待测兜兰属植物的DNA，使用本发明第一个方面所述的兜兰属EST-SSR分子标记引物组进行PCR扩增，对扩增产物进行STR分型，根据分型结果判断兜兰品种。
在本发明的一些实施方式中，所述PCR扩增体系如表2所示。
在本发明的一些实施方式中，所述PCR扩增的反应程序如表3所示。
本发明的第四个方面，提供本发明第一个方面所述的兜兰属EST-SSR分子标记引物组在植物物种鉴定中的应用。
在本发明的一些实施方式中，所述植物为兜兰属植物。
在本发明的一些实施方式中，所述兜兰属植物包括但不限于：迎春兜兰、巨瓣兜兰、海伦兜兰、苍叶兜兰、百花兜兰、紫毛兜兰、硬叶兜兰、粉国王兜兰、彩云兜兰、咸哥兜兰、红旗兜兰、报春兜兰、亨利兜兰、长瓣兜兰、国王兜兰、紫毛兜兰、红旗兜兰、带叶兜兰、同色兜兰、越南美人、文山兜兰、魔魁兜兰或其中任意两种兜兰的杂交种。
本发明的有益效果是：
1.本发明首次开发得到了一种可以广泛用于任意兜兰属植物分型鉴定的引物组，从而有效克服了现有技术中的引物通用性较差的缺陷。
2.本发明中的兜兰属EST-SSR分子标记引物组识别、鉴定准确，能够基于分型峰有效区分不同的兜兰品种，实现了兜兰属植物的批量化、快速化分型。
附图说明
图1为SSR1～16下游引物对应于带叶兜兰和同色兜兰的原有SSR位置关系。
图2为SSR17～30下游引物对应于带叶兜兰和同色兜兰的原有SSR位置关系。
图3为SSR1引物扩增产物在大斑点兜兰、麻栗坡兜兰、白旗兜兰DNA中的特征峰图。
图4为SSR2引物扩增产物在大斑点兜兰、麻栗坡兜兰、白旗兜兰DNA中的特征峰图.
图5为SSR1在部分兜兰属测试物种/品种DNA中的特征峰。
图6为SSR6在部分兜兰属测试物种/品种DNA中的特征峰。
图7为兜兰属植物的系统进化树。
图8为兰科物种的系统发生树。
图9为SSR1在鸿运、绿翡翠、野生株DNA中的扩增条带。
图10为SSR6在鸿运、绿翡翠、野生株DNA中的扩增条带。
图11为SSR8在鸿运、绿翡翠、野生株DNA中的扩增条带。
图12为SSR10在鸿运、绿翡翠、野生株DNA中的扩增条带。
图13为SSR11在鸿运、绿翡翠、野生株DNA中的扩增条带。
图14为SSR12在鸿运、绿翡翠、野生株DNA中的扩增条带。
图15为SSR13在鸿运、绿翡翠、野生株DNA中的扩增条带。
图16为SSR16在鸿运、绿翡翠、野生株DNA中的扩增条带。
图17为SSR20在鸿运、绿翡翠、野生株DNA中的扩增条带。
图18为SSR23在鸿运、绿翡翠、野生株DNA中的扩增条带。
图19为SSR25在鸿运、绿翡翠、野生株DNA中的扩增条带。
图20为SSR29在鸿运、绿翡翠、野生株DNA中的扩增条带。
图21为SSR30在鸿运、绿翡翠、野生株DNA中的扩增条带。
具体实施方式
以下通过具体的实施例对本发明的内容作进一步详细的说明。实施例和对比例中所用的原料、试剂或装置如无特殊说明，均可从常规商业途径得到，或者可以通过现有技术方法得到。除非特别说明，试验或测试方法均为本领域的常规方法。
兜兰SSR引物设计
从NCBI上下载Li(Li,Dong-Mei,and Gen-Fa Zhu."High-Density GeneticLinkage Map Construction and QTLs Identification Associated with Four Leaf-Related Traits in Lady’s Slipper Orchids(Paphiopedilum concolor×Paphiopedilum hirsutissimum)."Horticulturae 2022,8(9):842.)发表的兜兰遗传图谱中带叶兜兰(Paphiopedilum hirsutissimum)和同色兜兰(P.concolor)的转录组数据。使用Trinity软件将转录组raw read拼接成Scaffold序列，使用Bioedit软件搜索同色兜兰与带叶兜兰均表达的转录组Scaffold，利用MicroSAtellite(MISA)(http://pgrc.ipk-gatersleben.de/misa/)软件对Scaffold文件中的所有SSR位点进行搜索，设置搜索条件为二碱基重复最少重复6次，三碱基、四碱基、五碱基和六碱基重复最少重复5次。两个SSR位点之间如果小于100bp则视为复合型SSR。SSR标记利用PRIMER 3软件进行引物设计，参数为：引物长度为18-25nt，退火温度为55-65℃，GC含量为40-60％，PCR产物的长度为100-300bp。
