CN112251519A - 鉴定呼伦贝尔短尾羊纯合子、杂合子的特异性引物和探针、试剂盒及方法 - Google Patents

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Abstract

本发明公开了一种鉴定呼伦贝尔短尾羊纯合子、杂合子的特异性引物、探针及试剂盒，并提供了一种基于非标记探针高分辨率熔解曲线的呼伦贝尔短尾羊群体中纯合子、杂合子个体的鉴定方法。通过设计的非标记探针放大了纯合子和杂合子之间熔解曲线Tm值信号差异，取代传统测序，作为呼伦贝尔短尾羊基因分型的手段之一。本发明的鉴定方法操作简便，反应时间短，具有极高的灵敏性和特异性，可检测出呼伦贝尔羊群体中纯合子、杂合子个体。

Description

鉴定呼伦贝尔短尾羊纯合子、杂合子的特异性引物和探针、试 剂盒及方法
技术领域
本发明属于分子生物学技术领域，具体涉及一种鉴定呼伦贝尔短尾羊纯合子、杂合子的特异性引物和探针、试剂盒及方法。
背景技术
呼伦贝尔短尾羊是生长在我国呼伦贝尔地区的肉用绵羊品种之一，短而肥厚的尾部是该品系独特的标志。我们利用基因组重测序技术筛选到与脊椎发育相关的T/Brachyury基因作为候选基因，并确定在呼伦贝尔短尾羊群体中存在稳定T/Brachyury基因c.G334T突变，并证明与“短尾”这一具有经济价值的性状相关。在绵羊分子育种中，纯合子个体相对于杂合子后代性状表现稳定，因而近年来，人们更倾向于筛选种群中纯合个体作为主要的繁育对象。
传统测序主要以sanger测序法、Taqman探针基因分型鉴定为基础，与具有商业价值相关性状的SNP位点关联作为依据，Sanger法是根据化学试剂处理末段DNA片段，造成碱基的特异性切割，产生一组具有各种不同长度的DNA链的反应混合物，经凝胶电泳分离。化学切割反应：包括碱基的修饰：碱基从其糖环上转移出去在失去碱基的糖环处DNA断裂。传统测序技术存在着无法实现闭管操作、且受SNP位点GC值影响用时长、成本高、通量低的缺点，且DNA模板的组成或二级结构有时引起DNA聚合酶不正常终止。
发明内容
本发明目的在于提供一种鉴定呼伦贝尔短尾羊纯合子、杂合子的特异性引物和探针、试剂盒及方法，克服传统sanger测序法由于技术限制的原因，一次鉴定的样品数量较少，操作较为繁琐，用时长，
本发明的目的通过以下技术方案实现：
一种鉴定呼伦贝尔短尾羊纯合子、杂合子的特异性引物和探针，其特征是，序列如下：
上游引物：5’-TGCGCCCCTTCCTTTTCAG-3’
下游引物：5’- GGGGGAGTCGGGGTGGATGTAG-3’
探针：5’- GCTTGCCCCAGGGCACCCA-C3 Spacer-3’。
优选地，所述探针为非标记探针，3’端用C3 Spacer封闭。
一种鉴定呼伦贝尔短尾羊纯合子、杂合子的试剂盒，包括如下成分：鉴定呼伦贝尔短尾羊纯合子、杂合子的特异性上游引物、下游引物及非标记探针，Spacer-3’PCR反应混合液，呼伦贝尔短尾羊基因组DNA及呼伦贝尔短尾羊T/Brachyury基因纯合子、杂合子所制备的标准品质粒。
优选地，所述PCR反应混合液包括HRM AnaiysisPreMix（2X）和RNase-Free ddH2O。
优选地，所述呼伦贝尔短尾羊T/Brachyury基因纯合子、杂合子所制备的标准品质粒为50ng/ul。
一种鉴定呼伦贝尔短尾羊纯合子、杂合子的方法，包括如下步骤：
(a)提取待测呼伦贝尔短尾羊血液基因组DNA样品；
(b)荧光定量PCR反应体系扩增呼伦贝尔短尾羊Brachyury/T基因的片段序列，序列片段为纯合、杂合短尾羊Brachyury/T基因的95879486位点至95879323位点，如SEQ ID NO：1的DNA序列所示；
(c)高分辨率熔解曲线法获取步骤（b）扩增产物的高分辨率熔解曲线。
优选地，所述步骤（b）中PCR反应体系总体积为10ul，包括HRM AnaiysisPreMix(2X) 5ul，上游引物 0.2ul，下游引物0.2ul，上、下游引物浓度比例为1：10，10uM非标记探针 0.2ul，50ng/ul DNA模板 0.5ul，RNase-Free ddH2O3.9ul。
优选地，所述PCR反应按照如下反应程序进行：95℃预变性：5min，95℃变性：5s，62℃退火：30s，扩增50个循环，收集荧光信号。
优选地，所述步骤（c）中高分辨率熔解曲线在60℃-95℃进行分析，在60℃反应1min，在95℃反应30s，升温速率为0.2℃/s。
优选地，所述上游引物的浓度为1uM，下游引物的浓度为10uM。
优选地，所述HRM AnaiysisPreMix包括饱和荧光EvaGreen染料。
本发明的有益效果：
（1）该分型方法可以取代传统测序，作为呼伦贝尔短尾羊基因分型的手段之一，成本低，仅为传统测序的五分之一；
（2）所设计的非标记探针放大了纯合子和杂合子之间熔解曲线Tm值信号差异，纯合子样本与杂合子样本之间熔解曲线区分明显，敏感性极高；
（3）结果准确，不受检测位点的局限，实现了真正的闭管操作；
（4）定性鉴定速度快，用时时间短，一次最多可以鉴定96个样品，耗时1.5h，而传统测序办法由于运输和样本质量测定的原因约需三天。
附图说明
图1是本发明1%琼脂糖凝胶电泳呼伦贝尔短尾羊基因组DNA；
图2 是本发明的分型结果图。
具体实施方式
实施例1
呼伦贝尔短尾羊血液基因组DNA样品的提取
