CN114507748B - 鉴定仙草品种的est-ssr分子标记、试剂盒及鉴定方法 - Google Patents

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Abstract

本发明提供一种提供鉴定仙草品种的EST‑SSR分子标记、试剂盒及鉴定方法，利用转录组数据中的EST序列分析其所含微卫星重复序列的组成和特征，开发仙草EST‑SSR引物，并验证仙草EST‑SSR引物有效性及其在仙草中的通用性，以期为仙草及其近缘属种的亲缘关系鉴定、系统进化、遗传变异、遗传图谱构建等研究提供重要的工具和有价值的信息。

Description

鉴定仙草品种的EST-SSR分子标记、试剂盒及鉴定方法
技术领域
本发明涉及仙草鉴定技术领域，尤其涉及一种鉴定仙草品种的EST-SST 分子标记、试剂盒及鉴定方法。
背景技术
仙草(Mesona chinensis Benth)，又名凉粉草、仙人草，是唇形科凉粉 草属一年或多年生草本植物，作为中草药和制作凉粉冻的原料。仙草在我国 乃至东南亚地区已有悠久历史，分布于我国广东、广西、福建、江西、海南、 浙江、台湾和云南等地，越南、印度、印度尼西亚、马来西亚也有分布(Tang DF,Wei F,Cai ZQ,et al.Analysis of codon usagebias and evolution in the chloroplast genome of Mesona chinensis Benth.DevGenes Evol.)。
仙草以野生资源为主，在长期进化过程中，不同地区的仙草资源在外部 形态特征、甚至内部的生理和分子结构产生了极大差异。目前在仙草种植和 生产过程中有许多问题亟待解决，其中种苗混杂是当前急需待解决的问题之 一。
具体来讲，在实际的生产种植中，仙草的栽培种苗主要是一些当地的农 家品种，多是由野生种驯化而成，其种质来源非常混杂，因而导致药材质量 参差不齐。随着仙草用量的不断提升，仙草的种质资源问题得到了重视，分 子标记是资源鉴定与评价仙草品种的有的效方法之一。
专利文献CN110484653A公开了SSR分子标记引物、仙草品种的鉴定 方法及试剂盒，该文献中的SSR分子标记引物用于扩增仙草中含有SSR分 子标记的核苷酸片段所述SSR分子标记包括SSR80位点、SSR82位点、SSR83 位点、SSR100位点、SSR102位点及SSR106位点中的至少一种，结果表现 为：针对4种不同品种的已知仙草的电泳条型差异明显，并且与仙草属于近 亲的薄荷、留兰香、夏枯草、丹参、韩信草和半枝莲的电泳条带与仙草的条 带完全不同。但是，目前发现的凉粉草属植物约有8～10种，上述技术主要 针对4种仙草进行SSR分析。
发明内容
基于此，有必要提供一种鉴定仙草品种的EST-SST分子标记、试剂盒及 鉴定方法，能够同步鉴定更多不同品种的仙草。
本发明采用如下技术方案：
本发明提供一种鉴定仙草品种的EST-SST分子标记，所述分子标记所针 对的SSR位点包括TDF016位点、TDF032位点、TDF048位点、TDF050位 点、TDF109位点、TDF139位点、TDF166位点、TDF172位点及TDF191 位点，各位点核苷酸序列所包含的重复单元分别为(CCT)5、(CAA)5、 (CAA)6、(ACC)7、(TGA)8、(TCA)7、(CATCCTT)5、(CAC) 7及(GGT)5。
本发明还提供一种鉴定仙草品种的EST-SST分子标记引物组，包括:
引物对1：
GACCAACCAATCATGTTCCC和AAGAAGGTGTGGTTGTTGGC；
引物对2：
TTAGATGTTCCTCGAACCCG和GCATCCCGACGTGATAGACT；
引物对3：
GGAGCAATTCGCTTCAGTTC和CATGTAGCCGATCCCAATTT；
引物对4：
AACTGAATCCCAATTGCAGC和TGGGAAGCTGTCAACACTCA；
引物对5：
GGACTGAAACTGGGAGTGGA和GATCCAGCTTCATGGGAAGA；
引物对6：
TCCTCCGCTTTGTTCATTCT和AGGTTGCGTACATCTGACCC；
引物对7：
CCCTCAATTCATCCCTCTCA和ATTGATGAAGAGACTGCGGG；
引物对8：
AGCATCCTGCGACTCCTAAA和CCGGAAATACGAATGCCTAA；
引物对9：
GTGGAAAGGGTGGAGGATTT和TCCTCCTCCAGCACCACTAC。
本发明还提供一种鉴定仙草品种的试剂盒，包括上述所述的EST-SST 分子标记引物组。
在其中一些实施例中，所述鉴定仙草品种的试剂盒还包括DNA提取试 剂、DNA聚合酶预混液及电泳试剂中的至少一种。
本发明还提供一种鉴定仙草品种的方法，包括如下步骤：提供待鉴定品 种，提取样品基因组DNA；采用上述鉴定仙草品种的EST-SST分子标记引 物组，通过荧光PCR扩增，得扩增产物；将所述扩增产物进行电泳检测荧 光PCR扩增条带。
进一地，所述鉴定仙草品种的方法还包括如下步骤：再将扩增产物稀释， 加入混有Liz 500内标的去离子甲酰胺，进行毛细管电泳检测；将所述毛细 管电泳检测结果进行峰图分析，得到等位基因分型表及分型峰图，编码形成 指纹图谱。
在其中一些实施例中，所述荧光PCR的反应体系为：1μL基因组DNA， 0.3μL上下游引物，5μL 2×Taq PCR Master Mix，超纯水补足至10μL。
在其中一些实施例中，所述荧光PCR的反应程序为：95℃预变性5min， 95℃变性30s，62～52℃退火30s，72℃延伸30s，运行10个循环，95℃变 性30s，52℃退火30s，72℃延伸30s，运行25个循环，最后72℃延伸 20min。
本发明的有益效果是：
