CN108754010B - 一种快速检测总rna样本中基因组dna残留的方法 - Google Patents

Abstract

本发明提供一种快速检测总RNA样本中基因组DNA残留的方法，包括：1)根据待测生物材料的遗传信息，选择至少含有一个内含子序列的基因作为靶标，针对内含子序列设计PCR引物；2)提取待测生物材料的总RNA，以总RNA或其反转录得到的cDNA为模板，利用步骤1)的引物进行PCR扩增；3)分析PCR扩增产物。本发明仅设计了1对引物，就可以简便快捷的检测生物材料总RNA以及cDNA样本中有无基因组DNA残留。本发明方法为基因表达分析的准确性提供了保障，对促进分子生物学的基础研究具有重要的科学意义。

Description

一种快速检测总RNA样本中基因组DNA残留的方法

技术领域

本发明涉及生物技术领域，具体地说，涉及一种快速检测总RNA样本中基因组DNA残留的方法。

背景技术

百合(Lilium spp.)为我国栽培历史悠久的药、食、赏多用途植物，世界五大鲜切花之一。随着现代分子生物学的不断发展，百合花色(Yamagishi M,Yoshida Y,NakayamaM.The transcription factor LhMYB12determines anthocyanin pigmentation in thetepals of Asiatic hybrid lilies(Lilium spp.)and regulates pigmentquantity.Molecular Breeding,2012,30(2):913-925.)、花香(Du F,Fan JM,Wang T,etal.Identification of differentially expressed genes in flower,leaf and bulbscale of Lilium oriental hybrid'Sorbonne'and putative control network forscent genes.BMC Genomics,2017,18(1):899.)、发育(Yang PP,Xu LF,Xu H,etal.Histological and transcriptomic analysis during bulbil formation in Liliumlancifolium.Frontiers in Plant Science,2017,8:1508.)以及抗性(Howlader J,ParkJI,Robin AHK,et al.Identification,characterization and expression profilingof stress-related genes in Easter Lily(Lilium formolongi).Genes,2017,8(7):172.)等相关基因的研究都取得了较大进展，为今后百合分子育种奠定了良好基础。

前人对百合基因功能研究中，基因表达分析占据了重要地位(Zhang J,Gai MZ,Xue BY,et al.The use of miRNAs as reference genes for miRNA expressionnormalization during Lilium,somatic embryogenesis by real-time reversetranscription PCR analysis[J].Plant Cell,Tissue and Organ Culture,2016,129(1):105-118.)。实时荧光定量PCR(real-time quantitative PCR，qRT-PCR)是一种快速检测基因表达量的方法，因其具有高通量、高灵敏和实时性等特点，目前被广泛应用于植物基因表达水平研究中(Lekshmy S,Jha SK.Selection of reference genes suitable forqRT-PCR expression profiling of biotic stress,nutrient deficiency and planthormone responsive genes in bread wheat.Indian Journal of Plant Physiology,2017,22(1):101-106.)。尽管qRT-PCR操作简单，但qRT-PCR的准确性却受多方面因素影响，如引物特异性、反应体系和RNA质量等(Nolan T,Hands RE,Bustin SA.Quantification ofmRNA using real-time RT-PCR[J].Nature protocols,2006,1(3):1559-1582.)。RNA样本中基因组DNA残留对后期基因表达分析的准确性具有很大影响，残留的基因组DNA一方面会影响RNA浓度的精确定量；另一方面，残留的DNA也会影响qRT-PCR扩增效率。目前，常采用设计跨内含子引物的方法来避免基因组DNA残留对供试基因表达结果的影响。但是很多物种的基因组测序尚未开展，很难将所有待研究基因的引物都设计为跨内含子引物。因此，为了保证qRT-PCR结果的准确性，获得高质量且无基因组DNA残留的RNA样本是非常必要的。

目前，市面上RNA提取试剂盒和第一链cDNA合成试剂盒种类繁多。虽然大部分RNA提取试剂盒中都包含有DNA去除步骤，但DNA是否去除干净无法得知。此外，为了避免RNA样本中有残留的基因组DNA污染，部分第一链cDNA合成试剂盒中也加入了基因组DNA去除步骤，但cDNA质量无法预知。最关键的是，目前针对百合总RNA中基因组DNA残留检测的方法无相关文献报道。

