CN110343778B - 山茶品种春江红霞的多态性标记引物及山茶品种鉴定方法 - Google Patents

山茶品种春江红霞的多态性标记引物及山茶品种鉴定方法 Download PDF

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Abstract

山茶品种‘春江红霞’的多态性标记引物及山茶品种鉴定方法，属于分子生物学技术领域。该多态性标记引物的上游引物的核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示，下游引物的核苷酸序列如SEQ ID NO.2所示。本发明以3份山茶种质的基因组DNA为模板，通过对山茶EST序列的分析，合成90对引物，并进行进一步筛选，得到一对特异性高的山茶‘春江红霞’的多态性标记引物。本发明以筛选得到的多态性特异标记引物对山茶新品种‘春江红霞’进行快速鉴别，区分山茶种质的差异性。该方法简单、快捷、准确，是一种优于表观特征鉴别的新的分子手段。

Description

山茶品种春江红霞的多态性标记引物及山茶品种鉴定方法
技术领域
本发明属于分子生物学技术领域，具体涉及山茶品种‘春江红霞’的多态性标记引物及山茶品种鉴定方法。
背景技术
山茶（Camellia japonica)是山茶科(Theaceae)山茶属中以观赏为主要栽培目的的种。灌木或小乔木，叶色浓绿，有光泽，花色多样，是我国十大传统名花之一，种质资源丰富，栽培历史悠久，园林应用十分广泛，具有极高的观赏价值、生态价值和经济价值。据记载，世界茶花品种已达3万余种，在长期栽培过程中，人工选择和自然杂交导致了山茶种内的性状变异以及众多新品种的出现。但很多品种间性状相似，遗传背景不明；尤其是生产中，同名异物，同物异名现象导致山茶众多品种混淆，不便于品种鉴定、推广、交流及新品种的培育。
全国范围内的山茶品种调查和分类方法主要基于分析形态学特征、过氧化物酶和酯酶同工酶技术等，这些方法尽管应用较为普遍，但很难对山茶品种进行快速、准确的鉴定。
SSR标记在山茶中的应用已逐步展开。张亚利等利用20对SSR引物对33份山茶属种质的遗传多样性进行了研究；胡兴华等进行了茶花品种SSR指纹图谱构建的初步研究；李琳琳等利用SSR标记技术进行了茶花品种的杂交F1代的真实性研究。然而基于转录组测序的SSR标记在山茶中的应用研究则未见报道。
目前，在山茶长期人工选择和自然杂交过程中，我们发现多个种质（见表1）在亲缘关系中存在混淆，从表型特征方面很难鉴别，给园林植物应用、推广以及新品种选育带来很多困难。因此，利用高效便捷的分子标记技术，区分茶花品种，理清遗传背景，提高育种效率显得尤为重要。
。
发明内容
针对现有技术存在的问题，本发明的目的在于设计提供山茶品种‘春江红霞’的多态性标记引物及山茶品种鉴定方法的技术方案。
所述的山茶品种‘春江红霞’的多态性标记引物，其特征在于多态性标记引物的上游引物的核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示，下游引物的核苷酸序列如SEQ ID NO.2所示。
所述的利用多态性标记引物进行山茶品种‘春江红霞’鉴定的方法，其特征在于包括以下步骤：
1）取山茶叶片提取基因组DNA，作为模板DNA；
2）将山茶品种‘春江红霞’的多态性标记引物对模板DNA进行PCR扩增；
3）利用Bioptic Qseq100软件对SSR条带进行判读，若获得多态性条带，则鉴定为山茶品种‘春江红霞’。
所述的方法，其特征在于所述的PCR扩增体系为：50-90ng模板DNA2μL，Mix12.5μL，10mmol·L-1引物2μL，蒸馏水9μL；PCR反应程序为：94℃预变性5min，94℃变性30s，55℃退火30s，72℃延伸30s，共35个循环，最后72℃延伸9min。
所述的山茶品种‘春江红霞’的多态性标记引物在鉴定山茶品种‘春江红霞’中的应用。
本发明以3份山茶种质的基因组DNA为模板，通过对山茶EST序列的分析，合成90对引物，并进行进一步筛选，得到一对特异性高的山茶‘春江红霞’的多态性标记引物。本发明以筛选得到的多态性特异标记引物对山茶新品种‘春江红霞’进行快速鉴别，区分山茶种质的差异性。该方法简单、快捷、准确，是一种优于表观特征鉴别的新的分子手段。
附图说明
图1 为3个山茶种质的UPGMA聚类图；
图2 为3个山茶种质的SSR条带；
图3为3个山茶种质的SSR峰图。
具体实施方式
下面结合具体实施案例对本发明进行进一步描述，但本发明的保护范围并不仅限于此。
（1）山茶品种基因组DNA提取
取待测山茶‘春江红霞’（C.japonicaRed Leaved Black Magic）种质幼嫩叶片0.01g，加液氮研磨，基因组DNA提取方法参照北京艾德莱生物科技公司试剂盒说明进行，通过1%的琼脂糖凝胶电泳和NanoDrop2000紫外分光光度计（Thermo Fisher公司）检测DNA浓度和纯度。DNA样品用于后续PCR扩增。DNA提取物于-20℃冰箱保存。
