CN101451163A - 霍山石斛及其相似种的分子标记指纹图谱的构建和鉴别方法 - Google Patents

Abstract

本发明涉及霍山石斛及其相似种的分子标记指纹图谱的构建和鉴别方法，解决了现有技术鉴定药用植物的方法成本高、程序复杂和耗时长的问题。本发明包括以下步骤：1.石斛样品收集；2.各样品基因组DNA的提取与纯化；3.ISSR－PCR扩增；4.琼脂糖凝胶电泳；4.构建各供试样品的ISSR分子标记指纹图谱；5.利用构建的ISSR分子标记指纹图谱进行石斛种质的鉴定。本发明方法的优点在于节约了时间和成本，通过对石斛属植物的DNA的提取，ISSR－PCR扩增，琼脂糖凝胶电泳就能得到准确可靠的鉴别图谱，该方法对外形上容易混淆的原料的鉴定具有简便快捷、重复性好、分辨率高等优点，而且在幼苗期即可进行鉴定，对于保证药材基源的准确性和稳定性具有重要的作用。

Description

霍山石斛及其相似种的分子标记指纹图谱的构建和鉴别方法

技术领域

本发明涉及石斛种质指纹图谱的构建及其鉴定方法。

背景技术

霍山产可加工为优质枫斗的有三种石斛，首推霍山石斛。霍山石斛又称米斛(Dendrobium huoshanense C.Z.Tang et S.J.Cheng)，是属于含粘多糖为主的一类药用石斛，以其嚼之味甘，粘牙，无渣，有特殊疗效，而被誉为中华仙草之最，同属此类的还有霍山产铁皮石斛(Dendrobium candidumWall.ex Lindl.)，但此两者均资源匮乏，长期以来有市无货，今国内外市场凡冠以“霍山石斛”，“霍斗”，“金霍斗”的枫斗类商品，均非前两者加工而成，而多以霍山产铜皮石斛(又称细茎石斛Dendrobiummoniliforme(L.)Sw.)加工而成，尽管从含粘多糖的性质及含量判断，这几者都可加工成质量很好的枫斗产品，但从科学的角度和中药的发展来认识，此三种石斛及其相似种应加以区分，以利于各自的研究与开发工作深入进行，因此，准确鉴别霍山石斛及其相似种成了当务之急。

1994年，加拿大蒙特利尔大学Zietkiewicz等首次发明了串联重复序列区间片段多态性标记(ISSR，Inter simple sequence repeat，ISSR)技术，之后ISSR分子标记技术在全世界不断得到推广和应用。由于SSR序列在基因组中广泛分布(Roderetal.，1998)，且等位变异特别丰富，因此ISSR与其它分子标记技术RFLP、AFLP和RAPD相比，可以检测到更高的多态性，同时锚定碱基使基因组上只有那些与锚定碱基匹配的位点才能被靶定，避免了SSR在基因组上的滑动，大大提高了PCR扩增的稳定性和可重复性，因而ISSR分子标记技术非常适合于种间和种下关系的分析。

本发明研究利用ISSR分子标记方法来鉴定霍山石斛及其相似种，通过对霍山石斛及其相似种植物的ISSR分子标记指纹图谱研究，发现霍山石斛及其相似种多态性丰富，存在较大的、稳定的差异。虽然通过PCR产物测序，依据序列来鉴定药用植物的方法具有科学性和可靠性，但存在成本高、程序复杂和耗时长等缺点。

发明内容

为了解决现有技术鉴定药用植物的方法成本高、程序复杂和耗时长的问题，本发明提供一种鉴定操作简便快捷、重复性好、分辨率高的霍山石斛及其相似种的分子标记指纹图谱的构建和鉴别方法。

本发明的具体操作，包括以下步骤：

霍山石斛及其相似种的分子标记指纹图谱的构建和鉴别方法包括新鲜石斛的预处理、DNA的提取、ISSR-PCR扩增、琼脂糖凝胶电泳；其中：

所述新鲜石斛的预处理：

将新鲜石斛避光6个小时以上消耗淀粉；

取消耗淀粉后的新鲜石斛10克，放入比例为3：1的50克以上的丙酮和水混合溶液中浸泡两天，再用50克以上的蒸馏水浸泡1小时，最后用50克以上无水乙醇浸泡二次，每次10分钟，将浸泡物擦干，为DNA的提取备用；

