CN102134604B - 鉴别中华乌塘鳢种群的单核苷酸多态性标记和鉴别方法 - Google Patents
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Abstract
鉴别中华乌塘鳢种群的单核苷酸多态性标记和鉴别方法。涉及中华乌塘鳢种群的鉴别方法，中华乌塘鳢种群的单核苷酸多态性标记位于中华乌塘鳢线粒体基因组中脯氨酸tRNA基因5’端的第29个碱基，鉴别方法包括：提取中华乌塘鳢的基因组DNA；以DNA为模板，PCR扩增中华乌塘鳢的线粒体基因组中脯氨酸tRNA基因，将PCR扩增产物进行电泳分析，若检测出330bp的PCR扩增产物，则该样品来自珠江口以北的中华乌塘鳢种群，若检测不出330bp的PCR扩增产物，则该样品来自珠江口以南的中华乌塘鳢种群。该方法具有简单易行、准确快捷、公正客观、经济实用的优点。
Description
技术领域
本发明涉及中华乌塘鳢种群的鉴别方法，特别涉及鉴别中华乌塘鳢种群的单核苷酸多态性标记和鉴别方法。
背景技术
中华乌塘鳢(Bostrychus sinensis)又名乌鱼、文鱼、笋壳鱼、土鱼、蟹虎，隶属于鲈形目(Perciformes)，鰕虎鱼亚目(Gobioidei)，塘鳢科(Eleotridae)，乌塘鳢属(Bostrychus)，其野生群体广泛分布在我国长江口以南至东南亚一带的潮间带海区，是我国东南沿海名贵的海产品，目前，市场价格可达160元/kg(张健东，中华乌塘鳢的生长，生长模型和生活史类型.生态学报[J]，200222(6)：841-846)。目前，中华乌塘鳢在广东、广西、福建、浙江均有养殖，但苗种主要来源于自然海区。其中，我国南海海域尤其是珠江口以南海区的种群因具有抗病力强、体型好、生长快以及耐热等优点，成为养殖苗种的首选，价格显著高于来自珠江口以北海区的中华乌塘鳢野生苗，然而由于苗种阶段难于在外形上对野生苗种的来源进行准确鉴别，许多不法分子以次充好，以北方苗代替南方苗出售给养殖户以牟取暴利。目前用于准确鉴别珠江口以南和珠江口以北中华乌塘鳢的方法还未见报道。
发明内容
本发明的目的在于提供鉴别中华乌塘鳢种群的单核苷酸多态性标记。
本发明的另一目的在于提供中华乌塘鳢种群的鉴别方法。
所述鉴别中华乌塘鳢种群的单核苷酸多态性标记位于中华乌塘鳢线粒体基因组中脯氨酸tRNA基因5’端的第29个碱基，分布在珠江口以南的中华乌塘鳢，其种群线粒体基因组中脯氨酸tRNA基因5’端的第29个碱基为T，分布在珠江口以北的中华乌塘鳢，其种群线粒体基因组中脯氨酸tRNA基因5’端的第29个碱基为C，中华乌塘鳢线粒体基因组中脯氨酸tRNA基因的全序列为：
tcaaagaagg gagattctaa ctcccacctc tagctcccaa agctagaatt ctaaattaaa 60
ctattctttg 70
所述中华乌塘鳢种群的鉴别方法包括以下步骤：
1)提取中华乌塘鳢的基因组DNA；
2)以步骤1)所得的基因组DNA为模板，PCR扩增中华乌塘鳢的线粒体基因组中脯氨酸tRNA基因，获得PCR扩增产物；
3)将PCR扩增产物进行电泳分析，若检测出330bp的PCR扩增产物，则该样品来自珠江口以北的中华乌塘鳢种群，若检测不出330bp的PCR扩增产物，则该样品来自珠江口以南的中华乌塘鳢种群。
在步骤2)中，所述PCR扩增的引物为tRNA-proH和tRNA-proL，所述tRNA-proH和tRNA-proL的序列如下：
tRNA-proH：5’-gtgtgagaag ggagattcta actcccaacc-3’
tRNA-proL：5’-acgggatggt ggttcgtggt at-3’；
