CN105154584B - 一种快速区分prrsv经典毒株和变异毒株的hrm非标记探针方法及其引物和探针 - Google Patents

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Abstract

本发明公开了一种快速区分PRRSV经典和变异毒株HRM非标记探针方法及其引物和探针，操作简单：只需PCR反应之前加UN‑Probe和荧光饱和染料即可；检测速度快且高通量：全部操作过程只需3小时，极大缩短了分型所需时间；费用低，不需要特异性荧光标记探针，每个样品的饱和染料成本为1.6 RMB；准确性高、特异性好，重复性好，可以准确、快速、高通量地进行分析，有利于在临床实践中推广应用。

Description

一种快速区分PRRSV经典毒株和变异毒株的HRM非标记探针方 法及其引物和探针
技术领域
本发明涉及病毒经典毒株与变异毒株的鉴别方法，具体涉及一种快速区分PRRSV经典毒株和变异毒株的HRM非标记探针方法及其引物和探针。
背景技术
猪繁殖与呼吸综合征（Porcine reproductive and respiratory syndrome，PRRS）由猪繁殖与呼吸综合征病毒（Porcine reproductive and respiratory syndromevirus，PRRSV）感染引起，主要特征为怀孕母猪发生流产、早产和死胎等严重的繁殖障碍以及仔猪与育肥猪的呼吸道疾病。根据病毒基因组的差异，PRRSV可分为两个基因型, 即欧洲型和北美洲型。虽然PRRSV流行毒株有美洲型和欧洲型，但迄今为止，在我国流行的PRRSV的基因型均为北美洲型，包括以北美洲型 PRRSV CH-1a株为代表的经典毒株（C-PRRSV）和2006年以后开始流行的以JXA1、HuN4和TJ为代表的变异毒株（H-PRRSV）。
PRRS传播非常迅速，猪群一旦感染即呈持续性，污染猪场可成为疫源地。尤其以H-PRRSV引起的“高热”病，仔猪发病率高达100%，死亡率可达50%以上，母猪流产率在30%以上，育肥猪也可发病死亡，损失巨大。由于RRRSV感染猪群易引起继发感染（细菌性或病毒性继发），使得临床症状和病理变化复杂化，特别是近年来越来越多的PRRS呈现亚临床型和慢性型病例，仅根据临床症状和病变及流行病学特点很难做出诊断，因此PRRSV的实验室诊断至关重要，尤其需要快速鉴别PRRSV经典毒株和高致病性变异株的诊断技术。目前，鉴别C-PRRSV和H-PRRSV方法主要包括One Step RT-PCR方法（Yang K, Li Y, Duan Z, et al. Aone-step RT-PCR assay to detect and discriminate porcine reproductive andrespiratory syndrome viruses in clinical specimens. Gene. 2013, 531（2）:199-204.）；同时检测PRRSV 欧洲型、北美洲型和H-PRRSV的多重荧光定量PCR方法（Wernike K,Hoffmann B, Dauber M, et al. Detection and typing of highly pathogenicporcine reproductive and respiratory syndrome virus by multiplex real-timert-PCR. PloS one. 2012, 7（6）:e38251.）；检测C-PRRSV和H-PRRSV的SYBR荧光染料法（Chai Z, Ma W, Fu F, et al. A SYBR Green-based real-time RT-PCR assay forsimple and rapid detection and differentiation of highly pathogenic andclassical type 2 porcine reproductive and respiratory syndrome viruscirculating in China. Archives of virology. 