CN103667525A - 草莓镶脉病毒的快速检测试剂盒及方法 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了检测草莓镶脉病毒（Strawberry vein banding virus）的专用引物及其应用。检测草莓镶脉病毒（Strawberry vein banding virus）的专用引物，由序列表的序列1所示DNA、序列表的序列2所示DNA、序列表的序列3所示DNA和序列表的序列4所示DNA组成。利用本发明引物进行检测，检测过程快速、灵敏、操作简便，不需要其他贵重仪器和试剂，特别适合种苗繁育、脱毒培养、田间调查时快速检测和生产基层技术人员掌握应用。
Description
技术领域
本发明涉及草莓镶脉病毒的LAMP检测引物、快速检测试剂盒及其应用。
背景技术
草莓镶脉病毒（Strawberry vein banding virus，SVBV）是一种对草莓危害较严重的潜隐性病毒，属花椰菜花叶病毒科（Caulimoviridae）花椰菜病毒属（Caulimovirus），病毒粒子为等轴状，直径约50nm，无包膜。基因组为单分子环状dsDNA，长7876bp。目前，SVBV唯一的自然传播载体是蚜虫，但是病毒不能在蚜虫体内复制，也不能通过蚜虫的后代传递。机械接种病汁液不能传播SVBV，种子和花粉也不传播。当SVBV侵染栽培草莓品种时，一般不表现明显症状，但是可造成草莓植株生长衰弱，匍匐茎数量有所减少，草莓的产量及品质降低。对草莓生产影响很大，甚至造成部分草莓产田绝产绝收。因此，草莓苗的病毒检测至关重要，尤其是在草莓苗的茎尖脱毒组织培养过程中，SVBV的快速、准确检测在生产上的要求极为迫切。
由于草莓病毒提纯困难、蚜虫传播等原因，病毒病害防治困难，因此，建立高效灵敏的检测技术，成为解决种苗检测、早期鉴定等问题的关键，为草莓栽培提供保障。SVBV的检测技术目前包括指示植物的小叶嫁接法、血清学方法和聚合酶链式反应（PCR）等。小叶嫁接法、血清学方法周期长、灵敏度较低、较为费时费工，PCR方法需要特殊的仪器和试剂，在农业生产单位和技术推广部门很难应用检测。
环介导等温扩增技术检测病毒操作简便，不需要特殊的仪器和试剂，操作简单，可以在恒温条件下快速检测，成本较低。与其他病毒检测方法相比，快速、简便、灵敏，至今尚未有任何有关环介导等温扩增技术在草莓镶脉病毒检测上的应用。
发明内容
本发明的目的是提供检测草莓镶脉病毒（Strawberry vein banding virus）的专用引物以及特异性强、灵敏度高、易于操作、结果可靠的草莓镶脉病毒（Strawberry vein banding virus）的快速分子检测方法。
本发明所提供的检测草莓镶脉病毒（Strawberry vein banding virus）的专用引物，由序列表的序列1所示DNA、序列表的序列2所示DNA、序列表的序列3所示DNA和序列表的序列4所示DNA组成。
本发明还提供一种检测草莓镶脉病毒（Strawberry vein banding virus）的试剂盒，包括所述的专用引物。
本发明所述专用引物在制备检测草莓镶脉病毒（Strawberry vein banding virus）的试剂盒中的应用也属于本发明的保护范围
上述专用引物或试剂盒在鉴定草莓镶脉病毒（Strawberry vein banding virus）病害中的应用也是本发明的保护范围。
本发明还保护一种检测草莓镶脉病毒（Strawberry vein banding virus）或检测草莓镶脉病毒（Strawberry vein banding virus）病害发生危害的方法，包括如下步骤：
（1）提取待测生物样本的基因组DNA；
（2）以步骤（1）的基因组DNA为模板，用权利要求1所述的专用引物进行环介导恒温扩增；
（3）根据步骤（2）的扩增产物鉴定所述待测生物样本是否含有草莓镶脉病毒（Strawberry vein banding virus）或者是否感染草莓镶脉病毒（Strawberry vein banding virus）病害。
所述环介导恒温扩增的反应程序为：63℃1小时，80℃10分钟。
所述环介导恒温扩增的反应体系中，序列表的序列1所示DNA和序列表的序列4所示DNA的浓度均为1.2μM，序列表的序列2所示DNA和序列表的序列3所示DNA的浓度均为0.1μM。