与现有技术相比，本发明首次发现鉴定仙草品种的EST-SST分子标记位 点，并设计特异性更好的引物组，通过荧光PCR以及毛细管电泳检测峰图， 得到基因分型情况，在近缘物种甚至远缘物种间通用性更好，可以为仙草及 其近缘属种的亲缘关系鉴定、系统进化、遗传变异、遗传图谱构建等研究提 供重要的工具和有价值的信息。
与CN110484653A公开的技术方案相比，本发明基于仙草转录组数据开 发的EST-SSR分子标记，位点都位于CDS区，因此筛选出的位点更为保守， 可靠性更高。同时，全世界约有8～10种凉粉草属植物，本发明选用8类不 同来源的仙草品种进行EST-SSR分析。同时，本发明采用荧光毛细管电泳， 检测具有更准确、分辨率更高的优势。
附图说明
图1为实施例2处理部分样品的电泳图示例。
图2为实施例2处理获得的TDF016检测数据图示例。
图3为实施例2处理获得的指纹图谱。
图4为实施例2处理获得的聚类树。
具体实施方式
下面结合具体实施例对本发明作进一步的详细说明，以使本领域的技术 人员更加清楚地理解本发明。
以下各实施例，仅用于说明本发明，但不止用来限制本发明的范围。基 于本发明中的具体实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动的情 况下，所获得的其他所有实施例，都属于本发明的保护范围。
在本发明实施例中，若无特殊说明，所有原料组分均为本领域技术人员 熟知的市售产品；在本发明实施例中，若未具体指明，所用的技术手段均为 本领域技术人员所熟知的常规手段。
实施例1
发明人团队依据仙草转录组数据设计合成192对SSR引物，对仙草材料 的鉴定效果进行筛选，部分引物组及鉴定结果统计如下：
Figure BDA0003488890390000051
Figure BDA0003488890390000061
Figure BDA0003488890390000062
Figure BDA0003488890390000071
通过重复试验探究发现，大部分根据转录组数据设计合成的SSR引物的 鉴定效果不好。仅采用如下表所示的9组引物针对仙草品种的位点的鉴定效 果较好，相关位点及其引物组的信息见下表：
Figure BDA0003488890390000072
进一步，针对位点的遗传多样性分析：Na、Ne、I、Ho、He、F、Fst等参数使用GenAIex软件计算，各个位点的PIC值由Cervus软件计算。以 下为具体的分析结果及其解释，每个位点的平均等位基因数(Na)，有效等 位基因数(Ne)，平均观测杂合度(H0)，平均期望杂合度(He)等是反映群 体遗传多样性的常用指标，固定指数F用以衡量观测杂合度偏离 Hardy-weinberg平衡的程度。
统计结果见下表：
Figure BDA0003488890390000073
Figure BDA0003488890390000081
实施例2
本实施例提供仙草品种的鉴定方法，包括如下步骤：
S1，提供待检样品：BD-1，BD-2，BD-3，FJ-1，FJ-2，FJ-3，YN-1， YN-2，YN-3，TW-1，TW-2，TW-3，7-1，7-2，7-3，8-1，8-2，8-3，9-1， 9-2，9-3，10-1，10-2，10-3，不同品种的样品来源地信息见下表：
Figure RE-GDA0003601717610000082
Figure BDA0003488890390000091
S2，提取基因组DNA：
每份材料叠放整齐后用剪刀剪取适量叶片于2mL离心管中。低温冷冻 采好样品的离心管，使用组织研磨仪将叶片充分研磨成粉末状，使用天根植 物基因组DNA提取试剂盒提取待检测样品基因组DNA。用Nanodrop one 检测DNA的浓度，用超纯水将DNA稀释为10ng/μL备用。样品提取基 因组DNA电泳图如图1A所示。
S3，荧光PCR扩增：
PCR反应体系，包括：1μL基因组DNA，0.3μL上、下游引物(10p)， 5μL 2×Taq PCRMaster Mix，超纯水补足至10μL。
反应程序为：95℃预变性5min，95℃变性30s，62～52℃退火30s，72℃ 延伸30s，运行10个循环，95℃变性30s，52℃退火30s，72℃延伸30s， 运行25个循环，最后72℃延伸20min。
S4，毛细管电泳：
取3uL荧光PCR扩增产物，使用2％琼脂糖凝胶电泳检测荧光PCR扩 增条带是否正常(部分样品抽检结果如图1B所示)，并参照标准DNA Marker 将荧光PCR产物稀释至相同浓度，分别取每个稀释后的荧光PCR产物1μL 加入7μL混有4‰Liz 500内标的去离子甲酰胺，上ABI 3730xl测序仪进行 毛细管电泳检测。
S5，数据处理：
荧光毛细管电泳结果使用峰图分析软件GeneMarker 2.0读取荧光PCR 扩增片段大小，得到等位基因分型表及分型峰。
分别针对上述样品的TDF016位点、TDF032位点、TDF048位点、TDF050 位点、TDF109位点、TDF139位点、TDF166位点、TDF172位点及TDF191 位点处理的图示例2，部分数据统计结果见下表：
Figure BDA0003488890390000101
Figure BDA0003488890390000111
Figure BDA0003488890390000112
/>
Figure BDA0003488890390000121
/>
Figure BDA0003488890390000131
Figure BDA0003488890390000132
/>
Figure BDA0003488890390000141
/>
Figure BDA0003488890390000151
Figure BDA0003488890390000152
/>
Figure BDA0003488890390000161