2013, 158（2）:407-415.）和同时检测C-PRRSV和H-PRRSV的MGB探针方法（Chen NH, Chen XZ, Hu DM, et al. Rapiddifferential detection of classical and highly pathogenic North AmericanPorcine Reproductive and Respiratory Syndrome virus in China by a duplexreal-time RT-PCR. Journal of virological methods. 2009, 161（2）:192-198.）等等。虽然以上方法均能够区分PRRSV经典毒株和变异毒株，但传统的PCR检测技术如One StepRT-PCR方法需要对RT-PCR产物进行凝胶电泳分析，易造成PCR产物污染，导致假阳性，灵敏度低。而荧光定量PCR 虽然灵敏度高，但价格昂贵，需同时合成2个或以上探针。本研究拟利用HRM非标记探针方法（UP-HRM）对C-PRRSV和H-PRRSV进行鉴别。UP-HRM检测方法探针无需荧光标记，只需在PCR扩增前加入一定体积的饱和荧光染料，只需1个非标记探针即可对C-PRRSV和H-PRRSV进行鉴别。
发明内容
本发明的目的在于提供一种快速区分PRRSV经典毒株和变异毒株的HRM非标记探针和引物。
本发明的目的在于提供一种快速区分PRRSV经典毒株和变异毒株的HRM非标记探针方法。
本发明的再一目的在于提供一种快速区分PRRSV经典毒株和变异毒株的HRM试剂盒。
本发明所采取的技术方案是：
一种快速区分PRRSV经典毒株和变异毒株的HRM非标记探针方法的引物，其核苷酸序列如下所示：
引物P1：GAYATTCATCATTACACCAGT（SEQ ID NO：1），
引物P2：AACACYCCGCCAGAGCC（SEQ ID NO：2），
引物P3：GCYACCGCACCAGATGGRACCTACTT（SEQ ID NO：3），
引物P4：ACGGTGTTCAGTGAGGGC（SEQ ID NO：4）。
一种快速区分PRRSV经典毒株和变异毒株的HRM非标记探针方法的探针，其核苷酸序列如下所示：
探针UN-Probe：GTCCGCCGTGCTGCGCTGACTGG（SEQ ID NO：5）或其核苷酸互补序列。
一种快速区分PRRSV经典毒株和变异毒株的HRM试剂盒，其特征在于：该试剂盒含有上述所述的引物。
进一步的，上述试剂盒还含有上述所述的探针。
一种快速区分PRRSV经典毒株和变异毒株的HRM非标记探针方法，包括以下步骤：
1）从样品中提取病毒核酸；
2）以核酸为模板，用权利要求1所述的引物对P1和P2进行预扩增反应获得预扩增产物；
3）以预扩增产物作为DNA模板，用权利要求1所述的引物对P3、P4、权利要求2所述的探针UN-Probe及荧光饱和染料进行PCR-HRM扩增反应获得扩增产物；
4）对扩增产物进行HRM分析，确定病毒类型。
进一步的，上述步骤2）中PCR预扩增反应体系为：
模板RNA 1 µL
PrimeScript 1 Step Enzyme Mix 0.5 µL
2×1 Step Buffer 6.25µL
10Mm引物P1 0.5µL
10Mm引物P2 0.5µL
Syto9 0.5µL
RNase Free ddH2O 3.75µL
总体积 13µL。
进一步的，步骤2）中的预扩增反应程序为：50℃反转录30min；95℃预变性2min；95℃变性20s，55℃退火20s，72℃延伸20s；循环35次。
进一步的，步骤3）中的PCR-HRM扩增反应体系为：
2×Buffer pH 8.0 10.0µL
25 Mm MgCl2 2.8µL
2.5 Mm dNTPs 2.0µL
1.0Mm 引物P3 0.5µL
10 Mm引物 P4 0.5µL
10 Mm 探针UN-Probe 0.5µL
Syto9 0.5µL
1.0 U Taq HS 0.2µL
模板DNA 1.0 µL
ddH2O 2.0µL
