CN108396072B - 一种快速鉴别毛菊苣与菊苣的方法 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种快速鉴别毛菊苣与菊苣的方法。该方法基于毛菊苣和菊苣单核苷酸多态性标记，毛菊苣所示序列的5’端起第466位为G，第640位为C，而此位点与菊苣所对应位点具有稳点的变异。本发明基于叶绿体rbcL基因核苷酸序列SNP位点，设计出可快速、准确鉴别毛菊苣与菊苣的特异性引物F和R，并在此基础上优化建立PCR检测体系，为两者鉴别提供了分子鉴定依据。根据该特异性引物建立的检测方法，操作简便，特异性好，灵敏度高，可实现对两者的快速、准确的鉴别，适于广泛的推广使用。

Description

一种快速鉴别毛菊苣与菊苣的方法

技术领域

本发明涉及毛菊苣和菊苣的分子生物学检测，特别涉及一种快速鉴别毛菊苣与菊苣的方法。

背景技术

毛菊苣Cichorium glandulosum Boiss.et Huet为维吾尔族传统习用药材，维吾尔语名称为卡斯纳Ksina，为菊科植物毛菊苣的干燥地上部分或根，该品种被收录于2015年版《中国药典》，具有清肝利胆，健胃消食，利尿消肿；用于湿热黄疸，胃痛食少，水肿尿少。在国内，主要分布于新疆南疆的阿克苏，和田、喀什等平原绿洲区域，新疆各地均有栽培。国外，高加索、土耳其均有分布。近年来发现，维吾尔药毛菊苣具有非常好的保肝、降脂、抗炎等作用。随着对毛菊苣的市场需求量不断地增加，市场中毛菊苣与菊苣Cichorium intybusL常常混淆使用，在一定程度上影响了药用的安全有效性。由于两者在其外观、形态比较相似，传统的物理化学方法很难将其快速准确的区分出来，其检测方法也受到地理环境及其人为的影响，很难对其进行质量有效的控制。因此，建立准确而可靠的鉴定方法显得尤为重要。

位点特异性PCR技术可用于检测单个或多个位点的核苷酸变异，主要是根据Newton等建立的扩增阻滞突变系统原理，由于DNA聚合酶缺乏3’-5’外切酶活性，从而不能与模板DNA进行正确的互补配对，因此就不能有效扩增目的基因。本发明即是基于此原理，而建立一种快速鉴别毛菊苣与菊苣的方法及其应用，以期建立准确可靠的DNA分子检测方法，为将来两者质量控制提供坚实的科研基础。

发明内容

本发明的目的是基于rbcL叶绿体核苷酸序列SNP位点提供一种可快速、准确地鉴别毛菊苣和菊苣的特异性引物及鉴别方法及其应用。

一种毛菊苣和菊苣单核苷酸多态性标记，其核苷酸序列如序列表SEQ IDNO：1所示，其中，毛菊苣所示序列的5’端起第466位为G，第640位为C，而此位点与菊苣所对应位点具有稳点的变异。

所述引物的核苷酸序列如序列表SEQ ID NO：2和SEQ ID NO：3所示。

一种快速鉴别毛菊苣与菊苣的方法，按照如下步骤进行：

(1)提取待检样品中的DNA；

(2)以步骤(1)中所提取的DNA为模板，使用如序列表SEQ ID NO：2和SEQ ID NO：3所示的引物序列，进行位点特异性PCR扩增；

(3)对上述PCR扩增产物进行琼脂糖凝胶电泳，根据电泳检测结果来鉴别出毛菊苣及菊苣。

所述PCR扩增反应结束后，如果经琼脂糖凝胶电泳检测发现扩增出目的条带，则鉴定为毛菊苣，反之则鉴定为菊苣。

所述毛菊苣与菊苣鉴别的部位为其基原植物、果实、根皮或茎。

与现有技术相比，本发明具有如下有益效果：本发明是基于叶绿体rbcL基因核苷酸序列SNP位点，设计出可快速、准确鉴别毛菊苣与菊苣的特异性引物F和R，并在此基础上优化建立PCR检测体系，为两者鉴别提供了分子鉴定依据。根据该特异性引物建立的检测方法，操作简便，特异性好，灵敏度高，可实现对两者的快速、准确的鉴别，适于广泛的推广使用。