发明内容

本发明的目的是提供一种快速检测总RNA样本中基因组DNA残留的方法。

为了实现本发明目的，本发明提供的快速检测总RNA样本中基因组DNA残留的方法，包括：

1)根据待测生物材料的遗传信息，选择至少含有一个内含子序列的基因作为靶标，针对内含子序列设计PCR引物；

2)提取待测生物材料的总RNA，以总RNA或其反转录得到的cDNA为模板，利用步骤1)的引物进行PCR扩增；

3)分析PCR扩增产物。

步骤3)中根据扩增条带的有无来判断总RNA样本中是否有基因组DNA残留。

本发明所述生物材料包括但不限于植物、动物。

优选地，所述生物材料为岷江百合。

本发明从前期得到的岷江百合转录组数据中筛选了1个高度保守的持家基因TIP41-like，针对其内含子序列设计了1对引物(LDRG-F：5'-CTCTTTTATGACGAGGTTGGTA-3'，LDRG-R：5'-CAGGGAAATCGGTCAGTGTT-3')，可简便快捷的检测岷江百合RNA以及cDNA样本中有无基因组DNA残留，为后续提高相关基因表达分析的准确性奠定基础。

本发明还提供用于快速检测岷江百合总RNA样本中基因组DNA残留的PCR引物LDRG-F/LDRG-R。

本发明还提供含有所述引物LDRG-F/LDRG-R的检测试剂或试剂盒。

优选地，所述试剂盒还包括dNTPs、Taq DNA聚合酶、Mg²⁺、PCR反应缓冲液、标准阳性模板中的至少一种。

本发明还提供所述所述引物LDRG-F/LDRG-R、所述检测试剂或试剂盒在检测岷江百合总RNA样本中基因组DNA残留中的应用：提取待测样品的总RNA，以总RNA或其反转录得到的cDNA为模板，利用所述引物进行PCR扩增，分析PCR扩增产物。

优选地，PCR反应体系为：RNA或cDNA 2μL，上、下游引物各0.5μL，2×Taq PCRMagic Mix 10μL，ddH₂O 7μL。

优选地，PCR反应程序为：94℃预变性3min；94℃变性30s，58℃退火30s，72℃延伸1min，35个循环；72℃延伸5min。

本发明具体技术方案如下：

(1)岷江百合TIP41-like一段含内含子的DNA序列扩增

从岷江百合转录组数据中获得了持家基因TIP41-like的一段mRNA序列，利用DNAMAN 5.0软件将其序列与NCBI数据库中所有物种的TIP41-like基因组序列进行比对，推测该岷江百合TIP41-like部分序列对应的基因组DNA序列中含有2个内含子，并使用PrimerPremier 5.0软件根据此段序列设计DNA扩增产物中含2个内含子的引物：F：5'-CCGAAAATCAGGGTAGGGTG-3'及R：5'-CGAAGCCAGAAACGGAGAAGA-3'。引物由上海生工生物公司合成。

以岷江百合叶片DNA为模板进行PCR扩增，PCR反应体系20μL：模板DNA 2μL，引物F0.5μL，引物R 0.5μL，2×Taq PCR Magic Mix 10μL，ddH₂O 7μL。

PCR反应程序为：94℃预变性3min；94℃变性30秒，58℃退火30s，72℃延伸1min，循环35次；72℃延伸5min。反应结束后，取6μL产物用2％琼脂糖凝胶电泳并观察拍照。

结果显示：获得了条带单一的目的片段(图1)。将此DNA扩增产物送上海生工生物公司测序，得到了片段大小为367bp的碱基序列。利用DNAMAN 5.0软件将测序获得的DNA产物片段与转录组mRNA序列进行比对发现，此DNA扩增产物共有2段内含子序列(图2)。

(2)基因组DNA残留检测引物设计

根据所获得的TIP41-like内含子序列，利用Primer Premier 5.0软件设计了1对基因组DNA残留检测引物，LDRG-F：5'-CTCTTTTATGACGAGGTTGGTA-3'，LDRG-R：5'-CAGGGAAATCGGTCAGTGTT-3'，此引物由上海生工生物公司合成。以岷江百合叶片DNA为模板进行PCR扩增验证，反应体系和反应程序均同步骤(1)。反应结束后，取6μL产物用2％琼脂糖凝胶电泳并观察拍照。