所述环介导恒温扩增的体系包括：1.2μM序列表的序列1所示DNA，1.2μM列表的序列4所示DNA，0.1μM序列表的序列2所示DNA，0.1μM序列表的序列3所示DNA，10×Bst buffer2.5ul，2mM MgSO4，1.6mM dNTPs，1M Betaine，8U Bst DNApolymerase，DEPC ddH2O，待测生物样本的基因组DNA,扩增体系总体积为25μl。
所述环介导恒温扩增产物的检测方法为下述1）或2）所述的方法：
1）扩增产物中加入0.1μl荧光染料SYBR green I，直接观察，染有草莓镶脉病毒的样本有沉淀物呈现黄绿色，无草莓镶脉病毒侵染的样本透明且呈橘红色；
2）常规电泳和紫外成像方法：取5μl扩增产物加入5μlH2O进行1%琼脂糖凝胶电泳，通过紫外成像技术能够显示感染有草莓镶脉病毒的样本形成瀑布型条带。
本发明基于环介导等温扩增技术（loop-mediated isothermal amplification,LAMP）的草莓镶脉病毒（Strawberry vein banding virus，SVBV）检测试剂盒及方法，该试剂盒根据草莓镶脉病毒的基因保守区域设计了四个特异性引物，可以特异性的检测样品中草莓镶脉病毒。利用本发明试剂盒进行检测，检测过程快速、灵敏、操作简便，不需要其他贵重仪器和试剂，特别适合种苗繁育、脱毒培养、田间调查时快速检测和生产基层技术人员掌握应用。
附图说明
图1为SVBV LAMP各反应温度扩增产物电泳检测；图1中，泳道M.DNA MarkerAL2000；泳道1：60℃；泳道2：61℃；泳道3：62℃；泳道4：63℃；泳道5：64℃；泳道6：65℃。
图2为SVBV LAMP不同反应时间扩增产物电泳检测；其中，泳道M：DNA MarkerAL2000；泳道1：30min；泳道2：45min；泳道3：60min；泳道4：75min。
图3为SVBV LAMP引物FIP/BIP不同终浓度扩增产物电泳检测；其中，泳道M.DNA Marker AL2000；泳道1：1.0μM；泳道2：1.2μM；泳道3：1.4μM；泳道4：1.6μM；泳道5：1.8μM。
图4为SVBV LAMP引物F3/B3不同终浓度扩增产物电泳检测；其中，泳道M：DNA Marker AL2000；泳道1：0.1μM；泳道2：0.15μM；泳道3：0.2μM；泳道4：0.25μM；泳道5：0.3μM。
图5为SVBV LAMP Mg2+不同终浓度扩增产物电泳检测；其中，泳道M：DNAMarker AL2000；泳道1：2mM；泳道2：4mM；泳道3：6mM；泳道4：8mM；5：10mM。
图6为SVBV LAMP dNTPs不同终浓度扩增产物电泳检测；其中，泳道M：DNAMarker AL2000；泳道1：0.2mM；泳道2：0.4mM；泳道3.0.8mM；泳道4：1.2mM；泳道5：1.6mM；泳道6：2.0mM。
图7为SVBV LAMP betaine不同终浓度扩增产物电泳检测；其中，泳道M.DNAMarker AL2000；泳道1：0.2M；泳道2：0.4M；泳道3：0.8M；泳道4：1.0M；泳道5：1.2M；泳道6：1.4M。
图8为SVBV PCR检测灵敏度测定；其中，泳道M：DNA Marker AL2000；泳道1：提取的DNA原液做模板；泳道2-8依次为DNA原液稀释10-1、10-2、10-3、10-4、10-5、10-6和10-7。
图9为SVBV LAMP检测的灵敏度测定；其中，泳道M：DNA Marker AL2000；泳道1：提取的DNA原液做模板；泳道2-8依次为DNA原液稀释10-1、10-2、10-3、10-4、10-5、10-6和10-7。
图10为SVBV LAMP检测的特异性测定；其中，（a）为LAMP产物的电泳和凝胶成像技术检测；（b）为LAMP产物加入SYBR green I检测；泳道M：DNA MarkerAL2000；泳道1：健康植株样品DNA；泳道2-5依次为含有SVBV的植株样品DNA和SMYEV、SMoV、SCV的cDNA。
具体实施方式
以下的实施例便于更好地理解本发明，但并不限定本发明。下述实施例中的试验方法，如无特殊说明，均为常规方法。下述实施例中所用的实验材料，如无特殊说明，均为常规生化试剂公司购买得到的。
实施例1、草莓镶脉病毒（Strawberry vein banding virus）环介导引物及其应用
一、草莓镶脉病毒（Strawberry vein banding virus）环介导引物的获得
