CN111944917B - 一种基于转录组测序开发山茶属植物ssr引物的方法 - Google Patents
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Abstract
本发明提供一种基于转录组测序开发山茶属植物引物的方法：以茶树叶片为材料进行cDNA库的构建和illumina测序，经过滤和从头组装后获得转录组数据。使用MISA、SSR Hunter完成位点搜索，并对包含SSR位点的序列进行生物信息学分析。以此为据进行SSR分子标记引物的开发，利用开发的引物对部分山茶属植物材料进行遗传多样性分析。本发明成功设计38对引物，经多态性筛选最终获得16对多态性引物，利用这16对引物检测了部分山茶属植物资源的遗传相似性，验证了这些引物的可用性。本发明为山茶属植物SSR引物开发提供了新思路。
Description
技术领域
本发明属于分子生物学标记技术领域，具体涉及基于转录组序列开发的山茶属SSR标记引物对及其应用。
背景技术
茶树(Camellia sinensis)是山茶科山茶属植物，起源于中国西南地区。栽培历史悠久，关于茶树栽培的论述性文字记载可追溯至唐(杨逢春等，海南师范大学学报(自然科学版)，2006，19(3)：277-282.)。在人工选择和异花授粉的交叉作用下，山茶属植物形成了极为丰富的种质资源。分子生物学的发展为山茶属植物遗传变异的研究工作提供了更好的选择。90年代初期便有关于分子标记在山茶属植物中应用的相关报道，而SSR分子标记在山茶属植物领域开发和应用则仅有十几年的时间(胡慈杰，中国科学技术协会学会学术部，2014：5)。
转录组是一定条件下包括信使RNA、核糖体RNA、转运RNA及非编码RNA在内的所有转录物的集合。转录组能有效反馈植物基因的表达、调节等信息，反映基因组的表达与不同外界环境的关联性。任意生命体的任意部位或组织均可进行转录组测序。转录组测序技术兼具检测范围广、灵敏度高等优点，测序技术的进步为基于转录组SSR标记的开发提供了更加丰富的资源(王楚彪等，桉树科技，2018，35(04)：20-26.)。
SSR标记是分子标记的重要手段之一，是一种以1～6个核苷酸为基元多次串联后形成的核苷酸序列。由于同一物种不同基因型的SSR位点在重复基元的组成、重复频率存在较大的差异，在染色体上的分布也存在差异，等位基因的多样性也由此形成(敖日格乐，贾晓，葛台明.湖北民族学院学报(自然科学版)，2009，27(04)：462-467.)。SSR的分布涵盖了原核和真核生物基因组且可以鉴别纯合子和杂合子，因此SSR遗传标记被广泛应用于植物遗传变异的相关研究。
本发明通过对茶树转录组测序发掘到一批Unigene，从中搜索到大量位点涵盖一至六核苷酸元件，设计并合成引物38对，经多态性筛选最终获得16对多态性引物，利用这16对引物检测了部分山茶属植物资源的遗传相似性，验证了这些引物的可用性。
发明内容
针对现有技术的不足，发明提供一种基于转录组测序开发山茶属植物SSR引物的方法，包括：
S1：构建茶树转录组文库并测序，将测序结果进行滤和从头组装后获得转录组数据，即Unigene库；
S2：对步骤S1中的Unigene库进行SSR位点检测；
S3：根据SSR位点信息进行引物设计，并鉴定引物的多态性。
设计的引物共38对，引物序列如SEQ ID NO.1-76所示。
综上所述，本发明由于采用了上述方案，具有以下积极效果：
本发明利用转录组数据开发的SSR标记引物，信息更全面、通用性好、效率更高，可以挖掘到更多的位点。
本发明采用生物信息学途径进行山茶属植物SSR标记引物的开发，可大批量开发SSR标记引物，获得了一批扩增效率高且多态性好的SSR标记引物对，克服了传统方式开发标记步骤繁琐、工作量大、成本高的问题。
附图说明
图1.茶树转录组各类型SSR的比例
图2.茶树转录组重复次数分布
图3.茶树转录组中含有SSR的Unigene的GO分类
图4.茶树转录组含SSR的Unigene的KEGG代谢通路分类(A)和新陈代谢通路Unigene的通路分析(B)
图5.部分引物的PCR扩增结果
图6.引物TS21在样品中的扩增结果
图7.根据Nei’s遗传距离的山茶属植物资源UPGMA聚类图
具体实施方式
茶树转录组数据处理：本课题组以中国云南茶树“云南十里香”(T1)、中国江苏茶树“槎湾三号”(T2)、中国湖南茶树“汝城毛叶茶”(T3)和中国浙江茶树“安吉白茶”(T4)的幼嫩叶片为材料提取RNA。经由1.2％的琼脂糖凝胶电泳以及微量紫外检测仪Nano-Drop检测合格后，送至公司进行cDNA库的构建和测序(北京百迈客生物科技有限公司)。将测序结果图像转换为序列数据，并过滤数据去除重复和质量差的部分以获得干净序列(cleanreads)。
SSR位点搜索：茶树转录组中Unigene的SSR位点搜索由MISA、SSR Hunter共同完成。筛选的相关参数为：重复元件碱基数≤6，各元件的重复次数分别为单核苷酸≥10，二核苷酸≥6，其他核苷酸元件重复的次数≥5。
茶树转录组SSR信息处理与分析：SSR位点信息处理包括核苷酸重复元件数量、各类型核苷酸元件重复次数、SSR位点长度。将茶树转录组中含SSR的Unigene与nr蛋白数据库和KEGG数据库进行比对。
