CN104531872A - 鉴别重唇石斛和钩状石斛的分子特异性标记引物及方法 - Google Patents

鉴别重唇石斛和钩状石斛的分子特异性标记引物及方法 Download PDF

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Abstract

本发明涉及鉴别重唇石斛和钩状石斛的分子特异性标记引物及方法。用于鉴别重唇石斛 D.hercoglossum 和钩状石斛 D. aduncum 的分子特异性标记引物的上游引物CCF：如SEQ ID NO.1所示；下游引物CCR：如SEQ ID NO.2所示。本发明利用分子特异性标记引物CCF/CCR，通过常规PCR方法可对两个相似物种重唇石斛 D.hercoglossum 和钩状石斛 D. aduncum 进行快速的分子鉴定，方法简单，采用PCR技术进行检测，时间短，半日即可完成，是形态特征辨别重唇石斛 D.hercoglossum 和钩状石斛 D. aduncum 的有效辅助。

Description

鉴别重唇石斛和钩状石斛的分子特异性标记引物及方法
技术领域
本发明涉及一种鉴别重唇石斛Dendrobium hercoglossum和钩状石斛D.aduncum的分子特异性标记引物，以及一种利用该特异性引物对重唇石斛和钩状石斛标本快速鉴别的方法。
背景技术
石斛是中国传统名贵中草药，始载于《神农本草经》，具有滋阴养胃、润肺止咳、清热明目之功效，另外，还有增强人体免疫力，消除肿瘤，抑制癌症等作用。其中，重唇石斛Dendrobium hercoglossum和钩状石斛D.aduncum是我国仅有的两种属于兰科(Orchidaceae)石斛属Dendrobium下的瘦轴组(Section Breviflores)植物，主要分布于我国云南、广东、广西、海南等省，被《濒危野生植物贸易公约》(CITES)收录，并列为重点保护的濒危(EN)级植物。重唇石斛和钩状石斛的形态学特征非常相似，主要表现为茎肉质，圆柱形或有时棒状花序轴和花序柄细而坚实，具少数小花，萼囊宽，唇瓣比萼片短，并且凹陷呈舟状，不裂。并且两者的花型、花色极其相似，均为粉红色小花。所以，从形态学上很难将二者相似种轻易鉴别开。因而在过去的很多年里，将两种石斛混淆的情况经常发生。
对D.hercoglossum和D.aduncum这两个相似种辨别的主要特征是宏观上差异并不是很显著的花的唇瓣的颜色。但是由于两者花朵的整体颜色非常相似，且易受生境、气候、生理状况等的影响而常常导致主观辨别上的偏差。而对长期保存的标本，特别是对不在开花期的标本，以及古老标本的重新鉴别，仅靠花的性状差异更是无法进行准确鉴定。因此，在石斛分类研究上，分子标记技术成为了对石斛样本辅助鉴别的重要手段。
ITS2是真核生物核糖体基因rRNA的内转录间隔区(InternalTranscribed Spacer,ITS)上的一段顺反子，位于5.8S和28S rRNA之间。ITS2片段在物种水平的变异较快，序列有许多的突变位点，这一特点使得ITS2序列非常适合于植物物种的分子鉴定。近年来，ITS2序列在药用植物鉴别研究中得到广泛应用。对D.hercoglossum和D.aduncum的ITS2区序列测序结果显示，D.hercoglossum和D.aduncum的ITS2序列长度均为246bp。因此，很难利用通用ITS2引物(ITS-2F/ITS-3R)的PCR扩增、普通电泳对两个相似种进行准确鉴别。通过对两个相似种的ITS2序列比对分析发现二者的局部序列存在多个碱基差异，本发明根据这一特点，设计开发了用于鉴定重唇石斛的ITS2特异性引物。本发明为两个相似种的分子辅助鉴别提供了可能性，对有效的鉴别和保护两种石斛种质资源具有非常重要的意义。
发明内容
本发明的目的是针对现有技术的不足，提供了一种可鉴别重唇石斛D.hercoglossum和钩状石斛D.aduncum的分子特异性标记引物，以及一种利用该引物对重唇石斛和钩状石斛进行快速鉴别的方法。
本发明采用的技术方案是：
一种鉴别重唇石斛D.hercoglossum和钩状石斛D.aduncum的分子特异性标记引物，其核苷酸序列如下：
上游引物CCF：5’-ATCCATCCATGGATGTGTTGGC-3’，如SEQ IDNO.1所示；
下游引物CCR：5’-GCATGAATTGGGATCACCTAAT-3’，如SEQ IDNO.2所示。
此对分子特异性引物是采用普通PCR技术，经过对重唇石斛D.hercoglossum和钩状石斛D.aduncum标本的核糖体ITS2区序列的克隆测序，然后对测序获得的两个相似种ITS2序列进行碱基差异比对，并以此设计分子特异性引物(CCF/CCR)。上述引物对具有极高的专一性，用此对引物对D.hercoglossum和D.aduncum进行PCR扩增，可以从D.hercoglossum中获得186bp大小的特异性片段。