总体积 20µL。
进一步的，步骤3）中的PCR-HRM扩增反应程序为：95℃预变性5min；95℃变性20s，55℃退火20s，72℃延伸20s；循环55次；98℃变性2min，40℃杂合2min，45℃到98℃以0.3℃/s的熔解速率进行熔解曲线分析。
进一步的，步骤4）中所述HRM分析的具体分析过程为：
以PRRSV经典毒株CH-1R的标准样品为阳性对照，待检样品和阳性对照之间探针峰∆Tm值的绝对值小于2.0℃时判定为PRRSV经典毒株；
以PRRSV变异毒株JXA1-R的标准样品为阳性对照，待检样品和阳性对照之间探针峰∆Tm值的绝对值小于2.0℃时判定为PRRSV变异毒株。
本发明的有益效果是：
1）本发明首次建立了一种快速区分PRRSV经典和变异毒株HRM非标记探针方法、引物和探针，操作简单：只需在PCR反应之前加UN-Probe和荧光饱和染料即可；检测速度快且高通量：全部操作过程只需3小时，极大缩短了分型所需时间；费用低，不需要特异性荧光标记探针，每个样品的饱和染料成本为1.6 RMB；准确性高、特异性好，重复性好，可以准确、快速、高通量地进行分析，有利于在临床实践中推广应用。
2）本发明的PCR-HRM引物，对PRRSV经典和变异毒株，均有很好的扩增性，有助于提高PCR的效率，减少病毒鉴别分型的时间。
3）本发明的UN-Probe，对PRRSV经典和变异毒株，均有很好地的匹配性，有助于提高分析效率，减少病毒分型的时间。
4）本发明的PCR-HRM引物和UN-Probe特异性好，除可以与PRRSV经典和变异毒株结合外，不与其他常见猪源病毒，如猪瘟病毒（classical swine fever virus, CSFV）、猪伪狂犬病毒（Pseudorabies Virus, PRV）、猪圆环2型（Porcine circovirus type 2, PCV2）、猪细小病毒（Porcine parvovirus, PPV）等核酸结合，特异性扩增PRRSV核酸，有利于提高本发明对PRRSV经典和变异毒株分析的正确性。
5）本发明利用套式PCR方法来提高区别PRRSV经典和变异毒株的准确性和重复性。
附图说明
图1为C-PRRSV和H-PRRSV标准样品UP-HRM峰型化熔解曲线图；其中C-PRRSV为CH-1R经典株，H-PRRSV为JXA1-R变异株；
图2为临床样品PRRSV UP-HRM峰型化熔解曲线图；以标准品C-PRRSV（CH-1R）和H-PRRSV（JXA1-R）作为阳性对照；蓝色的熔解曲线为C-PRRSV临床样本及C-PRRSV阳性对照品，红色的熔解曲线为H-PRRSV临床样本及H-PRRSV阳性对照品；
图3为PRRSV非标记探针法特异性试验结果；其中C-PRRSV为CH-1R经典株， H-PRRSV为JXA1-R变异株；
图4为PRRSV非标记探针法灵敏度试验结果；其中C-PRRSV为CH-1R经典株， H-PRRSV为JXA1-R变异株。
具体实施方式
实施例1一种快速区分PRRSV经典毒株和变异毒株的HRM非标记探针方法
引物和非标记探针
1）PCR预扩增引物
根据H-PRRSV（PRRSV变异毒株）和C-PRRSV（PRRSV经典毒株）基因序列设计出扩增H-PRRSV和C-PRRSV部分基因片段的引物对P1和P2（PCR预扩增引物），其碱基序列如下所示。
P1：5'- GAYATTCATCATTACACCAGT -3'（SEQ ID NO：1），
P2：5'- AACACYCCGCCAGAGCC -3'（SEQ ID NO：2）。
2）PCR-HRM引物：
经过对所设计的大量引物进行筛选后，发现引物碱基序列SEQ ID NO：3和SEQ IDNO：4对PCR-HRM方法区分PRRSV经典和变异毒株的效果最好，其碱基序列如下所示。
P3：5'- GCYACCGCACCAGATGGRACCTACTT -3'（SEQ ID NO：3），
P4：5'- ACGGTGTTCAGTGAGGGC -3'（SEQ ID NO：4）。
2）非标记探针
经过对所设计的大量探针进行筛选后，发现非标记探针碱基序列SEQ ID NO：5对PCR-HRM方法区分PRRSV经典和变异毒株的效果最好，其碱基序列如下所示。