根据美国NCBI中的GenBank发布的草莓镶脉病毒（Strawberry vein banding virus）的序列（AY605663，AY955374，FM867860，JN542480，NC001725），通过软件DNAMAN7.0进行同源性分析后找出草莓镶脉病毒（Strawberry vein banding virus）的外壳蛋白基因保守序列作为模板，使用在线软件Primer3Input（http://bioinfo.ut.ee/primer3-0.4.0/primer3/）设计LAMP引物，并对设计的引物进行筛选，序列调整，验证，最终获得一组敏感性和特异性很高的LAMP引物。引物由上海生工生物技术有限公司合成，引物序列如下表1；
表1SVBV LAMP检测引物组
| 引物 | 序列5’-3’ | |
| 1 | SVBV-FIP | CAGTGTGAAGTGATTCCAACAATGATCTTATCCTTACTCTCGCAAAG（序列表中序列1） |
| 2 | SVBV-F3 | CAGAGAAGGCTCTTACAAATGA（序列表中序列2） |
| 3 | SVBV-B3 | CGAGTTCCCTGTGTAAGATAGTTAG（序列表中序列3） |
| 4 | SVBV-BIP | CAAACAAGCTTCTTCAACAGGACGAATTTGTCAGAGTTGTCA（序列表中序列4） |
二、检测方法的优化：
本发明还对LAMP检测方法的各种条件进行了优化，在反应条件优化的方法中使用的待测样品取自北京市昌平地区草莓种植园，田间样本植株表现为矮化、叶畸形等症状，采集有典型症状的叶片，称取约0.2克新鲜叶片，采用CTAB植物基因组DNA快速提取试剂盒（北京艾德莱生物科技有限公司，货号：DN14）提取待测样品中的DNA，经PCR检测和PCR产物的序列测定，并与GeneBank上的SVBV序列对比分析，确定为SVBV阳性样品。同时采用下述方法鉴定：PCR扩增反应采用2003年隋春等报道的引物I2/SM2（I2GAATGGGACAATGAAATGAG；SM2AACCTGTTTCTAGCTTCTTG，由上海生工生物技术有限公司合成）。PCR扩增反应体系为2×Taq PCR Mix12.5μl（北京艾德莱生物科技有限公司，货号：242128AX），10μM引物I2和SM2各1μl，DNA模板2μl，加入DEPC ddH2O至总体积25μl。反应程序：94℃2分钟，94℃30秒，55℃30秒，72℃30秒，35个循环，72℃延伸5分钟。目的片段大小为278bp后，PCR产物直接测序（上海生工生物技术有限公司），经在美国NCBI中进行BLAST，证明为SVBV病毒的基因片段。将提取的DNA置于-20℃保存备用。
LAMP反应条件优化具体方法如下所述：
1、最适温度的选择
LAMP试剂盒中反应溶液的配置：10μM SVBV-FIP和10μM SVBV-BIP各3μl，10μM SVBV-F3和10μM SVBV-B3各0.25μl（由上海生工生物技术有限公司合成），10×Bst buffer（北京天恩泽基因科技公司，货号：004147）2.5μl，50mM MgSO41μl，10mM dNTPs（北京艾德莱生物科技公司，货号：241639AH）3μl，12.5M Betaine（上海生工生物工程有限公司，货号：BK185-100g）2μl，8U Bst DNA polymerase（北京天恩泽基因科技公司，货号：004192）1μl，提取的DNA1μl，加入DEPC ddH2O（Solarbio公司，货号：R1600）至总体积25μl。
设置60、61、62、63、64、65℃共6个反应温度梯度，选出最适的温度。检测体系同前，温度不同，不同温度下反应时间均为1小时，80℃热激10分钟。
检测结果：取5μl LAMP扩增产物进行1%琼脂糖凝胶电泳。
检测结果显示不同温度对瀑布型条带的形成有一定影响，63℃条件下，条带较为清晰明亮（图1），确定最适检测温度为63℃。
2、最适时间的选择
选择最适温度63℃，设置30、45、60、75分钟4个不同的反应时间，之后80℃热激10分钟。其余步骤同步骤1。检测结果显示不同反应时间，检测电泳条带有一定的差异，反应时间60分钟，瀑布型条带最亮最清晰（图2），确定最佳检测时间为60分钟。
3、选择最适引物浓度
将引物SVBV-FIP/SVBV-BIP终浓度设置1.0、1.2、1.4、1.6、1.8μM等5个不同处理，引物SVBV-F3/SVBV-B3终浓度暂定为0.1μM，同步骤1，反应温度为63℃，反应时间60分钟，之后80℃热激10分钟。经电泳检测结果显示，当引物SVBV-FIP/SVBV-BIP终浓度为1.0μM时，没有清晰的瀑布型条带，其他浓度是均能形成条带清楚的瀑布形阶梯（图3），因此选择其中最低的引物浓度，即SVBV-FIP/SVBV-BIP终浓度为1.2μM。