本发明还涉及上述开发的分子特异性引物(CCF/CCR)在鉴别重唇石斛D.hercoglossum标本和钩状石斛D.aduncum标本中的应用。
本发明采用上述分子特异性标记引物(CCF/CCR)作为特异性扩增引物，以待测石斛标本基因组DNA为模板，进行PCR扩增，对扩增产物进行电泳检测，若电泳结果出现186bp的DNA带谱，则待测石斛样本为重唇石斛D.hercoglossum。
上述方法关键在于扩增引物的选择、基因组DNA提取、PCR反应体系及反应条件确定，以及电泳检测，这些步骤均可按照本领域常规方法进行。
需要说明的是，本发明分子特异性标记引物和检测方法仅适用于重唇石斛D.hercoglossum和钩状石斛D.aduncum的鉴别，即待测标本是限定为重唇石斛D.hercoglossum标本和钩状石斛D.aduncum标本的范围内，本领域普通技术人员根据两个相似种的形态学特征进行初步的判断，再将判断为D.hercoglossum和D.aduncum的石斛标本运用发明方法进行鉴别。采用本发明方法可对相似种重唇石斛D.hercoglossum和钩状石斛D.aduncum进行快速的分子鉴定，方法简便、准确、快速，是形态学鉴别方法的有效补充。
具体的所述方法如下：
(1)取待测石斛标本叶片0.2g，加入液氮磨碎成粉末，利用植物基因组DNA提取试剂盒提取待测石斛的基因组DNA；
(2)以步骤(1)提取的基因组DNA为模板，以所述分子特异性标记引物(CCF/CCR)作为扩增引物，进行PCR扩增：
PCR反应体系(总体积为25μl)组成为：
PCR反应程序为：94℃预变性5min；35个循环(94℃变性50s，56℃退火50s，72℃延伸1.5min)；最后于72℃下延伸10min。
(3)用1.5﹪琼脂糖凝胶电泳检测步骤(2)PCR扩增产物，然后利用凝聚成像分析仪拍照，若电泳结果出现186bp的DNA指纹带谱，则待测石斛物种为重唇石斛D.hercoglossum，若电泳图上未出现186bp的DNA指纹带谱，则待测石斛种类为钩状石斛D.aduncum。
本发明的有益效果主要体现在：本发明的分子特异性标记引物(CCF/CCR)可对石斛相似种D.hercoglossum和D.aduncum进行快速的分子鉴定，方法快捷、准确，灵敏度高，是形态特征辨别这两种相似石斛物种的有效辅助手段。
附图说明
图1是采用本发明的核酸特异性标记引物对重唇石斛D.hercoglossum和钩状石斛D.aduncum进行PCR扩增的电泳图；其中通道M为DNA分子量标准marker DL2000；通道1～4：重唇石斛D.hercoglossum；通道5～8：钩状石斛D.aduncum；C:阴性对照；从图1上可以看出D.hercoglossum标本扩增出了分子量为186bp的特异性DNA条带，而D.aduncum未扩增出该条带。
具体实施方式
本发明可以从分子水平上较为客观准确的鉴别重唇石斛D.hercoglossum和钩状石斛D.aduncum。下面结合具体实施例对本发明进行进一步说明：
实施例1
(1)待测石斛标本基因组DNA的提取
剪取-80℃保存的待测石斛标本叶片0.2g,立即加入液氮研磨至粉末，然后使用上海生工生物工程有限公司的UNIQ-10柱式植物基因组DNA抽提试剂盒提取待测石斛标本基因组DNA，用1％琼脂糖胶对所得DNA进行电泳检测，并用紫外分光光度计检测DNA浓度，稀释至50ng/μl。-20℃冰箱存放备用。
(2)设计合成特异性PCR扩增引物
设计合成基于重唇石斛ITS2序列获得的重唇石斛特异性引物，上游引物CCF：5’-ATCCATCCATGGATGTGTTGGC-3’和下游引物CCR：5’-GCATGAATTGGGATCACCTAAT-3’，由上海生物工程技术有限公司合成。
(3)分子特异性标记引物(CCF/CCR)的PCR扩增
PCR反应体系：反应体系为25μl，10×Buffer(含Mg2+)2.5μl，dNTPs(10mM)1μl,上游引物CCF(10μM)1μl,下游引物CCR(10μM)1μl,Taq酶(2U/μl)0.5μl，模板DNA(50ng/μl)1μl，ddH2O 18μl。
PCR反应程序为：94℃预变性5min；35个循环(94℃变性50s，56℃退火50s，72℃延伸1.5min)；最后于72℃下延伸10min。
(4)电泳检测：取步骤(3)PCR扩增产物5μl，利用1.5﹪琼脂糖凝胶电泳检测，电泳图如图1所示。
按照上述方法，分别对重唇石斛D.hercoglossum和钩状石斛D.aduncum标本进行检测，以无菌水为阴性对照，电泳图见图1，其中编号为1，2，3，4的D.hercoglossum标本扩增出分子量为186bp的特异性DNA条带，而编号为5，6，7，8的D.aduncum标本未扩增出该条带。这表明本发明的核酸分子引物具有极高的专一性，因此可以用于快速的鉴别重唇石斛和钩状石斛标本。
  SEQUENCE LISTING
 