UN-Probe：GTCCGCCGTGCTGCGCTGACTGG（SEQ ID NO：5），或其核苷酸互补序列，探针3′端用C3修饰物封闭。
实施例2 一种快速区分PRRSV经典毒株和变异毒株的HRM非标记探针方法
标准样品的PCR-HRM分析
1）PRRSV标准品核酸的提取：
分别取CH-1R疫苗（C-PRRSV经典毒株）和JXA1-R疫苗（H-PRRSV变异毒株）加入3mLPBS盐酸缓冲溶液进行溶解，取200μL按TAKARA的MiniBEST Viral RNA/DNA ExtractionKit Ver.4.0的说明书进行核酸提取。
2）阳性标准样品的PCR- HRM操作步骤
为了验证所设计的引物和非标计探针对实际样品的鉴别能力，本研究利用CH-1R疫苗（C-PRRSV经典毒株）和JXA1-R疫苗（H-PRRSV变异毒株）作为标准样品进行PCR-HRM分析。分别以上述标准样品提取核酸作为核酸模板，分别进行PCR-HRM预扩增反应、PCR-HRM扩增反应和分析。
2.1 RT-PCR预扩增
参照PrimeScript® One Step RT-PCR Kit产品说明书，按以下组成配制RT-PCR反应液。引物P1/P2为区分PRRSV经典毒株和变异毒株的预扩增引物。
预扩增反应程序为50℃反转录30min；95℃预变性2min；95℃变性20s，55℃退火20s，72℃延伸20s；循环35次。
2.2 PCR-HRM分析
将引物P1/P2预扩增产物稀释100倍后作为模板，以P3/P4为引物进行第2轮不对称PCR扩增，PCR反应体系如下：
PCR反应程序为：95℃预变性5min；95℃变性20s，55℃退火20s，72℃延伸20s；循环55次；
HRM运行程序：98℃变性2min，40℃杂合2min，45℃到98℃以0.3℃/s的熔解速率进行熔解曲线分析。HRM试验结果用Rotor-GeneTMQ 2.0.2.软件进行分析。
3）阳性标准样品PCR-HRM结果分析
PCR扩增产物用Rotor-Gene Q分析仪进行分析。C-PRRSV和H-PRRSV标准样品UP-HRM峰型化熔解曲线如图1所示。
图1为非标记探针法区分PRRSV经典和变异毒株的PCR-HRM分析图。分析结果显示，非标记探针方法（UP-HRM）能够区分C-PRRSV和H-PRRSV不同毒株。其中，C-PRRSV探针峰Tm值较低为65.02±0.2℃，H-PRRSV探针峰Tm值较高为75.03±0.1℃，两者探针峰Tm差异明显（约10℃），而两者扩增峰Tm值差异不明显。
实施例3 临床样品PCR-HRM分析
1）从样本中提取病毒核酸：分别取疑似感染有C-PRRSV经典毒株和H-PRRSV疫苗毒株的猪肺脏组织样品2g，加入3mL PBS盐酸缓冲溶液进行研磨，将研磨好的匀浆液4000×g离心 8 min，并吸取离心上清液至-80℃保存备用。或血清样本200μL组织样品匀浆液和血清样品按TAKARA的MiniBEST Viral RNA/DNA Extraction Kit Ver.4.0的说明书进行核酸提取。
2）以提取的病毒核酸为模板，进行RT-PCR预扩增（参照PrimeScript® One StepRT-PCR Kit试剂盒说明书），预扩增反应体系为：
预扩增反应程序为50℃反转录30min；95℃预变性2min；95℃变性20s，55℃退火20s，72℃延伸20s；循环35次。
3）将预扩增产物稀释100倍后作为模板，以P3/P4为引物进行第2轮不对称PCR扩增，PCR反应体系如下：
PCR反应程序为：95℃预变性5min；95℃变性20s，55℃退火20s，72℃延伸20s；循环55次；
HRM运行程序：98℃变性2min，40℃杂合2min，45℃到98℃以0.3℃/s的熔解速率进行熔解曲线分析。HRM试验结果用Rotor-GeneTMQ 2.0.2.软件进行分析。
4）对扩增产物进行HRM分析（用Rotor-GeneTMQ 2.0.2.软件进行分析），确定病毒变异株或经典株，具体分析过程为：