按照市面上所售柱式血液基因组DNA抽提试剂盒及其说明书进行，所提取得到的基因组DNA的1%琼脂糖凝胶电泳显示条带单一、明亮、无拖尾现象，如图1所示，用Nanodrop等微量紫外分光光度计测量基因组DNA浓度不低于50ng/ul、OD260/280在1.6至2.1之间。
实施例2
呼伦贝尔短尾羊纯合子、杂合子的特异性引物和探针的设计
呼伦贝尔短尾羊纯合子、杂合子的特异性引物和探针的序列如下：
上游引物：5’-TGCGCCCCTTCCTTTTCAG-3’
下游引物：5’- GGGGGAGTCGGGGTGGATGTAG-3’
探针：5’- GCTTGCCCCAGGGCACCCA-C3 Spacer-3’
所述探针为非标记探针，3’端用C3 Spacer封闭。
引物和探针设计思路为：由于SNP位点处于T/Brachyury基因第二外显子的334位，在SNP位点附近设计产物长度约为250bp以下的合适引物且SNP位点最好处于PCR产物中间的位置。由于采用的是非标记探针，所以探针在设计时不需要考虑探针两端碱基“G”的淬灭作用，探针与引物的距离越近越好。PCR产物大小控制在250bp以内，探针Tm值高于引物Tm值5℃到10℃左右。为了保证PCR产物、探针的特异性，所设计的探针尽量在保证Tm值和3’端互补少于4个碱基的同时长度最长。探针和引物的G/C%为30%至80%。设计好的探针和引物输入进PrimerEpress v 3.0进行验证：
Tm（℃） GC(%) 长度
上游引物 62.1 58 19
下游引物 66.5 68 22
非标记探针 69.3 74 19
实施例3
鉴定呼伦贝尔短尾羊纯合子、杂合子的特异性引物和探针的试剂盒，包括特异性上游引物，下游引物，非标记探针，Spacer-3’PCR反应混合液，呼伦贝尔短尾羊基因组DNA及呼伦贝尔短尾羊T/Brachyury基因纯合子、杂合子所制备的标准品质粒，Spacer-3’PCR反应混合包括HRM AnaiysisPreMix（2X）及RNase-Free ddH2O，其中，标准品质粒的浓度为50ng/ul。
实施例4
荧光定量PCR检测
利用呼伦贝尔短尾羊纯合子、杂合子的特异性引物和探针快速鉴定呼伦贝尔短尾羊纯合子、杂合子的荧光定量PCR检测：
荧光定量PCR反应体系扩增呼伦贝尔短尾羊Brachyury/T基因的片段序列，序列片段为纯合、杂合短尾羊Brachyury/T基因的95879486位点至95879323位点；
PCR反应体系配置步骤：
PCR反应体系在配置过程中添加组分按照添加体积“先大后小”的原则，优先向管中添加较大体积的DNA聚合酶、荧光染料、ddH2O随后添加上下游引物、探针及稀释浓度为50ng/ul的模板。添加组分过程在冰上进行，添加完成后用涡旋仪混匀组分并离心。管中的液体不要有气泡，涡旋和离心过程中尽量用镊子夹取PCR管，防止手触碰到盖子。
PCR反应体系按照如下配置，总体积为10ul，组成为HRM AnaiysisPreMix(2X)5ul，上游引物0.2ul，下游引物0.2ul，上游引物的浓度为1uM，下游引物的浓度为10uM，10uM非标记探针 0.2ul，50ng/ul DNA模板 0.5ul，RNase-Free ddH2O3.9ul，HRMAnaiysisPreMix包括饱和荧光EvaGreen染料。所使用的特异性引物上下游引物浓度比为1：10，这种非对称PCR方法减少了非标记探针和引物自身造成的二聚体现象，避免了机器在反应过程中的错误判读。
将PCR管放入荧光PCR反应仪中，按照如下设定反应程序：
95℃预变性：5min；
95℃变性：5s；
62℃退火：30s；
扩增50个循环，收集荧光信号。
高分辨率熔解曲线在60℃-95℃进行分析，在60℃反应1min，在95℃反应30s，升温速率为0.2℃/s。荧光定量PCR反应结果见图2，使用的非标记探针3’端用C3 Spacer封闭，在反应过程中放大了因SNP位点造成的温度差异信号呼伦贝尔短尾羊纯合子，其定量PCR呈阳性，Ct值在0-10.5之间，呼伦贝尔短尾羊杂合子，其定量PCR呈阴性，说明本发明设计的探针及引物结合荧光定量PCR能够快速、准确的对呼伦贝尔短尾羊纯合子和杂合子进行定性鉴定。
本发明提供了一种鉴定呼伦贝尔短尾羊纯合子、杂合子的特异性引物和探针、试剂盒及方法，结合实施例加以具体说明，相关领域的人员完全可以根据本发明提供的方法进行适当改动或变更与组合，来实现该技术。需要特别说明的是，所有这些通过对本发明提供的系统进行相类似的改动或变更与重新组合，都被视为在本发明的保护范围和内容中。
序列表
<110> 内蒙古农业大学
<120> 一种鉴定呼伦贝尔短尾羊纯合子、杂合子的特异性引物和探针、试剂盒及方法
<160> 1
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 203
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 1
tgcgcccctt ccttttcagg aggatgttcc cggtgctgaa ggtgaacgta tccggcctgg 60
accccaacgc catgtactcc ttcctgctgg acttcgtggc cgccgacaac caccgctgga 120
agtacgtgaa cggggagtgg gtgccggggg gcaagccaga gccgcaggcg cccagctgcg 180
tctacatcca ccccgactcc ccc 203