结果显示：获得了与预期产物长度(184bp)一致的特异扩增片段(图3)。

(3)岷江百合总RNA样本中基因组DNA残留检测

包括如下步骤：

①岷江百合各种组织的总RNA的提取；

从试剂公司购买相应的植物总RNA提取试剂盒，并参照说明书进行百合不同组织总RNA样本提取；并分别取微量总RNA样品经1.2％琼脂糖凝胶电泳检测和Quawell Q3000检测，以确保提取的总RNA样本质量好。

②总RNA基因组DNA残留检测；

以提取的岷江百合组织总RNA为模板，使用基因组DNA残留检测引物(LDRG-F/LDRG-R)进行PCR扩增，PCR反应体系20μL：模板RNA 2μL，LDRG-F 0.5μL，LDRG-R 0.5μL，2×Taq PCR Magic Mix 10μL，ddH₂O 7μL。

PCR反应程序为：94℃预变性3min；94℃变性30s，58℃退火30s，72℃延伸1min，循环35次；72℃延伸5min。

反应结束后，取6μL产物用2％琼脂糖凝胶电泳并观察拍照。若有一条184bp扩增产物则说明总RNA样本中含有基因组DNA污染，若无扩增条带则表明此总RNA样本中无基因组DNA污染。

借由上述技术方案，本发明至少具有下列优点及有益效果：

(一)本发明能够根据扩增条带的有无，可快速、高效地检测岷江百合总RNA样本中基因组DNA的残留。

(二)本发明的方法同样可以适用岷江百合cDNA样本中基因组DNA残留的检测。

(三)本发明为今后岷江百合相关基因的表达分析结果的准确性提供了保障。

附图说明

图1为本发明实施例1中岷江百合TIP41-like含内含子DNA片段扩增结果。其中，M：Marker Ⅰ；1：TIP41-like含内含子DNA片段。

图2为本发明实施例1中TIP41-like一段含内含子DNA片段和对应的mRNA片段序列比对结果。其中，方框为基因组DNA检测引物设计位置。

图3为本发明实施例1中岷江百合基因组DNA残留检测片段扩增结果。其中，M：Marker Ⅰ；1：基因组DNA残留检测片段。

图4为本发明实施例1中三种不同RNA提取试剂盒提取的岷江百合叶片RNA电泳检测结果。

图5为本发明实施例1中RNA样本中基因组DNA残留检测片段扩增结果。其中，M：Marker Ⅰ。

图6为本发明实施例2中cDNA样本中基因组DNA残留检测片段扩增结果。其中，M：Marker Ⅰ；Ⅰ、Ⅱ分别代表两种不同的cDNA合成试剂盒。

图4-图6中，A、B、C分别代表3种不同的RNA提取试剂盒；1–6分别代表不同单株的叶片样本。

具体实施方式

以下实施例用于说明本发明，但不用来限制本发明的范围。若未特别指明，实施例均按照常规实验条件，如Sambrook等分子克隆实验手册(Sambrook J&Russell DW,Molecular Cloning:a Laboratory Manual,2001)，或按照制造厂商说明书建议的条件。

以下实施例中随机选取6株生长发育一致的组培苗，分别取其叶片，经液氮速冻后，于-80℃冰箱保存备用。

分别选择3种不同公司生产的RNA提取试剂盒(分别标记为A、B、C，均含有基因组DNA去除步骤)用于提取岷江百合叶片RNA。

分别采用2种不同公司品牌的第1链cDNA合成试剂盒(分别标记为Ⅰ、Ⅱ；Ⅰ不含有基因组DNA去除步骤，Ⅱ含有基因组DNA去除步骤)用于合成cDNA。

实施例1不同试剂盒提取的总RNA样本中基因组DNA残留检测

包括如下步骤：

(1)总RNA样本提取

选择3种不同公司生产的RNA提取试剂盒，分别参照各自试剂盒说明书，对6株植株的叶子进行总RNA提取。对提取的总RNA样本进行1.2％琼脂糖凝胶电泳检测和QuawellQ3000检测，结果见图4，从图4可以看出，提取的18个总RNA样本完整性好，无蛋白质污染。并且，仅从图中无法用肉眼判断出RNA样本中是否含有基因组DNA污染。