所述PCR扩增的反应体系为：总体积为25μL，PCR缓冲液10mmol/L，dNTP 0.2mmol/L，Mg2+1.5mmol/L，tRNA-proH 0.32mmol/L，tRNA-proL 0.4mmol/L，Taq酶1U，模板50ng，用双蒸水补足到25μL。
所述PCR扩增的程序为：95℃预变性5min；前5个循环为每个循环于95℃变性30s，67℃退火30s(退火温度每个循环后降低1℃)，72℃延伸30s；后20个循环为每个循环于95℃变性30s，62℃退火30s，72℃延伸30s；最后一次循环结束后于72℃延伸5min。
在步骤3)中，所述电泳分析可采用1％琼脂糖凝胶电泳分析。
本发明利用中华乌塘鳢种群间的一个线粒体单核苷酸多态性位点差异，设计了一对选择性扩增引物tRNA-proH和tRNA-proL，对中华乌塘鳢种群的DNA进行PCR扩增，并通过检测PCR扩增产物的有无，从而辨别中华乌塘鳢种群的来源。该方法具有简单易行、准确快捷、公正客观、经济实用等优点。
附图说明
图1为本发明实施例中阳性检测反应PCR扩增产物的琼脂糖胶电泳图。在图1中，M为DNA分子量标记，2000bp、1000bp、750bp、500bp、250bp和100bp为DNA分子量标记的大小；HF表示中华乌塘鳢样品取自广东海丰，ZJ表示中华乌塘鳢样品取自广东湛江，XM表示中华乌塘鳢样品取自福建厦门，ZH表示中华乌塘鳢样品取自广东珠海，ND表示中华乌塘鳢样品取自福建宁德，BH表示中华乌塘鳢样品取自广西北海，NB表示中华乌塘鳢样品取自浙江宁波，DX表示中华乌塘鳢样品取自广西东兴，ZS表示中华乌塘鳢样品取自浙江舟山，YN表示中华乌塘鳢样品取自越南海防。
图2为本发明实施例中PCR扩增产物的琼脂糖胶电泳图。在图2中，M为DNA分子量标记，2000bp、1000bp、750bp、500bp、250bp和100bp为DNA分子量标记的大小；HF表示中华乌塘鳢样品取自广东海丰，ZJ表示中华乌塘鳢样品取自广东湛江，XM表示中华乌塘鳢样品取自福建厦门，ZH表示中华乌塘鳢样品取自广东珠海，ND表示中华乌塘鳢样品取自福建宁德，BH表示中华乌塘鳢样品取自广西北海，NB表示中华乌塘鳢样品取自浙江宁波，DX表示中华乌塘鳢样品取自广西东兴，ZS表示中华乌塘鳢样品取自浙江舟山，YN表示中华乌塘鳢样品取自越南海防。
具体实施方式
本发明分别从珠江口以北的海丰、宁德、厦门、舟山、宁波，珠江口以南的东兴、北海、湛江、珠海，以及越南等地取样，对中华乌塘鳢种群进行了鉴定。
实施例1
1)选用取自湛江(珠江口以南)的中华乌塘鳢与海丰(珠江口以北)的中华乌塘鳢，按常规方法采用酚氯仿抽提法(参见黄培堂等译《分子克隆实验指南》(第三版)，科学出版社，2002年9月)提取中华乌塘鳢DNA；
2)设计合成一对选择性扩增引物
tRNA-proH：5’-gtgtgagaag ggagattcta actcccaacc-3’
tRNA-proL：5’-acgggatggt ggttcgtggt at-3’；
对中华乌塘鳢DNA进行2次PCR扩增反应：
第1次PCR扩增，即阳性检测反应PCR扩增程序为：95℃预变性5min；每个循环于95℃变性30s，58℃退火30s，72℃延伸30s，共进行35个循环。
第2次PCR扩增，即选择性PCR扩增程序为：95℃预变性5min；前5个循环为每个循环于95℃变性30s，67℃退火30s(退火温度每个循环后降低1度)，72℃延伸30s；后20个循环为每个循环于95℃变性30s，62℃退火30s，72℃延伸30s；最后一次循环结束后于72℃延伸5min。
2次PCR扩增的反应体系组成为：25μL总体积，Buffer 10mM，dNTP 0.2mM，Mg2+1.5mM，tRNA-proH 0.32mM，tRNA-proL 0.4mM，Taq酶1U，模板50ng，用双蒸水补齐到25μL。