Claims (10)

1.一种鉴定呼伦贝尔短尾羊纯合子、杂合子的特异性引物和探针，其特征是，序列如下：
上游引物：5’-TGCGCCCCTTCCTTTTCAG-3’
下游引物：5’-GGGGGAGTCGGGGTGGATGTAG-3’
探针：5’-GCTTGCCCCAGGGCACCCA-C3 Spacer-3’。
2.根据权利要求1所述的特异性引物和探针，其特征在于，所述探针为非标记探针，3’端用C3 Spacer封闭。
3.一种鉴定呼伦贝尔短尾羊纯合子、杂合子的试剂盒，包括权利要求1或2所述的特异性引物及探针，其特征在于，还包括如下成分：PCR反应混合液，呼伦贝尔短尾羊基因组DNA，呼伦贝尔短尾羊T/Brachyury基因纯合子、杂合子所制备的标准品质粒。
4.根据权利要求3所述的一种鉴定呼伦贝尔短尾羊纯合子、杂合子的试剂盒，其特征在于，所述PCR反应混合液包括HRM AnaiysisPreMix（2X）及RNase-Free ddH2O。
5.一种鉴定呼伦贝尔短尾羊纯合子、杂合子的方法，包括如下步骤，其特征在于，所述荧光定量PCR反应体系包括权利要求1或2所述的特异性引物和探针：
(a)提取待测呼伦贝尔短尾羊血液基因组DNA样品；
(b)荧光定量PCR反应体系扩增呼伦贝尔短尾羊Brachyury/T基因的片段序列，序列片段为纯合、杂合短尾羊Brachyury/T基因的95879486位点至95879323位点，如SEQ ID NO：1的DNA序列所示；
(c)高分辨率熔解曲线法获取步骤（b）扩增产物的高分辨率熔解曲线。
6.根据权利要求5所述的鉴定呼伦贝尔短尾羊纯合子、杂合子的方法，其特征在于，所述步骤（b）中PCR反应体系总体积为10ul，包括HRM AnaiysisPreMix(2X)5ul，上游引物0.2ul，下游引物0.2ul，上、下游引物浓度比例为1：10，10uM非标记探针0.2ul，50ng/ulDNA模板0.5ul，RNase-Free ddH2O3.9ul。
7.根据权利要求5所述的鉴定呼伦贝尔短尾羊纯合子、杂合子的方法，其特征在于，所述PCR反应按照如下反应程序进行：95℃预变性：5min，95℃变性：5s，62℃退火：30s，扩增50个循环，收集荧光信号。
8.根据权利要求5所述的鉴定呼伦贝尔短尾羊纯合子、杂合子的方法，其特征在于，所述步骤（c）中高分辨率熔解曲线在60℃-95℃进行分析，在60℃反应1min，在95℃反应30s，升温速率为0.2℃/s。
9.根据权利要求6所述的鉴定呼伦贝尔短尾羊纯合子、杂合子的方法，其特征在于：所述上游引物的浓度为1uM，下游引物的浓度为10uM。
10.根据权利要求6所述的鉴定呼伦贝尔短尾羊纯合子、杂合子的方法，其特征在于，所述HRM AnaiysisPreMix包括饱和荧光EvaGreen染料。
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