附图说明

图1是位点特异性PCR引物用于不同来源的毛菊苣及菊苣鉴别的琼脂糖凝胶电泳图，其中1-10号泳道为毛菊苣，产物大小约为230bp左右；11-20号泳道为菊苣，21号为ddH2Ocontrol，M为DL2000DNA Marker。

图2是位点特异性PCR反应体系优化琼脂糖凝胶电泳图。M为DL2000 DNA Mark；1～4为不同循环数26、29、32、35；5～8为不同退火温度49℃、52℃、55℃、58℃；9～11为不同体积dNTP 0.5μl、1.0μl、2.0μl；12～14为不同taq DNA聚合酶0.05U、0.1U、0.25U；15～17不同引物体积0.1μl、0.25μl、0.5μl。

图3是利用位点特异性PCR引物扩增毛菊苣不同DNA浓度的琼脂糖凝胶电泳图，其中1-6号DNA浓度分别为25ng/μl、2.5ng/μl、250pg/μl、25pg/μl、2.5pg/μl、0.25pg/μl等6个梯度浓度的毛菊苣PCR扩增产物条带，产物大小约为230bp左右；M为DL2000DNA Marker。

具体实施方式

下面结合附图，对本发明的具体实施方式进行详细描述，但应当理解本发明的保护范围并不受具体实施方式的限制。

若未特别指明，以下实施例均按照常规实验条件，如Sambrook等分子克隆实验手册(New York:Gold Spring Harbor Laboratory Press,1989)中所述的操作技术规程，或按照制造厂商所建议的实验条件；所用原料均为市售商品。

实施例1位点特异性PCR引物用于毛菊苣及菊苣的鉴别

新型植物基因组DNA提取试剂盒(北京天根)，Taq酶(2.5U/μl)、dNTPs(2.5mM)、DL2000DNA Mark均购自(北京天根)，琼脂糖(GENE Biowest)，核酸染料(Geneview)，液氮，无水乙醇，均购自国产分析纯。

电泳系统(北京六一DYY-6C)，凝胶成像系统(美国BIO-RAD Del DocTMXR+)，PCR仪(美国BIO-RAD C-1000TM)，电子天平(北京余姚JM1000)，低温冷冻离心机(德国Eppendorf5424型)，纯水仪(优普UPC-I-10T)，微量移液器(德国Eppendorf)。

本实施例选取样本分别于2016-2017年间在新疆乌鲁木齐、吉木萨尔、和田、喀什，昌吉等不同地理区域所采集，其中毛菊苣10份，菊苣10份。样本鉴定由新疆药物研究所何江副研究员所鉴定，凭证标本保存于新疆药物研究所维吾尔药重点实验室标本室。详见下表：

表1植物标本信息

样品基因组总DNA的提取：

取适量的菊苣药材在液氮中迅速研磨成细粉，使用植物基因组DNA提取试剂盒提取样品总DNA，具体步骤依据试剂盒提供的说明书进行，DNA于-20℃保存备用。

PCR：

上述所述的PCR扩增反应体系为：

PCR扩增反应程序为：94℃预变性4min；94℃30s，55℃30s，72℃1min，共32个循环；72℃延伸7min；12℃forever。取扩增产物5μL，在1％的琼脂糖凝胶上进行电泳，电压为120V，30分钟后在凝胶成像系统下检测电泳结果，如果出现约230bp的条带，则证明所检样品为毛菊苣，反之则是菊苣。

结果分析：

电泳检测结果如图1所示，泳道1-10为毛菊苣样品，均能扩增出约230bp的DNA条带，亮度也较为适宜，而其他泳道11-20菊苣待测样品则未出现明显的条带，说明位点特异性PCR引物F与R在毛菊苣与菊苣的鉴别中具有显著的特异性，适宜应用在两者之间的进一步分子鉴别上。