Figure BDA0003488890390000162
/>
Figure BDA0003488890390000171
/>
Figure BDA0003488890390000181
Figure BDA0003488890390000182
/>
Figure BDA0003488890390000191
/>
Figure BDA0003488890390000201
/>
Figure BDA0003488890390000211
Figure BDA0003488890390000212
/>
Figure BDA0003488890390000221
Figure BDA0003488890390000222
/>
Figure BDA0003488890390000231
/>
Figure BDA0003488890390000241
将各样品各位点的等位基因编码成01矩阵形式的指纹图谱。指纹图谱 可以直观的展示每个样品的差异，见图3。
根据样品间及群体间的Nei's遗传距离，个体间的聚类分析使用R包poppr的aboot方法，选择nei距离，bootstrap1000次；群体间的聚类分析运 用Phylip软件对其进行UPGMA(Unweighted Pair Group Method using Arithmetic Averages)方法构建聚类树，结果见图4。
在此有必要指出的是，以上实施例仅限于对本发明的技术方案做进一步 的阐述和说明，并不是对本发明的技术方案的进一步的限制，本发明的方法 仅为较佳的实施方案，并非用于限定本发明的保护范围。凡在本发明的精神 和原则之内，所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保 护范围之内。
序列表
<110> 广西壮族自治区药用植物园
<120> 鉴定仙草品种的EST-SSR分子标记、试剂盒及鉴定方法
<140> 2022100903008
<141> 2022-01-25
<160> 18
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 1
gaccaaccaa tcatgttccc 20
<210> 2
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 2
aagaaggtgt ggttgttggc 20
<210> 3
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 3
ttagatgttc ctcgaacccg 20
<210> 4
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 4
gcatcccgac gtgatagact 20
<210> 5
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 5
ggagcaattc gcttcagttc 20
<210> 6
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 6
catgtagccg atcccaattt 20
<210> 7
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 7
aactgaatcc caattgcagc 20
<210> 8
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 8
tgggaagctg tcaacactca 20
<210> 9
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 9
ggactgaaac tgggagtgga 20
<210> 10
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 10
gatccagctt catgggaaga 20
<210> 11
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 11
tcctccgctt tgttcattct 20
<210> 12
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 12
aggttgcgta catctgaccc 20
<210> 13
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 13
ccctcaattc atccctctca 20
<210> 14
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 14
attgatgaag agactgcggg 20
<210> 15
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 15
agcatcctgc gactcctaaa 20
<210> 16
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 16
ccggaaatac gaatgcctaa 20
<210> 17
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 17
gtggaaaggg tggaggattt 20
<210> 18
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 18
tcctcctcca gcaccactac 20