所述ISSR-PCR扩增：

利用所提取的DNA作为模板，在MJ Research PTC.200型扩增仪上进行ISSR-PCR扩增；

PCR反应体系特征为：模板浓度25ng/L，引物浓度0.5μmol/L，Mg²⁺浓度2.0mmol/L，dNTP浓度200μmol/L，Taq聚合酶浓度1U/20μl；

制备20μl反应体系，在200μl的PCR管中加入如下量的物质：

扩增程序条件为：94℃预变性8分钟，94℃变性45秒，58-62℃退火45秒，72℃延伸2分钟，扩增40个循环，最后于72℃终延伸10分钟；

所用的ISSR-PCR扩增引物为下表中所列单引物中的1条引物或1条以上的引物的组合；

多于一条引物时，每种引物加入量相同，减少相应水的用量，保持总体积不变；

霍山石斛及其相似种的ISSR-PCR分子标记指纹图谱的构建：

把ISSR-PCR扩增反应得到不同新鲜石斛样品的扩增产物通过凝胶电泳，根据呈现的条带建立图谱：以石斛品系编号为横坐标，以条带存在的位点编号为纵坐标，在每一纵横坐标交结处，有扩增带用“—”表示，没有扩增带不作标记，“有”带或“无”带以总亮度值作为选择依据，采用Bandscan软件，选取亮度值在≥0.4的有扩增带用“—”，<0.4的为没有扩增带，制得8个品系的石斛DNA指纹图谱如下；

利用构建的8个品系的石斛DNA指纹图谱鉴定霍山石斛：

把未知样品在上述条件下所建立的指纹图谱与已得的霍山石斛指纹图谱相比较，与霍山石斛图谱相同即为霍山石斛，否则不是霍山石斛。

本发明的有益技术效果体现在下述几个方面：

1)、本发明采用ISSR分子标记技术来构建石斛的指纹图谱，对在幼苗期材料即可进行鉴定，对于保证药材基源的准确性和稳定性具有重要的作用，与利用化学色谱指纹图谱鉴定相比：取样少、取样时期随意、不受植物生长环境条件影响；与利用分子测序鉴定相比：环节简单，通过对石斛属植物的DNA的提取，ISSR的PCR扩增，琼脂糖凝胶电泳就能得到准确可靠的鉴别图谱，省力、省时、省钱。

2)、本发明提供了有效材料预处理方法，利于野外采集保存和提取石斛高质量DNA。

3)、本发明对PCR扩增的反应体系及扩增程序进行了优化，使结果更为稳定和可靠。

4)、采用本发明构建的石斛DNA指纹图谱，可以根据需要不断增加和更新，以满足发展的需要。

5)、利用本发明所提供的指纹图谱很容易实现石斛种质鉴定的自动化。

6)、本发明所采用的指纹图谱构建及种质鉴定方法，除了可以应用于石斛的种质鉴定之外，还可以应用其它物种的种质鉴定。

7)、本发明的所选择引物的扩增产物多态性高，基因分型能力非常强，可用于种间鉴别和种内居群间的鉴别。

附图说明

图1为本发明所收集的8个石斛品系的ISSR标记分析电泳图。

图2为5个石斛品系的ISSR—PCR实验结果电泳图。

具体实施方式

下面结合附图，通过实施例对本发明作进一步地描述。

实施例1

本实施例采用收集到的8个在药用价值和形态上与霍山石斛具有相似性的石斛品系的叶片作为供试材料，提取基因组总DNA，进行指定引物的ISSR分子标记分析，以凝胶电泳呈现的条带建立各供试样品的ISSR-PCR分子标记指纹图谱，将所构建的ISSR-PCR分子标记指纹图谱用于石斛的种质鉴定。