将SVBV-F3/SVBV-B3终浓度设置0.1、0.15、0.2、0.25、0.3μM等5个不同处理，同步骤1，反应温度为63℃，反应时间60分钟，之后80℃热激10分钟。经电泳检测结果显示，本次检测的不同浓度间对检测结果的影响较小（图4），因此，最终确定引物SVBV-F3/SVBV-B3的终浓度为0.1μM。
4、Mg2+浓度的确定
设置Mg2+终浓度2、4、6、8、10mM等5个不同处理，其他条件不变，同步骤1，反应温度63℃，反应时间60分钟；之后80℃热激10分钟。检测结果显示不同浓度的Mg2+对反应结果影响较小（图5），因此，LAMP检测时采用最低浓度即Mg2+终浓度为2mM。
5、dNTPs浓度的确定
设置dNTPs终浓度0.2、0.4、0.8、1.2、1.6、2.0mM等6个不同浓度处理，其他条件不变，同步骤1，反应温度63℃，反应时间60分钟，之后80℃热激10分钟。检测结果显示不同浓度的dNTPs对反应结果影响较明显，当采用1.2mM dNTPs时，瀑布型条带清晰（图6），因此，确定检测时最适dNTPs终浓度为1.2mM。
6、Betaine浓度的确定
设置Betaine终浓度0.2、0.4、0.8、1.0、1.2、1.4M等6个不同处理，其他条件不变，同步骤1，反应温度63℃，反应时间60分钟，之后80℃热激10分钟。检测结果显示不同浓度的Betaine对反应结果影响不明显，当Betaine终浓度为1.0M，瀑布型条带较亮（图7），因此，采用LAMP检测常用的Betaine终浓度1.0M。
通过上述筛选实验，最终确定，草莓镶脉病毒基于环介导等温扩增技术的检测试剂盒的主要步骤：
采用CTAB植物基因组DNA快速提取试剂盒（北京艾德莱生物科技有限公司，货号：DN14）提取待测样品中的DNA；
LAMP试剂盒中反应溶液的配置：10μM SVBV-FIP和10μM SVBV-BIP各3μl，10μM SVBV-F3和10μM SVBV-B3各0.25μl，10×Bst buffer2.5μl，50mM MgSO41μl，10mM dNTPs3μl，12.5M Betaine2μl，8U Bst DNA polymerase1μl，提取的DNA1μl，加入DEPC ddH2O至总体积25μl；63℃恒温反应60分钟；其中，SVBV-FIP为序列表中序列1所示的DNA分子，SVBV-BIP为序列表中序列4所示的DNA分子，SVBV-F3为序列表中序列2的DNA分子；SVBV-B3为序列表中序列3的DNA分子。
检测结果：扩增产物中加入0.1μl荧光染料SYBR green I后，直接肉眼观察检测，染有草莓镶脉病毒的样本会呈现黄绿色，无草莓镶脉病毒侵染的样本呈橘红色；或者采用常规电泳和紫外成像方法进行检测，感染有草莓镶脉病毒的样本能够形成瀑布型条带。
实施例2、本发明试剂盒及其应用效果监测
一、LAMP方法灵敏度检测：
按照实施例1确定的最优的技术方案进行LAMP和PCR检测灵敏度的测定，检测的对象是上述反应条件优化过程中选用的感染草莓镶脉病毒的草莓叶片中提取的DNA。
将DNA原液进行10倍梯度稀释后，取DNA原液、10-1、10-2、10-3、10-4、10-5、10-6和10-7稀释液各1μl，分别进行LAMP和PCR扩增。PCR扩增反应采用2003年隋春等报道的引物I2/SM2（I2GAATGGGACAATGAAATGAG；SM2AACCTGTTTCTAGCTTCTTG），由上海生工生物技术有限公司合成，阳性样品能够扩增出的片段为278bp。PCR扩增反应体系为2×Taq PCR Mix12.5μl（北京艾德莱生物科技有限公司，货号：242128AX），10μM引物I21μl，10μM引物SM21μl，DNA模板2μl，加入DEPC ddH2O至总体积25μl。反应程序：94℃2分钟，94℃30秒，55℃30秒，72℃30秒，35个循环，72℃延伸5分钟。结果显示，DNA原液、10-1、10-2、10-3稀释液进行PCR反应后，可以检测到显著的条带，10-4、10-5、10-6和10-7稀释液作为模板的反应物，电泳检测条带不清晰，尤其是10-7稀释液作为模板的反应物，电泳检测条带几乎不能分辨出（图8）。而进行LAMP检测时，各个DNA稀释梯度的模板的LAMP产物均为明亮清晰条带（图9）。因此，LAMP检测SVBV比PCR方法检测的灵敏度高10倍以上，非常有利于草莓镶脉病毒的检测应用。