Claims (7)

1.一种鉴定仙草品种的EST-SSR分子标记引物组，其特征在于，包括:
引物对1：
GACCAACCAATCATGTTCCC和AAGAAGGTGTGGTTGTTGGC；
引物对2：
TTAGATGTTCCTCGAACCCG和GCATCCCGACGTGATAGACT；
引物对3：
GGAGCAATTCGCTTCAGTTC和CATGTAGCCGATCCCAATTT；
引物对4：
AACTGAATCCCAATTGCAGC和TGGGAAGCTGTCAACACTCA；
引物对5：
GGACTGAAACTGGGAGTGGA和GATCCAGCTTCATGGGAAGA；
引物对6：
TCCTCCGCTTTGTTCATTCT和AGGTTGCGTACATCTGACCC；
引物对7：
CCCTCAATTCATCCCTCTCA和ATTGATGAAGAGACTGCGGG；
引物对8：
AGCATCCTGCGACTCCTAAA和CCGGAAATACGAATGCCTAA；
引物对9：
GTGGAAAGGGTGGAGGATTT和TCCTCCTCCAGCACCACTAC。
2.一种鉴定仙草品种的试剂盒，其特征在于，包括权利要求1所述的EST-SSR分子标记引物组。
3.根据权利要求2所述的鉴定仙草品种的试剂盒，其特征在于，还包括DNA提取试剂、DNA聚合酶预混液及电泳试剂中的至少一种。
4.一种鉴定仙草品种的方法，其特征在于，包括如下步骤：
提供待鉴定品种，提取样品基因组DNA；
采用权利要求1所述的鉴定仙草品种的EST-SSR分子标记引物组，通过荧光PCR扩增，得扩增产物；
将所述扩增产物进行电泳检测荧光PCR扩增条带。
5.根据权利要求4所述的鉴定仙草品种的方法，其特征在于，还包括如下步骤：
再将扩增产物稀释，加入包含Liz 500内标的去离子甲酰胺，进行毛细管电泳检测；
将所述毛细管电泳检测结果进行峰图分析，得到等位基因分型表及分型峰图，编码形成指纹图谱。
6.根据权利要求4或5所述的鉴定仙草品种的方法，其特征在于，所述荧光PCR的反应体系为：1μL基因组DNA，0.3μL上下游引物，5μL 2×Taq PCR Master Mix，超纯水补足至10μL。
7.根据权利要求6所述的鉴定仙草品种的方法，其特征在于，所述荧光PCR的反应程序为：95℃预变性5min，95℃变性30s，62～52℃退火30s，72℃延伸30s，运行10个循环，95℃变性30s，52℃退火30s，72℃延伸30s，运行25个循环，最后72℃延伸20min。
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Assignee: GUANGXI BOBAI COUNTY RUNBAI PLANTING PROFESSIONAL COOPERATIVE

Assignor: GUANGXI BOTANICAL GARDEN OF MEDICINAL PLANTS

Contract record no.: X2023980045131

Denomination of invention: EST-SSR molecular markers, kits, and identification methods for identifying Xiancao varieties

Granted publication date: 20230627

License type: Common License

Record date: 20231101