实施例2位点特异性PCR体系优化

DNA提取：

每个样品取约30mg，在液氮中迅速研磨成细粉，使用植物基因组DNA提取试剂盒提取样品总DNA，具体步骤依据试剂盒提供的说明书进行，试剂盒采用北京天根公司的植物基因组DNA提取试剂盒。

PCR体系优化：

用设计的特异性鉴别引物F和R进行PCR扩增反应，反应体系为30μl，包含体系内含Taq酶0.25μl、10×buffer 2.5μl、dNTP 2.0μl、正反向引物各0.5μl、总DNA 2μl，ddH2O补足至30μl。PCR反应体系条件为：94℃3min；94℃30s，55℃30s，72℃1min，32cycles；72℃7min；12℃hold。取5μl PCR扩增产物，通过1％的琼脂凝胶糖电泳，染色，凝胶紫外成像系进行观察，成像。PCR反应体系及程序同上，对其进行不同循环数26，29，32，35；不同退火温度49℃，52℃，55℃，58℃；不同体积dNTP 0.5μl，1.0μl，2.0μl；不同taq DNA聚合酶0.05U，0.1U，0.25U，不同引物体积0.1μl，0.25μl，0.5μl进行了考察，以确定特异性引物在扩增目的基因片段的最优化条件。

结果分析：

为建立准确可靠的维吾尔药毛菊苣及其易混品菊苣分子鉴别方法，本实施例对特异性位点鉴别引物F和R在PCR反应体系中进行了进一步的优化。

对反应体系的循环数进行了优化分析，从图2中可以看出，循环数在26，29，32，35个循环时都可以有效的扩增出目的约230bp条带，而循环数在32个循环时，扩增出的目的条带最为明亮，所以选择32个循环为PCR体系的循环数。对反应体系的退火温度Tm进行了优化分析，从图中可以看出，退火温度在49℃，53℃，55℃，58℃都可以有效的扩增出约230bp目的条带，通过对目的条带的质量进行分析，退火温度在55℃时，目的条带质量最好，所以选择退火温度55℃为PCR体系的退火温度。对反应体系的所加引物体积进行了优化分析，从图中可以看出，所加引物体积在0.25μl，0.5μl，1.0μl时都可以有效的扩增出约300bp目的条带，而引物浓度在0.5μl时，目的条带最为明亮，所以选择引物浓度为0.5μl时作为PCR体系的引物参数。对反应体系的dNTP进行了优化分析，从图中可以看出，dNTP在0.05，0.1，2.0时都可以有效的扩增出约230bp目的条带，而dNTP为2.0时，目的条带最为明亮，所以选择dNTP为2.0时作为PCR体系的dNTP的浓度。对反应体系的taq DNA聚合酶优化分析，从图中可以看出，taq酶在0.05U，0.1U，0.25U时都可以有效的扩增出约230bp目的条带，而taq DNA聚合酶在0.25U时，目的条带最为明亮，所以选择taq DNA聚合酶为0.25U作为PCR体系的优化参数。最终，PCR体系优化后，反应体系为30μl，包含体系内含Taq酶0.25μl、10×buffer 2.5μl、dNTP 2.0μl、正反向引物各0.5μl、总DNA 2μl，ddH2O补足至30μl。反应条件为：94℃4min；94℃30s，55℃30s，72℃1min，32cycles；72℃7min；12℃hold。

实施例3利用特异性PCR引物鉴别毛菊苣检出限分析

DNA提取：

每个样品取约30mg，在液氮中迅速研磨成细粉，使用植物基因组DNA提取试剂盒提取样品总DNA，具体步骤依据试剂盒提供的说明书进行，试剂盒采用北京天根公司的植物基因组DNA提取试剂盒。

样品DNA的梯度稀释：

将毛菊苣总DNA进行10倍逐级梯度稀释，依次分别为25ng/μl、2.5ng/μl、250pg/μl、25pg/μl、2.5pg/μl、0.25pg/μl等6个梯度浓度。以稀释的DNA为模板进行毛菊苣位点特异性PCR扩增，以能扩增出目的条带的最低浓度确定检出限。