（2）引物设计
用MISA（Http://pgrc.jpk-gatersleben.de/misa/)对拼接组装得到的Unigenes进行SSR位点识别，搜索重复单元长度为1-6 bp，搜索标准为一、二、三、四、五、六核苷酸最少重复次数分别为10、6、5、5、5、5次，复合微卫星位点之间最大间隔碱基数为100 bp。
利用Primer 3.0软件进行SSR重复单元前后的序列进行引物设计，每个SSR位点设计出3条引物，引物序列长度18-27 bp，GC含量40%～60%，退火温度55-65 ℃，预期扩增产物长度100～280 bp，尽量避免出现二级结构和二聚体。引物设计完成后，随机挑选90对引物交擎科生物工程（杭州）有限公司合成。
（3）PCR扩增
PCR体系为：50-90 ng模板DNA2μL，Mix 12.5μL，引物（10mmol·L-1）2μL，蒸馏水9μL。PCR反应在Thermal Cycler Dice PCR仪（日本）上进行，程序为：94℃预变性5 min，94℃变性30 s，55℃退火30 s，72℃延伸30 s，共35个循环，最后在72℃延伸9 min。
（4）PCR反应分析
采用Bioptic Qsep100全自动核酸分析系统（Bioptic,Inc.,台湾地区）进行PCR产物检测，并利用该系统自带的Bioptic Qseq100软件对SSR条带进行判读和分析。利用Bioptic Qseq100的分析和判读结果，建立原始数据矩阵。利用NTSYS-pc 2.10e 软件计算遗传相似系数，并进行UPGMA进化树的构建。
分别将3个山茶种质与90对引物进行PCR，并进行数据分析，UPGMA聚类图见图1。在相似系数为0.53时，‘黑蛋石’与‘春江红霞’聚为一类。在90对引物中，发现仅有一对引物存在较高的特异性，该引物的上游引物的核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示，下游引物的核苷酸序列如SEQ ID NO.2所示（上游引物：5′- ATTGAAGCTCTCCGGAGTCA -3′，下游引物：5′-CCACCTTCACTCTCCTCCCT -3′）。在3个山茶品种中，只有‘春江红霞’中得到单一明亮的特异性条带（图2黑框）。而在此引物扩增判读下，发现‘春江红霞’具有与‘黑蛋石’在相近的时段中出现大小一致的峰值，289 bp。‘春江红霞’是经人工杂交选育出的最新红叶品种，根据SSR的亲缘关系及聚类分析结果显示，‘春江红霞’与‘黑蛋石’这2个种质间的亲缘关系较近，‘黑蛋石’是‘春江红霞’的父本。利用试验所得的特异性引物可以准确快速的鉴别‘春江红霞’。
综上，基于山茶叶片转录组开发的SSR标记具有较好的鉴别山茶新品种的能力；该标记多态性较高，重复性及可用性强，可应用于山茶的遗传多样性分析、分子鉴定、遗传图谱构建、基因定位及分子标记辅助育种等方面的研究。
序列表
<110> 中国林业科学研究院亚热带林业研究所
<120> 山茶品种‘春江红霞’的多态性标记引物及山茶品种鉴定方法
<160> 2
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 20
<212> DNA
<213> 引物(primer)
<400> 1
attgaagctc tccggagtca 20
<210> 2
<211> 20
<212> DNA
<213> 引物(primer)
<400> 2
ccaccttcac tctcctccct 20

Claims (3)

1. 山茶品种‘春江红霞’的多态性标记引物在山茶品种‘黑蛋石’、‘春江红霞’和‘黑魔法’中快速鉴定山茶品种‘春江红霞’中的应用，其特征在于多态性标记引物的上游引物的核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示，下游引物的核苷酸序列如SEQ ID NO.2所示。
2.利用多态性标记引物进行山茶品种‘春江红霞’鉴定的方法，其特征在于包括以下步骤：
1）取山茶叶片提取基因组DNA，作为模板DNA；
2）将山茶品种‘春江红霞’的多态性标记引物对模板DNA进行PCR扩增；
3）利用Bioptic Qseq100软件对SSR条带进行判读，若获得多态性条带，则鉴定为山茶品种‘春江红霞’；
所述多态性标记引物的上游引物的核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示，下游引物的核苷酸序列如SEQ ID NO.2所示。
3.如权利要求2所述的方法，其特征在于所述的PCR扩增体系为：50-90ng模板DNA2μL，Mix12.5μL，10mmol·L-1引物2μL，蒸馏水9μL；PCR反应程序为：94℃预变性5min，94℃变性30s，55℃退火30s，72℃延伸30s，共35个循环，最后72℃延伸9min。
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