具体操作步骤如下：

1)、收集新鲜石斛样品预处理；

将新鲜石斛避光6个小时以上消耗淀粉；

取避光处理后新鲜的石斛叶片10克，放入50克以上的比例为3∶1的丙酮和水混合溶液中保存两天，取出材料，再用50克以上蒸馏水浸泡一小时，再取出材料，最后用50克以上无水乙醇浸泡二次，每次10分钟，擦干备用。

2)、石斛样品基因组DNA的提取；

用十六烷基三甲基溴化铵法(CTAB法，Cetyl Trimethyl Ammonium Bromide)提取石斛叶片基因组DNA。操作如下：

(1)将预处理后的石斛叶片放入冰冻过的陶瓷研钵中，并加入适量石英沙，然后多次加入液氮充分研磨至粉末状，用药匙将叶片粉末转移到10ml预冷Eppendorf离心管中，粉末的高度达到离心管的1/3处，停止加入粉末。

(2)在离心管中加入4ml 65℃预热的CTAB提取缓冲液[2％(v/w)CTAB，1.4M NaCI，，20mMEDTA，100mM Tris-HCl(PH8.0)，2％巯基乙醇]。

(3)65℃温浴2h(中间每10min反转1～2次)。

(4)15000rpm离心8min，将上清液转入另一离心管中。

(5)冷却至室温后，轻柔加入等体积氯仿：异戊醇(24∶1)，轻缓颠倒40min。

(6)15000rpm室温离心10min，去沉淀，将上清液转入另一离心管中。

(7)在上清液加入2/3体积异丙醇，轻缓颠倒混匀，—20℃放置1.5h以上。

(8)离心去上清液(15000rpm，10min)。

(9)用2ml75％乙醇洗两次以去除盐，无水乙醇一次。

(10)倒去乙醇，37℃干燥(20min)，溶于600μL缓冲液，转移到1.5mI。离心管中。

(11)加入5μLRnaseA(终浓度为50μL/2mL，37℃温浴1h。

(12)用等体积的酚、氯仿和异戊醇溶液对上述步骤(11)产生的溶液抽提2次，按体积比，酚：氯仿：异戊醇＝25：24：1。

(13)离心取上清(15000rpm，10min)。

(14)加入2倍体积的无水乙醇，.20℃保温1h(20min翻转一次)。

(15)15000rpm离心，—20～C预冷75％乙醇洗涤2-3次，无水乙醇一次。

(16)37℃温浴干燥，得石斛基因DNA，加入100μLTE缓冲液溶解备用，4℃保存。

3)、ISSR-PCR扩增

利用所提取的石斛基因DNA作为模板，在MJ Research PTC.200型扩增仪上进行ISSR-PCR扩增；

PCR反应体系特征为：模板浓度25ng/L，引物浓度0.5μmol/L，Mg²⁺浓度2.0mmol/L，dNTP浓度200μmol/L，Taq聚合酶浓度1U/20μl；

以20μl反应体系为例，在200μl的PCR管中加入如下量的物质：

扩增程序条件为：94℃预变性8分钟，94℃变性45秒，58-62℃退火45秒，72℃延伸2分钟，扩增40个循环，最后于72℃终延伸10分钟；

所用的ISSR-PCR扩增引物为下表中所列单引物中的1条引物或1条以上的引物的组合。经过几百条引物的试验比较，所选引物如下：

多于一条引物时，每种引物加入量相同，减少相应水的用量，保持总体积不变，以加入两条引物的20μl反应体系为例，加入量如下：

ISSR-PCR扩增反应得到不同石斛样品的扩增产物贮存在—20℃冰箱中；

4)、琼脂糖凝胶电泳

ISSR-PCR扩增反应结束后，取扩增产物5μL-15μL在1.5％的琼脂糖凝胶上于3V/cm的电压下电泳2.5h，经EB显色，并用凝胶成像仪记录扩增产物的凝胶电泳结果，电泳结果见图1。