引物设计：使用Primer 3.0进行引物设计。引物设计的区域为SSR位点的侧翼序列，即位点上游和下游各150个碱基。SSR引物设计的相关参数如下：序列的长度区间为18～27bp，上下游Tm值不应差别过大，退火温度保持在50～60℃之间，PCR产物大小200bp左右；GC含量为50±10％，且无二级结构和二聚体。
引物筛选：使用植物基因组DNA提取试剂盒完成6个样品基因组DNA的提取，以此为模板进行PCR扩增，经琼脂糖凝胶电泳检测，能否有效扩增。能有效扩增的引物合成荧光修饰引物进行毛细管电泳检测是否具多态性。
山茶属华东山茶和滇山茶遗传多样性研究：使用植物基因组DNA提取试剂盒完成全部样品基因组DNA的提取，以此为模板与具多态性的荧光修饰引物进行PCR扩增。
毛细管电泳检测与分析：采用ABI 3730XL测序仪系统进行毛细管电泳检测，电泳结束后将上机结果的原始文件导入GENEMAPPER进行数据分析，按位点导出峰图。利用POPGENE32软件对样品的等位基因数、有效等位基因数、遗传距离、Nei’s遗传多样性指数和香农信息指数等遗传多样性指标进行统计分析。利用MAGA 7.0中的UPGMA方法，根据Nei’s遗传距离进行样品聚类作图。
试验结果
从供试材料中共获得146,342条Unigene。T1占比34.5％，其Unigene平均长度为591bp。T2占比21.9％，其Unigene平均长度为601bp。T3占比13.7％，其Unigene平均长度为530bp。T4占比29.9％，其Unigene平均长度为596bp。
使用MISA、SSR Hunter软件对茶树转录组数据进行位点搜索，在9,508条Unigene中查找到10,578个符合筛选参数的SSR位点，发生频率(含SSR的Unigene/总Unigene)为6.49％，出现频率(SSR个数/总Unigene数目)为7.23％。各SSR位点间的平均距离为2.85kb。
SSR位点信息统计结果显示，二核苷酸重复元件数量最多，占总SSR位点的43.1％(图1)。各类型核苷酸元件重复次数以5～9次为主(图2)。AG/CT和A/T核苷酸类型数量较多(均为3,584个)，总计占总SSR的比例为67.76％。SSR位点长度集中于12～30bp，有8,823个，占比83.4％。将茶树转录组中含SSR的Unigene与nr蛋白数据库和KEGG数据库进行比对，分别获得17,267条、1,866条注释信息。对注释信息进行综合统计分析，结果显示被注释的含SSR的Unigene主要与细胞代谢相关(图3，图4)。
引物设计：使用Primer 3.0进行引物批量设计，从中随机选取38对涵盖一至六核苷酸元件的引物用于后续筛选。
引物筛选：使用植物基因组DNA提取试剂盒完成6个样品基因组DNA的提取，以此为模板进行PCR扩增，经琼脂糖凝胶电泳检测24对引物能有效扩增(图5)。合成荧光修饰引物进行毛细管电泳检测后发现其中16对引物具多态性(图6)。
山茶属华东山茶和滇山茶所提取的基因组DNA完整度好，无明显拖尾，无降解现象。微量紫外检测仪Nano-Drop的检测结果显示，所提取茶树样品基因组DNA浓度较高，均大于50μg/μL。260/280的数值区间为1.7～2.0。PCR扩增条带符合预期大小。
POPGENE32软件分析结果显示：单个引物检测到的等位基因数在2～4个，平均为3.3125个。有效等位基因数为1.65～3.55个，平均为2.65个。香农信息指数在0.6874～1.3117之间，均值为1.039。Nei’s基因多样性指数均值为0.61。
利用UPGMA法进行聚类分析，得到山茶属华东山茶和滇山茶20份供试材料的遗传距离树状图(图7)。供试材料于遗传距离0.3处，被划分为三个群体，群体二只包括一份样品材料，而在遗传距离0.38处，群体二被归纳至原群体三。两个群体的山茶属植物材料来源于华东地区和云南地区。结果显示，华东群体样品个体间的遗传距离差异较大，根据供试材料来源信息推测该遗传差异可能是引种工作造成的。供试材料聚类分析结果与样品地理信息相符。
序列表
<110> 南京农业大学
<120> 一种基于转录组测序开发山茶属植物SSR引物的方法
<160> 76
<170> SIPOSequenceListing 1.0
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<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 64
atgcaaagaa cagccacctc 20
<210> 65
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 65
gtctttcagg tcggggaaga 20
<210> 66
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 66
atcagactcc gatgccaaca 20
<210> 67
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 67
gtggtggtga gggtgagatt 20
<210> 68
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 68
tccaccgaag ctcacatctt 20
<210> 69