使用Bioedit鉴定上述步骤挖掘出的SSR标记在带叶兜兰和同色兜兰转录组中的多态性，筛选出具有显著多态性的30个SSR标记，在上游引物(left Primer)加入“M13”序列(5’-GTAAAACGACGGCCAGT-3’(SEQ ID NO：1))，得到的各引物信息如表1所示。
其中，SSR的显示形式为：(重复单元)重复数。例如(AGGTCG)5表示以AGGTCG为重复单元重复5次。
表1SSR引物序列信息
其中，下游引物均是对应于带叶兜兰和同色兜兰的原有SSR位置。两者的对应关系如图1～2所示。
兜兰SSR引物筛选及通用性测试
以大斑点兜兰(P.bellatulum)、麻栗坡兜兰(P.malipoense)、白旗兜兰(P.spicerianum)的植株上剪取嫩叶作为检测样品，提取DNA(使用植物基因组DNA提取试剂盒(天根))，提取操作步骤参考说明书。
以提取得到的DNA为模板，分别采用上述表1中的30对SSR引物为引物，进行PCR扩增。PCR扩增体系中，除上下游引物外，还加入5’端带有荧光标记(HEX、FAM)的M13引物(SEQID NO：1)。PCR扩增具体如表2所示。
表2“三引物”PCR扩增体系
| 组分 | 浓度 | 含量 | 终浓度/含量 |
| DNA模板 | 50ng/μL | 1μL | 50ng |
| 上游引物 | 0.25μM | 1μL | 0.0125μM |
| 下游引物 | 5μM | 1μL | 0.25μM |
| M13荧光引物 | 3μM | 1μL | 0.15μM |
| 2×Taq PCR StarMix | - | 10μL | - |
| ddH2O | - | 6μL | - |
| 合计 | - | 20μL | - |
反应程序采用Touchdown PCR反应程序(如表3所示)，扩增得到SSR扩增产物。
表3“三引物”PCR扩增程序
SSR扩增产物在避光冷冻条件下保存，并送由Thermo Fisher Scientific公司进行STR(Short Tandem Repeat)分型，分型数据通过GeneMarker(V2.4.0)输出分析结果。
结果如表4和图3、图4所示。
表4 30对SSR引物在兜兰属中的通用性检测结果
其中，○表示可以稳定扩增，能够产生明显的STR分型峰。
从上述结果表明，30对SSR引物在大斑点兜兰、麻栗坡兜兰、白旗兜兰中均能稳定扩增，STR分型结果均能产生明显的峰(图3和图4分别为SSR1和SSR2在大斑点兜兰、麻栗坡兜兰、白旗兜兰DNA中的特征峰)。
基于表4中初步筛选所得的扩增阳性结果以及得到的STR峰结果，选择30对SSR引物中选择多态性较高的13对SSR引物(分别为SSR1、SSR6、SSR8、SSR10、SSR11、SSR12、SSR13、SSR16、SSR20、SSR23、SSR25、SSR29、SSR30)，并分别测试其在其他兜兰属植物中的鉴定效果。
其中，用于测试的兜兰属植物包括：迎春兜兰、巨瓣兜兰、海伦兜兰、苍叶兜兰、白花兜兰、紫毛兜兰、硬叶兜兰、粉国王兜兰、彩云兜兰、咸哥兜兰、红旗兜兰、报春兜兰、亨利兜兰、长瓣兜兰、国王兜兰、长瓣×紫纹杂交种、小叶×亨利杂交种、亨利×长瓣杂交种、紫毛×红旗杂交种、带叶兜兰、同色兜兰1、同色兜兰2、文山兜兰、魔魁兜兰。
检测方法同上述实施例。
结果如表5和图5～6所示。
表5 13对SSR引物在兜兰属中的通用性检测结果
由上述结果可见，13对SSR引物均能在24个兜兰属物种/品种中稳定扩增，STR分型结果均能产生明显的峰(图5、图6分别为SSR1和SSR6在部分测试物种/品种DNA中的特征峰)。
进一步根据其STR分型结果，使用软件NTsys(v2.10)构建兜兰系统进化树(图7)，可见13对SSR能显著区分上述兜兰中/品种。其中杂交种能准确的居于两亲本之间，说明本发明实施例中的13对SSR引物能准确判断兜兰的亲缘关系。
兜兰SSR引物在兰科石斛兰属通用性