<110>  杭州师范大学
 
<120>  鉴别重唇石斛和钩状石斛的分子特异性标记引物及方法
 
<130>  1
 
<160>  2    
 
<170>  PatentIn version 3.3
 
<210>  1
<211>  22
<212>  DNA
<213>  人工合成
 
<400>  1
atccatccat ggatgtgttg gc                                              22
 
 
<210>  2
<211>  22
<212>  DNA
<213>  人工合成
 
<400>  2
gcatgaattg ggatcaccta at                                              22
 
 

Claims (6)

1. 鉴别鉴别重唇石斛D.hercoglossum和钩状石斛D.aduncum的分子特异性标记引物，其特征在于该引物核苷酸序列如下：
上游引物CCF：5’-ATCCATCCATGGATGTGTTGGC-3’，如SEQ ID NO.1所示；
下游引物CCR：5’-GCATGAATTGGGATCACCTAAT-3’，如SEQ ID NO.2所示。
2.如权利要求1所述的分子特异性标记引物在鉴别重唇石斛D.hercoglossum和钩状石斛D.aduncum中的应用。
3.利用如权利要求1所述的分子特异性标记引物进行鉴别重唇石斛和钩状石斛的方法，其特征在于该方法是首先提取待测石斛标本基因组DNA作为模板，以分子特异性标记引物CCF/CCR作为扩增引物，进行PCR扩增，得到扩增产物；然后对扩增产物进行电泳检测：若电泳结果出现186 bp的DNA条带，则待测石斛样本为重唇石斛D.hercoglossum；若电泳结果未出现186 bp的DNA条带，则待测石斛样本为钩状石斛D.aduncum。
4.如权利要求3所述的鉴别重唇石斛D.hercoglossum和钩状石斛D.aduncum的方法，其特征在于所述的分子特异性标记引物CCF/CCR，其核苷酸序列如下：
上游引物CCF：5’-ATCCATCCATGGATGTGTTGGC-3’，如SEQ ID NO.1所示；
下游引物CCR：5’-GCATGAATTGGGATCACCTAAT-3’，如SEQ ID NO.2所示。
5.如权利要求3所述的鉴别重唇石斛D.hercoglossum和钩状石斛D.aduncum的方法，其特征在于该方法仅适用于待测标本为重唇石斛D.hercoglossum和钩状石斛D.aduncum标本。
6.如权利要求3所述的鉴别重唇石斛D.hercoglossum和钩状石斛D.aduncum的方法，其特征在于PCR反应程序为：94℃预变性5 min；94℃变性50 s，56℃退火50 s，72℃延伸1.5 min，35个循环；最后于72℃下延伸10 min。
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