以PRRSV经典毒株CH-1R的标准样品为阳性对照，待检样品和阳性对照之间探针峰∆Tm值的绝对值小于2.0℃时判定为PRRSV经典毒株；
以PRRSV变异毒株JXA1-R的标准样品为阳性对照，待检样品和阳性对照之间探针峰∆Tm值的绝对值小于2.0℃时判定为PRRSV变异毒株。
为了验证所建立的方法对实际临床样品的鉴别能力。本发明对广东省和江西省某猪场收集到的21份临床样品进行PCR-HRM分析，分析结果如图2，从中可以看出，21份临床样品中共检测出4份C-PRRSV阳性样本（标记为蓝色熔解曲线）和17份H-PRRSV阳性样本（标记为红色熔解曲线）（每个样品重复3次）。4份C-PRRSV阳性样本探针熔解峰Tm值为65.1±0.28℃，与阳性对照样品Tm值无明显差异（65.3±0.12℃）。17份H-PRRSV阳性样本探针熔解峰Tm值为75.3±0.37℃，与阳性对照样品Tm值无明显差异（75.3±0.05℃）。
实施例4 特异性实验
下面对本发明建立的HRM非标记探针方法进行特异性检测。
分别提取其他常见猪病毒核酸，如CSFV、PRV、PCV2和PPV的核酸为模板，以上述实施例3中所述的方法进行HRM分析，分别验证引物P1/P2、P3/P4和非标记探针UN-Probe特异性，同时以经典毒株CH-1R和变异毒株JXA1-R为阳性对照，水作为阴性对照进行PCR-HRM分析。
分析结果如图3所示，从图上可看出，本发明非标记探针法能特异性扩增出PRRSV熔解峰，而其它常见病毒，如猪瘟病毒（classical swine fever virus, CSFV）、猪伪狂犬病毒（Pseudorabies Virus, PRV）、猪圆环2型（Porcine circovirus type 2, PCV2）、猪细小病毒（Porcine parvovirus, PPV）样品均未扩增出熔解峰，表明本发明使用的非标记探针（UN-Probe）、引物P1/P2和P3/P4特异性高，适合作为HRM探针和引物。
实施例5 灵敏度试验
下面对本发明建立的HRM非标记探针方法进行灵敏度检测。
分别以CH-1R和JXA1-R Nsp3质粒（Nsp3 pGEM-T质粒载体中含有本发明检测的目的基因片段）样品体外转录RNA为模板，将模板进行定量和梯度稀释后进行PCR-HRM分析，检测本发明UP-HRM方法最低检测限。其中，体外转录按Transcript Aid T7 High YieldTranscription Kit （Thermo Fisher Scientific）试剂盒说明书进行操作，用GeneJETRNA Purification Kit（Thermo Fisher Scientific）试剂盒对体外转录产物进行纯化。体外转录产物按用上述实施例2中所述的HRM非标记探针方法进行灵敏度试验。
图4为PRRSV非标记探针法灵敏度试验结果。从图上可看出，本发明HRM非标记探针法对H-PRRSV（JXA1-R）和C-PRRSV（CH-1R）最低检测限分别为200.2copy/µL和347.6copy/µL。
实施例6 重复性试验
下面对本发明建立的PCR-HRM法作重复性检测。
选取CH-1R、JXA1-R阳性对照，分别抽提不同批次的核酸样品，用上述实施例2中方法进行重复性试验，并计算出批内和批间变异系数（CV%）。
实验结果如表1所示，从表中可看出，H-PRRSV（JXA1-R）和C-PRRSV（CH-1R）样品在不同批次抽提核酸后的熔解曲线重复性较高。虽然，不同批次样品在熔解温度（Tm）上有微弱变化，但熔解峰形状、熔解温度∆Tm和变异系数（CV%）上无显著差异。
表1 PRRSV UP-HRM方法重复性试验结果
a PRRSV UP-HRM方法；
b批内和批间变异系数由∆Tm值计算得出。
上述实施例为本发明较佳的实施方式，但本发明的实施方式并不受上述实施例的限制，其他的任何未背离本发明的精神实质与原理下所作的改变、修饰、替代、组合、简化，均应为等效的置换方式，都包含在本发明的保护范围之内。
<110> 广东省农业科学院动物卫生研究所
<120> 一种快速区分PRRSV经典毒株和变异毒株的HRM非标记探针方法及其引物和探针
<130>