已发现并发表的兜兰属物种现有80多种，且在不断增加中。由于兜兰物种的稀有性，因此不可能在所有兜兰物种中验证其通用性。Sun(Sun Yin,Zou Peishan,JiangNannan,Fang Yifu&Liu Guofeng(2022)Comparative Analysis of the CompleteChloroplast Genomes of Nine Paphiopedilum Species.Frontiers in Genetics,12.)根据兰科66个物种叶绿体基因组构建的系统发生树。从系统发生树(图8)可知，兜兰属(Paphiopedilum)和石斛兰属(Dendrobium)分别属于杓兰亚科(Subfam.Cypripedioideae)和兰亚科(Subfam.Orchidoideae)树兰族(Epidendreae)。兜兰属和石斛兰属亲缘关系较远，因此，兜兰属SSR引物若能在石斛兰属植物中成功PCR扩增，则能间接证明该SSR引物能在兜兰属所有物种中扩增。
为证明本发明实施例中开发的SSR引物在兜兰属中具有稳定的通用性，采集石斛兰属春石斛(Dendrobium loddigesii)3个植株(品种：鸿运、绿翡翠、野生株)的DNA进行验证。
测试方法同上述实施例。
测试结果如表6和图7～19所示。
表6 13对SSR引物在石斛兰属属中的通用性检测结果
由上述结果可见，13对SSR引物均能在3个春石斛的品种中稳定扩增，STR分型结果均能产生明显的多态性峰(如图9-21所示，分别为SSR1、SSR6、SSR8、SSR10、SSR11、SSR12、SSR13、SSR16、SSR20、SSR23、SSR25、SSR29、SSR30在鸿运、绿翡翠、野生株DNA中的扩增条带)，说明上述实施例中开发筛选的13对SSR引物，能在兜兰属的临近物种中稳定扩增，且具有多态性，因此可间接证明13对SSR可在兜兰属的所有物种中通用。
上述实施例为本发明较佳的实施方式，但本发明的实施方式并不受上述实施例的限制，其他的任何未背离本发明的精神实质与原理下所作的改变、修饰、替代、组合、简化，均应为等效的置换方式，都包含在本发明的保护范围之内。
Claims (10)
1.兜兰属EST-SSR分子标记引物组，其特征在于，所述引物组包括如SEQ ID NO:2～61所示核苷酸序列中的至少13个。
2.根据权利要求1所述的兜兰属EST-SSR分子标记引物组，其特征在于，所述引物组还包括：与SEQ IDNO:2～61所示核苷酸序列中任一条的序列同一性大于等于95％，且与原序列具有相同功能性的核酸分子。
3.根据权利要求1或2所述的兜兰属EST-SSR分子标记引物组，其特征在于，所述引物组中的上下游引物中的至少一条上具有能够被识别的标记。
4.根据权利要求3所述的兜兰属EST-SSR分子标记引物组，其特征在于，所述标记包括荧光基团、特异性核酸分子、核素和配体。
5.根据权利要求1所述的兜兰属EST-SSR分子标记引物组，其特征在于，所述兜兰属包括：迎春兜兰、巨瓣兜兰、海伦兜兰、苍叶兜兰、白花兜兰、紫毛兜兰、硬叶兜兰、粉国王兜兰、彩云兜兰、咸哥兜兰、红旗兜兰、报春兜兰、亨利兜兰、长瓣兜兰、国王兜兰、紫毛兜兰、红旗兜兰、带叶兜兰、同色兜兰、文山兜兰、魔魁兜兰或其中任意两种兜兰的杂交种。
6.一种兜兰种属检测试剂，其特征在于，所述检测试剂中包括权利要求1～5任一项所述的兜兰属EST-SSR分子标记引物组和M13引物；
其中，所述M13引物的核苷酸序列如SEQ ID NO：1所示。
7.权利要求1～5任一项所述的兜兰属EST-SSR分子标记引物组在制备兜兰属植物物种鉴定检测产品中的应用。
8.根据权利要求7所述的应用，其特征在于，所述检测产品包括检测试剂盒和检测芯片。
9.权利要求1～5任一项所述的兜兰属EST-SSR分子标记引物组在植物物种鉴定中的应用。
10.根据权利要求9所述的应用，其特征在于，所述植物包括兜兰属和石斛兰属植物。
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Cited By (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CN118028509A (zh) * | 2023-11-29 | 2024-05-14 | 广州市林业和园林科学研究院 | 一种用于带叶兜兰物种鉴定的caps分子标记及其应用 |
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2023
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