进行三次重复实验，结果一致。
二、LAMP方法特异性检测：
选用感染草莓镶脉病毒（Strawberry vein banding virus）的草莓叶片中提取的DNA和草莓斑驳病毒(Strawberry mottle virus,SMoV)、草莓轻型黄边病毒(Strawberry mildyellow edge virus,SMYEV)、草莓皱缩病毒（Strawberry crinkle virus,SCV）等3种其他草莓的重要病毒的cDNA以及健康草莓植株叶片中提取的DNA作为阴性对照进行本发明LAMP检测体系的特异性检测（不同病毒的GeneBank序列号分别为SVBV--NC001725、SMoV—NC003445和NC003446、SMYEV--NC003794、SCV—AY250986和AY331390，文献出处M.Q.K.Andrew et al.Virus taxonomy:9th Reportof the ICTV,Elsevier,2012）。检测体系采用优化后的LAMP检测体系，加入三种其他病毒的cDNA和健康草莓植株叶片中提取的DNA各1μl。其他试剂种类、用量和反应条件等均与优化后的本发明试剂盒一致。试验结果显示仅有SVBV的DNA能够扩增出瀑布型条带，本LAMP检测体系有很好的特异性（图10中（a））。并且将反应产物中各加入0.1μl SYBR green I（Solarbio公司，货号：SR4110），可以肉眼观察到染有草莓镶脉病毒（Strawberry vein banding virus）的样本呈现黄绿色，其他样本均呈橘红色（图10中（b））。
Claims (9)
1.检测草莓镶脉病毒（Strawberry vein banding virus）的专用引物，由序列表的序列1所示DNA、序列表的序列2所示DNA、序列表的序列3所示DNA和序列表的序列4所示DNA组成。
2.一种检测草莓镶脉病毒（Strawberry vein banding virus）的试剂盒，包括权利要求1所述的专用引物。
3.权利要求1所述专用引物在制备检测草莓镶脉病毒（Strawberry vein banding virus）的试剂盒中的应用。
4.权利要求1所述专用引物或权利要求2所述试剂盒在鉴定草莓镶脉病毒（Strawberry vein banding virus）病毒病中的应用。
5.一种检测草莓镶脉病毒（Strawberry vein banding virus）或检测草莓镶脉病毒（Strawberry vein banding virus）病毒病感染的方法，包括如下步骤：
（1）提取待测生物样本的基因组DNA；
（2）以步骤（1）的基因组DNA为模板，用权利要求1所述的专用引物进行环介导恒温扩增；
（3）根据步骤（2）的扩增产物鉴定所述待测生物样本是否含有草莓镶脉病毒或者是否感染草莓镶脉病毒病毒病。
6.如权利要求5所述的方法，其特征在于：所述环介导恒温扩增的反应程序为：63℃1小时，80℃10分钟。
7.如权利要求5或6所述的方法，其特征在于：所述环介导恒温扩增的反应体系中，序列表的序列1所示DNA和序列表的序列4所示DNA的浓度均为1.2μM，序列表的序列2所示DNA和序列表的序列3所示DNA的浓度均为0.1μM。
8.根据权利要求7所述的方法，其特征在于：所述环介导恒温扩增的体系包括：1.2μM序列表的序列1所示DNA，1.2μM列表的序列4所示DNA，0.1μM序列表的序列2所示DNA，0.1μM序列表的序列3所示DNA，10×Bst buffer2.5ul，2mM MgSO4，1.6mM dNTPs，1M Betaine，8U Bst DNA polymerase，DEPC ddH2O，待测生物样本的基因组DNA,扩增体系总体积为25μl。
9.根据权利要求8所述的方法，其特征在于：所述环介导恒温扩增产物的检测方法为下述1）或2）所述的方法：
1）扩增产物中加入0.1μl荧光染料SYBR green I，直接观察，染有草莓镶脉病毒的样本有沉淀物呈现黄绿色，无草莓镶脉病毒侵染的样本透明且呈橘红色；
2）常规电泳和紫外成像方法：取5μl扩增产物加入5μlH2O进行1%琼脂糖凝胶电泳，通过紫外成像技术能够显示感染有草莓镶脉病毒的样本形成瀑布型条带。
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