<160> 5
<170> PatentIn version 3.5
<210> 1
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 1
gayattcatc attacaccag t 21
<210> 2
<211> 17
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 2
aacacyccgc cagagcc 17
<210> 3
<211> 26
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 3
gcyaccgcac cagatggrac ctactt 26
<210> 4
<211> 18
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 4
acggtgttca gtgagggc 18
<210> 5
<211> 23
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 5
gtccgccgtg ctgcgctgac tgg 23

Claims (9)

1.一种快速区分PRRSV经典毒株和变异毒株的HRM非标记探针方法的引物，其核苷酸序列如下所示：
引物P1：GAYATTCATCATTACACCAGT(SEQ ID NO：1)，
引物P2：AACACYCCGCCAGAGCC(SEQ ID NO：2)，
引物P3：GCYACCGCACCAGATGGRACCTACTT(SEQ ID NO：3)，
引物P4：ACGGTGTTCAGTGAGGGC(SEQ ID NO：4)，
所述PRRSV的经典毒株为CH-1R，变异毒株为JXA1-R。
2.一种快速区分PRRSV经典毒株和变异毒株的HRM试剂盒，其特征在于：该试剂盒含有权利要求1所述的引物，所述PRRSV的经典毒株为CH-1R，变异毒株为JXA1-R。
3.根据权利要求2中所述的试剂盒，其特征在于：该试剂盒还含有探针，其核苷酸序列如下所示：
探针UN-Probe：GTCCGCCGTGCTGCGCTGACTGG(SEQ ID NO：5)或其核苷酸互补序列。
4.一种快速区分PRRSV经典毒株和变异毒株的HRM非标记探针方法，其特征在于：包括以下步骤：
1)从样品中提取病毒核酸；
2)以核酸为模板，用权利要求1所述的引物对P1和P2进行预扩增反应获得预扩增产物；
3)以预扩增产物作为DNA模板，用权利要求1所述的引物对P3、P4、权利要求3所述的探针UN-Probe及荧光饱和染料进行PCR-HRM扩增反应获得扩增产物；
4)对扩增产物进行HRM分析，确定病毒类型；
上述方法用于非疾病的诊断和治疗，
所述PRRSV的经典毒株为CH-1R，变异毒株为JXA1-R。
5.根据权利要求4所述的方法，其特征在于：步骤2)中PCR预扩增反应体系为：
6.根据权利要求4所述的方法，其特征在于：步骤2)中的预扩增反应程序为：50℃反转录30min；95℃预变性2min；95℃变性20s，55℃退火20s，72℃延伸20s；循环35次。
7.根据权利要求4所述的方法，其特征在于：步骤3)中的PCR-HRM扩增反应体系为：
8.根据权利要求4所述的方法，其特征在于：步骤3)中的PCR-HRM扩增反应程序为：95℃预变性5min；95℃变性20s，55℃退火20s，72℃延伸20s；循环55次；98℃变性2min，40℃杂合2min，45℃到98℃以0.3℃/s的熔解速率进行熔解曲线分析。
9.根据权利要求4所述的方法，其特征在于：步骤4)中所述HRM分析的具体分析过程为：
以PRRSV经典毒株CH-1R的标准样品为阳性对照，待检样品和阳性对照之间探针峰ΔTm值的绝对值小于2.0℃时判定为PRRSV经典毒株；
以PRRSV变异毒株JXA1-R的标准样品为阳性对照，待检样品和阳性对照之间探针峰ΔTm值的绝对值小于2.0℃时判定为PRRSV变异毒株。
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