图1为8个石斛品系的ISSR标记分析电泳图(引物序列为：5’-(AC)₈CG-3’)，泳道M为GeneRuler^TM 100bpDNA Ladder，Y阴性对照，1富阳铁皮石斛、2荔波铁皮石斛、3霍山石斛、4金钗石斛、5束花石斛、6马鞭石斛、7环草石斛、8广东石斛。

图2为5个石斛品系的ISSR—PCR实验结果电泳图(引物序列为：5’-(AC)8CT-3’)，泳道1DNA Markerl(GeneRulerTM 100bpDNA Ladder，MBI)，2霍山产米斛♂×铜皮♀，3霍山产铁皮石斛，4霍山石斛，5霍山产铜皮石斛，6霍山产铜皮♂×铁皮♀，7阴性对照，8DNA Marker2(ID Marker2000，TAKARA)。

5)、各供试样品的ISSR-PCR分子标记指纹图谱的构建

把ISSR-PCR扩增反应得到不同新鲜石斛样品的扩增产物通过凝胶电泳，根据呈现的条带建立图谱：以石斛品系编号为横坐标，以条带存在的位点编号为纵坐标，在每一纵横坐标交结处，有扩增带用“—”表示，没有扩增带不作标记，“有”带或“无”带以总亮度值作为选择依据，采用Bandscan软件，选取亮度值在≥0.4的有扩增带用“—”，<0.4的为没有扩增带，由图1所得记录结果制得下表；

8个品系石斛DNA指纹图谱

实施例2：

利用构建的8个品系的石斛DNA指纹图谱鉴定霍山石斛

取未知样品按实施例1的方法建立指纹图谱，将未知样品的指纹图谱与已得的8个品系的石斛DNA指纹图谱相比较，与霍山石斛图谱相同即为霍山石斛，否则不是霍山石斛。

Claims (1)

1、霍山石斛及其相似种的分子标记指纹图谱的构建和鉴别方法，包括新鲜石斛的预处理、DNA的提取、ISSR-PCR扩增、琼脂糖凝胶电泳，其特征在于：

所述新鲜石斛的预处理：

将新鲜石斛避光6个小时以上消耗淀粉；

取消耗淀粉后的新鲜石斛10克，放入比例为3：1的50克以上的丙酮和水混合溶液中浸泡两天，再用50克以上的蒸馏水浸泡1小时，最后用50克以上无水乙醇浸泡二次，每次10分钟，将浸泡物擦干，为DNA的提取备用；

所述ISSR-PCR扩增：

利用所提取的DNA作为模板，在MJ Research PTC.200型扩增仪上进行ISSR-PCR扩增；

PCR反应体系特征为：模板浓度25ng/L，引物浓度0.5μmol/L，Mg²⁺浓度2.0mmol/L，dNTP浓度200μmol/L，Taq聚合酶浓度1U/20μl；

制备20μl反应体系，在200μl的PCR管中加入如下量的物质：

扩增程序条件为：94℃预变性8分钟，94℃变性45秒，58-62℃退火45秒，72℃延伸2分钟，扩增40个循环，最后于72℃终延伸10分钟；

所用的ISSR-PCR扩增引物为下表中所列单引物中的1条引物或1条以上的引物的组合；

多于一条引物时，每种引物加入量相同，减少相应水的用量，保持总体积不变；

霍山石斛及其相似种的ISSR-PCR分子标记指纹图谱的构建：

把ISSR-PCR扩增反应得到不同新鲜石斛样品的扩增产物通过凝胶电泳，根据呈现的条带建立图谱：以石斛品系编号为横坐标，以条带存在的位点编号为纵坐标，在每一纵横坐标交结处，有扩增带用“—”表示，没有扩增带不作标记，“有”带或“无”带以总亮度值作为选择依据，采用Bandscan软件，选取亮度值在≥0.4的有扩增带用“—”，<0.4的为没有扩增带，制得8个品系的石斛DNA指纹图谱如下；

利用构建的8个品系的石斛DNA指纹图谱鉴定霍山石斛：

把未知样品在上述条件下所建立的指纹图谱与已得的霍山石斛指纹图谱相比较，与霍山石斛图谱相同即为霍山石斛，否则不是霍山石斛。

Images