扩增产物经1％琼脂糖凝胶电泳检测，在阳性检测反应中，两个DNA样品皆存在330bp的扩增产物，说明整个反应体系无其他干扰因素(参见图1)；选择性扩增中，若存在330bp的扩增产物，则该DNA样品来自珠江口以北的海丰，若无任何扩增产物，则该DNA样品来自珠江口以南的湛江(参见图2)。
实施例2
与实施例1类似，其不同在于珠江口以南中华乌塘鳢取自珠海；珠江口以北样品选用厦门。电泳检测结果时，在保证阳性检测反应正常(即存在阳性扩增产物)的前提下，选择性PCR扩增中，若存在330bp的扩增产物，则该DNA样品来自厦门，若无任何扩增产物，则该DNA样品来自珠海(参见图1和2)。
实施例3
与实施例1类似，其不同在于珠江口以南中华乌塘鳢取自北海；珠江口以北样品取自宁德。电泳检测结果时，在保证阳性检测反应正常的(即存在阳性扩增产物)前提下，选择性PCR扩增中，若存在330bp的扩增产物，则该DNA样品来自宁德，若无任何扩增产物，则该DNA样品来自北海(参见图1和2)。
实施例4
与实施例1类似，其不同在于珠江口以南中华乌塘鳢取自广西东兴；珠江口以北样品取自宁波。电泳检测结果时，在保证阳性检测反应正常的(即存在阳性扩增产物)前提下，选择性扩增中，若存在330bp的扩增产物，则该DNA样品来自宁波，若无任何扩增产物，则该DNA样品来自广西东兴(参见图1和2)。
实施例5
与实施例1类似，其不同在于珠江口以南中华乌塘鳢取自越南海防；珠江口以北样品取自舟山。电泳检测结果时，在保证阳性检测反应正常的(即存在阳性扩增产物)前提下，选择性扩增中，若存在330bp的扩增产物，则该DNA样品来自舟山，若无任何扩增产物，则该DNA样品来自越南海防(参见图1和2)。
Claims (4)
1.中华乌塘鳢种群的鉴别方法，其特征在于包括以下步骤：
1）提取中华乌塘鳢的基因组DNA；
2）以步骤1）所得的基因组DNA为模板，PCR扩增中华乌塘鳢的线粒体基因组中脯氨酸tRNA基因，获得PCR扩增产物；所述PCR扩增的引物为tRNA-proH和tRNA-proL，所述tRNA-proH和tRNA-proL序列如下：
tRNA-proH：5’-gtgtgagaag ggagattcta actcccaacc-3’
tRNA-proL：5’-acgggatggt ggttcgtggt at-3’；
3）将PCR扩增产物进行电泳分析，若检测出330bp的PCR扩增产物，则该样品来自珠江口以北的中华乌塘鳢种群，若检测不出330bp的PCR扩增产物，则该样品来自珠江口以南的中华乌塘鳢种群。
2.如权利要求1所述的中华乌塘鳢种群的鉴别方法，其特征在于在步骤2）中，所述PCR扩增的反应体系为：总体积为25μL，PCR缓冲液10mmol/L，dNTP0.2mmol/L，Mg2+1.5mmol/L，tRNA-proH0.32mmol/L，tRNA-proL0.4mmol/L，Taq酶1U，模板50ng，用双蒸水补齐到25μL。
3.如权利要求1所述的中华乌塘鳢种群的鉴别方法，其特征在于在步骤2）中，所述PCR扩增的程序为：95℃预变性5min；前5个循环为每个循环于95℃变性30s，67℃退火30s，退火温度每个循环后降低1℃，72℃延伸30s；后20个循环为每个循环于95℃变性30s，62℃退火30s，72℃延伸30s；最后1次循环结束后于72℃延伸5min。
4.如权利要求1所述的中华乌塘鳢种群的鉴别方法，其特征在于在步骤3）中，所述电泳分析采用1%琼脂糖凝胶电泳分析。
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| 张健东.中华乌塘鳢的生长，生长模式和生活史类型.《生态学报》.2002,第22卷(第6期),841-846. * |
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