位点特异性PCR反应:

上述所述的PCR扩增反应体系为：

PCR扩增反应程序为：94℃预变性4min；94℃30s，55℃30s，72℃1min，共32个循环；72℃延伸7min；12℃forever。取扩增产物5μL，在1％的琼脂糖凝胶上进行电泳，电压为120V，30分钟后在凝胶成像系统下检测电泳结果。如果出现约230bp的条带，则证明所检毛菊苣DNA模板浓度可以检测出阳性结果；如果，没有明亮的条带出现，则说明此毛菊苣DNA模板浓度为最低检出限。

结果分析:

对不同浓度梯度稀释的毛菊苣模板DNA进行特异性PCR扩增(如图3)，其扩增出的条带亮度随DNA模板浓度降低而减弱变暗，当DNA模板质量浓度在2.5pg/μl以下时，不能有效的扩增出特异性鉴别条带，说明毛菊苣位点特异性PCR鉴别最低检出限为2.5pg/μl，其检测灵敏度较高。

以上公开的仅为本发明的具体实施例，但是，本发明并非局限于此，任何本领域的技术人员能思之的变化都应落入本发明的保护范围。

序列表

<110> 新疆维吾尔自治区药物研究所

<120> 一种快速鉴别毛菊苣与菊苣的方法

<160> 3

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 729

<212> DNA

<213> 毛菊苣(CichoriumglandulosumBoissetHuet)

<400> 1

aacagaaact aaagcaagtg ttggattcaa agctggtgtt aaagattata aattgactta 60

ttatactcct gaatatgaaa ccaaggatac tgatattttg gcagcatttc gagtaactcc 120

tcaacctgga gttccgcctg aagaagcagg ggccgcagta gctgccgaat cttctactgg 180

tacatggaca actgtgtgga ccgatggact tacgagcctt gatcgttaca aagggcgctg 240

ctatggaatc gagcctgttc ctggagaaga aaatcaatat attgcttatg tagcttaccc 300

attagacctt tttgaagaag gttctgttac taacatgttt acttccattg taggtaatgt 360

atttgggttc aaagccctgc gtgctctacg tctggaagat ttgcgaatcc ctactgcgta 420

tgttaaaact ttccaaggtc cgcctcacgg catccaagtt gagagagata aattgaacaa 480

gtatggtcgt cccctgttgg gatgtactat taaacctaaa ttggggttat ccgctaaaaa 540

ctacggtaga gctgtttatg aatgtcttcg tggtggcctt gattttacta aagatgatga 600

gaacgtgaac tcccaaccat ttatgcgttg gagagaccgt ttcttatttt gtgccgaagc 660

tatttttaaa tcacaagctg aaacaggtga aatcaaaggg cattacttga atgctactgc 720

aggtacatg 729

<210> 2

<211> 18

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 2

cacggcatcc aagttgag 18

<210> 3

<211> 26

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 3

tagcttcggc acaaaataag aaactg 26

Claims (2)

1.一种鉴别毛菊苣与菊苣的方法，其特征在于，按照如下步骤进行：

（1）提取待检样品中的DNA，其核苷酸序列如序列表SEQ ID NO：1所示；

（2）以步骤（1）中所提取的DNA为模板，使用如序列表SEQ ID NO：2和SEQ ID NO：3所示的引物序列，进行位点特异性PCR扩增；

（3）对上述PCR扩增产物进行琼脂糖凝胶电泳，根据电泳检测结果来鉴别出毛菊苣及菊苣；

所述PCR扩增反应结束后，如果经琼脂糖凝胶电泳检测发现扩增出目的条带，则鉴定为毛菊苣，反之则鉴定为菊苣。

2.根据权利要求1所述的鉴别毛菊苣与菊苣的方法，其特征在于，所述毛菊苣与菊苣鉴别的部位为其基原植物、果实、根皮或茎。

Images