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 69
taaattttgg gctgggttgc 20
<210> 70
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 70
atctaccacc tcctcctcca 20
<210> 71
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 71
taaccaccgc tgttcctgat 20
<210> 72
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 72
catccaggtt tgaagccacc 20
<210> 73
<211> 26
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 73
cttggaagtt gttattgaag tcctga 26
<210> 74
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 74
tttcgatgca gattcccgat c 21
<210> 75
<211> 22
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 75
atccgagttt gctcaaggtc tg 22
<210> 76
<211> 25
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 76
gtgatagtgt tgtgccagtt cagtg 25
Claims (4)
1.一种基于转录组序列开发的山茶属植物标记引物对，其特征在于所述引物对共38对，分别为：如SEQ ID NO.1-2所示、如SEQ ID NO.3-4所示、如SEQ ID NO.5-6所示、如SEQID NO.7-8所示、如SEQ ID NO.9-10所示、如SEQ ID NO.11-12所示、如SEQ ID NO.13-14所示、如SEQ ID NO.15-16所示、如SEQ ID NO.17-18所示、如SEQ ID NO.19-20所示、如SEQ IDNO.21-22所示、如SEQ ID NO.23-24所示、如SEQ ID NO.25-26所示、如SEQ ID NO.27-28所示、如SEQ ID NO.29-30所示、如SEQ ID NO.31-32所示、如SEQ ID NO.33-34所示、如SEQ IDNO.35-36所示、如SEQ ID NO.37-38所示、如SEQ ID NO.39-40所示、如SEQ ID NO.41-42所示、如SEQ ID NO.43-44所示、如SEQ ID NO.45-46所示、如SEQ ID NO.47-48所示、如SEQ IDNO.49-50所示、如SEQ ID NO.51-52所示、如SEQ ID NO.53-54所示、如SEQ ID NO.55-56所示、如SEQ ID NO.57-58所示、如SEQ ID NO.59-60所示、如SEQ ID NO.61-62所示、如SEQ IDNO.63-64所示、如SEQ ID NO.65-66所示、如SEQ ID NO.67-68所示、如SEQ ID NO.69-70所示、如SEQ ID NO.71-72所示、如SEQ ID NO.73-74所示、如SEQ ID NO.75-76所示。
2.根据权利要求1所述的基于转录组序列开发的山茶属植物标记引物对的筛选方法，其特征在于通过以下步骤得到：
(1)以茶树叶片为材料进行cDNA库的构建和illumina测序，经过滤和从头组装后获得转录组数据；
(2)使用MISA、SSR Hunter软件对茶树转录组数据进行单碱基重复SSR、双碱基重复SSR、三碱基重复SSR、四碱基重复SSR、五碱基重复SSR、六碱基重复和复合类型SSR位点搜索；
(3)使用Primer 3.0进行引物设计，引物设计的区域为SSR位点的侧翼序列；
(4)SSR引物的多态性筛选，使用植物基因组DNA提取试剂盒完成样品基因组DNA的提取，以此为模板进行PCR扩增，琼脂糖凝胶电泳检测能否有效扩增，毛细管电泳检测是否具多态性；所述SSR引物序列如SEQ ID NO.1-76所示。
3.根据权利要求2所述的基于转录组序列开发的山茶属植物标记引物对的筛选方法，其特征在于步骤(2)：筛选的相关参数为：重复元件碱基数≤6，各元件的重复次数分别为单核苷酸≥10，二核苷酸≥6，其他核苷酸元件重复的次数≥5。
4.根据权利要求2所述的基于转录组序列开发的山茶属植物标记引物对的筛选方法，其特征在于步骤(3)：SSR引物设计的相关参数如下：序列的长度区间为18～27bp，上下游Tm值不应差别过大，退火温度保持在50～60℃之间，PCR产物大小200bp左右；GC含量为50±10%，且无二级结构和二聚体。
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Applications Claiming Priority (1)
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