(2)RNA样本中基因组DNA残留检测

使用基因组DNA残留检测引物(LDRG-F/LDRG-R)对提取的RNA进行PCR扩增，PCR反应体系20μL：200-300ng/μL模板RNA 2μL，LDRG-F Primer 0.5μL，LDRG-R Primer 0.5μL，2×Taq PCR Magic Mix 10μL，ddH₂O 7μL。

PCR反应程序为：94℃预变性3min；94℃变性30s，58℃退火30s，72℃延伸1min，循环35次；72℃延伸5min。反应结束后，取6μL产物用2％琼脂糖凝胶电泳并观察拍照。

检测结果显示：使用试剂盒A和B提取的12个RNA样本中均能扩增出184bp的目的条带，且条带单一、清晰，表明RNA样本中含有较高浓度的DNA残留；而使用试剂盒C提取的RNA样本中无扩增条带，表明此总RNA样本中无基因组DNA残留(图5)。

实施例2 cDNA样本中基因组DNA残留检测

包括如下步骤：

(1)总RNA样本提取

同实施例1。

(2)第一链cDNA合成

采用2种不同公司品牌的第一链cDNA合成试剂盒(分别标记为Ⅰ、Ⅱ；Ⅰ不含有基因组DNA去除步骤，Ⅱ含有基因组DNA去除步骤)，分别参照各自试剂盒说明书，对18个总RNA样本进行第一链cDNA合成。

(3)cDNA样本中基因组DNA残留检测

以获得的cDNA为模板，分别使用基因组DNA残留检测引物(LDRG-F/LDRG-R)进行PCR扩增，PCR反应体系20μL：模板cDNA(约1ng/μL)2μL，LDRG-F Primer 0.5μL，LDRG-RPrimer 0.5μL，2×Taq PCR Magic Mix 10μL，ddH₂O 7μL。

PCR反应程序同实施例1。反应结束后，取6μL产物用2％琼脂糖凝胶电泳并观察拍照。

检测结果显示：两种cDNA合成试剂盒合成的cDNA样本中A1–A6和B1–B6均能扩增出184bp目的片段，而C1–C6无扩增条带(图6)。表明两种cDNA合成试剂盒均无法去除RNA样本中残留的基因组DNA。进一步说明RNA质量严重影响cDNA质量。

虽然，上文中已经用一般性说明及具体实施方案对本发明作了详尽的描述，但在本发明基础上，可以对之做一些修改或改进，这对本领域技术人员而言是显而易见的。因此，在不偏离本发明精神的基础上所做的这些修改或改进，均属于本发明要求保护的范围。

序列表

<110> 中国农业科学院蔬菜花卉研究所

<120> 一种快速检测总RNA样本中基因组DNA残留的方法

<130> KHP181113506.6

<160> 2

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 22

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 1

ctcttttatg acgaggttgg ta 22

<210> 2

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 2

cagggaaatc ggtcagtgtt 20

Claims (3)

1.一种快速检测岷江百合总RNA样本中基因组DNA残留的方法，其特征在于，包括：

1)以岷江百合基因TIP41-like作为靶标，针对内含子序列设计PCR引物；

PCR引物如下：

LDRG-F：5'-CTCTTTTATGACGAGGTTGGTA-3'

LDRG-R：5'-CAGGGAAATCGGTCAGTGTT-3'；

2)提取待测岷江百合的总RNA，以总RNA或其反转录得到的cDNA为模板，利用步骤1)的引物进行PCR扩增；

3)分析PCR扩增产物。

2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤3)中根据扩增条带的有无来判断总RNA样本中是否有基因组DNA残留。

3.根据权利要求2所述的方法，其特征在于，PCR反应体系为：RNA或cDNA 2μL，上、下游引物各0.5μL，2×Taq PCR Magic Mix 10μL，ddH₂O 7μL；

PCR反应程序为：94℃预变性3min；94℃变性30s，58℃退火30s，72℃延伸1min，35个循环；72℃延伸5min。

Images